JP2022541852A

JP2022541852A - 抗酸化および抗ウイルスの組成物および方法

Info

Publication number: JP2022541852A
Application number: JP2022505295A
Authority: JP
Inventors: ピーターソンティモシー; ベーファーアタ; パラダイスクリストファー
Original assignee: メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2020-07-23
Publication date: 2022-09-27
Also published as: KR20220041131A; CA3148604A1; EP4003322A1; WO2021021572A1; AU2020321880A1; BR112022001338A2; US20220241325A1; EP4003322A4

Abstract

エクソソームおよび／または精製エクソソーム産物（ＰＥＰ）の製剤は、抗酸化タンパク質および抗ウイルスタンパク質を含む。エクソソームおよび／またはＰＥＰを含む組成物は、少なくとも部分的に酸化ストレスによって引き起こされる状態または組織損傷を有する、または有するリスクのある対象を治療するために使用することができる。また、エクソソームおよび／またはＰＥＰを含む組成物は、ウイルス感染を有する、または有するリスクのある対象を治療するために使用することができる。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年７月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８７９，０３３号の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本開示は、一つの態様では、酸化ストレスによって引き起こされる組織損傷を有するリスクのある対象において、酸化ストレスによって引き起こされる組織損傷を治療する方法を記載している。一般に、方法は、組成物が投与されていない対象と比較して、組織損傷の可能性または重症度を軽減するのに有効な量の少なくとも一つの抗酸化タンパク質を有するエクソソームおよび／または精製エクソソーム産物（ＰＥＰ）を含む組成物を対象に投与することを含む。

別の態様では、本開示は、酸化ストレスによって引き起こされる状態を有するリスクのある対象において、酸化ストレスによって引き起こされる状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を治療する方法を記載している。一般に、方法は、有効な量の少なくとも一つの抗酸化タンパク質を含むエクソソームおよび／またはＰＥＰを含む組成物を対象に投与する工程を含む。場合によっては、組成物の有効量は、組成物が投与されていない対象と比較して、対象が酸化ストレスによって引き起こされる状態の症状または臨床徴候を経験する可能性を低減するのに有効な量である。他の場合では、組成物の有効量は、組成物が投与されていない対象と比較して、酸化ストレスによって引き起こされる状態の症状または臨床徴候の重症度を軽減するのに有効な量である。

別の態様では、本開示は、対象において酸化ストレスによって引き起こされる組織損傷を治療する方法を記載している。一般に、方法は、組成物が投与されていない対象と比較して、組織損傷の重症度を軽減するのに有効な量の少なくとも一つの抗酸化タンパク質を含むエクソソームおよび／またはＰＥＰを含む組成物を対象に投与する工程を含む。

別の態様では、本開示は、対象において酸化ストレスによって引き起こされる状態を治療する方法を記載している。一般に、方法は、組成物が投与されていない対象と比較して、酸化ストレスによって引き起こされる状態の症状または臨床的兆候の重症度を軽減するのに有効な量の少なくとも一つの抗酸化タンパク質を含むエクソソームおよび／またはＰＥＰを含む組成物を対象に投与する工程を含む。

上に要約された任意の態様の一部の実施形態では、エクソソームおよび／またはＰＥＰは、エクソソームおよび／またはＰＥＰは、酸化的にストレスを受けている組織の細胞におけるアポトーシスを減少させるのに有効な量で提供される。

別の態様では、本開示は、ウイルス感染を有するリスクがある対象を治療する方法を記載している。一般に、方法は、少なくとも一つの抗ウイルスタンパク質を有する有効量のエクソソームおよび／またはＰＥＰを含む組成物を対象に投与する工程を含む。場合によっては、有効量は、組成物が投与されていない対象と比較して、対象がウイルス感染の症状または臨床徴候を経験する可能性を低減するのに有効な量である。他の場合では、有効量は、組成物が投与されていない対象と比較して、ウイルス感染によって引き起こされる状態の症状または臨床徴候の重症度を軽減するのに有効な量である。一部の実施形態では、抗ウイルスタンパク質は、インターフェロン誘導性膜貫通タンパク質－１（ＩＦＩＴＭ－１）、ＩＦＩＴＭ－３、ＭＸ１、またはｖｉｐｅｒｉｎを含んでもよい。

上記の要約は、開示された各実施形態または本発明のすべての実施を記載することを意図するものではない。以下の記載は、より具体的に、例示的な実施形態を例示している。本願全体のいくつかの箇所で、様々な組み合わせで使用できる例のリストを通じてガイダンスを提供している。いずれの場合も、列挙されたリストは代表的なグループとしてのみ機能し、排他的なリストとして解釈されるべきではない。

特許ファイルまたは出願ファイルは、カラーで作成された図面が少なくとも一つ含む。カラー図面による本特許の公報または特許出願公開のコピーは、依頼および必要な料金の支払いに応じて、特許庁から提供される。

エクソソーム形成およびフリーラジカル生成のメカニズムの概略図。（Ａ）細胞によるエクソソームの産生および分泌の概略図。（Ｂ）フリーラジカル生成およびこのフリーラジカル連鎖反応を阻害する抗酸化剤の概略図。化合物ＬＹ８３５８３は、培養中の細胞に投与される場合にスーパーオキシド発生剤であり、ＰＥＰが酸化ストレスの毒性作用を抑制することができることを実証するためにいくつかの研究で使用された。３つの異なるＰＥＰ製剤における抗酸化発現。（Ａ）ＰＥＰ試料中の抗酸化タンパク質のウエスタンブロット分析。ヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ－１）、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）、Ｍｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ２）、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）。（Ｂ）いくつかのＰＥＰ試料におけるカタラーゼ活性の定量化。ＰＥＰは、初代神経細胞（ｐｒｉｍａｒｙｎｅｕｒａｌｃｅｌｌ）の酸化ストレスを軽減する。スーパーオキシド発生剤ＬＹ８３５８３（１μＭ）で２４時間処理する前に、ｉｎｖｉｔｒｏでマウスニューロンを、ＰＥＰの存在下または非存在下で処理した。細胞死は、アポトーシス細胞を赤くするカスパーゼ３／７特異的色素を使用して検出された。（Ａ）マウスニューロンの位相差顕微鏡。（Ｂ）（Ａ）の蛍光顕微鏡画像。ＬＹ８３５８３のみで処理した細胞では、赤いカスパーゼ３／７色素が見られる。（Ｃ）また、ニューロンは、細胞の核を検出するためにＮｕｃＬｉｇｈｔｇｒｅｅｎで標識した。（Ｄ）Ｂ～Ｄのマージされた画像。（Ｅ）ＩＮＣＵＣＹＴＥＳ３セルイメージャー（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、ミシガン州アナーバー）を使用したカスパーゼ３／７陽性細胞の定量。ＰＥＰ非存在下では、ＬＹ８３５８３は２４時間のＬＹ８３５８３処理後にニューロンのアポトーシスを誘導する。対照的に、１時間のＰＥＰ前処理は酸化ストレスを抑制する。ヒト胎児腎臓２３９Ｔ細胞（ＨＥＫ２３９Ｔまたは２９３Ｔ）細胞における、酸化ストレスに対するＰＥＰの用量依存的効果。（Ａ）２９３Ｔ細胞をＰＥＰで前処理すると、ＬＹ８３５８３が誘導する酸化ストレスが用量依存的に阻害される。スーパーオキシド発生剤ＬＹ８３５８３（１μＭ）で２４時間処理する前に、ｉｎｖｉｔｒｏでマウスニューロンを、ＰＥＰの存在下または非存在下で処理した。（Ｂ）ＬＹ８３５８３のみで処理した後のアポトーシス細胞を示す共焦点顕微鏡画像。（Ｃ）ＬＹ８３５８３および１０％ＰＥＰで処理した後のアポトーシス細胞を示す共焦点顕微鏡画像。（Ｄ）ＬＹ８３５８３および２０％ＰＥＰで処理した後のアポトーシス細胞を示す共焦点顕微鏡画像。細胞死は、瀕死の細胞を赤くするカスパーゼ３／７特異的色素を使用して検出した。分析は、ＩＮＣＵＣＹＴＥＳ３セルイメージャー（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、ミシガン州アナーバー）を使用して定量化した。ＰＥＰは、初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ；ＨＵＶＥＣ）の酸化ストレスを抑制する。スーパーオキシド発生剤ＬＹ８３５８３（２０μＭ）で５時間処理する前に、ｉｎｖｉｔｒｏでＨＵＶＥＣ細胞を、ＰＥＰの存在下または非存在下で処理した。ＩＮＣＵＣＹＴＥＳ３セルイメージャー（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、ミシガン州アナーバー）を使用して、経時的に管形成を観察するために生細胞イメージングを実施した。内皮管形成の代表的な蛍光画像。ＰＥＰは、初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の酸化ストレスを抑制する。スーパーオキシド発生剤ＬＹ８３５８３（２０μＭ）で５時間処理する前に、ｉｎｖｉｔｒｏでＨＵＶＥＣ細胞を、ＰＥＰの存在下または非存在下で処理した。（Ａ）血管パーセンテージ面積（ｖｅｓｓｅｌｐｅｒｃｅｎｔａｇｅａｒｅａ）の定量化。（Ｂ）血管長の定量化。管形成は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して測定した。ＰＥＰ前処理は、総血管パーセンテージおよび血管長によって決定される酸化ストレスの設定で、管形成を有意に増強した。ＰＥＰにおけるエクソソームの性質決定。（Ａ）ＰＥＰにおけるエクソソームのＮＡＮＯＳＩＧＨＴ（ＭａｌｖｅｒｎＰａｎａｌｙｔｉｃａｌＬｔｄ．、ソールズベリー、英国）画像。（Ｂ）２０％ＰＥＰ（１８００１－Ｂ２）におけるエクソソームの大きさおよび数のＮＡＮＯＳＩＧＨＴ定量化。（Ｃ）ＰＥＰの３つの別々の製剤におけるエクソソームの既知のマーカーのウエスタンブロット分析。エクソソームにパッケージされているインターフェロン誘導性膜貫通タンパク質１、３（ＩＦＩＴＭ）、ならびにＭＸ１およびｖｉｐｅｒｉｎを含む抗ウイルスタンパク質を示す概略図。これらの抗ウイルスタンパク質は、エクソソーム内に含まれ、ＰＥＰ製剤にも含まれている。ＰＥＰがウイルス産生を阻害するメカニズムを示す概略図。ＰＥＰによる前処理および後処理は、ウイルスの細胞への侵入を阻害する。ＰＥＰの抗ウイルスタンパク質がこの阻害の原因である。神経膠芽腫（ＧＢＭ）および脂肪由来間葉系幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ；ａＭＳＣ）細胞株における抗ウイルスタンパク質の特性評価。（Ａ）ＩＦＩＴＭ３は、全細胞溶解物（ＷＣＬ）およびａＭＳＣから調製されたＰＥＰの両方で検出されたが、ＧＢＭから調製されたＰＥＰでは検出されなかった。（Ｂ）ＩＦＩＴＭ１は、ＰＥＰの３つの異なる製剤で発現していることが見出された。６つの異なる細胞株における抗ウイルスタンパク質の特性評価。ＩＦＩＴＭ－１、ＩＦＩＴＭ－３、ＭＸ１、およびｖｉｐｅｒｉｎを探索するための細胞溶解物のウエスタンブロット。レーン１：ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）；レーン２：ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）；レーン３：正常なヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）；レーン４：正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）；レーン５：脂肪由来間葉系幹細胞（ａＭＳＣ）；レーン６：臍帯由来間葉系幹細胞（ｕＭＳＣ）。予測される感染力は、ウエスタンブロットで示される抗ウイルスタンパク質の量に由来する。レーン１（ＨＥＫ２９３Ｔ）はＩＦＩＴＭタンパク質の量が最も少ないため、最も感染しやすいと予測される。ＰＥＰにおけるタンパク質発現の特性評価。（Ａ）２９３Ｔ細胞、Ｈｅｌａ細胞、およびＰＥＰにおけるエクソソームマーカーＣＤ６３ならびに抗ウイルスタンパク質ＭＸ１およびｖｉｐｅｒｉｎのタンパク質発現レベルを比較するウエスタンブロット。（Ｂ）ＰＥＰの３つの異なる生産バッチにおけるＩＦＩＴＭ１発現の比較。ｉｎｖｉｔｒｏの実験計画を要約した概略図。（Ａ）ＰＥＰによる２９３Ｔ細胞の前処理。（Ｂ）ウイルス感染後のＰＥＰによる２９３Ｔ細胞の処理。細胞をＰＥＰで前処理すると、ウイルス感染が阻害される。２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに３００，０００細胞／ウェルで播種した。感染多重度（ＭＯＩ）が１０のＶＳＶ－ＧＦＰ感染の前に、細胞をＰＥＰで９６時間、７２時間、４８時間、または２４時間前処理した。ＶＳＶ－ＧＦＰ（２．３７×１０⁵ＰＦＵ／ｍｌ）を無血清培地で希釈し、ＭＯＩを１０にした。感染の２４時間後、細胞を２％ＰＦＡで固定し、フローサイトメトリーに供して、感染後に緑色になった感染細胞の数を測定した。（Ａ）陰性対照：未染色の細胞。（Ｂ）陽性対照：ＰＥＰ前処理なしでＭＯＩ１０でＶＳＶ－ＧＦＰに感染した２９３Ｔ細胞。（Ｃ）ウイルス感染の前に９６時間ＰＥＰで処理された２９３Ｔ細胞。（Ｄ）ウイルス感染の前に７２時間ＰＥＰで処理された２９３Ｔ細胞。（Ｅ）ウイルス感染の前に４８時間ＰＥＰで処理された２９３Ｔ細胞。（Ｆ）ウイルス感染の前に２４時間ＰＥＰで処理された２９３Ｔ細胞。ＰＥＰの前処理は、特に曝露から４８時間以内に、ウイルス感染を有意に阻害した。ウイルス感染後にＰＥＰで細胞を処理すると、ウイルス感染した場合の拡散が阻害される。２９３Ｔ細胞にＶＳＶ－ＧＦＰ（ＭＯＩ１０）を形質導入し、形質導入と同時に、形質導入の１時間後、形質導入の２時間後、または形質導入の３時間後にＰＥＰで処理した。ＰＥＰ後処理は、ウイルス感染から細胞を有意に保護する。形質導入の２４時間後、細胞を２％ＰＦＡで固定し、フローサイトメトリーに供して、感染後に緑色になった感染細胞の数を測定した。（Ａ）陰性対照：未染色の細胞。（Ｂ）陽性対照：ＰＥＰ前処理なしでＭＯＩ１０でＶＳＶ－ＧＦＰに感染した２９３Ｔ細胞。（Ｃ）ウイルスへの曝露と同時にＰＥＰで処理された２９３Ｔ細胞。（Ｄ）ウイルスへの曝露の１時間後にＰＥＰで処理された２９３Ｔ細胞。（Ｅ）ウイルスへの曝露の２時間後にＰＥＰで処理された２９３Ｔ細胞。（Ｆ）ウイルスへの曝露の３時間後にＰＥＰで処理された２９３Ｔ細胞。噴霧によるマウス肺へのＰＥＰのｉｎｖｉｖｏ取り込み。噴霧されたＰＥＰは、上皮に取り込まれて肺胞で高密度に詰められた肺組織（ａｌｖｅｏｌａｒｂｅｄ）に浸透する。生理食塩水中のＤｉＲ標識ＰＥＰは、人工呼吸器（ＦＬＥＸＩＶＥＮＴ；ＳＣＩＲＥＱＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＥｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．、モントリオール州ケベック、カナダ）を使用して、５分間にわたって様々な用量で投与し、噴霧されたＰＥＰを送達した。ＸＥＮＯＧＥＮイメージャ（ＩＶＩＳ２００、ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ホプキントン）を使用して画像を取得した。噴霧経路を介した肺におけるＤｉＲ標識ＰＥＰ蓄積を調べるための経時的研究。５％ＰＥＰまたは１０％ＰＥＰの投与量は、５日間、１０日間、１５日間、２０日間、または２５日間投与された。肺におけるＰＥＰの蓄積は２０日でプラトーに達した。ＰＥＰは１日５分、週５日投与された。各用量は、５分で噴霧を介して送達されるＰＥＰ溶液（約０．６～０．８ｍｌ）として投与された。ＰＥＰは、Ｉ型肺胞細胞およびＩＩ型肺胞細胞の両方で検出される。（Ａ）肺胞の解剖学的構造の概略図。（Ｂ）免疫組織化学：対照のマウス肺における最小の内因性ＣＤ６３染色（緑色）。（Ｃ）免疫組織化学：ＣＤ６３染色（ＰＥＰ－緑）、ならびにサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰＣ、赤細胞質ゾル染色）およびＴ１アルファタンパク質（赤膜染色）の染色。（Ｄ）免疫組織化学：ＰＥＰで３日間噴霧した後の強いＣＤ６３染色（緑色）（２０％ＰＥＰで１日５分）。（Ｅ）免疫組織化学：（Ｃ）のクローズアップ画像（倍率６３倍）。ＣＤ６３に対する抗体を使用してＰＥＰを検出した；Ｔ１アルファタンパク質はＩ型肺胞細胞の特異的マーカーである；ＳＰＣはＩＩ型肺胞細胞のマーカーである。

例示的な実施形態の詳細な説明
エクソソームは微小胞（直径４０ｎｍ～１００ｎｍ）であり、すべての異なる細胞型から分泌され、細胞間通信信号を提供する。ｍｉＲＮＡおよびタンパク質を含む様々な異なるカーゴ分子は、エクソソームを介して細胞間を輸送することができる。創傷治癒におけるエクソソーム機能に関する現在の知識は限られたままである。

図１Ａは、細胞によるエクソソームの産生を示す概略図である。ＰＥＰ（ＰｕｒｉｆｉｅｄＥｘｏｓｏｍｅＰｒｏｄｕｃｔ；精製エクソソーム産物）は、標準的なエクソソームと比較して、ユニークな物理的構造を有する改変されたエクソソーム産物である。たとえば、ヒト血液細胞からのＰＥＰの調製は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６５６２７（国際公開番号ＷＯ２０１９／１１８８１７Ａ１）に詳細に記載されている。

ＰＥＰは、多くの用途のための医薬組成物に製剤化することができる。ＰＥＰは、たとえば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および／または皮膚線維芽細胞の増殖を、従来の治療法（たとえば、血小板溶解物）またはウシ胎児血清よりも大きく増大させることができる。同様に、ＰＥＰは、従来の治療法（血小板溶解物など）またはウシ胎児血清よりも高い程度で、骨分化、軟骨分化、および／または脂肪分化を誘導する可能性がある。ＰＥＰはまた、筋芽細胞の増殖を従来の治療法（たとえば、血小板溶解物）またはウシ胎児血清よりも高い程度に維持することができる。ＰＥＰは、ＣＡＲ－Ｔ、ＴＲｕＣ－Ｔ、ＮＫ－ＣＡＲ、および造血幹細胞等に限定されない免疫療法に使用される細胞における増殖プロファイルを増強するために使用することができる。（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６５６２７；国際公開番号ＷＯ２０１９／１１８８１７Ａ１）。

ＰＥＰの組成物および製剤は、主に増殖、抗アポトーシス、免疫調節、および新しい血管形成に焦点を当てた幅広い細胞応答を誘導する可能性がある。ＰＥＰの存在下で損傷した組織は、再生する傾向がある。この応答は、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＦＧ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の増強された発現を実証する観察によって例示される。応答はこれらの因子に限定されないが、これらの因子が異なる組織で誘導されるという観察は、ＰＥＰの再生的影響の実施形態である。

本開示は、追加の治療的および／または予防的用途につながる、天然のエクソソームおよびＰＥＰの両方であるエクソソームの抗酸化および抗ウイルス特性を記載している。ＰＥＰおよび／またはエクソソームの例示的な実施形態の関連で本明細書に記載されているが、本明細書に記載の組成物および方法は、ＰＥＰおよび／またはエクソソームに抗酸化または抗ウイルス特性を付与することに関与する１一つまたは複数のタンパク質を含む任意の細胞外小胞を含んでもよい。たとえば、本明細書に記載の組成物および方法は、それらの起源および細胞からの放出のメカニズムに関係なく、細胞外小胞を含んでもよい。エクソソームは一般に５０ｎｍから１５０ｎｍの大きさであり、特定の起源の生物学的メカニズムを有するが、細胞外小胞は複数の起源の生物学的メカニズムを有し、５０ｎｍから１０００ｎｍの大きさの範囲である。

抗酸化活性
たとえば、心血管疾患は、世界中の死亡数および罹患数の主要な原因である。有害な環境は、フリーラジカルのレベルの上昇が酸化ストレスおよび免疫細胞活性の増加を引き起こす病状に存在する。免疫細胞活性のこの増加は、心血管疾患の発症に寄与する可能性がある。酸化防止剤は、フリーラジカルの安定した非ラジカル化合物への変換を触媒することにより、フリーラジカルの影響に対抗する（図１Ｂ）。エクソソームおよびＰＥＰは抗酸化物質を含み、免疫応答を回避するため、それぞれが有害な疾患の環境を緩和するのに役立つ。

図７Ａは、ＰＥＰ粒子の代表的なＮＡＮＯＳＩＧＨＴ（ＭａｌｖｅｒｎＰａｎａｌｙｔｉｃａｌＬｔｄ．、ソールズベリー、英国）画像である。図７Ｂは、２０％再構成されたＰＥＰ製剤（無血清培地でストック濃度の２０％に希釈されたＰＥＰ）中のＰＥＰ粒子の大きさおよび数のＮＡＮＯＳＩＧＨＴ定量化を示す。図７Ｃは、ＰＥＰの３つの別々の製剤における既知のマーカーエクソソームのウエスタンブロット分析を示す。

図２は、異なるＰＥＰ製剤における抗酸化発現の存在を実証するデータを示している。各製剤は同じ方法で調製されたが、各製剤からの出発物質は、ＰＥＰの異なるバッチ生産由来のものであった。図２Ａは、ＰＥＰ試料中の５つの抗酸化タンパク質のウエスタンブロット分析を示している：カタラーゼ、ヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ－１）、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）、Ｍｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ２）、および細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）。図２Ｂは、８つの異なるＰＥＰ製剤のそれぞれにおけるカタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）発現の定量化を示している。

図３は、２９３Ｔ細胞の酸化ストレスに対するＰＥＰの用量依存的効果を示している。ＰＥＰで前処理された細胞は、ＬＹ８３５８３によって誘導された酸化ストレス後、アポトーシスが少ない（図３Ａ～Ｄ）。さらに、ＰＥＰ前処理の効果は用量依存的である。神経細胞がＰＥＰの濃度を増加させて前処理されるのに従って、アポトーシスが用量依存的に減少することを確認する共焦点顕微鏡画像。図４～６は、他の２９３Ｔ細胞（図４）およびヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；図５および図６）におけるＰＥＰの抗酸化効果を実証するデータを提供する。

一部の実施形態では、抗酸化剤は、エクソソームまたはＰＥＰが作成されるエクソソーム内の誘導性抗酸化剤であってもよい。エクソソームおよび／またはＰＥＰは内因性抗酸化剤を含んでもよいが、エクソソームおよび／またはＰＥＰの抗酸化剤は、エクソソームの供給源をストレスにプレコンディショニングすることによって上方制御することができる。これらのストレス誘導物質は、低酸素症、高体温、化学物質誘導性、または放射線を含んでもよいが、これらに限定されない。

したがって、エクソソームおよび／またはＰＥＰを使用して、病変組織の酸化ストレスを抑制することができる。抗酸化剤を含むエクソソームおよび／またはＰＥＰで細胞を前処理すると、多くの疾患に関連する酸化ストレスの影響が軽減される。

したがって、本開示は、酸化ストレスによって少なくとも部分的に引き起こされる疾患を有する、または有するリスクのある対象を治療するための方法を記載している。本明細書で使用される場合、「リスクがある」という用語は、記載されたリスクを実際に有する場合もしない場合もある対象を指す。したがって、たとえば、少なくとも部分的に酸化ストレスによって引き起こされる状態の「リスクがある」対象は、たとえば、遺伝的素因、祖先、年齢、性別、地理的位置、ライフスタイル、または病歴等の状態に関連する一つまたは複数のリスク因子を有する対象である。

したがって、エクソソームおよび／またはＰＥＰを含む組成物は、対象が、少なくとも部分的に酸化ストレスによって引き起こされる状態の症状または臨床徴候を最初に示す前、最中、または後に投与することができる。対象がその状態に関連する症状または臨床徴候を最初に示す前に開始された治療は、予防的治療と見なされ、組成物が投与されていない対象と比較して、対象が状態の臨床的エビデンスを経験する可能性を低下させ、状態の症状および／または臨床徴候の重症度を軽減し、および／または状態を完全に回復させうる。対象がその状態に関連する症状または臨床徴候を最初に示した後に開始された治療は、治療的であると見なされ、組成物が投与されていない対象と比較して、状態の症状および／または臨床徴候の重症度を軽減し、および／または状態を完全に回復させうる。

したがって、本方法は、特定の病状を有する、または有するリスクのある対象に、エクソソームおよび／またはＰＥＰを含む有効量の組成物を投与することを含む。この態様では、「有効量」は、状態に関連する症状または臨床徴候をある程度まで軽減、進行の抑制、改善、または回復させるのに有効な量である。

抗ウイルス活性
インターフェロン（ＩＦＮ）システムは、動物ウイルスに対する人間の第一の防衛線である。Ｉ型ＩＦＮまたはＩＩＩ型ＩＦＮの、それらの受容体（それぞれＩＦＮＡＲ１／２およびＩＬ－２８Ｒα／ＩＬ－１０Ｒβ）への結合は、インターフェロン誘導性膜貫通タンパク質（ＩＦＩＴＭ－１、ＩＦＩＴＭ－３、およびＩＦＩＴＭ－５）、ｖｉｐｅｒｉｎ、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＲＮＡ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ；ＰＫＲ）、リボヌクレアーゼＬ（ＲＮａｓｅＬ）、粘液腫抵抗性タンパク質１（ｍｙｘｏｍａｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ１；ＭＸ１）、およびオリゴアデニル酸合成酵素（ＯＡＳ）を含むＩＦＮ活性化遺伝子（ＩＦＮ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｇｅｎｅ）の転写を誘導することにより、細胞内に抗ウイルス状態を誘導する。

図８は、エクソソームにパッケージされているインターフェロン誘導性膜貫通タンパク質１、３（ＩＦＩＴＭ）、ＭＸ１、およびｖｉｐｅｒｉｎ等の抗ウイルスタンパク質を示す概略図である。これらの抗ウイルスタンパク質はＰＥＰにも存在する。図９は、ＰＥＰおよび／またはエクソソームがウイルス産生を阻害しうるメカニズムを示す概略図である。ＰＥＰによる前処理および後処理は、ウイルスの細胞への侵入を阻害する。ＰＥＰおよび／またはエクソソームの抗ウイルスタンパク質がこの阻害の原因である。

インターフェロン誘導性膜貫通タンパク質ＩＦＩＴＭは、ＩＦＩＴＭファミリー（インターフェロン誘導膜貫通タンパク質）のメンバーであり、ＩＦＩＴＭ遺伝子によってコードされている。ヒトＩＦＩＴＭ遺伝子は１１番染色体上にあり、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、およびＩＦＩＴＭ５の４つのメンバーを有する。ＩＦＩＴＭタンパク質は、インフルエンザウイルスＡの複製の抗ウイルス制限因子として同定されている。ＩＦＩＴＭ３のノックアウトは、インフルエンザウイルスＡの複製を増加させ、ＩＦＩＴＭ３の過剰発現は、インフルエンザウイルスＡの複製を阻害する。ＩＦＩＴＭタンパク質は、様々なウイルスファミリーに属する他のいくつかのエンベロープウイルスによる感染を阻害することもできる。これらのウイルスは、フラビウイルス（デングウイルスおよびウエストナイルウイルス）、フィロウイルス（マールブルグウイルスおよびエボラウイルス）、コロナウイルス（ＳＡＲＳコロナウイルス）、およびレンチウイルス（ヒト免疫不全ウイルス）を含む。ＩＦＩＴＭ３ノックアウトは豚インフルエンザウイルスの増殖を増加させるが、過剰発現はウイルスレベルを低下させる。

インターフェロン誘導性ＧＴＰ結合タンパク質Ｍｘ１は、ヒトではＭＸ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。マウスでは、インターフェロン誘導性Ｍｘタンパク質が、インフルエンザウイルス感染に対する特定の抗ウイルス状態に関与している。ヒトタンパク質は、その抗原性の関連性（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）、誘導条件、物理化学的特性、およびアミノ酸分析によって決定されるように、マウスタンパク質に類似している。この細胞質タンパク質は、ダイナミンファミリーおよび大きなＧＴＰアーゼファミリーの両方のメンバーである。

ＲＳＡＤ２（ｒａｄｉｃａｌＳＡＭｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ２）としても知られるｖｉｐｅｒｉｎ（ウイルス阻害タンパク質、小胞体関連、インターフェロン誘導性）は、ウイルスプロセスにおける多機能タンパク質である。ｖｉｐｅｒｉｎは、たとえば、ＣＨＩＫＶ、ＨＣＭＶ、ＨＣＶ、ＤＥＮＶ、ＷＮＶ、ＳＩＮＶ、インフルエンザ、およびＨＩＶ－１ＬＡＩ株等の多くのＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを阻害することができる細胞タンパク質である。

場合によっては、エクソソームまたはＰＥＰは、ウイルスの侵入および複製を阻害することができる抗ウイルス粒子に変換することができる。エクソソームは、ＰＥＰの調製中に存在し続ける内因性抗ウイルスタンパク質を含む場合がある。エクソソームおよび／またはＰＥＰは、ウイルス複製を妨害するｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むようにさらに修飾することができる。適切なそのようなｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１２７－３ｐ、ｍｉＲ－４８６－５、ｍｉＲ－５９３－５ｐ、ｍｉＲ－１９６、ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２９６、ｍｉＲ－３５１、ｍｉＲ－４３１、およびｍｉＲ－４４８を含むが、これらに限定されない。

図１１は、６つの異なる細胞株における抗ウイルスタンパク質の特性を示している。試験した細胞株は、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、脂肪由来間葉系幹細胞（ａＭＳＣ）、臍帯由来間葉系幹細胞（ｕＭＳＣ）であった。ヒトにおけるウイルス複製の阻害は、抗ウイルス予防的（感染前）または治療的（感染後）治療として特に有用である可能性がある。異なる細胞型は、エクソソームおよび／またはＰＥＰに見られる異なる抗ウイルスタンパク質を含む。したがって、ＰＥＰ調製物の抗ウイルスカーゴは、少なくとも部分的に、ＰＥＰを調製するための出発物質として使用される細胞型によって設計することができる。

図１３は、ＰＥＰのｉｎｖｉｔｒｏ抗ウイルス活性に関する研究の実験計画を示している。図１３Ａは、ＰＥＰによる細胞の予防的前処理がウイルス感染を阻害できるかどうかを試験するための実験計画を示している。ウイルス感染は、ＶＳＶ－ＧＦＰを細胞に感染させることによってモニタリングした。ＶＳＶ－ＧＦＰにより、感染した細胞は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する。図１４は、ＶＳＶ－ＧＦＰ形質導入の前に抗ウイルスＰＥＰで前処理された細胞が、陽性対照と比較して、ＧＦＰ陽性細胞の数の有意な減少を示したことを示している。形質導入の２４時間前に処理された細胞は、ＧＦＰ陽性細胞をほとんどまたはまったく示さず、陰性対照の細胞とより類似していた。

図１３Ｂは、細胞がＶＳＶ－ＧＦＰに曝露された後に投与されたＰＥＰがウイルス増殖を阻害できるかどうかを試験するための実験計画を示している。図１５は、ＶＳＶ－ＧＦＰへの曝露とともにまたは最大３時間後に投与されたＰＥＰが、陽性対照と比較してＧＦＰ陽性細胞の量の有意な減少を引き起こし、すべての場合で陰性対照とほぼ同じプロファイルを示したことを示している。

したがって、エクソソームおよび/またはＰＥＰを使用してウイルス感染症を治療することができる。ＰＥＰおよび／またはエクソソームで治療可能なウイルス感染症は、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、およびインフルエンザＣウイルスを含むがこれらに限定されないオルトミクソウイルス科；ウエストナイルウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、およびＣ型肝炎ウイルスを含むが、これらに限定されないフラビウイルス科；水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、およびラゴスコウモリウイルスを含むが、これらに限定されないラブドウイルス科；マールブルグウイルスおよびエボラウイルスを含むが、これらに限定されないフィロウイルス科；これには、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むが、これらに限定されないコロナウイルス科；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）－１、モロニー白血病ウイルス、およびヤーグジークテヒツジレトロウイルスを含むが、これらに限定されないレトロウイルス科；ラッサウイルス、マチュポウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、およびルジョウイルスを含むが、これらに限定されないアレナウイルス科；セムリキ森林ウイルスを含むが、これに限定されないトガウイルス科；ラクロスウイルス、ハンタンウイルス、アンデスウイルス、リフトバレー熱ウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルスを含むが、これらに限定されないブニヤウイルス科；レオウイルスを含むが、これに限定されないレオウイルス科のウイルスによる感染を含むが、これらに限定されない。

ウイルス感染症の治療は予防的であるか、あるいは、対象がウイルス感染によって引き起こされる状態の一つまたは複数の症状または臨床徴候を示した後に開始することができる。予防的である治療（たとえば、対象が状態の症状または臨床徴候を示す前、たとえば、感染が無症状のままである間等）は、本明細書では、状態の「リスクがある」対象の治療と呼ばれる。本明細書で使用される場合、「リスクがある」という用語は、記載されたリスクを実際に有する場合もしない場合もある対象を指す。したがって、たとえば、感染状態の「リスクがある」対象は、他の個体が感染状態を有すると特定された領域に存在する対象であり、および／または対象がまだ感染の検出可能な徴候を示していない場合でも、対象が無症状レベルの感染症を抱えている可能性があるかどうかに関係なく、感染性ウイルスに曝露される可能性が高い対象である。

したがって、エクソソームおよび／またはＰＥＰを含む組成物は、対象が最初に感染性ウイルスと接触する前、最中、または後に投与することができる。対象が最初に感染性ウイルスと接触する前に開始された治療は、組成物が投与されていない対象と比較して、対象がウイルス感染の臨床的エビデンスを経験する可能性を低下させ、ウイルス感染によって引き起こされる状態の症状および／または臨床徴候の重症度を低下させ、および／またはウイルス感染を完全に回復させうる。対象が最初に感染性ウイルスと接触した後に開始された治療は、組成物が投与されていない対象と比較して、ウイルス感染によって引き起こされる状態の症状および／または臨床徴候の重症度を低下させ、および／またはウイルス感染を完全に回復させうる。

したがって、本方法は、ウイルス感染を有する、または有するリスクのある対象に有効量の組成物を投与することを含む。この態様では、「有効量」は、ウイルス感染によって引き起こされる状態に関連する症状または臨床徴候を、ある程度まで軽減、進行の抑制、改善、または回復させるのに有効な量である。

ＰＥＰおよび／またはエクソソームは、医薬組成物を形成するために、薬学的に許容される担体と共に製剤化することができる。本明細書で使用される場合、「担体」は、任意の溶媒、分散媒、媒体、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤、および／または抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁剤、コロイド等を含む。医薬活性物質のためのそのような媒体および／または薬剤の使用は、当技術分野で周知である。従来の媒体または薬剤が有効成分と適合しない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が企図される。補助的な有効成分も組成物に組み込むことができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」とは、生物学的または他の方法で望ましくなくない材料を指し、すなわち、望ましくない生物学的効果を引き起こしたり、それが含まれる医薬組成物中の他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用したりすることなく、ＰＥＰおよび／またはエクソソームと共に材料を個体に投与することができることを指す。

酸化ストレスによって引き起こされるか、またはそれに関連する状態、またはウイルス感染に関連するか、またはウイルス感染によって引き起こされる状態を治療することを目的とするかどうかにかかわらず、ＰＥＰおよび／またはエクソソームを含む医薬組成物は、好ましい投与経路に適合した様々な形態で製剤化することができる。したがって、医薬組成物は、たとえば、経口、非経口（たとえば、皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内等）、または局所（たとえば、鼻腔内、肺内、乳房内、膣内、子宮内、皮内、経皮、直腸等）を含む既知の経路を介して投与することができる。医薬組成物は、たとえば、鼻粘膜または呼吸粘膜への投与（たとえば、スプレー剤またはエアロゾルによる）等によって、粘膜表面に投与することができる。医薬組成物はまた、持続放出または遅延放出を介して投与することができる。

したがって、医薬組成物は、液剤、懸濁剤、乳濁剤、スプレー剤、エアロゾル、または任意の形態の混合物を含むがこれらに限定されない、任意の適切な形態で提供することができる。医薬組成物は、任意の薬学的に許容される賦形剤、担体、または媒体を含む製剤で送達することができる。たとえば、製剤は、たとえば、クリーム、軟膏、エアロゾル製剤、非エアロゾルスプレー、ゲル、ローション等の従来の局所剤形で送達することができる。製剤は、たとえば、アジュバント、皮膚浸透促進剤、着色剤、香料、香味剤、保湿剤、増粘剤等を含む一つまたは複数の添加剤をさらに含んでもよい。

製剤は、単位剤形で便利に提示することができ、薬局の分野で周知の方法によって調製することができる。薬学的に許容される担体を含む組成物を調製する方法は、ＰＥＰおよび／またはエクソソームを一つまたは複数の補助成分を構成する担体と結合させる工程を含む。一般に、製剤は、活性化合物を液体担体、細かく分割された固体担体、またはその両方と均一におよび／または密接に結合させ、次いで、必要に応じて、生成物を所望の製剤に成形することによって調製することができる。

投与されるＰＥＰおよび／またはエクソソームの量は、投与されるＰＥＰおよび／またはエクソソームの含有量および／または供給源、対象の体重、体調、および／または年齢、および／または投与経路を含むがこれらに限定されない様々な要因に応じて変化しうる。したがって、所与の単位剤形に含まれるＰＥＰおよび／またはエクソソームの絶対重量は、大きく変動する可能性があり、対象の種、年齢、体重および体調、および／または投与方法等の要因に依存する。したがって、すべての可能な用途に有効なＰＥＰおよび／またはエクソソームの量を構成する量を一般的に説明することは実用的ではない。しかしながら、当業者は、そのような要因を十分に考慮して、適切な量を容易に決定することができる。

一部の実施形態では、方法は、たとえば、約０．０１％溶液から１００％溶液までの用量を対象に提供するのに十分なＰＥＰおよび／またはエクソソームを投与することを含むことができるが、一部の実施形態では、方法は、この範囲外の用量のＰＥＰおよび／またはエクソソームを投与することによって実施することができる。本明細書で使用される場合、ＰＥＰの１００％溶液は、１ｍｌの液体担体（たとえば、水、リン酸緩衝生理食塩水、無血清培地等）に可溶化されたＰＥＰを指す。比較のために、０．０１％ＰＥＰの用量は、標準的な細胞馴化培地を使用してｉｎｖｉｔｒｏで細胞からエクソソームを単離する等の従来の方法を使用して調製されたエクソソームの標準用量とほぼ同等である。

したがって、一部の実施形態では、方法は、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２５％、少なくとも０．５％、少なくとも１．０％、少なくとも２．０％、少なくとも３．０％、少なくとも４．０％、少なくとも５．０％、少なくとも６．０％、少なくとも７．０％、少なくとも８．０％、少なくとも９．０％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％の最小用量を提供するのに十分なＰＥＰおよび／またはエクソソームを投与することを含んでもよい。

一部の実施形態では、方法は、１００％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、９．０％以下、８．０％以下、７．０％以下、６．０％以下、５．０％以下、４．０％以下、３．０％以下、２．０％以下、１．０％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、または０．１％以下の最大用量を提供するのに十分なＰＥＰおよび／またはエクソソームを投与することを含んでもよい。

一部の実施形態では、方法は、上記で同定された任意の最小用量、および最小用量よりも大きい任意の最大用量によって定義されるエンドポイントを有する範囲によって特徴付けられる用量を提供するのに十分なＰＥＰおよび／またはエクソソームを投与することを含んでもよい。たとえば、一部の実施形態では、方法は、たとえば５％～２０％の用量等、１％～５０％の用量を提供するのに十分なＰＥＰおよび／またはエクソソームを投与することを含んでもよい。特定の実施形態では、方法は、上記の任意の最小用量、または任意の最大用量に等しい用量を提供するのに十分なＰＥＰおよび／またはエクソソームを投与することを含んでもよい。したがって、たとえば、方法は、０．０５％、０．２５％、１．０％、２．０％、５．０％、２０％、２５％、５０％、８０％、または１００％の用量を投与することを含んでもよい。

一部の実施形態では、ＰＥＰおよび／またはエクソソームは、たとえば、週に単回投与から複数回投与まで投与することができるが、一部の実施形態では、方法は、この範囲外の頻度でＰＥＰおよび／またはエクソソームを投与することによって実施することができる。一定期間内に複数回投与する場合、各投与量は同じでも異なっていてもよい。たとえば、１日１ｍｇの用量は、１ｍｇの単回投与、０．５ｍｇの２回の投与として、または０．７５ｍｇの第一の投与およびそれに続く０．２５ｍｇの第二の投与として投与することができる。また、一定期間内に複数回投与する場合は、投与間隔が同じでも異なっていてもよい。

特定の実施形態では、ＰＥＰおよび／またはエクソソームは、用途に応じて、１回限りの投与から、または１ヶ月に１回から、１日に１回から、１日に複数回まで投与することができる。たとえば、ＰＥＰおよび／またはエクソソームは、急性心筋梗塞の１回限りの治療として投与することができる。他の実施形態では、ＰＥＰ－エクソソームは、創傷治癒または美容的使用のために、１日に複数回投与することができる。

一部の実施形態では、方法は、様々な細胞型から調製されるエクソソームおよび／またはＰＥＰの混合物を投与することを含んでもよく、各細胞型は、固有の抗ウイルスタンパク質プロファイルを有する。このようにして、エクソソームおよび／またはＰＥＰ組成物は、エクソソームおよび／またはＰＥＰ組成物が単一の細胞型から調製される場合よりも、より広い範囲の抗ウイルス活性を提供することができる。

ＰＥＰの調製
ＰＥＰの調製物は、以前に記載されたように調製された（国際公開番号ＷＯ２０１９／１１８８１７Ａ１；米国特許第１０，５９６，１２３Ｂ２号；米国特許出願公開第ＵＳ２０１６／０３２４７９４Ａ１号）。

ウエスタンブロット分析
ＰＥＰおよび他の細胞株ペレットを、５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＦ、５０ｍｍｏｌ／Ｌのピロリン酸ナトリウム、５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、５ｍｍｏｌのＥＧＴＡ、２ｍｍｏｌ／ＬのＮａ₃ＶＯ₄、１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＰＭＳＦ、１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン（ｐＨ７．４）。を含む溶解緩衝液で再構成した。可溶性タンパク質抽出物（試料あたり２０μｇ）を１２．５％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ハーキュリーズ）にロードした。次に、ゲルをフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。様々な抗原に対する一次抗体を一晩インキュベートし、続いて適切な二次抗体で１時間プローブし、増強された化学発光を使用して視覚化した。

ＰＥＰのＮＡＮＯＳＩＧＨＴ解析
ＰＥＰエクソソームの大きさおよび数は、ＮＡＮＯＳＩＧＨＴ３００粒子アナライザー（ＭａｌｖｅｒｎＰａｎａｌｙｔｉｃａｌＬｔｄ．、ソールズベリー、英国）を使用して分析した。ＰＥＰを５ｍｌの水で再構成して、２０％のＰＥＰ溶液を得た。これを分析前にさらに１：１０００に希釈した。各試料を３回分析し、平均を取った。

生細胞イメージングおよびアポトーシスの検出
細胞のリアルタイムイメージングは、ＩＮＣＵＣＹＴＥＳ３イメージングシステム（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、ミシガン州アナーバー）を製造元の指示に従って使用して実行した。カスパーゼ３／７色素試薬は、製造元のガイドライン（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、ミシガン州アナーバー）に従って使用した。

ＸＥＮＯＧＥＮ研究のためのＰＥＰのＤｉＲ標識
ＸＥＮＯＧＥＮ（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ホプキントン）の画像分析では、ＰＥＰは、製造元のガイドラインに従って、遠赤色色素ＤｉＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォルサム）で標識した。近赤外蛍光性の親油性カルボシアニンＤｉＯＣ₁₈（７）（「ＤｉＲ」）は、水中では弱い蛍光を発するが、膜に組み込むと非常に蛍光性が高く、非常に光安定性である。ＰＥＰをｄＨ₂Ｏで再構成し、０．２０μｍフィルターでろ過した。ローテーター上で室温で３０分間ＤｉＲ色素とインキュベートした後、ＰＥＰ－ＤｉＲ溶液を温度制御されたカウンタートップ小型遠心分離機で最高速度（１４，８００ｒｐｍ）で３０分間遠心沈殿し、ｄＨ₂Ｏで１回洗浄した。

フローサイトメトリー
細胞を回収し、ＰＢＳおよびＦＡＣＳバッファー（１．８％ＢＳＡ、１ｍｍＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で洗浄した。フローサイトメトリー分析の前に、細胞を１００μｌのバッファーに再懸濁し、２％パラホルムアルデヒドで固定した。

前述の記載および後続の特許請求の範囲において、「および／または」という用語は、リストされた要素の１つまたはすべて、またはリストされた要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語、およびそれらの変形は、オープンエンドとして解釈されるべきである。すなわち、追加の要素または工程は任意選択であり、存在する場合も存在しない場合もある。特に明記されていない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「少なくとも１つ」は互換的に使用され、一つまたは複数を意味する。そして、エンドポイントによる数値範囲の表記は、その範囲内に含まれるすべての数値を含む（たとえば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。

前述の記載では、明確にするために、特定の実施形態を単独で説明することができる。特定の実施形態の特徴が別の実施形態の特徴と互換性がないことが明示的に特定されない限り、特定の実施形態は、一つまたは複数の実施形態に関連して本明細書に記載される互換性のある特徴の組み合わせを含んでもよい。

別々の工程を含む本明細書に開示される任意の方法について、工程は、任意の実行可能な順序で実施することができる。そして、必要に応じて、２つ以上の工程の任意の組み合わせを同時に実施することができる。

本明細書で引用される、すべての特許、特許出願、刊行物、および電子的に入手可能な資料の完全な開示（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑでのヌクレオチド配列の提出、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢ等でのアミノ酸配列の提出、およびＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑの注釈付きコーディング領域からの翻訳を含む）は、参照によりその全体が組み込まれる。本出願の開示と、参照により本明細書に組み込まれる任意の文書の開示との間に矛盾が存在する場合、本出願の開示が優先するものとする。前述の詳細な説明および実施例は、理解を明確にするためにのみ提供されている。それらから不必要な制限を理解する必要はない。本発明は、示され、記載されている正確な詳細に限定されない。当業者に明らかな変形は、特許請求の範囲によって定義される本発明に含まれるであろう。

特に明記しない限り、明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量等を表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって改変されるものとして理解されるべきである。したがって、反対に別段の指示がない限り、明細書および特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化しうる近似値である。少なくとも、均等物を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくともレポートされた有効桁数に照らして、通常の丸め手法を適用することによって解釈されるべきである。

本発明の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示される数値は可能な限り正確にレポートされる。しかしながら、すべての数値は、それぞれの試験計測で見出された標準偏差から必然的に生じる範囲を本質的に含む。

すべての見出しは読者の便宜のためのものであり、特に明記されていない限り、見出しに続くテキストの意味を制限するために使用されるべきではない。

Claims

酸化ストレスによって引き起こされる組織損傷を有するリスクのある対象において、酸化ストレスによって引き起こされる組織損傷を治療する方法であって、
組成物が投与されていない対象と比較して、組織損傷の可能性または重症度を軽減するのに有効な量の少なくとも一つの抗酸化タンパク質を含むエクソソームおよび／または精製エクソソーム産物（ＰＥＰ）を含む組成物を該対象に投与する工程
を含む方法。
酸化ストレスによって引き起こされる状態を有するリスクのある対象において、酸化ストレスによって引き起こされる状態を治療する方法であって、
組成物が投与されていない該対象と比較して、
該対象が酸化ストレスによって引き起こされる該状態の症状または臨床徴候を経験する可能性を低減する、または
酸化ストレスによって引き起こされる該状態の症状または臨床的兆候の重症度を軽減するのに
有効な量の少なくとも一つの抗酸化タンパク質を含むエクソソームおよび／またはＰＥＰを含む組成物を該対象に投与する工程
を含む方法。
酸化ストレスによって引き起こされる組織損傷を有する対象において、酸化ストレスによって引き起こされる組織損傷を治療する方法であって、
組成物が投与されていない対象と比較して、組織損傷の重症度を軽減するのに有効な量の少なくとも一つの抗酸化タンパク質を含むエクソソームおよび／またはＰＥＰを含む組成物を該対象に投与する工程
を含む方法。
酸化ストレスによって引き起こされる状態を有する対象において、酸化ストレスによって引き起こされる状態を治療する方法であって、
組成物が投与されていない対象と比較して、酸化ストレスによって引き起こされる該状態の症状または臨床徴候の重症度を軽減するのに有効な量の少なくとも一つの抗酸化タンパク質を含むエクソソームおよび／またはＰＥＰを含む組成物を該対象に投与する工程
を含む方法。
前記抗酸化タンパク質は、カタラーゼ、ヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ－１）、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）、Ｍｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ２）、または細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記エクソソームおよび／またはＰＥＰは、カタラーゼ、ヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ－１）、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）、Ｍｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ２）、および細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記エクソソームおよび／またはＰＥＰは、酸化的ストレスを受けている組織の細胞におけるアポトーシスを減少させるのに有効な量で提供される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
ウイルス感染を有するリスクがある対象を治療する方法であって、
組成物が投与されていない対象と比較して、該対象がウイルス感染の症状または臨床徴候を経験する可能性を低減するのに有効な量の少なくとも一つの抗ウイルスタンパク質を含むエクソソームおよび／またはＰＥＰを含む組成物を該対象に投与する工程
を含む方法。
ウイルス感染を有する対象を治療する方法であって、
組成物が投与されていない対象と比較して、ウイルス感染によって引き起こされる状態の症状または臨床徴候の重症度を軽減するのに有効な量の少なくとも一つの抗ウイルスタンパク質を含むエクソソームおよび／またはＰＥＰを含む組成物を該対象に投与する工程
を含む方法。
前記エクソソームおよび／またはＰＥＰは、インターフェロン誘導性膜貫通タンパク質－１（ＩＦＩＴＭ－１）、ＩＦＩＴＭ－３、ＭＸ１、またはｖｉｐｅｒｉｎを含む、請求項８または９に記載の方法。