ES2937145T3 - Azelastina como tratamiento antiviral - Google Patents

Abstract

Un compuesto de azelastina en una cantidad eficaz antiviral para usar como sustancia antiviral en una preparación farmacéutica para usar en el tratamiento profiláctico o terapéutico de un sujeto que necesita tratamiento antiviral. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Azelastina como tratamiento antiviral

Campo de la invención

La presente invención se refiere a novedosos usos de un compuesto de fármaco antihistamínico para tratar infecciones virales, particularmente métodos y compuestos para tratar infecciones por Coronaviridae (p. ej., virus SARS o virus MERS), infecciones por adenovirus, infecciones virales respiratorias sincitiales humanas e infecciones por influenza.

Antecedentes de la invención

Los coronavirus son virus de ARN monocatenario, de aproximadamente 120 nanómetros de diámetro. Son propensos a la mutación y la recombinación y, por lo tanto, son muy diversos. Hay aproximadamente 40 variedades diferentes e infectan principalmente a mamíferos y aves humanos y no humanos. Residen en murciélagos y aves silvestres, y pueden propagarse a otros animales y, por lo tanto, a los humanos.

Hay cuatro géneros principales (coronavirus alfa, beta, gamma y delta) basados en su estructura genómica. Los coronavirus alfa y beta infectan solo a los mamíferos y usualmente causan síntomas respiratorios en humanos y gastroenteritis en otros animales. Hasta diciembre de 2019, solo se sabía que seis coronavirus diferentes infectaban a los humanos. Cuatro de estos (HCoV-NL63, HCoV-229E, HCoV-OC43 y HKU1) usualmente causaron síntomas leves de tipo resfriado común en personas inmunocompetentes y los otros dos han causado pandemias en las últimas dos décadas. En 2002-2003, el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) provocó una epidemia de SARS que resultó en una mortalidad del 10%. De manera similar, el coronavirus causante del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) provocó una pandemia en 2012 con una tasa de mortalidad del 37 %.

A fines de 2019 y principios de 2020, se descubrió que un nuevo coronavirus, el SARS-coronavirus 2 (SARS-CoV-2), que está estrechamente relacionado con el SARS-CoV, es la causa de un brote grande y de rápida propagación de enfermedades respiratorias, que incluyen neumonía. Desde que se reconoció el nuevo coronavirus, la enfermedad que causó se denominó enfermedad por coronavirus 2019 (CoVID-19).

Los coronavirus relacionados con el SARS están cubiertos por proteínas de espícula que contienen un dominio de unión al receptor variable (RBD). Este RBD se une al receptor de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE-2) que se encuentra en el corazón, los pulmones, los riñones y el tracto gastrointestinal, lo que facilita la entrada del virus en las células diana.

La cepa del virus original que se propagó desde Wuhan se considera el virus "de tipo salvaje", que pronto dio lugar a variantes, es decir, mutantes que evolucionaron a través de la selección natural basada en una mayor infectividad. A principios de marzo de 2020, se identificó en Europa una variante con la mutación D614G en la proteína de espícula (variante B.1), que pronto reemplazó a la cepa original de Wuhan en todo el mundo. Posteriormente, se identificaron las variantes B.1.1.7 (también conocida como 20I/501Y.V1, VOC 202012/01) y B.1.351 (también conocida como 20H/501Y.V2) del SARS-CoV-2 en el Reino Unido y Sur África, respectivamente, y desde entonces se han extendido a muchos países. Estas variantes albergan diversas mutaciones en el gen que codifica la proteína de espícula. Uno de ellos está en el dominio de unión al receptor (RBD que se une a ACE2 humana) en la posición 501, donde el aminoácido asparagina (N) ha sido reemplazado por tirosina (Y) (mutación N501Y). La variante B.1.1.7 también tiene varias otras mutaciones, que incluyen: deleción 69/70 y probablemente conduce a un cambio conformacional en la proteína de pico y P681H, cerca del sitio de escisión de furina S1/S2. La combinación de estas mutaciones conduce a una mayor unión al receptor, una propagación más eficiente y un mayor potencial de causar enfermedades en comparación con la versión original que surgió en Wuhan en China en 2019. La variante B.1.351 tiene además del N501Y, también las mutaciones E484K y K417N, pero no la deleción 69/70. Varias líneas de evidencia sugieren que esta variante surgió debido a la presión inmunitaria, es decir, como un escape de la respuesta inmunitaria humana resultante de una infección natural, o una terapia inmunitaria pasiva o una inmunización activa con diferentes vacunas. La mutación E484K parece ser la responsable de la reducción de la eficacia de la vacuna. Esta mutación (junto con otras 16 mutaciones N501Y y K417T) también se detectó en la variante brasileña, designada como P.1. La variante P.1. causó una infección generalizada en Brasil y luego se detectó a nivel mundial. Se sospecha que este mutante causa una enfermedad más grave en personas más jóvenes, conduce a una mayor mortalidad y evade la respuesta inmunitaria inducida por la variante anterior y algunas de las vacunas.

El mutante B.1.617 se detectó y propagó por primera vez en la India. Tiene 13 mutaciones de las 3 que son motivo de preocupación con respecto a la evasión inmune: E484Q, L452R y P681R. El linaje B.1.618 se convirtió en uno de los mutantes dominantes en Bengala Occidental, lleva la deleción de dos aminoácidos (H146del y Y145del), así como las mutaciones E484K y D614G en la proteína de espícula. Se especula que posee una mayor infectividad y representa una amenaza para evadir la inmunidad natural o inducida por vacunas.

Es muy probable que la vacunación generalizada induzca la aparición de variantes adicionales con una combinación diferente de las mutaciones nuevas y conocidas actualmente.

La vacunación global acelerada junto con la intensa propagación simultánea del virus plantea una enorme presión evolutiva para la aparición de mutantes de escape. Todas las vacunas, casi exclusivamente, se basan en desencadenar una respuesta inmunitaria contra la proteína de espícula. Además, de acuerdo con el punto de vista actual, se considera que una respuesta inmunitaria neutralizante contra el dominio de unión al receptor de la proteína de espícula es el principal contribuyente a la protección. Con base a estos dos hechos, entre las variantes de virus emergentes de forma natural se seleccionarán aquellas que expresen proteínas de espícula mutadas que proporcionen una ventaja selectiva (mayor unión al receptor y/o evasión de la respuesta inmune neutralizante). Las variantes posteriores pueden acumular varias mutaciones sucesivas, con mayor virulencia/transmisibilidad general y/o con una mayor probabilidad de evasión inmunitaria. Se prevé que, además de las mencionadas anteriormente, surgirán nuevas variantes de virus adicionales con la posible necesidad de vacunas de segunda generación para una protección óptima contra ellas.

Por lo tanto, los compuestos antivirales activos contra la variante UK (B1.1.7) ahora dominante y la variante SA (B.1.351), así como contra otras variantes emergentes que están asociadas con una protección inducida por la vacuna muy reducida, son muy relevantes, tanto para la prevención como para el tratamiento.

Los adenovirus son virus grandes sin envoltura con un genoma de ADN de doble cadena. La familia Adenoviridae contiene seis géneros con una amplia especificidad de huésped de los virus. Las siete familias de adenovirus humanos (A a G) pertenecen al género Mastadenovirus. Actualmente, los virus humanos se clasifican en 88 (sero)tipos diferentes, que son responsables de causar diversas infecciones de las mucosas. Los tipos dentro de las familias B (HAdV-B) y C (HAdV-C) son responsables de infecciones del tracto respiratorio superior, los tipos HAdV-F (principalmente tipos 40 y 41) y HAdV-G (principalmente tipo 52) causan gastroenteritis. La conjuntivitis se asocia con HAdV-B y HAdV-D. Estas infecciones de las mucosas suelen ser autolimitadas, pero pueden ser más graves en un huésped inmunocomprometido. El adenovirus serotipo 14 es un patógeno emergente que provoca brotes de infecciones respiratorias graves que pueden ser letales incluso en huéspedes inmunocompetentes.

Los adenovirus exhiben una cápside icosaédrica clásica formada por 240 hexones y 12 pentones. Las bases de pentón están asociadas con fibras sobresalientes que se unen a los receptores de la célula huésped: CD46 (familia B) y receptor de coxsackie/adenovirus (CAR, para todas las demás familias). A esta unión inicial le sigue la interacción de las estructuras víricas de base pentónica con las integrinas aV, lo que estimula la endocitosis de las partículas víricas. Intracelularmente, la cápside se desestabiliza, el endosoma se degrada y el ADN viral ingresa al núcleo a través del poro nuclear. Después de asociarse con las proteínas histonas, la maquinaria de transcripción del huésped se utiliza para la expresión de genes virales sin la integración del genoma viral en el genoma del huésped. Las proteínas virales se expresan de forma temprana (principalmente proteínas reguladoras) y tardía (proteínas estructurales) separadas por la replicación del genoma. Finalmente, los genomas virales se empaquetan en la cubierta de proteína y se liberan de la célula huésped mediante un procedimiento de lisis inducida por el virus.

Los adenovirus son relativamente resistentes a los desinfectantes y detergentes (no encapsulados) y sobreviven mucho tiempo en las superficies y en el agua. No existen fármacos antivirales comprobados para tratar las infecciones adenovirales, por lo que el tratamiento se dirige principalmente a los síntomas. Actualmente, no existe una vacuna de adenovirus disponible para el público en general, pero el ejército de los EE. UU. utilizó una vacuna para los tipos 4 y 7. Recientemente, los adenovirus modificados genéticamente se utilizaron con éxito en la terapia génica y como vectores virales para la administración de antígenos de vacunas heterólogas (Ebola y COVID-19).

El virus sincitial respiratorio humano (hRSV) es un virus envuelto con un genoma de ARN monocatenario de sentido negativo. El genoma es lineal y tiene 10 genes que codifican para 11 proteínas. RSV se divide en dos subtipos antigénicos, A y B, con 16 y 22 clados (o cepas), respectivamente.

El RSV es altamente contagioso y puede causar brotes tanto por transmisión comunitaria como hospitalaria. Cada año, aproximadamente 30 millones de enfermedades respiratorias agudas y más de 60,000 muertes infantiles son causadas por el RSV en todo el mundo. La transmisión se produce a través de gotitas de aerosol contaminadas que entran en contacto con las superficies mucosas de la nariz, la boca o los ojos. A la infección de las células ciliadas de las vías respiratorias superiores le sigue la propagación a las vías respiratorias inferiores. Se encuentra entre las infecciones infantiles más comunes de diversa gravedad, que van desde una infección leve del tracto respiratorio superior hasta la bronquiolitis y la neumonía viral, que en los casos más graves puede requerir ventilación mecánica. Las personas inmunocomprometidas (incluidos los bebés prematuros) tienen un mayor riesgo de desarrollar enfermedades más graves. Las opciones terapéuticas por lo general se limitan a la atención de apoyo, aunque la ribavirina ha sido aprobada para infecciones por RSV en niños. Las vacunas no están disponibles (a pesar de los importantes esfuerzos de desarrollo), sin embargo, la inmunización pasiva con anticuerpos monoclonales (palivizumab) está disponible como una opción para la profilaxis.

La influenza, comúnmente llamada "gripe", es una enfermedad infecciosa causada por los virus de la influenza. En cada estación (meses de invierno en el hemisferio norte) 5-15% de la población contrae influenza, con aprox. 3-5 millones de casos graves. Cada año se producen más de medio millón de muertes entre los grupos de alto riesgo, incluidos los niños pequeños, los ancianos y las personas con enfermedades crónicas. Después de un período de incubación de 1 a 4 días, la aparición de los síntomas es repentina e incluye fiebre, escalofríos, dolores de cabeza, dolores musculares, pérdida de apetito, fatiga y confusión. La neumonía puede ser causada por una infección viral primaria o por una infección bacteriana secundaria, como por el neumococo o S. aureus. La transmisión de la influenza está mediada por gotitas de aerosol. El sitio de infección primaria son las vías respiratorias superiores, seguido de la progresión a las vías respiratorias inferiores y la infección invasiva.

Hay cuatro tipos (especies) de virus de influenza: A, B, C y D. Las epidemias estacionales (es decir, la temporada de gripe) son causadas por los virus de influenza humana A (IAV) y B (IBV), mientras que C y D rara vez se asocian con Infecciones sintomáticas en humanos. Los virus de influenza A se dividen en subtipos con base en dos proteínas en la superficie del virus: hemaglutinina (H) y neuraminidasa (N). Aunque existen potencialmente 198 combinaciones diferentes de subtipos de influenza A, actualmente los tipos H1N1 y H3N2 circulan en todo el mundo. Los virus de la influenza B no se dividen en subtipos, sino que se clasifican en dos linajes: B/Yamagata y B/Victoria. Con base en esto, las vacunas contra la gripe estacional usualmente contienen dos cepas A (una H1N1 y una H3N2) y una o dos cepas B en combinación. Los virus de la influenza tienen un genoma de ARN monocatenario de sentido negativo que está segmentado. Tanto el IAV como el IBV contienen 8 segmentos, que podrían combinarse con el genoma de otros virus de la gripe tras la coinfección de la misma célula. Este proceso (llamado reselección) da lugar a una progenie con una composición de antígeno viral significativamente alterada. Estas variantes de virus reordenadas son novedosas para la población humana y pueden dar lugar a pandemias (p. ej., la gripe española en 1918, H1N1). La reselección también puede ocurrir entre virus específicos de diferentes huéspedes. Por ejemplo, la pandemia de "gripe porcina" en 2009 fue causada por un virus triple reordenado que presentaba una combinación de secuencias virales específicas de cerdos, aves y humanos (H1N1). De manera similar, las cepas de influenza aviar, que son comunes en las aves acuáticas salvajes ocasionalmente infectan a los humanos ("gripe aviar o aviar", H5N1). Tras la reselección de tales virus aviares con virus de influenza humana, puede dar lugar a variantes que permiten la propagación de persona a persona y, por lo tanto, tienen el potencial de causar pandemias mundiales.

La terapia de los individuos de los grupos de menor riesgo se centra principalmente en el tratamiento sintomático (fiebre) y el aislamiento. Los pacientes que padecen una enfermedad clínica grave o progresiva asociada con una infección por el virus de la influenza sospechada o confirmada se tratan con medicamentos antivirales (p. ej., oseltamivir u otros inhibidores de la neuraminidasa) y terapia de apoyo (p. ej., medicamentos antiinflamatorios). Los grupos de alto riesgo (ancianos, embarazadas, inmunocomprometidos, enfermedades crónicas asociadas) deben recibir vacunas anuales contra la gripe estacional como profilaxis.

La Azelastina, un derivado de la ftalazina, es un antihistamínico disponible como aerosol intranasal para el tratamiento de la rinitis alérgica y vasomotora y como solución oftálmica para el tratamiento de la conjuntivitis alérgica. Es una mezcla racémica, aunque no se observa ninguna diferencia en la actividad farmacológica entre los enantiómeros, y recibió la aprobación de la FDA por primera vez en 1996.

Gysi et al. ("Network Medicine Framework for Identifying Drug Repurposing Opportunities for COVID-19", arXiv:2004.07229 [q-bio.MN] con fecha de 15.04.2020) describe un conjunto de herramientas basado en la red para COVID-19 para llegar a ciertos candidatos a fármacos con base en su eficacia probable para los pacientes con COVID-19, entre ellos Azelastine, pero sin ninguna indicación de si el antihistamínico tendría un impacto directo en el virus subyacente a la enfermedad.

Hasanain Abdulhameed Odhar et al. (Bioinformation 2020, 16(3):236-244) describen el acoplamiento molecular y la simulación dinámica de medicamentos aprobados por la FDA con la proteasa principal del nuevo coronavirus de 2019. Los fármacos se clasificaron de acuerdo con su actividad de unión mínima al cristal de proteasa principal de 2019-nCoV, y Azelastine se clasificó como menos preferido que Conivaptan.

Xia Xiao et al. (bioRxiv 6 de julio de 2020, DOI:10.1101/2020.07.06.188953) describen la actividad antiviral de una serie de compuestos frente a OC43, entre ellos Azelastine como antihistamínico.

Fu et al. (Cell Prolif. 2014, 47:326-335) describen el clorhidrato de Azelastina dirigido al polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio (NTCP) en la terapia del virus de la hepatitis B (VHB). NTCP es una proteína transmembrana altamente expresada en hepatocitos humanos que media el transporte de ácidos biliares, lo que desempeña un papel clave en la entrada del VHB en los hepatocitos.

M. W. Simon (Pediatric Asthma, Allergy & Immunology, 2003, Vol.16:275-282) describe la Azelastina como un potente y selectivo antagonista del receptor Hi de la histamina de segunda generación que subregula la expresión del receptor de la molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1), que desempeña un papel importante en el rinovirus humano, los virus Coxsackie tipo A, el adenovirus tipo 5, virus de la parainfluenza humana tipo 2 y 3, y adhesión a la mucosa del virus sincitial respiratorio, así como la movilización de células efectoras inmunitarias.

Sumario de la invención

El objetivo de la presente invención es proporcionar nuevos tratamientos antivirales, medicamentos y productos farmacéuticos que puedan usarse para prevenir la infección por virus y/o la propagación del virus, en particular en sujetos que han estado expuestos o infectados con un virus, o que están en riesgo de ser infectados. El objetivo se resuelve mediante el objeto de las presentes reivindicaciones y como se describe más adelante en este documento. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

La invención proporciona un compuesto de Azelastina en una cantidad eficaz antiviral de 0.1 - 500 pg por dosis, para uso como sustancia antiviral en una preparación farmacéutica para uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de un sujeto que necesita tratamiento anti-SARS-CoV-2.

Específicamente, el compuesto de Azelastina es Azelastina, o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, tal como clorhidrato de Azelastina.

De acuerdo con un aspecto específico, la preparación farmacéutica es un producto medicinal o un fármaco. Específicamente, la preparación farmacéutica comprende el compuesto de Azelastina y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Específicamente, el objeto es la necesidad de un tratamiento antiviral dirigido al SARS-CoV-2.

El virus objetivo SARS-CoV-2 es un virus respiratorio que se entiende aquí específicamente como un virus que causa una enfermedad respiratoria. Aunque el virus diana descrito adicionalmente en el presente documento puede no sólo causar una enfermedad respiratoria, sino también afectar a otras partes del cuerpo, dicho virus todavía se entiende en el presente documento como un "virus respiratorio".

Específicamente, se trata una condición de enfermedad causada por o asociada con una infección por SARS-CoV-2. Específicamente, el tratamiento antiviral se dirige adicionalmente a uno o más virus humanos, en particular un virus respiratorio humano, ta como los seleccionados de las familias de virus Coronaviridae, Adenoviridae, Paramyxoviridae u Orthomyxoviridae.

Específicamente, se trata una condición de enfermedad causada por o asociada con una infección por SARS-CoV-2, y uno o más de:

a) Virus Coronaviridae, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en un p-coronavirus, tal como el SARS-CoV-2, MERS-CoV, SARS-CoV-1, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, y un a-coronavirus, como como HCoV-NL63, HCoV-229E o PEDV, incluidas variantes naturales o mutantes de cualquiera de los anteriores, o b) Adenoviridae, preferiblemente Adenovirus humanos, tales como HAdVB, HAdVC o HAdVD;

c) virus respiratorios sincitiales humanos (RSV), tales como RSV subtipo A o B; o

d) virus de la influenza, tal como los virus de la influenza humana, preferiblemente el virus de la influenza A (IVA), tal como el H1N1, H3N3 o H5N1, o el virus de la influenza B (IVB), o el virus de la influenza C (IVC), o el virus de la influenza D (iVD).

Específicamente, se trata una condición de enfermedad causada por o asociada con una infección por SARS-CoV-2 y uno o más virus Coronaviridae diferentes.

De acuerdo con un aspecto específico, tales virus Coronaviridae se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en un p-coronavirus, como el SARS-CoV-2, MERS-CoV, SARS-CoV-1, HCoV-OC43, o HCoV-HKU1, o un acoronavirus, tal como Humane Coronavirus NL63 (HCoV-NL63, New Haven coronavirus), HCoV-229E o el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), incluidas las variantes o mutantes de origen natural de cualquiera de los anteriores. Específicamente, dichos uno o más virus Coronaviridae a los que se hace referencia en el presente documento son variantes o mutantes del SARS-CoV-2 de origen natural, en particular aquellos que comprenden una o más mutaciones de la proteína de espícula (proteína S del SARS-CoV-2), tal como una cualquiera o más de las siguientes mutaciones: K417N, L452R, N501Y, D614G, P681H, P681R, E484K, E484Q o deleción 69/70.

Específicamente, la proteína de espícula comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 4 (secuencia proporcionada en la Fig. 5, número de acceso de NCBI QII57161.1, SARS-CoV-2, proteína S). Preferiblemente, dichos uno o más virus Coronaviridae diferentes son variantes o mutantes del SARS-CoV-2 de origen natural seleccionados del grupo que consiste en la variante UK (B1.1.7), la variante de Sudáfrica (B.1.351), la variante brasileña (P. 1), la variante india (B.1.617) y la variante de Bengala (B.1.618).

Las preparaciones, métodos y usos descritos en el presente documento comprenden específicamente un compuesto de azelastina en una cantidad eficaz antiviral. Tal cantidad eficaz antiviral puede dirigirse a un virus específico o más de un virus diferente, mutantes de virus o variantes de virus, tal como se describe más adelante en el presente documento. El virus diana de un efecto antiviral se entiende particularmente como el virus que está (directa o indirectamente) relacionado con la indicación del tratamiento aquí descrito, en particular el tratamiento para la profilaxis o la terapia de una condición de enfermedad o enfermedad causada o asociada de otro modo por dicho diana objetivo.

Específicamente, el objetivo de las preparaciones, métodos y usos descritos en este documento, y en particular el objetivo de un efecto antiviral descrito en este documento, puede ser una o más especies diferentes de virus, mutantes de virus o variantes de virus, p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 especies diferentes de virus, mutantes o variantes.

Específicamente, el objetivo puede ser dos o más virus cualesquiera, siendo uno de ellos el SARS-CoV-2, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 especies diferentes de virus, mutantes de virus o variantes de virus, en donde al menos 2, 3 o 4 de los virus son de diferentes familias de virus, tales como seleccionados de las familias:

a) Coronaviridae (p-coronavirus, tal como SARS-CoV-2, MERS-CoV, SARS-CoV-1, HCoV-OC43, HCoV-HKU1; o a-coronavirus, tal como HCoV-NL63, HCoV-229E o PEDV, incluidas variantes o mutantes de origen natural de cualquiera de los anteriores);

b) adenoviridae (tales como adenovirus o adenovirus humanos, por ejemplo, HAdVB, HAdVC o HAdVD);

c) Paramyxoviridae (tales como RSV o RSV humano, por ejemplo, hRSV subtipo A o B); o

d) Orthomyxoviridae (tales como virus de influenza o virus de influenza humana, preferiblemente virus de influenza A (IVA), como H1N1, H3N3 o H5N1, o virus de influenza B (IVB), o virus de influenza C (IVC) o virus de influenza D (DIV)).

Específicamente, tales virus enumerados en a) a d) anteriormente se denominan aquí "virus respiratorios" de ejemplo.

De acuerdo con un ejemplo específico, el objetivo puede ser el SARS-CoV-2 y se selecciona al menos un virus de a), y se selecciona al menos un virus de b), c) o d). Específicamente, el objetivo puede ser el SARS-CoV-2 y al menos un virus de la influenza.

Específicamente, el objetivo puede ser SARS-CoV-2 y al menos un adenovirus HAdVB, HAdVC o HAdVD.

Específicamente, el objetivo puede ser al menos el SARS-CoV-2 y al menos un subtipo A o B de hRSV.

De acuerdo con un ejemplo específico, el objetivo puede ser al menos un virus seleccionado de a) y al menos un virus seleccionado de b), y opcionalmente al menos un virus seleccionado de c), o d). Específicamente, el objetivo puede ser al menos el SARS-CoV-2 y al menos un virus de la influenza y, opcionalmente, al menos un adenovirus HAdVB, HAdVC o HAdVD y/o al menos un hRSV subtipo A o B.

La invención proporciona además un compuesto de azelastina (como se describe con más detalle en el presente documento) en una cantidad eficaz antiviral como se describe en el presente documento, para uso como sustancia antiviral en una preparación farmacéutica para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad causada por o asociada con una infección. por SARS-CoV-2 y uno o más virus diferentes que son virus Coronaviridae, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en un p-coronavirus, como SARS-CoV-2, MERS-CoV, SARS-CoV-1, HCoV-OC43, o HCoV-HKU1, o un a-coronavirus, como HCoV-NL63, HCoV-229E o PEDV, incluidas las variantes o mutantes de origen natural de cualquiera de los anteriores, por ejemplo, uno cualquiera o más de las variantes o mutantes del SARS-CoV-2 de origen natural a los que se hace referencia en el presente documento, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en la variante UK (B1.1.7), la variante SA (B.1.351), la variante brasileña (P.1), la variante india (B.1.617) y la variante de Bengala (B.1.618).

Específicamente, la condición de enfermedad asociada con o causada por un virus objetivo, o un virus respiratorio descrito en el presente documento, en particular en donde el virus objetivo es un virus de la familia Coronaviridae, Adenoviridae, Paramyxoviridae u Orthomyxoviridae, es un resfriado común, una infección de la nariz, sinusitis, garganta y laringe, bronquiolitis, diarrea, erupción cutánea o neumonía, síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS).

Específicamente, se trata profiláctica o terapéuticamente una condición de enfermedad que es resfriado común, infección de nariz, sinusitis, garganta y laringe, bronquiolitis, diarrea, erupción en la piel o neumonía, síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS).

Específicamente, una condición de enfermedad puede ser un síntoma asociado con uno cualquiera o más de los anteriores. Específicamente, un síntoma a tratar puede ser tos, dolor de garganta, secreción nasal, estornudos, dolor de cabeza y fiebre.

De acuerdo con un aspecto específico, la cantidad efectiva antiviral es efectiva para prevenir la infección de células susceptibles por el virus, tratando así la condición de la enfermedad. Específicamente, las células susceptibles están dentro o en una superficie biológica o un sujeto.

De acuerdo con un aspecto específico, la cantidad eficaz antiviral es de 0.1 - 500 pg/dosis, preferiblemente por debajo de una cualquiera de 100, 90, 80, 70, 50, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1 o 1 pg/dosis. Específicamente, el número de dosis es de 1 a 10 por día.

De acuerdo con un aspecto específico, la cantidad eficaz antiviral es de 15 pg - 150 pg por dosis, preferiblemente menos de 100 pg o menos de 50 pg.

Específicamente, la cantidad efectiva antiviral puede ser incluso menor, tal como menos que cualquiera de 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1,0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 o 0.1% de la cantidad que oscila entre 15 gg y 150 gg. En particular, se ha demostrado que estas cantidades más bajas son eficaces con coronavirus (o virus de la familia Coronaviridae) y/o virus distintos de los coronavirus (o distintos de los virus de la familia Coronaviridae), como los virus de las familias Adenoviridae, Paramyxoviridae u Orthomyxoviridae.

Por ejemplo, el efecto antiviral dirigido a cualquiera de los virus objetivo descritos en el presente documento ha demostrado ser muy eficaz con una dosis del 0.1 % (es decir, 2.39 mM) y 5 veces reducida (0.02 %, es decir, 478 microM) de una preparación comercial de aerosol nasal de azelastina, lo que reduce la carga viral en humanos.

Por ejemplo, el efecto contra el virus de la influenza ha demostrado ser altamente efectivo a una dilución de 5x (0.02 %, es decir, 478 microM) y dilución de 10x (0.01 %, es decir, 239 microM) de una preparación comercial de azelastina (siendo 0.1 %, 2.39 mM).

Por ejemplo, el efecto anti-RSV ha demostrado ser muy eficaz en un rango de 0.4 a 6.4 microM in vitro.

De acuerdo con un aspecto específico, dicha preparación farmacéutica está formulada para administración local, como para administración tópica o tópica en mucosas, preferiblemente administración en mucosas, preferiblemente para aplicación en el tracto respiratorio superior e inferior, uso nasal, pulmonar, intraoral, ocular o dérmico, o para administración sistémica, preferiblemente por administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, transdérmica u oral. Típicamente, para la administración parenteral, se prefiere la administración intravenosa o peroral.

De acuerdo con un aspecto específico, dicha preparación farmacéutica se administra a un sujeto en forma de aerosol, como un aerosol nasal, un polvo, como un polvo instantáneo o un polvo para inhalación, o mediante un dispositivo sanitario, como por ejemplo, que comprende una superficie o tela impregnada con el compuesto Azelastine para inhalación, un gel, un ungüento, una crema, una espuma o una solución líquida, una loción, una solución para hacer gárgaras, un polvo en aerosol, una formulación líquida en aerosol, gránulos, cápsulas, gotas, tabletas, jarabe, comprimidos para deshacer en la boca, gotas para los ojos o una preparación para infusión o inyección.

Específicamente, se proporcionan formulaciones antivirales y formas de administración, como para uso veterinario y humano. Específicamente, las formulaciones comprenden una cantidad predeterminada del compuesto Azelastine como principio activo; por ejemplo, como polvo o gránulos; como solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite.

De acuerdo con un aspecto específico, el compuesto Azelastine se usa en una cantidad eficaz antiviral para proporcionar una concentración pico (o concentración máxima) en sangre o plasma, que es de aproximadamente 0.01­ 2 gg/mL, o hasta cualquiera de 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 o 0.1 gg/ml

De acuerdo con un aspecto específico, el compuesto de Azelastina se usa en una formulación a una concentración de 1 gM-10 mM, preferiblemente hasta cualquiera de 1 mM, 100 gM, 90 gM, 80 gM, 70 gM, 60 gM o 50 gM. De acuerdo con una realización específica, la concentración es de 3-50 gM.

Específicamente, se usa una solución o dispersión líquida para la administración nasal, como gotas nasales o un aerosol nasal, preferiblemente donde la cantidad efectiva antiviral es de 1 a 1000 gg por fosa nasal, preferiblemente de 1 a 500 gg por fosa nasal, o hasta cualquiera de 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, más preferiblemente hasta 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 gg por fosa nasal.

Específicamente, se puede administrar una dosis por administración nasal que es de aproximadamente 2-2000 gg por dosis, preferiblemente 2-1000 gg por dosis, o hasta cualquiera de 400, 380, 360, 340, 320, 300, 280, 260, 240, 220, más preferiblemente hasta 200, 180, 160, 140, 120, 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 4, 3 o 2 gg por dosis.

Una formulación se aplica preferiblemente como un aerosol nasal, gotas nasales, un aerosol tal como un líquido o polvo aerosolizado, por ejemplo, como un aerosol para la garganta o para administración intrapulmonar, o como gotas para los ojos.

Ejemplos de formulaciones pueden contener el compuesto de Azelastina como principio activo en una cantidad de, por ejemplo, 0.001 a 2 % (p/p), tal como aproximadamente 0.001 %, 0.002 %, 0.003 %, 0.004 %, 0.005 %, 0.006 %, 0.007 %, 0.008 %, 0.009 %, 0.01 %, 0.02 %, 0.05 %, 0.1 %, 0.15 %, 0.2 %, 0.3 %, 0.4 %, 0.5 %, 0.6 %, 0.7 %, 0.8 %, 0.9 %, 1.0 %, 1.1 %, 1.2 %, 1.3 %, 1.4 %, 1.5 %, 1.6 %, 1.7 %, 1.8 %, 1.9 % o 2.0 % (p/p).

Específicamente, se puede aplicar un volumen de 100 - 1000 gL por dosis en una formulación pulverizable, por ejemplo, hasta un volumen de pulverización de 500 gL. De acuerdo con un ejemplo específico, un aerosol nasal puede administrar un volumen de aproximadamente 100-150 gl por aerosol. Por lo general, se aplican dos pulverizaciones por fosa nasal una o dos veces al día.

Cuando se usa un aerosol, se usa preferiblemente un aerosol medido para administrar un cierto volumen de rociado o dosis por bocanada.

Las formulaciones adecuadas para administración intrapulmonar pueden tener un tamaño de partícula en el rango de 0.1 a 500 micras, que pueden administrarse por inhalación a través de las fosas nasales o por inhalación a través de la boca para llegar a los sacos alveolares. Las formulaciones adecuadas incluyen soluciones acuosas u oleosas del compuesto de Azelastina. Las formulaciones adecuadas para la administración en aerosol o en polvo seco se pueden preparar de acuerdo con métodos convencionales y se pueden administrar con otros agentes terapéuticos tales como compuestos usados en el tratamiento o profilaxis de inflamación pulmonar o enfermedades pulmonares.

Específicamente, se usa una solución o dispersión líquida para administración parenteral, como infusiones o inyecciones.

Específicamente, se usa una tableta, gel o comprimido para deshacer en la boca para administración oral.

Específicamente, se puede usar una tableta que comprende el compuesto de Azelastina que se puede administrar de una a tres veces al día.

Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en la boca incluyen comprimidos para deshacer en la boca que comprenden el principio activo en una base aromatizada, como sacarosa, acacia o tragacanto, pastillas que comprenden el compuesto de Azelastina en una base inerte, como gelatina y glicerina, sacarosa o acacia, o enjuagues bucales que comprenden el compuesto de Azelastina en un vehículo líquido adecuado.

Cuando se formulan en un gel o pomada de aplicación tópica, los principios activos pueden emplearse con una base de pomada parafínica o miscible en agua. Alternativamente, los principios activos pueden formularse en una crema con una base de crema de aceite en agua.

Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en el ojo pueden incluir gotas para los ojos, gel o crema, en las que el compuesto de Azelastina se disuelve o suspende en un vehículo adecuado, especialmente un disolvente acuoso o una emulsión de aceite/agua.

De acuerdo con ejemplos específicos, tales formulaciones para administración tópica en la boca, o una formulación de aplicación tópica como un gel o ungüento, pueden comprender el compuesto de Azelastina en una concentración de, por ejemplo, 0.001 a 20% (p/p), tal como aproximadamente 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008%, 0.009%, 0.01%, 0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 9, o 20% (p/p).

De acuerdo con un aspecto específico, el tratamiento con el compuesto de Azelastina se puede combinar con un tratamiento adicional que administra un compuesto de Azelastina (que puede ser el mismo o un compuesto diferente) en otra forma de administración. Por ejemplo, el tratamiento con un aerosol intranasal o para la garganta que comprende clorhidrato de Azelastina se puede combinar con una tableta que comprende un compuesto de Azelastina (que puede ser clorhidrato de Azelastina o diferente del clorhidrato de Azelastina).

De acuerdo con un aspecto específico, el compuesto de Azelastina se administra como la única sustancia antiviral, o en donde el tratamiento se combina con un tratamiento adicional, como un tratamiento antiviral, antiinflamatorio y/o antibiótico adicional, por ejemplo, que comprende la administración de una o más sustancias antivirales. o agentes, y/o una o más sustancias o agentes antiinflamatorios y/o antibióticos, por una o más preparaciones diferentes y/o una o más vías de administración diferentes.

Específicamente, el compuesto de Azelastina se puede combinar con uno o más agentes terapéuticos activos adicionales en una forma de dosificación unitaria para la administración simultánea, conjunta o secuencial a un sujeto. La terapia de combinación puede, por ejemplo, administrarse como un régimen simultáneo, paralelo o secuencial. Cuando se administra secuencialmente, la combinación se puede administrar en dos o más administraciones.

De acuerdo con un aspecto específico, se trata a un sujeto que ha sido infectado o tiene riesgo de serlo por dicho virus, preferiblemente un ser humano, o un mamífero no humano, como perro, gato, caballo, camélidos, bovinos o cerdo.

Específicamente, el sujeto está o ha estado expuesto a un virus, o corre el riesgo de infectarse con el virus.

Específicamente, el sujeto tiene un sistema inmunitario debilitado y tiene un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad viral o una mayor gravedad de la enfermedad viral.

Específicamente, se ha determinado o diagnosticado que el sujeto está infectado con el virus.

En realizaciones específicas, se trata a un sujeto que es un sujeto enfermo o un paciente que padece una enfermedad causada por el virus Coronaviridae, por ejemplo, una enfermedad causada por el virus del SARS, al entrar en contacto con el patógeno, como COVID19, o neumonía asociada a COVID19.

En realizaciones específicas adicionales, se trata a un sujeto que es un sujeto enfermo o un paciente que padece una enfermedad causada por el virus de la influenza, p. ej., influenza.

El compuesto de Azelastina se describe adicionalmente en el presente documento para su uso como sustancia antiviral en un producto medicinal para tratar una superficie biológica para prevenir la infección por virus y/o la propagación del virus.

De acuerdo con un aspecto específico, dicho producto medicinal está formulado para uso tópico, preferiblemente para aplicación en las vías respiratorias superiores e inferiores, uso nasal, pulmonar, intraoral, ocular o dérmico.

La aplicación tópica normalmente se refiere a la superficie de la piel, una herida y/o células o tejidos de la mucosa (por ejemplo, mucosa alveolar, bucal, lingual, masticatoria o nasal, etc.).

De acuerdo con un aspecto específico, dicho producto medicinal se utiliza en una formulación adecuada para la administración tópica, en particular la administración mucosal, tal como un aerosol, una solución, una dispersión, un polvo seco o un líquido o polvo aerosolizado.

De acuerdo con un aspecto específico, el compuesto de Azelastina se aplica a una superficie biológica en una cantidad eficaz antiviral, preferiblemente en donde la cantidad es de 1 ng -1000 ng por cm2, preferiblemente 10 - 800 ng/cm2, o hasta cualquiera de 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50 ng/ cm2.

Cualquiera de los productos medicinales usados adecuadamente para el tratamiento tópico como se describe en este documento puede usarse para tratar la superficie biológica.

De acuerdo con un aspecto concreto, la superficie biológica comprende o consiste en una superficie mucosa que está infectada o en riesgo de estarlo por dicho virus.

No está dentro del alcance de las presentes reivindicaciones el uso de un compuesto de Azelastina descrito más adelante en este documento, como desinfectante viral, en particular adecuado para tratar una superficie biológica o una superficie no biológica, como dispositivos sanitarios, mascarillas, etc. Específicamente, Las superficies animadas o no animadas se pueden tratar usando el desinfectante.

Específicamente, el desinfectante viral es una preparación antiviral, como un producto medicinal.

De acuerdo con un aspecto específico, en el presente documento se describe adicionalmente un compuesto de Azelastina para su uso en la prevención o el tratamiento de una infección viral por Coronaviridae, en particular una infección por el virus SARS-CoV-2, en un mamífero humano o no humano.

De acuerdo con un aspecto específico, se proporciona un kit que comprende una o más unidades de dosificación individuales del compuesto de Azelastina como se describe más adelante en el presente documento, e instrucciones para su uso en el tratamiento de una infección viral por Coronaviridae o una enfermedad causada por el virus de Coronaviridae, en un ser humano o mamífero no humano.

De acuerdo con un aspecto específico, se proporciona una preparación farmacéutica antiviral que comprende el compuesto de Azelastina como se describe más adelante en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Específicamente, la preparación farmacéutica se proporciona para uso médico, en particular, para uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad causada por el virus Coronaviridae tal como COVID19. Específicamente, la preparación farmacéutica se proporciona para uso médico, en particular, para uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad causada por un virus Coronaviridae, opcionalmente y cualquiera de un virus Adenoviridae y/o un virus Paramyxoviridae y/o un virus Orthomyxoviridae.

De acuerdo con un aspecto específico, métodos para tratar a un sujeto infectado o en riesgo de serlo con uno o más virus diferentes tales como uno o más de los virus Coronaviridae y/o virus Adenoviridae y/o virus Paramyxoviridae y/o virus Orthomyxoviridae, que comprenden la administración de una cantidad eficaz antiviral del compuesto de Azelastina y los respectivos productos medicinales o preparaciones farmacéuticas se describen adicionalmente en el presente documento.

De acuerdo con otro aspecto específico, en el presente documento se describe una preparación antiviral del compuesto de Azelastina (tales como un producto medicinal, una preparación farmacéutica o un desinfectante) y métodos para producir dicha preparación antiviral que comprenden formular una cantidad eficaz antiviral del compuesto de Azelastina con un portador farmacéuticamente aceptable para producir una preparación antiviral, en particular un producto medicinal o una preparación farmacéutica.

La administración tópica de cualquiera de las preparaciones antivirales descritas en el presente documento (tales como un producto medicinal, una preparación farmacéutica o un desinfectante) a una superficie biológica es preferiblemente tal que tras un cierto tiempo de contacto de, p.ej., 10 minutos a 24 horas, y/o hasta 24, 18, 12, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 hora(s), el contacto da como resultado una reducción de al menos 0.5 veces (a la mitad), o reducción de 1 log, 2 log, 3 log, 4 log, 5 log de un virus en dicha superficie.

Figuras

Figura 1 muestra la ilustración del enfoque de entropía de Shannon para la identificación de homólogos de fármacos con perfiles de rutas coincidentes (A) y la identificación de rutas relevantes para el SARS-CoV-2 (B). Se calcularon los perfiles de ruta para la hidroxicloroquina y los inhibidores del SARS con mecanismos y modo de acción bien definidos: SSAA09E2, inhibidor de ACE2 de molécula pequeña y SSAA09E3, un inhibidor general de la fusión de la membrana del huésped del virus.

Figura 2 muestra la prevención del efecto citopático del SARS-CoV-2 causado a las células Vero E6 con base en imágenes microscópicas de contraste de fase. A: Cultivo no infectado (control); B: Células infectadas con SARS-CoV-2; C-F: Células infectadas con SARS-CoV-2 en presencia de concentraciones crecientes de Azelastine-HCl: 3.125, 6.25, 12.5 y 25 pM. Las células se infectaron con el virus MOI 0.1 SARS-Co-V2 durante 30 minutos, luego se retiró el medio de cultivo y se reemplazó con medio de cultivo fresco sin virus (pero que contenía Azelastina), y se tomaron fotografías microscópicas 48 horas después de la infección.

Figura 3 muestra la reducción del efecto citopático del SARS-CoV-2 en tejido nasal humano reconstituido (MucilAir). El tejido nasal humano se infectó con SARS-CoV-2 y posteriormente se trató con una solución de aerosol nasal que contenía Azelastina-HCl al 0.1% diluida 5 veces durante 20 minutos cada 24 horas durante 3 días. La figura muestra la imagen microscópica de baja resolución del tejido nasal humano después de 48 y 72 horas después de la infección. La producción de mucina (como signo de la función tisular intacta) se demuestra como la presencia de manchas oscuras en el tejido.

Figura 4 (Inhibición in vitro de la infección por SARS-CoV-2 B.1.351 y B.1.1.7 por azelastina) muestra el efecto de la azelastina que inhibe la infección de células Vero-TMPRSS2/ACE2 con SARS-CoV-2 B.1.351 (A) o B.1.1.7 (B). Las células se infectaron con el virus MOI 0.01 SARS-CoV-2 durante 30 minutos, se agregó azelastina a las células infectadas justo antes de la infección (ajuste preventivo) o 30 minutos después de la infección (ajuste terapéutico). 48 h después de la infección, el número de copias virales se determinó mediante PCR cuantitativa. La inhibición de la infección se expresa como el número de copias virales en relación con los pocillos del virus solamente (sin tratamiento con azelastina). Los gráficos muestran la media y la desviación estándar calculadas a partir de 9 (A) o 6 (B) valores individuales. La concentración de azelastina que inhibe el 50 % de la infección (EC50) se calculó con regresión no lineal (log(agonista) frente a respuesta normalizada - pendiente variable) usando GraphPad Prism 8.4.3.

Figura 5: SEQ ID NO: 4 (NCBI número de acceso QII57161.1, SARS-CoV-2, proteína S).

Figura 6: Efecto antiviral de Azelastine a 2 concentraciones diferentes determinado en células humanas Calu-3 infectadas por SARS-CoV-2 a un MOI de 0.01, así como citotoxicidad de las mismas concentraciones del compuesto medidas en células idénticas sin infección viral. El gráfico muestra los resultados medios de los triplicados de un experimento representativo.

Figura 7: Viabilidad de células Hep-2 no infectadas tratadas con el rango de concentración final indicado de azelastina-HCl y el vehículo diluido correspondiente, DMSO durante 48 h. La media y SEM se calcularon a partir de 3 experimentos independientes. El umbral para la diferencia estadísticamente significativa fue P<0.05. ****P<0.0001

Figura 8: Efecto antiviral de azelastina-HCl en el rango de concentración final indicado sobre la infección por RSV de células HEp-2. Se aplicó Azelastina-HCl antes de (A), simultáneamente (B) o después de (C) la infección por el virus y se evaluó la replicación visualizando las células infectadas con RSV como se describe en el texto. DMSO, el disolvente de la solución de reserva de azelastina-HCl se diluyó correspondientemente para servir como control. Los experimentos se repitieron dos veces con duplicados. Las barras representan la media con el error estándar de la media como barras de error.

Figura 9 Influencia de dos concentraciones diferentes de azelastina-HCl así como oseltamivir en el número de copias virales obtenidas de lavados apicales de tejidos nasales reconstituidos 24 horas después de la infección por el virus de la influenza H1N1. Las diferencias estadísticamente significativas están marcadas con asteriscos. El gráfico muestra los resultados medios de los triplicados de un experimento representativo. * P<0.05; ** P<0.01

Figura 10: Efecto de dos concentraciones diferentes de azelastina y oseltamivir sobre los niveles de IL-8 (panel A) y RANTES (panel B) secretados por tejidos nasales reconstituidos que habían sido infectados por el virus de la influenza H1N1. Las diferencias estadísticamente significativas están marcadas con asteriscos. El gráfico muestra los valores medios de los resultados de los triplicados de un experimento representativo. ** P<0.01; *** P<0.001; ****P<0.0001

Descripción detallada de la invención

Los términos "comprenden", "contienen", "tienen" e "incluyen" tal como se usan en el presente documento pueden usarse como sinónimos y deben entenderse como una definición abierta, que permite miembros o partes o elementos adicionales. "Que consiste en" se considera como una definición más cercana sin elementos adicionales de la función de definición consistente. Por lo tanto, "que comprende" es más amplio y contiene la definición de "que consiste en".

El término "aproximadamente" como se usa aquí se refiere al mismo valor o un valor que difiere en /-10% o /-5% del valor dado.

El término "compuesto de Azelastina", tal como se usa en el presente documento, se referirá a Azelastina o una de sus sales.

La fórmula molecular de Azelastine es C²²H²⁴CIN³O con la siguiente estructura química (I):

Nombre IUPAC: 4-[(4-clorofenil)metil]-2-(1 -metilazepan-4-il)ftalazin-1 -ona.

Número CAS: 58581 -89-8.

La sal de Azelastina es preferiblemente una sal farmacéuticamente aceptable, como por ejemplo un clorhidrato.

El clorhidrato de Azelastina es la forma de sal de clorhidrato de azelastina y se usa como un compuesto de fármaco antihistamínico formulado como una solución de aerosol medida para administración intranasal. Los productos comerciales que contienen clorhidrato de Azelastina se proporcionan como aerosol nasal que contiene 0.1 % o 0.15 % de clorhidrato de Azelastina USP en una solución acuosa a un pH de 6.8 ± 0.3.

El clorhidrato de Azelastina se presenta como un polvo cristalino blanco o casi blanco. Es escasamente soluble en agua y soluble en etanol y diclorometano.

Fórmula molecular: C²²H²⁵G ²N³O

Nombre IUPAC: 4-[(4-clorofenil)metil]-2-(1-metilazepan-4-il)ftalazin-1-ona; clorhidrato.

Números CAS: 58581-89-8; 37932-96-0; 79307-93-0.

La elección de una sal de Azelastina está determinada principalmente por cuán ácido o básico es el químico (el pH), la seguridad de la forma ionizada, el uso previsto del fármaco, cómo se administra el fármaco (por ejemplo, por la boca, inyección, o en la piel), y el tipo de forma de dosificación (tales como tableta, cápsula o líquido).

El término "farmacéuticamente aceptable", también denominado "farmacológicamente aceptable", significa compatible con el tratamiento de animales, en particular, humanos. El término sal farmacológicamente aceptable incluye tanto sales de adición ácida farmacológicamente aceptables como sales de adición básica farmacológicamente aceptables.

El término "sal de adición de ácido farmacológicamente aceptable", como se usa en el presente documento, significa cualquier sal orgánica o inorgánica no tóxica de cualquier compuesto base de la descripción, o cualquiera de sus intermedios. Los compuestos básicos de la descripción que pueden formar una sal de adición de ácido incluyen, por ejemplo, compuestos que contienen un átomo de nitrógeno básico. Los ácidos inorgánicos ilustrativos que forman sales adecuadas incluyen los ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico y fosfórico, así como sales metálicas tales como monohidrógeno ortofosfato de sodio e hidrógeno sulfato de potasio. Los ácidos orgánicos ilustrativos que forman sales adecuadas incluyen ácidos mono-, di- y tricarboxílicos tales como ácido glicólico, láctico, pirúvico, malónico, succínico, glutárico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, maleico, benzoico, fenilacético, cinámico y salicílico, así como ácidos sulfónicos tales como ácidos p-toluenosulfónico y metanosulfónico. Se pueden formar las sales mono-, di- o triácidas, y tales sales pueden existir en forma hidratada, solvatada o sustancialmente anhidra. En general, las sales de adición ácida de los compuestos de la descripción son más solubles en agua y en varios disolventes orgánicos hidrofílicos, y generalmente muestran puntos de fusión más altos en comparación con sus formas de base libre. La selección de la sal apropiada será conocida por un experto en la técnica. Otras sales de adición ácida no farmacológicamente aceptables, p. ej., oxalatos, pueden usarse, por ejemplo, en el aislamiento de los compuestos de la descripción, para uso en laboratorio, o para la conversión posterior en una sal de adición de ácido farmacológicamente aceptable.

El término "sal básica farmacológicamente aceptable", tal como se usa en este documento, significa cualquier sal de adición básica orgánica o inorgánica no tóxica de cualquier compuesto ácido, o cualquiera de sus intermedios, que sea adecuada o compatible con el tratamiento de animales, en particular humanos. Los compuestos ácidos que pueden formar una sal de adición básica incluyen, por ejemplo, compuestos que contienen ácido carboxílico, ácido sulfónico, ácido sulfínico, sulfonamida, tetrazol no sustituido en N, éster de ácido fosfórico o éster de ácido sulfúrico. Las bases inorgánicas ilustrativas que forman sales adecuadas incluyen hidróxido de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio o bario. Las bases orgánicas ilustrativas que forman sales adecuadas incluyen aminas orgánicas alifáticas, alicíclicas o aromáticas tales como metilamina, trimetilamina y picolina o amoníaco. La selección de la sal apropiada será conocida por un experto en la técnica. Pueden usarse otras sales de adición básicas no farmacológicamente aceptables, por ejemplo, en el aislamiento de los compuestos, para uso en laboratorio, o para la conversión posterior en una sal de adición básica farmacológicamente aceptable. La formación de una sal del compuesto deseado se logra utilizando técnicas estándar. Por ejemplo, el compuesto neutro se trata con una base en un disolvente adecuado y la sal formada se aísla mediante filtración, extracción o cualquier otro método adecuado.

El término "antiviral", como se usa en el presente documento, se referirá a cualquier sustancia, fármaco o preparación que afecte la biología de un virus y atenúe o inhiba la unión viral, entrada, replicación, desprendimiento, latencia o combinación de los mismos, lo que resulta en una reducción de la carga viral o infectividad. Los términos "atenuar", "inhibir", "reducir" o "prevenir", o cualquier variación de estos términos, cuando se usan en las reivindicaciones y/o la especificación, incluyen cualquier disminución medible o inhibición completa para lograr un resultado deseado, p. ej., reducción en el riesgo de infección viral (exposición previa), o reducción de la supervivencia, carga o crecimiento viral posterior a la exposición.

Preparaciones antivirales de ejemplo descritas en este documento son productos medicinales, preparaciones farmacéuticas o desinfectantes, para uso in vivo, ex vivo o in vitro.

El término "superficie biológica", como se usa en el presente documento, se referirá a una superficie que comprende células viables, como células de mamífero (humano o animal no humano), que incluye, p. ej., una superficie de tejido biológico, como una superficie o tejido epitelial o dérmico (por ejemplo, piel), tejido mucoso o tejido de membrana.

El término "cantidad eficaz" con respecto a un efecto antiviral como se usa en el presente documento, se referirá a una cantidad (en particular una cantidad predeterminada) que tiene un efecto antiviral probado. La cantidad suele ser una cantidad o actividad suficiente para, cuando se aplica a una superficie o se administra a un sujeto, tener un efecto beneficioso de los resultados deseados, incluidos los resultados antivirales o clínicos y, como tal, una cantidad efectiva o sinónimo de la misma depende del contexto en donde se está aplicando.

Se pretende que una cantidad eficaz de una preparación farmacéutica o un fármaco signifique la cantidad de un compuesto que es suficiente para tratar, prevenir o inhibir una enfermedad, afección o trastorno. Dicha dosis efectiva se refiere específicamente a la cantidad del compuesto suficiente para dar como resultado la curación, prevención o mejora de las condiciones relacionadas con las enfermedades o trastornos descritos en el presente documento.

En el contexto de enfermedad, las cantidades efectivas (en particular cantidades profiláctica o terapéuticamente efectivas) de un compuesto de Azelastina como se describe en el presente documento se usan específicamente para tratar, modular, atenuar, revertir o afectar una enfermedad o afección que se beneficia de su efecto antiviral. La cantidad del compuesto que corresponderá a tal cantidad efectiva variará dependiendo de varios factores, como el fármaco o compuesto dado, la formulación, la vía de administración, el tipo de enfermedad o trastorno, la identidad del sujeto o huésped que está siendo tratado, la evaluación de las situaciones médicas y otros factores relevantes, pero no obstante puede ser determinado de forma rutinaria por un experto en la técnica.

Un régimen de tratamiento o prevención de un sujeto con una cantidad eficaz del compuesto de Azelastina descrito en el presente documento puede consistir en una sola aplicación o administración, o alternativamente comprender una serie de aplicaciones y administraciones, respectivamente. Por ejemplo, el compuesto de Azelastina puede usarse al menos una vez al mes, o al menos una vez a la semana, o al menos una vez al día. Sin embargo, en ciertos casos de una fase aguda, p. ej., ante la exposición sospechosa o confirmada a un virus, o después de que se haya determinado la infección por el virus, el compuesto de Azelastina se puede usar con más frecuencia, p. ej., 1 -10 veces al día.

Específicamente, se proporciona una terapia de combinación que incluye el tratamiento con la preparación descrita en este documento y la terapia estándar de una enfermedad causada por el virus Coronaviridae y/o la terapia estándar de una enfermedad causada por cualquiera de los otros virus objetivo.

Las dosis se pueden aplicar en combinación con otros agentes activos tales como agentes antivirales, fármacos antiinflamatorios o antibióticos, p. ej., dependiendo del riesgo de propagación viral del sujeto, para prevenir una reacción asociada a un patógeno.

El tratamiento se puede combinar con un tratamiento antiviral, antiinflamatorio o antibiótico, preferiblemente en donde se administra una preparación farmacéutica antes, durante (por ejemplo, mediante coadministración o en paralelo) o después de dicho tratamiento antiviral, antiinflamatorio o antibiótico.

Específicamente, el compuesto de Azelastina descrito en el presente documento se puede combinar con un agente antiviral adicional, que puede ser un compuesto de Azelastina, p. ej., lo mismo de un compuesto diferente. Las realizaciones específicas se refieren a agentes antivirales adicionales seleccionados de un inhibidor de ACE2, un inhibidor del canal iónico de la proteína viral M2, un inhibidor de neuraminidasa, un inhibidor de la replicación y traducción de ARN y un inhibidor de polimerasa. El agente antiviral puede ser amantadina o rimantadina.

Específicamente, el agente antiviral puede ser oseltamivir, zanamivir, peramivir, ribavirina, lopinavir o ritonavir. Otros ejemplos antivirales específicos son los que se usan adecuadamente para el tratamiento biológico de superficies, como la carragenina, o los que se están investigando actualmente para tratar las infecciones por SARS-Cov2, como la hidroxicloroquina o el remdesivir.

Específicamente, el compuesto de Azelastina se combina con un agente antiinflamatorio tal como fármacos antiinflamatorios esteroideos estándar, glucocorticoides y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). Los AINE adecuados incluyen, pero no se limitan a ibuprofeno, naproxeno, fenoprofeno, ketoprofeno, flurbiprofeno, oxaprozina, indometacina, sulindac, etodolaco, ketorolac, diclofenaco, nabumetona, piroxicam, meloxicam, tenoxicam, droxicam, lornoxicam, isoxicam, ácido mefenámico, ácido meclofenámico, ácido flufenámico, ácido tolfenámico y celecoxib. Los agentes antiinflamatorios esteroideos adecuados incluyen, pero no se limitan a, corticosteroides tales como glucocorticoides sintéticos. Los ejemplos específicos son fluticasona, inhibidores de COX-2, ibuprofeno, hidroxicloroquina, heparina, heparina de bajo peso molecular, hirudina o inmunosupresores, como azatioprina, ciclosporina A o ciclofosfamida.

Específicamente, el compuesto de Azelastina se combina con un antibiótico tal como un antibiótico betalactámico, un antibiótico aminoglucósido, una ansamicina, un carbacefem, un carbapenem, una cefalosporina, un glicopéptido, una lincosamida, un lipopéptido, un macrólido, un monobactámico, un nitrofurano, una oxazolidinona, un polipéptido, una sulfonamida, clofazimina, dapsona, capreomicina, cicloserina, etambutol, etionamida, isoniazida, pirazinamida, rifampicina, rifabutina, rifapentina, estreptomicina, arsfenamina, cloranfenicol, fosfomicina, mupirocina, platensimicina, quinupristina/dalfopristina, tiamfenicol, Tigeciclina, tinidazol, trimetoprima, teixobactina, malacidinas, halicina, clindamicina, vancomicina, metronidazol, ácido fusídico, tiopéptidos, fidaxomicina, quinolonas, tetraciclinas, omadaciclina, rifamicina, kibdelomicina, oxazolidinona, cetólidos, tiazolidos, amixicilo, teicoplanina, ramoplanina, oritavancina, lantibióticos, capuramicina, surotomicina, turicina, endolisina, avidocin CD, cadazolid, ramizol, defensins, ridinilazol, ácidos grasos de cadena media, fagos, berberina, lactoferrina.

Específicamente, el tratamiento con el compuesto de Azelastina descrito en el presente documento se puede combinar con un tratamiento que administra al menos otro agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en un corticosteroide, un modulador de la transducción de señales antiinflamatorias, un broncodilatador agonista de los receptores adrenérgicos 2, un anticolinérgico, un agente mucolítico, solución salina hipertónica y otros fármacos para tratar una infección por el virus Coronaviridae y/o infecciones por cualquiera de los otros virus diana descritos en el presente documento; o mezclas de los mismos. Las composiciones farmacéuticas específicas pueden incluir particularmente uno o más agentes antiinflamatorios y/o analgésicos, agonistas de PPAR-y y moduladores de la respuesta inmune.

La duración del período de tratamiento depende de una variedad de factores, como la gravedad de la enfermedad, ya sea aguda o crónica, la edad del paciente y la concentración del compuesto de Azelastina. También se apreciará que la dosificación eficaz utilizada para el tratamiento o la profilaxis puede aumentar o disminuir durante el curso de un régimen de tratamiento o profilaxis particular. Los cambios en la dosificación pueden resultar y hacerse evidentes mediante ensayos de diagnóstico estándar conocidos en la técnica.

De acuerdo con un aspecto específico, un producto medicinal o composición farmacéutica descrito en el presente documento contiene una cantidad eficaz del compuesto de Azelastina como se define en el presente documento. La preparación descrita en el presente documento se puede proporcionar para uso en dosificación única o múltiple.

Se pueden usar envases de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, o aerosoles de usos múltiples, y se pueden almacenar comprendiendo una fase líquida o seca, por ejemplo, en una condición seca por congelación (liofilizada) que requiere solo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes del uso. Las formulaciones de dosificación unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis diaria o una subdosis diaria unitaria, o dosis múltiples, del compuesto de Azelastina.

El término "dosis única" como se usa en este documento se entiende de la siguiente manera. Una dosis única o cantidad para un solo uso es la cantidad destinada a la administración destinada a ser utilizada en un solo sujeto, como un paciente, ya sea humano o animal para un solo caso/procedimiento/administración. Los paquetes que comprenden la dosis única generalmente están etiquetados como tales por el fabricante. La cantidad de dosis única se entiende específicamente como una dosis diaria para un individuo, como un niño o un adulto, para proporcionar una cantidad efectiva.

El producto medicinal o composición farmacéutica descritos en el presente documento se proporciona específicamente como producto medicinal humano o veterinario o composición farmacéutica. Los productos medicinales se entienden como sustancias que se utilizan para tratar enfermedades, para aliviar dolencias o para prevenir tales enfermedades o dolencias en primer lugar. Esta definición se aplica independientemente de si el producto medicinal se administra a humanos o animales. Las sustancias pueden actuar tanto dentro como sobre el cuerpo.

El producto medicinal o composición farmacéutica aquí descrito contiene preferiblemente uno o más auxiliares farmacéuticamente aceptables y se encuentra en una forma farmacéutica que permite administrar el compuesto farmacéutico activo con alta biodisponibilidad. Los auxiliares adecuados pueden ser, por ejemplo, a base de ciclodextrinas. Las formulaciones adecuadas podrían, por ejemplo, incorporar nanopartículas poliméricas sintéticas formadas por un polímero seleccionado del grupo que consiste en acrilatos, metacrilatos, cianoacrilatos, acrilamidas, polilactatos, poliglicolatos, polianhidratos, poliortoésteres, gelatina, albúmina, poliestirenos, polivinilos, poliacroleína, poliglutaraldehído y derivados, copolímeros y mezclas de los mismos.

Los productos medicinales o composiciones farmacéuticas específicos descritos en el presente documento comprenden el compuesto de Azelastina y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación para uso medicinal o médico, distinto de un principio activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizador o conservante y, en particular, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares.

El compuesto de Azelastina tal como se utiliza aquí se puede formular con vehículos y excipientes convencionales, que se seleccionarán según la práctica habitual.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables generalmente incluyen todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antivirales, antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles con un compuesto de molécula pequeña antiviral o una composición relacionada o preparación combinada descrita en este documento.

De acuerdo con un aspecto específico, el compuesto de Azelastina se puede combinar con uno o más vehículos apropiados para una vía de administración deseada. El compuesto de Azelastina puede ser p.ej., mezclado con lactosa, sacarosa, almidón, ésteres de celulosa de ácidos alcanoicos, ácido esteárico, talco, estearato de magnesio, óxido de magnesio, sales de sodio y calcio de ácidos fosfórico y sulfúrico, acacia, gelatina, alginato de sodio, polivinilpirrolidina, alcohol polivinílico, y opcionalmente en tabletas o encapsulados para administración convencional. Alternativamente, el compuesto de Azelastina puede dispersarse o disolverse en solución salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, soluciones coloidales de carboximetilcelulosa, etanol, aceite de maíz, aceite de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, goma de tragacanto y/o diversos tampones. Otros vehículos, adyuvantes y modos de administración son bien conocidos en las técnicas farmacéuticas. Un vehículo puede incluir un material de liberación controlada o un material de retardo de tiempo, como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo solos o con una cera, u otros materiales bien conocidos en la técnica.

Los compuestos descritos en este documento pueden proporcionarse en productos farmacéuticos de liberación controlada ("formulaciones de liberación controlada") en los que la liberación del compuesto de Azelastina se controla y regula para permitir una dosificación de menor frecuencia o para mejorar el perfil farmacocinético o de toxicidad de un principio activo dado.

Las composiciones farmacéuticas también se pueden recubrir mediante métodos convencionales, normalmente con recubrimientos dependientes del tiempo o del pH, de modo que el agente en cuestión se libere en el tracto gastrointestinal en las proximidades de la aplicación tópica deseada, o en varios momentos para prolongar la acción deseada. Dichas formas de dosificación incluyen típicamente, pero no se limitan a, una o más de ftalato de acetato de celulosa, ftalato de polivinilacetato, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, etilcelulosa, ceras y goma laca.

Se conocen en la técnica vehículos farmacéuticamente aceptables adicionales y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22a edición revisada (Allen Jr, LV, ed., Pharmaceutical Press, 2012). Las formulaciones líquidas pueden ser soluciones, emulsiones o suspensiones y pueden incluir excipientes tales como agentes de suspensión, solubilizantes, tensioactivos, conservantes y agentes quelantes.

La preparación preferida está en una forma estable al almacenamiento, lista para usar, con una vida útil de al menos uno o dos años.

El término "formulación", como se usa en este documento, se refiere a una preparación lista para usar de una manera específica. Específicamente, las composiciones descritas en el presente documento comprenden el compuesto de Azelastina y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con un aspecto específico, se proporcionan formulaciones que comprenden vehículos farmacéuticamente aceptables para administración nasal, intrapulmonar, oral, tópica, mucosal o parenteral. La administración también puede ser intradérmica o transdérmica. Además, la presente descripción incluye dichos compuestos, que han sido liofilizados y que pueden reconstituirse para formar formulaciones farmacéuticamente aceptables para su administración.

Los productos medicinales específicos o las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se formulan para administración intranasal o por otra vía tópica, por ejemplo, sobre superficies biológicas, incluidas, por ejemplo, mucosas o piel. Los vehículos farmacéuticos adecuados para facilitar dichos medios de administración son bien conocidos en la técnica.

Específicamente, se puede usar un aerosol nasal que contenga 0.001 % o 0.15 % (p/p) de compuesto de Azelastina en una solución acuosa a pH 6.8 ± 0.3, que opcionalmente contenga uno cualquiera o más de ácido cítrico monohidratado, hidrogenofosfato disódico dodecahidratado, edetato disódico, hipromelosa, agua purificada, cloruro de sodio y un conservante como el cloruro de benzalconio.

Para administrar el compuesto de Azelastina por cualquier vía que no sea la administración parenteral, puede ser necesario recubrir el agente activo o coadministrar el agente activo con un material para evitar su inactivación. Por ejemplo, puede usarse un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones tampón salinas y acuosas.

El compuesto de Azelastina se puede administrar por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo asimilable o comestible. Por ejemplo, una preparación puede encerrarse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o comprimirse en tabletas. Para la administración terapéutica oral, el compuesto de Azelastina puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Por supuesto, el porcentaje del compuesto en las composiciones y preparaciones puede variar. La cantidad del compuesto de Azelastina en dichas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá una dosificación adecuada.

Las tabletas contendrán excipientes, deslizantes, rellenos, aglutinantes, desintegrantes, lubricantes, sabores y similares. Los gránulos se pueden producir usando isomaltosa. Además, se prefiere proporcionar una preparación formulada para actuar en el sitio de la mucosa, p. ej., en sitios mucosos (tales como nariz, boca, ojos, esófago, garganta, pulmón), p. ej., localmente sin acción sistémica. Las formulaciones acuosas se preparan en forma estéril, y cuando están destinadas a una administración distinta a la oral, generalmente serán isotónicas.

El término "mucosa" con respecto a la administración o aplicación o también uso en la mucosa de una preparación para tratar a un sujeto o una formulación respectiva, se refiere a la administración a través de la vía mucosa, incluida la administración sistémica o local, en la que un principio activo se absorbe por contacto. con superficies mucosas. Esto incluye la administración nasal, pulmonar, oral o peroral y las formulaciones, por ejemplo, líquido, jarabe, comprimido para deshacer en la boca, colirio, tableta, aerosol, polvo, polvo instantáneo, gránulos, cápsulas, crema, gel, gotas, suspensión o emulsión.

Las formulaciones perorales pueden incluir soluciones líquidas, emulsiones, suspensiones y similares. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para la preparación de dichas composiciones son bien conocidos en la técnica. Los componentes típicos de vehículos para jarabes, elixires, emulsiones y suspensiones incluyen etanol, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, sacarosa líquida, sorbitol y agua. Para una suspensión, los agentes de suspensión típicos incluyen metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, tragacanto y alginato de sodio; los agentes humectantes típicos incluyen lecitina y polisorbato 80; y los conservantes típicos incluyen metilparabeno y benzoato de sodio. Las composiciones líquidas perorales también pueden contener uno o más componentes tales como edulcorantes, agentes saborizantes y colorantes descritos anteriormente.

Otras composiciones útiles para lograr la administración sistémica del compuesto de Azelastina o las preparaciones respectivas incluyen formas de dosificación sublingual, bucal y nasal. Tales composiciones normalmente comprenden una o más sustancias de relleno solubles tales como sacarosa, sorbitol y manitol; y aglutinantes tales como acacia, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa, o deslizantes, lubricantes, edulcorantes, colorantes, antioxidantes y agentes saborizantes.

El compuesto de Azelastina o las preparaciones respectivas también se pueden administrar tópicamente a un sujeto, p. ej., mediante la aplicación o extensión directa de una composición que lo contiene sobre el tejido epidérmico o epitelial del sujeto, o por vía transdérmica a través de un "parche". Tales composiciones incluyen, por ejemplo, lociones, cremas, soluciones, geles y sólidos. Estas composiciones tópicas pueden comprender una cantidad eficaz, normalmente al menos aproximadamente el 0.001 % en peso, o incluso desde aproximadamente el 0.1 % en peso hasta el 5 % en peso, o desde el 1 % en peso hasta aproximadamente el 5 % en peso, del compuesto de Azelastina. Los vehículos adecuados para la administración tópica normalmente permanecen en su lugar sobre la piel como una película continua y se resisten a ser eliminados por la transpiración o la inmersión en agua. Generalmente, el vehículo es de naturaleza orgánica y capaz de tener dispersado o disuelto en él el agente terapéutico. El vehículo puede incluir emolientes, emulsionantes, agentes espesantes, disolventes y similares farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (en particular cuando los compuestos o sales farmacéuticamente aceptables son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En particular, la composición es específicamente estéril y fluida en la medida en que existe una fácil capacidad de aplicación mediante jeringa; es estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se conserva frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, sin limitación, cualquier adyuvante farmacéutico no inmunogénico adecuado para las vías de administración oral, parenteral, nasal, mucosal, transdérmica, intravascular (IV), intraarterial (IA), intramuscular (IM) y subcutánea (SC). como solución salina tamponada con fosfato (PBS).

El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se referirá a un mamífero de sangre caliente, en particular un ser humano o un animal no humano, incluidos, p. ej., perros, gatos, conejos, caballos, vacas y cerdos. En particular, el tratamiento y el uso médico descritos en este documento se aplican a un sujeto que necesita profilaxis o terapia de una enfermedad asociada con una infección por el virus Coronaviridae y/o una infección con cualquiera de los otros virus objetivo descritos en este documento. Específicamente, el tratamiento puede ser interfiriendo con la patogénesis de una condición de enfermedad donde un virus Coronaviridae y/o un virus Adenoviridae y/o un virus Paramyxoviridae y/o un virus Orthomyxoviridae es un agente causal de la condición. El sujeto puede ser un paciente con riesgo de tal condición de enfermedad o que padezca la enfermedad. Específicamente, el sujeto puede tener un sistema inmunitario debilitado o una enfermedad cardíaca o respiratoria existente que es más probable que aumente el riesgo de enfermedad o la gravedad de la enfermedad.

El término "en riesgo de" ciertas condiciones de enfermedad se refiere a un sujeto que potencialmente desarrolla tal condición de enfermedad, p.ej., por una cierta predisposición, exposición a virus o sujetos infectados por virus, o que ya padece tal condición de enfermedad en varias etapas, particularmente asociada con otras condiciones de enfermedad causales o bien condiciones o complicaciones posteriores como consecuencia de la infección viral. La determinación del riesgo es particularmente importante en un sujeto en donde todavía no se ha diagnosticado una enfermedad. Por lo tanto, esta determinación del riesgo incluye un diagnóstico temprano para permitir la terapia profiláctica. Específicamente, el compuesto de Azelastina se usa en sujetos con alto riesgo, p. ej., una alta probabilidad de desarrollar la enfermedad.

El término "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico. El término "paciente", tal como se usa aquí, siempre incluye sujetos sanos. Por lo tanto, el término "tratamiento" pretende incluir tanto el tratamiento profiláctico como el terapéutico.

Específicamente, el término "profilaxis" se refiere a medidas preventivas que pretenden abarcar la prevención de la aparición de patogénesis o medidas profilácticas para reducir el riesgo de patogénesis.

El término "terapia" como se usa en el presente documento con respecto al tratamiento de sujetos se refiere al manejo médico de un sujeto con la intención de curar, mejorar, estabilizar, reducir la incidencia o prevenir una enfermedad, condición patológica o trastorno, que individualmente o en conjunto se entienden como "condición de enfermedad". El término incluye tratamiento activo, dirigido específicamente hacia la mejora de una condición de enfermedad, profilaxis dirigida específicamente hacia la prevención de una condición de enfermedad, y también incluye tratamiento causal dirigido hacia la eliminación de la causa de la condición de enfermedad asociada. Además, este término incluye el tratamiento paliativo diseñado para el alivio de los síntomas en lugar de la curación de la enfermedad, y la curación adicional de una enfermedad dirigida a minimizar o inhibir parcial o completamente el desarrollo de la enfermedad asociada, y el tratamiento de apoyo empleado para complementar otra terapia específica dirigida a la mejora de la condición de enfermedad asociada.

La descripción anterior se comprenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos. Tales ejemplos son, sin embargo, meramente representativos de métodos para practicar una o más realizaciones de la presente invención y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: identificación de fármacos antivirales

El desarrollo de representaciones matemáticas para moléculas pequeñas (fármacos) es un área de investigación de inmenso valor para la investigación farmacéutica moderna y, por lo tanto, se han desarrollado numerosos descriptores moleculares que explotan las características 2D y/o 3D de las estructuras químicas. Estos descriptores han sido muy valiosos para evaluar las relaciones cuantitativas estructura-actividad. Específicamente, los pares de características centradas en el átomo han resultado ser de gran relevancia para los programas de descubrimiento de fármacos, ya que proporcionan enfoques rentables para el análisis de la relación estructura-actividad de alto rendimiento, la selección de compuestos, la detección química virtual y el perfil farmacológico. Uno de los descriptores químicos de uso común se conoce como SHED, por Shannon Entropy Descriptor (1). En este enfoque, las distribuciones topológicas de pares de características centradas en átomos se cuantifican con base en la teoría de la información (entropía de Shannon). El beneficio particular es que los andamios químicos químicamente diferentes pero topológicamente relacionados pueden identificarse utilizando el enfoque SHED.

Para identificar nuevos fármacos antivirales, se utilizó una estrategia de identificación de fármacos basada en una estrategia de intervención basada en rutas bioquímicas. Los fármacos aprobados clínicamente que coinciden con un perfil mecánico predefinido (modo de acción) se identificaron como fármacos antivirales candidatos utilizando una descripción basada en la entropía de Shannon de las características químicas inherentes de las moléculas pequeñas (fármacos). El fundamento de este enfoque es que los ligandos con vectores de entropía de Shannon similares se unirán a objetivos proteicos similares.

Aquí se utilizó la base de datos DRUGBANK (2), un repositorio de fármacos aprobados y sus objetivos proteicos verificados experimentalmente. Las similitudes entre fármacos se evaluaron calculando las distancias euclidianas (se tomó 0.25 como valor de corte).

Como punto de partida para el análisis, la información mecánica disponible sobre la infección por SARS-CoV-2 se extrajo de análisis bioinformáticos recientes (3) junto con el análisis de ciertos compuestos antivirales de consulta. Los perfiles de ruta de los compuestos antivirales de consulta con actividad SARS-CoV2 conocida (hidroxicloroquina (RS)-2-[{4-[(7-Clor-4-chinolinil)amino]pentil}(etil)amino]etanol; SSAA09E2 {N-[[4-(4-metilpiperazin-1 -il)fenil]metil]-1,2-oxazol-5-carboxamida} y SSAA09E3 [N-(9,10-dioxo-9,10-dihidroantracen-2-il) benzamida]) se predijeron utilizando el enfoque de entropía de Shannon y, curiosamente, mostraron una superposición mutua significativa.

En segundo lugar, los perfiles de la ruta para los inhibidores del SARS se predijeron con mecanismos y modos de acción bien definidos: SSAA09E2, un inhibidor de ACE2 de molécula pequeña, y SSAA09E3, un inhibidor general de la fusión de la membrana del huésped del virus (4). Se encontró que ambos inhibidores compartían un número considerable de rutas con la hidroxicloroquina. En resumen, el análisis mostró que rutas similares están involucradas en la infección por SARS-CoV-2, dirigidas por hidroxicloroquina y abordadas por inhibidores con mecanismos bien definidos. Por lo tanto, se concluyó que estas rutas son altamente relevantes para la actividad antiviral y pueden servir como base para la reutilización de un novedoso fármaco para la actividad antiviral mediante la búsqueda de fármacos clínicamente aprobados los cuales anteriormente no eran reconocidos por tener actividad antiviral con perfiles de rutas coincidentes.

Se exploraron fármacos clínicamente aprobados para hacer coincidir los perfiles de rutas individuales. Los perfiles de rutas predichos obtenidos para los diferentes compuestos de consulta (hidroxicloroquina, SSAA09E2 y SSAA09E3) se emplearon para examinar la base de datos de SELLECKCHEM de fármacos aprobados (y disponibles comercialmente). La justificación para la selección de candidatos se basó en la aparición simultánea de fármacos aprobados en los diferentes conjuntos de datos (previstos). La hidroxicloroquina y el SSAA09E2 (inhibidor de la ACE2) mostraron una superposición significativa entre sí y con los fármacos obtenidos con el perfil de la ruta del SARS-CoV-2. Después de eliminar los fármacos con base en su composición química, se seleccionaron dos fármacos aprobados como antivirales candidatos para realizar más pruebas en un modelo de infección in vitro por SARS-CoV-2: Azelastina y maraviroc.

Referencias:

(1) Gregori-Puigjane, E. and Mestres, J. SHED: Shannon Entropy Descriptors from Topological Feature Distributions. J.Chem.Inf.Model. 46, 1615-1622 (2006)

(2) Wishart, DS., Knox, C., Guo, AC:, Cheng, D., Shrivastava, S., Tzur, D., Gautam, B. and Hassanali, M. DrugBank: a knowledgebase for drugs, drug action and drug targets. Nucleic Acids Res. D901-D906, (2008)

(3) Zhou, Y, Hou, Y., Shen, J, Huang, Y., Martin, W. and Cheng, F. Network-based drug repurposing for novel coronavirus 2019-nCoV/SARS-CoV-2. Cell Discovery 6,14-32, (2020)

(4) Adedeji, AO., Severson, W., Jonsson, C., Singh, K., Weiss SR. and Sarafanos, SG. Novel Inhibitors of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Entry That Act by Three Distinct Mechanisms. J Virol. 87, 8017-8028, (2013).

Ejemplo 2: Prevención de la infección viral de células Vero E6 por SARS-CoV-2

Para detectar el efecto de Azelastine-HCI en la infección por SARS-CoV-2, las células Vero E6 (riñón de mono) que expresan ACE2 se infectaron con SARS-CoV-2 en ausencia o presencia de Azelastine-HCI y se evaluó el efecto citopatogénico mediante examen microscópico de las células.

Procedimiento experimental:

Se sembraron células Vero E6 (ATCC CRL-1586) en placas de 96 pocillos. Después de 2 días, los cultivos celulares alcanzaron la confluencia y formaron una monocapa homogénea. Las células se alimentaron con medio de cultivo celular nuevo (DMEM+ ^f B^s ?). Azelastina-HCI (Seleckchem cat# S2552, solución de reserva 10 mM disuelta en DMSO) y Maraviroc (Seleckchem cat# S2003, solución de reserva 10 mM disuelta en DMSO), un agente antiviral anti-VIH, se agregaron al medio de cultivo celular a concentraciones finales de 50, 25, 12.5, 6.25 y 3.125 pM (se prepararon diluciones en medio de cultivo). Para la infección viral, se añadió el virus SARS-CoV-2 (hCoV-19/Hungary/SRC_isolate_2/2020, ID de acceso: EPI_ISL_483637) al sobrenadante a una MOI de 0.1 (multiplicidad de infección: 1 partícula viral por 10 células) inmediatamente después del intercambio del medio de cultivo (básicamente de manera simultánea). La reserva de virus se preparó por propagación en células Vero E6 y se determinó el título infeccioso. Después de 30 min de incubación con el virus, se retiró el medio de cultivo y se reemplazó con medio de cultivo fresco que contenía Azelastina-HCl o Maraviroc en las concentraciones anteriores (coadministración: simulación de prevención). Los experimentos también se realizaron con Azelastina de manera que el fármaco se administrara solo después de los 30 minutos de incubación con el virus, pero no durante este período (administración posterior a la infección: ajuste posterior a la exposición/terapéutico). 48 horas después de la infección, las células se evaluaron mediante observación microscópica y luego los sobrenadantes se recolectaron y almacenaron a -80 °C para el análisis PCR cuantitativo. El ARN viral se extrajo de las muestras de sobrenadante de cultivo con el kit Monarch Total RNA Miniprep (New England BioLabs, Cat#: T2010S) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se mezclaron 300 pl de tampón de lisis con 100 pl de sobrenadante de cultivo, se eliminó la contaminación de ADNg con la columna dedicada (reteniendo el ADN) y se aplicó el flujo continuo que contenía ARN a la columna de unión al ARN. Después de lavar la columna, el ARN se eluyó con H2O, y las muestras se almacenaron a -80 °C hasta su análisis. Después de la reacción de transcripción inversa, se amplificó el ADN con los cebadores F, R y P2 del gen RdRp

Los cebadores y sondas utilizados fueron específicos para el gen RdRp del SARS-CoV-2:

Cebador inverso: CARATGTTAAASACACTATTAGCATA (SEQ ID NO: 1),

Cebador directo: GTGARATGGTCATGTTGTGGCGG (SEQ ID NO: 2),

Sonda: FAM-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-BBQ (SEQ ID NO:3).

Se utilizó el kit de PCR de gotas (BioRad ddPCR™, Bio-Rad Laboratories GmbH, Alemania). Los resultados de la reacción de RT-PCR se cuantificaron y calcularon como partículas virales/pl.

Resultados:

La capa homogénea, confluente de células (no infectadas, Fig. 2A) es alterada y aparecen "agujeros" que indican la muerte celular debida al virus (Fig. 2B). En presencia de Azelastina-HCl en todas las concentraciones probadas, las células infectadas con SARS-CoV-2 estaban significativamente protegidas de la muerte, lo que proporciona evidencia de un efecto antiviral directo (Fig. 2C-F). Maraviroc no fue efectivo en absoluto a concentraciones más bajas, e incluso las concentraciones más altas (12.5 a 50 pM) tuvieron solo un efecto protector marginal con puntajes citopatógenos altos (Tabla 1). Sorprendentemente, la Azelastina resultó ser una sustancia antiviral efectiva, que es al menos tan efectiva como la hidroxicloroquina.

Estos datos sugieren que un compuesto de Azelastina pudo detener la infección por SARS-CoV-2 inmediatamente tan pronto como se aplicó a las células. Dado que el virus necesita ingresar a las células para multiplicarse y propagarse por el cuerpo, se espera que Azelastina prevenga el COVID-19 justo en el lugar donde el virus infecta al cuerpo humano, en las superficies mucosas del tracto respiratorio.

Tabla 1

Puntuación:

0: sin efecto citopático (CPE), las células parecían ser las mismas que en el control no infectado

1: áreas muy pequeñas mostraron un bajo nivel de CPE

2: CPE observado en pequeñas áreas del cultivo celular

3: CPE más fuerte, pero no tan fuerte como en el control infectado

4: CPE es tan fuerte como en el control infectado

El análisis de PCR cuantitativo reveló que AzelastinA fue altamente eficaz para reducir el número de partículas virales, tanto en una coadministración (que simula la prevención) hasta > 99 % como hasta > 97 % en ajustes de administración posterior a la infección (que simula una exposición posterior o terapia) (Tabla 2) lo que sugiere que Azelastina puede usarse tanto en ajustes profilácticos como terapéuticos. Como era de esperar, la coadministración es más eficaz, pero los números virales bajos a la concentración de Azelastina de 25 pm demuestran que la infección en curso puede detenerse, no solo prevenirse.

Tabla 2

Los números representan valores medianos de hasta 5 muestras/concentración replicadas con 2-3 repeticiones técnicas (PCR cuantitativa repetida de la misma muestra biológica).

Ejemplo 3: Eficacia contra la infección por virus de tejido nasal humano reconstituido por SARS-CoV-2

Para confirmar la eficacia de Azelastina-HCl contra el SARS-CoV2 en células humanas, se infectó tejido nasal humano 3D reconstituido (MucilAir, Epitelio de las vías respiratorias humanas en 3D reconstituido in vitro) con SARS-CoV-2 y se trató con un aerosol nasal comercial que contenía Azelastina. El efecto citopatogénico se evaluó mediante examen microscópico del tejido y el número de partículas virales se determinó mediante PCR de gotas.

Procedimiento experimental:

El tejido nasal humano MucilAir generado a partir de donantes sanos (Epithelix Sarl (Ginebra, Suiza), Cat# EP02MP) se infectó con SARS-CoV-2 (virus SARS-CoV-2, hCoV-19/Hungary/SRC_isolate_2/2020, ID de acceso: EPI_ISL_483637) a una multiplicidad de infección (MOI) de 0.01 en el lado apical. Después de 20 min de incubación a 37°C en 5% de CO2, el medio que contenía el virus se eliminó por completo. Luego se añadió una solución diluida 5 veces (en medio de cultivo MucilAir) del aerosol nasal Allergodil (0.1% de Azelastina-HCl, Mylan) en el lado apical (en 200 pl de volumen) durante 20 min. Después del tratamiento, el aerosol nasal diluido se eliminó por completo de la superficie de las células para proporcionar una interfaz líquido-aire y se incubó durante 24 horas. El tratamiento de 20 minutos con Allergodil diluido se repitió a las 24 y 48 horas posteriores a la infección (hpi). Después de 24, 48 y 72 hpi, los lados apicales de las células se lavaron durante 15 minutos con medio de cultivo MucilAir y la solución se recogió para la cuantificación de partículas de virus infectantes. Las células también se inspeccionaron bajo un microscopio invertido a 48 y 72 hpi.

El ARN total se extrajo de los lavados apicales (100 pl) usando el kit Miniprep de ARN total Monarch (Promega, Cat#: T2010S) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como se describe en el Ejemplo 2, para la cuantificación del número de copias de virus se aplicó la tecnología de PCR digital en gotitas (Bio-Rad Laboratories Inc. QX200 Droplet Digital PCR System).

Resultados:

El análisis microscópico de los tejidos a las 48 y 72 horas reveló una producción reducida de mucina en las células infectadas, que se observa como una ausencia total de puntos negros en la imagen microscópica, en relación con las células de control (sin virus ni tratamiento farmacológico, se observa una gran cantidad de material negro sobre las células) (Figura 3.). Es importante destacar que la producción de mucina, demostrada por la presencia del material negro en la imagen microscópica, se demuestra claramente en presencia de un tratamiento con Allergodil diluido 5 veces y es comparable a la observada en el control negativo (sin virus ni tratamiento farmacológico). No se detectaron diferencias en la morfología del tejido en las células de control y las tratadas con Azelastina (sin infección por virus) y se detectó movimiento ciliar en todos los tejidos.

El análisis de PCR Digital en gotitas confirmó una infección eficaz por SARS-CoV-2 y una rápida replicación viral, alcanzando varios miles de copias por microlitro 72 horas después de la infección en el compartimento apical de los insertos de tejido. El aerosol nasal diluido en 5 veces (0.02 % de Azelastina HCI) usado diariamente durante 20 minutos redujo drásticamente el número de partículas virales a las 48 y 72 horas posteriores a la infección (> 99.9 % de inhibición) (Tabla 3).

Tabla 3

Ejemplo 4: Demostración de la potencia in vitro de azelastina contra variantes de interés B.1.1.7 y B.1.351 del SARS-CoV-2

Para detectar el efecto antiviral de la azelastina-HCI en las variantes del virus SARS-CoV-2, se infectó una línea celular Vero (riñón de mono) que expresaba ACE2 y TMPRSS2 con las variantes B.1.1.7 y B.1.351 de interés en ausencia o presencia de azelastina-HCl y se evaluó el efecto sobre la propagación viral mediante PCR cuantitativa.

Procedimiento experimental:

Ensayo de infección por SARS-CoV-2 con Vero-TMPRSS2/ACE2

Se sembraron células Vero que sobreexpresan de forma estable la serina proteasa humana TMPRSS2 y el receptor ACE2 (Riepler et al, Comparison of Four SARS-CoV-2 Neutralization Assays. Vaccines (Basilea), 2020;9(1):13) en placas de 96 pocillos a 104/pocillos el día antes de la infección. El clorhidrato de Azelastina, (Sigma-Aldrich, PHR1636-1G, Lot.# LRAC4832) disuelto en DMSO hasta una concentración de 10 mM, se diluyó con medio Eagle modificado de Dulbeccos (Merck, Darmstadt, Alemania) que contenía 2 % de FBS hasta concentraciones finales que oscilaban entre 50 pM a 0.4 pM (diluciones en serie dobles). Antes de la infección de las células, se aspiró el sobrenadante del cultivo celular y se reemplazó por 50 pl de diluciones de Azelastina-HCl en el ajuste preventivo (coadministración) y 50 pl de medio en el ajuste posterior a la infección. Para cada concentración de azelastina se realizaron mediciones por triplicado. Posteriormente, las células se infectaron con aislados de SARS-CoV-2 pertenecientes al tipo B.1.1.7 o B.1.351 a una MOI de 0.01 durante 30 minutos a 37 °C. Para ambos ajustes experimentales, el sobrenadante se aspiró luego y se reemplazó por 50 pl de medio fresco y 50 pl de las mismas concentraciones de Azelastina utilizadas anteriormente, lo que resultó en concentraciones de Azelastina que oscilaron entre 25 pM y 0.2 pM. 48 horas después de la infección, se evaluó el efecto citopático y se mezcló el sobrenadante en relaxión 1:1 con tampón DLR (IGEPAL al 0.5 %, NaCl 25 mM en tampón T ris-Hci 10 mM, 15 pl de inhibidor de RNasa RiboLock (ThermoScientific, 40 U/ pl, EO0381 por ml de tampón DLR) para aislar el ARN viral. Las copias del genoma del SARS-CoV-2 se cuantificaron mediante qPCR utilizando cebadores específicos del gen E (5' a Ca GGT ACG TTA ATA GTT AAT AGC GT 3' (SEQ ID NO:5 ) y 5' ATA TTG CAG CAG TAC GCA CAC A3' (SEQ ID NO:6)), sonda marcada con FAM (FAM-ACA CTA GCC ATC CTT ACT GCG CTT CG-BHQ1 (SEQ ID NO:7)) e iTaq Universal Probes One-Step Kit (BioRad, Cat.#1725141). Se utilizó un estándar de ARN transcrito in vitro producido internamente (gen E del SARS-CoV-2) para cuantificar los resultados de la qPCR. Los pocillos solo de virus sin tratamiento con azelastina se ajustaron al 100 % y se calculó el porcentaje de inhibición para cada muestra en relación con los pocillos solo de virus.

Resultados:

El análisis cuantitativo de PCR reveló que Azelastina fue altamente eficaz para reducir el número de partículas virales, tanto en entornos de administración preventivos (coadministración) como posteriores a la infección (simulación de la exposición posterior o terapia) (Tablas 4 y 5 y Figura 4). Similar a los resultados con el virus de tipo salvaje, la coadministración es algo más efectiva, pero las bajas cifras virales (más del 90 % de inhibición) a la concentración de Azelastina de 12.5 pm demuestran que la infección en curso puede detenerse, no solo prevenirse. La concentración efectiva de azelastina necesaria para inhibir el 50 % de la infección (EC50) estuvo entre 4 y 6.5 pM dependiendo del ajuste y el virus mutante, que está en el rango de la EC50 observada para el virus de tipo salvaje (~6 pM). Esto demuestra que la eficacia de la azelastina contra el SARS-CoV-2 es independiente de las mutaciones emergentes de alto riesgo.

Tabla 4: B.1.351

Los números representan valores medios de 3 experimentos independientes, cada uno con 3 muestras repetidas (9 en total)/concentración

Tabla 5. B1.1.7

Los números representan los valores medios de 2 experimentos independientes, cada uno con 3 muestras de réplicas (6 en total)/concentración

Conclusión:

Estos datos sugieren que un compuesto de azelastina pudo detener la infección por los mutantes B.1.351 y B.1.1.7 del SARS-CoV-2 tan pronto como se aplicó a las células. Dado que el virus necesita ingresar a las células para multiplicarse y diseminarse por el cuerpo, se espera que la azelastina prevenga el COVID-19 justo en el lugar donde el virus infecta al cuerpo humano, en las superficies mucosas de las vías respiratorias.

Ejemplo 5: Prevención de la infección viral de células Calu-3 por SARS-CoV-2

Para confirmar el efecto antiviral de Azelastina-HCI en células que expresan la proteasa de superficie TMPRSS2, la línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano, Calu-3 se infectó con SARS-CoV-2 en ausencia o presencia de Azelastina-HCI y el número de partículas cirales se midió después de 48 h.

Procedimiento experimental:

Calu-3 (ATCC)® HTB-55™) se sembraron en placas de 96 pocillos. 2 días después, cuando las células alcanzaron la confluencia, los cultivos se alimentaron con medio de cultivo celular fresco (EMEM+10%FBS+1% P/S, 1% L-Glutamina, 1% de aminoácidos no esenciales). Azelastina-HCI (Seleckchem cat# S2552, solución de reserva 10 mM disuelta en DMSO) y sulfato de hidroxicloroquina (TCI cat.# H1306, reserva 10 mM disuelta en H2O y filtrado estéril) se agregaron al medio de cultivo celular a concentraciones finales de 50 y 25 pM (se prepararon diluciones en medio de cultivo). El sulfato de hidroxicloroquina tiene un fuerte efecto anti-SARS-CoV-2 en las células Vero E6 (que no expresan TMPRSS2), pero pierde significativamente su potencia cuando se prueba en células que expresan la proteasa de superficie TMPRSS2, incluidas las células Calu-3 (ref. Hoffman et al. Naturaleza 2020, 585:588-590).

La reserva de virus se preparó por propagación en células Vero E6 y se determinó el título infeccioso. Para la infección viral, el virus SARS-CoV-2 se agregó al sobrenadante a MOI 0.01 (multiplicidad de infección: 1 partícula viral por 100 células) inmediatamente después del intercambio del medio de cultivo (básicamente de manera simultánea). Después de 30 min de incubación con el virus, se retiró el medio de cultivo y se reemplazó con medio de cultivo fresco que contenía Azelastina-HCl o sulfato de hidroxicloroquina en las concentraciones anteriores. 48 horas después de la infección, los sobrenadantes se recogieron y almacenaron a -80 °C para el análisis PCR cuantitativo. El ARN viral se extrajo de las muestras de sobrenadante de cultivo con el kit Monarch Total RNA Miniprep (New England BioLabs, Cat#: T2010S) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se mezclaron 300 pl de tampón de lisis con 100 pl de sobrenadante de cultivo, se eliminó la contaminación de ADNg con la columna dedicada (reteniendo el ADN) y se aplicó el flujo continuo que contenía ARN a la columna de unión al ARN. Después de lavar la columna, el ARN se eluyó con H2O, y las muestras se almacenaron a -80 °C hasta su análisis. Después de la reacción de transcripción inversa, el ADN se amplificó con los cebadores F, R y P2 del gen RdRp utilizando el kit avanzado para sondas RT-ddPCR de 1 Etapa (BioRad ddPCR™, cat# 1864021 y 1864022, https://www.bio-rad.com/de-at/product/1-step-rt-ddpcr-advanced-kit-for-probes?ID=NTGCRI15).

Los resultados de la reacción de RT-PCR se cuantificaron y calcularon como número de copias virales/pl y se compararon con el número de copias medido en células infectadas tratadas de forma simulada (tampón) (control positivo).

Simultáneamente, se midió la supervivencia celular en células Calu-3 no infectadas tratadas con azelastina-HCl o sulfato de hidroxicloroquina durante 48 h, con el Ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo® 2.0 (Promega® cat.# G9241) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se añadió el reactivo CellTiter-Glo® 2.0 a las células en un volumen igual al del medio y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se midió la señal de luminiscencia y se comparó con la señal medida con células no tratadas (control negativo).

Resultados:

El análisis de PCR cuantitativo reveló que Azelastina-HCI fue muy eficaz para reducir el número de partículas virales en células de adenocarcinoma de pulmón humano hasta >99 % a una concentración de 50 pM y más del 90 % a una concentración de 25 pM (Figura 6), lo que confirma que Azelastina ejerce su efecto anti-SARS-CoV-2 en células epiteliales respiratorias humanas que expresan la proteasa de superficie TMPRSS2 y la más relevante para la infección por SARS-CoV-2.

Ejemplo 6: Prevención y tratamiento de la infección de células HEp-2 por el virus respiratorio sincitial (RSV)

Para confirmar el amplio efecto antiviral de azelastina-HCI, se infectaron células HEp-2 (ATCC CCL-23) con RSV en ausencia o presencia de azelastina-HCI. Azelastina-HCl se probó en 3 ajustes: preventivo (tratamiento con azelastina-HCl seguido de infección), coadministración (células infectadas y tratadas con azelastina-HCl simultáneamente) y en ajustes terapéuticos (células infectadas tratadas con azelastina-HCl 1 hora después de la infección). Se determinó el número de manchas y el número de copias del genoma viral y se compararon con las células tratadas con tampón.

Procedimiento experimental:

Se probó la actividad anti-RSV de Azelastina-HCI (Sigma cat# PHR1636-1G) en el rango de concentración de 0.4 a 25 pM, utilizando una reserva de 10 mM preparada en DMSO.

Se sembraron 1 x 104 células HEp-2 (ATCC CCL-23) en placas de 96 pocillos y se cultivaron en 50 pl/pocillo de medio DMEM suplementado con FCS al 10 % y L-glutamina 2 mM a 37 °C y CO2 al 5 % y 100% de humedad durante 3 horas. Después de 3 horas, las células alcanzaron la adherencia y se infectaron con la cepa RSV Long (ATCC VR-26, proporcionada amablemente por T. Grunwald, Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, Leipzig, Alemania) a MOI 0.01. Se añadió Azelastina-HCl a las células 1 hora antes de la infección, simultáneamente con la infección o 1 hora después de la infección. La reserva de azelastina-HCl se diluyó en serie con medios de cultivo (DMEM/FCS al 10 %/L-glutamina 2 mM) para alcanzar la concentración final deseada. El DMSO se diluyó de la misma manera y se añadió a las células como vehículo de control. Las células infectadas y tratadas en un volumen total de 200 pl se incubaron durante 48 h a 37 °C al 5 % de CO2 y 100% de humedad. Las placas infectadas por RSV se determinaron mediante tinción inmunocitoquímica con anticuerpo de cabra policlonal contra RSV (anti-RSV Gt X (IgG Frac), Merck) y anti-IgG de cabra policlonal de conejo conjugado con HRP (Novusbio). Se usó 3-amino-9-etilcarbazol (AEC, Sigma) como cromógeno en inmunohistoquímica para visualizar células infectadas por RSV. Las manchas se contaron manualmente. El número de copias del genoma viral se determinó mediante RT-PCR utilizando los cebadores RSV-1 (5'-AGA TCA ACT TCT GTC ATC CAG CAA-3', SEQ ID NO:18) y RSV-2 (5'-GCA CAT CAT AAT ^{TAG GAG TAT} C^aA ^{T-3', SEQ ID NO:19) como se describió previamente por Wilmschen et al. (Vaccines, 2019, 7:59).} El valor de Ct obtenido después del tratamiento con azelastina-HCl se comparó solo con las células tratadas con vehículo. Para calcular el número de copias del genoma viral en las muestras tratadas en relación con el vehículo, se utilizó la siguiente ecuación: un aumento de 1 Ct equivale a un 50 % menos de número de copias.

La citotoxicidad de la azelastina-HCl frente a las células HEp-2 se determinó con un ensayo basado en citometría de flujo utilizando el colorante vital yoduro de propidio.

Los experimentos se realizaron 3-4 veces de forma independiente.

Resultados:

Azelastina-HCl mostró citotoxicidad para las células HEp-2 a concentraciones de 12.8 y 25.6 pM (Fig. 7). Por lo tanto, el efecto de la azelastina-HCl se evaluó a concentraciones de 6.4 pM y menores. La infección de células por RSV, determinada por recuento de manchas, se redujo a ~ 50 % a concentraciones de 3.2 y 6.4 pM en comparación con los controles tratados con vehículo (DMSO) (Fig. 8) en los 3 ajustes, lo que sugiere un potente efecto preventivo y terapéutico de azelastina-HCl en la infección por RSV de células HEp-2. La determinación del número de copias del genoma viral confirmó este efecto a una concentración de azelastina-HCl de 6.4 pM (Tabla 6).

Tabla 6. Efecto del tratamiento con azelastina-HCl 6.4 pM sobre el número de copias del genoma viral en células HEp-2 infectadas con RSV

Ejemplo 7. Prevención de la infección de MucilAir™ por el virus de la influenza A H1N1

El efecto de dosis repetidas de aerosol nasal de Azelastina-HCl (Pollival, UrsaPharm Arzneimittel) sobre la infección por influenza H1N1 se probó en células epiteliales nasales humanas completamente diferenciadas cultivadas en la interfase aire-líquido (MucilAir™ Pool, Epithelix Sarl- células primarias de un grupo de 14 donantes nasales normales diferentes).

Procedimiento experimental:

El efecto antiviral de la azelastina-HCl contra la influenza H1N1 se probó según lo descrito por Boda et al (Antiviral Research 156 (2018) 72-79). En resumen, después del lavado apical del grupo MucilAir™ con medio de cultivo MucilAir™ (200 pl durante 10 min), 10 pl de Azelastine-HCl a una concentración de 0.02 o 0.01 % diluida del aerosol nasal Pollival® (Ursapharm Arzneimittel GmbH) con su propio diluyente se aplicó al lado apical de MucilAir™ durante 10 minutos. Posteriormente, 100 pl de influenza H1N1 (ATCC VR-95), de una reserva de 106 número de copias del genoma por ml) se aplicó en el lado apical y se incubó durante 3 h. El inóculo se limpió lavando el lado apical de las células con 200 pl de medio de cultivo MucilAir (20 min de incubación) tres veces. Después del 3er lavado, se añadió la misma concentración de azelastina-HCl al lado apical de las células en un volumen de 10 pl y se incubaron durante 21 horas. A los puntyos de tiempo de 24 h, 48 y 72 h, se repitieron los lavados de células con MucilAir™, después de lo cual se reemplazó la azelastina en el lado apical como antes. Los números de copias virales se determinaron a partir de los lavados apicales en cada punto de tiempo. El medio de cultivo basal también se eliminó y se reemplazó con 500 pl de medio de cultivo fresco, diariamente. A partir del lavado basal se midió la liberación de l Dh (para evaluar la muerte celular a las 96 h) así como se determinaron los niveles de citoquinas (IL-8 y RANTES) en los puntos de tiempo de 48 hy 96 h. Todas las etapas de incubación se llevaron a cabo a 34°C al 5% de CO2 y al 100% de humedad. El número de copias virales se determinó a partir del lavado apical: para ello se extrajo el ARN con el Kit de ARN viral QlAamp® (Qiagen) y el ARN viral se cuantificó por RT-PCR (QuantyTect Probe RT-PCR, Qiagen) con el sistema de detección qTOWER3. Los datos de Ct se informaron en la curva estándar y se expresaron como número de copias del genoma/ml.

Como control negativo, se incluyeron células no infectadas. Como control positivo, se usaron células infectadas con influenza H1N1 pero tratadas solo con tampón. El efecto antiviral de la azelastina-HCl se comparó con el efecto del carboxilato de oseltamivir (oseltamivir de Carbosynth, Compton, Reino Unido, a 10 pM) añadido a las células infectadas en el compartimento basolateral. Los compuestos se ensayaron por triplicado.

Resultados:

El tratamiento de las células de MucilAir™ con azelastina-HCl en ambas concentraciones dieron como resultado una disminución estadísticamente significativa en la copia del genoma viral a las 24 h después de la infección, en comparación con las células tratadas con tampón. La disminución en la copia viral fue ~1.9 log (reducción del 98.74 %) con azelastina-HCl al 0.02 % y ~0.9 log (87.4 % de reducción) con azelastina-HCl al 0.01 % (Figura 9).

Además, la azelastina-HCl mostró un efecto antiinflamatorio durante la infección por H1N1 de MucilAir™; tanto los niveles de IL-8 (Figura 10/A) como de RANTES (Figura 10/B) se redujeron significativamente en comparación con el control de tampón en el día 2 y el día 4 después de la infección.

La Azelastina-HCl a una concentración del 0.02 % mostró una ligera citotoxicidad (6.5 %) en las células no infectadas, pero ninguna citotoxicidad en las células infectadas o en la concentración más baja (0.01 %).

Ejemplo 8: Prevención y tratamiento de la infección de células A549 por adenovirus

Para confirmar el amplio efecto antiviral de Azelastina-HCl, se infectaron células de carcinoma de pulmón humano (A549) con adenovirus en ausencia o presencia de Azelastina-HCl. La Azelastina-HCl se probó tanto en la coadministración como en un ajuste terapéutico.

Procedimiento experimental:

Se probó Azelastina-HCI (Sigma cat# PHR1636-1G) para la actividad anti-adenovirus en el rango de concentración de 0.78 a 50 pM, utilizando una reserva de 10 mM preparada en DMSO.

Se sembraron 3x104 células A549 (ATCC CCL-185™) en placas de 96 pocillos en 100 pl de medio de crecimiento completo (DMEM, glucosa alta, suplemento GlutaMAX™, con 10 % FBS, CALIFICADO, HI 500ML,Catálogo#: 10500064, Lote#: 08Q6291K) e incubarono a 37 °C con 5 % de CO2 y 100% de humedad. 24 h después, se añadieron 25 pl de medio fresco a las células con MOI 0.01 TCID50 de adenovirus hAdv5 (ATCC VR-5) para iniciar la infección. En el ajuste de coadministración, se añadieron a las células 25 pl de azelastina-HCl diluido en medio de crecimiento completo simultáneamente con la infección. En el ajuste terapéutico, se añadió azelastina-HCl a las células 6 horas después de la infección. Las células se incubaron 48 horas después de la infección a 37 °C al 5 % de CO2 y 100% de humedad. Posteriormente, la placa se congeló a -80 °C y el virus se liberó de las células mediante ciclos de congelación-descongelación de 3 veces. El título de virus se determinó mediante el Kit Adeno-X™ Rapid Titer (3 repeticiones por pocillo, Clontech, Takara Bio, cat. # PT3651-2) siguiendo las instrucciones del fabricante.

La citotoxicidad de azelastina frente a células A549 no infectadas se determinó con el ensayo CellTiter Glo (Promega, EE. UU.) usando el mismo protocolo que se describió anteriormente, solo que sin infectar las células con adenovirus.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de Azelastina en una cantidad eficaz antiviral de 0.1 - 500 pg por dosis, para uso como sustancia antiviral en una preparación farmacéutica para uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de un sujeto que necesita tratamiento anti-SARS-CoV-2, en donde el compuesto de Azelastina es Azelastina, o una de sus sales farmacéuticamente aceptable.

2. El compuesto de Azelastina para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se trata una condición de enfermedad que es causada por o asociada con una infección por SARS-CoV-2.

3. El compuesto de Azelastina para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la preparación farmacéutica es un producto medicinal o un producto fármaco que comprende el compuesto de Azelastina y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. El compuesto de Azelastina para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde se trata profiláctica o terapéuticamente una enfermedad que es un resfriado común, infección de la nariz, sinusitis, garganta y laringe, bronquiolitis, diarrea, erupción en la piel o neumonía, síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS).

5. El compuesto de Azelastina para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha preparación farmacéutica se formula para administración local, preferiblemente en las mucosas.

6. El compuesto de Azelastina para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha preparación farmacéutica está formulada para su aplicación en el tracto respiratorio superior e inferior, uso nasal, pulmonar, intraoral, ocular o dérmico.

7. El compuesto de Azelastina para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha preparación farmacéutica se administra al sujeto como un aerosol, un polvo, un gel, un ungüento, una crema, una espuma o una solución líquida, una loción, una solución para hacer gárgaras, un polvo en aerosol, una formulación líquida en aerosol, gránulos, cápsulas, gotas, tabletas, jarabe, comprimidos para deshacer en la boca, o gotas para los ojos.

8. El compuesto de Azelastina para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el compuesto de Azelastina se aplica mediante un aerosol nasal.

9. El compuesto de Azelastina para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el compuesto de Azelastina se administra como la única sustancia antiviral, o en donde el tratamiento se combina con un tratamiento adicional con una o más sustancias activas, preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en sustancias antivirales, antiinflamatorias y antibióticas.

10. El compuesto de Azelastina para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde se trata a un sujeto que ha sido infectado o está en riesgo de ser infectado con SARS-CoV-2.

11. El compuesto de Azelastina para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el sujeto es un ser humano, perro, gato, caballo, camélido, ganado vacuno o cerdo.