CN114533741A

CN114533741A - 孕酮的抗病毒用途

Info

Publication number: CN114533741A
Application number: CN202011338944.1A
Authority: CN
Inventors: 褚贝贝; 王江; 杨国宇; 苏冰倩; 钟远
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2020-11-25
Filing date: 2020-11-25
Publication date: 2022-05-27

Abstract

本发明涉及孕酮及其结构类似物在制备用于抑制囊膜病毒进入细胞的试剂中的用途。本发明还涉及孕酮及其结构类似物在制备用于在对象中抗囊膜病毒感染的药物中的用途。本发明证实孕酮能够在无毒范围内有效的抑制囊膜病毒对细胞的侵入和细胞内的增殖，这使得其今后在相关生物学研究以及抗病毒药物领域均具有广泛的应用前景。

Description

孕酮的抗病毒用途

技术领域

本发明涉及孕酮的抗病毒用途，特别是其在抑制囊膜病毒进入细胞由此发挥抗病毒作用中的用途。

背景技术

病毒是危害人类和动物体最重要的病原，给公共安全及养殖业带来严重的威胁。这些病毒不仅包括熟知的流感病毒(正黏病毒科)、人单纯疱疹病毒(疱疹病毒科)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(动脉炎病毒科)，还包括一些其他科病毒如弹状病毒科，冠状病毒科，副黏病毒科，痘病毒科，非囊膜病毒都给人类带来巨大困扰。以流感病毒为例，其在人类中已流行传播了300多年，数年即有一次爆发流行，数十年则有一次全球性的大流行。每年可导致25万至50万例死亡，300万至500万重病例(Cao,DiPiro et al.2019,Klifa,Toubiana etal.2019,Worobey,Cox et al.2019)；又如猪繁殖与呼吸综合征病毒，大多导致仔猪的高死亡率和母猪的流产、产死胎、弱胎，严重威胁到规模化猪场的效益和安全，造成较大的经济损失(Guo,Chen et al.2018,Han,Xu et al.2019,Liang,Zhao et al.2019)。不仅如此，大多病毒如流感病毒，疱疹病毒，弹状病毒等宿主谱广，可以在人体和多种动物体内增殖传播，给人类造成巨大威胁。

接种疫苗和使用抗病毒药物是应对病毒流行的重要手段。然而由于病毒构造很简单、变异能力强，在流行前基本不可能大规模生产疫苗，对动物和人类健康构成持续威胁，随时可能引发新的动物疫情暴发和公共卫生危机。且目前，抗病毒药物主要以靶向病毒的功能性蛋白为主，即，针对每一个病毒需要研发针对性的药物。这种抗病毒药物虽然可以达到很高的特异性和选择性，但长期大量使用往往会出现耐药性。针对不同的病毒开发不同的药物，研发周期长，成本也高。病毒作为寄生生活的生物体，必须依赖宿主细胞的资源进行繁殖。

因此，本领域急需针对病毒赖以生存的宿主细胞设计的小分子药物便以得到广谱抗病毒药物。

发明内容

本发明人在对孕酮作为动物妊娠关键免疫调节剂作用研究时，意外地发现了孕酮可以阻止病毒进入细胞。进一步的研究显示，这种阻止作用并非适用于所有的病毒，其尤其针对囊膜病毒十分有效。

因此，一方面，本发明提供了孕酮及其结构类似物在制备用于抑制囊膜病毒进入细胞的试剂中的用途。

另一方面，本发明提供了孕酮及其结构类似物在制备用于在对象中抗囊膜病毒感染的药物中的用途。

在一个实施方式中，所述抑制囊膜病毒进入细胞为抑制囊膜病毒对细胞的吸附。

在一个实施方式中，所述试剂为用于研究目的，特别是生物学和药学领域研究的试剂。

在一个实施方式中，所述抗囊膜病毒感染包括抗所述囊膜病毒对细胞的吸附。

在一个实施方式中，所述孕酮的结构类似物选自以下组中：去氢孕酮(Dydrogesterone)、醋酸烯诺孕酮(Nestoron)、甲羟孕酮(Medroxy progesterone)、醋酸氯地孕酮(Chlormadinone acetate)、醋酸甲地孕酮(Megestrol acetate)、醋酸环丙孕酮(Cyproterone acetate)、和11β-羟孕酮(11β-Hydroxyprogesterone)。

在一个实施方式中，所述囊膜病毒为选自由以下组成的组的病毒：正粘病毒、副粘病毒、冠状病毒、疱疹病毒、动脉炎病毒、痘病毒、弹状病毒和流感病毒；更优选为选自由以下组成的组的病毒：水泡性口炎病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、鼠痘病毒、新城疫病毒、伪狂犬病毒和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒。

在一个实施方式中，所述对象是哺乳动物，优选是猪或人。

本发明已证实孕酮及其结构类似物可以阻止囊膜病毒进入细胞，而且能够对于多种囊膜病毒产生广谱的抗病毒作用。

附图说明

图1孕酮的体内及体外毒性检测；

图2孕酮显著抑制囊膜病毒增殖；

图3孕酮显著抑制PRV病毒进入；

图4孕酮结构类似物显著抑制病毒增殖；和

图5孕酮在体内抑制PRV病毒的增殖。

具体实施方式

现在详细地参照本发明的代表性实施方案描述本发明。这些实施方案仅仅是例示性的，不应理解为以任何方式限制本发明的范围。相反地，本发明意图涵盖权利要求书所限定的在本发明范围内的所有替代、修改和等同。

除非另外指明，本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。

一方面，本发明提供了孕酮及其结构类似物在制备用于抑制囊膜病毒进入细胞的试剂中的用途。

在本文中，术语“孕酮(Progesterone)”也可以称为黄体酮、孕酮激素、或者黄体激素，是孕激素的一种，其具有以下结构，

术语“孕酮的结构类似物”是指具有与孕酮相同的母核结构，但是具有额外的修饰的化合物。孕酮的结构类似物包括但不限于去氢孕酮(Dydrogesterone)、醋酸烯诺孕酮(Nestoron)、甲羟孕酮(Medroxy progesterone)、醋酸氯地孕酮(Chlormadinoneacetate)、醋酸甲地孕酮(Megestrol acetate)、醋酸环丙孕酮(Cyproterone acetate)、和11β-羟孕酮(11β-Hydroxyprogesterone)。

病毒主要由蛋白质和DNA(或者RNA)组成，而所谓病毒的复制其实是指病毒的遗传物质。病毒是以其基因为模版，借DNA多聚酶或RNA多聚酶以及其他必要因素，指令细胞停止合成细胞的蛋白质与核酸，转为复制病毒的基因组，转录、转译出相应的病毒蛋白，最终释放出子代病毒。从病毒进入宿主细胞开始，经过基因组复制到释放出来，为一个复制周期。病毒生活周期简单分4个步骤：吸附和穿入、脱壳、生物合成、组装成熟和释放。

在本文中，术语“囊膜病毒”是指病毒外层具有囊膜的一类病毒的统称。病毒囊膜的主要功能是帮助病毒进入宿主细胞。进入涉及的机理可能包括首先包膜表面上的糖蛋白识别并结合宿主表面受体，接着病毒包膜与宿主细胞膜结合，最后病毒衣壳和病毒基因组进入宿主，完成感染过程。

在一个实施方式中，所述病毒为囊膜病毒。

在一个实施方式中，所述囊膜病毒为选自由以下组成的组的病毒：正粘病毒、副粘病毒、冠状病毒、疱疹病毒、动脉炎病毒、痘病毒和流感病毒。

在一个实施方式中，所述囊膜病毒为选自由以下组成的组的病毒：水泡性口炎病毒、流感病毒、伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和单纯疱疹病毒。

不受任何理论束缚，本发明人认为孕酮对于对病毒侵入细胞的抑制作用或许与孕酮可以抑制细胞膜上Ca²⁺通道蛋白的表达有关。异常的蛋白表达会造成细胞内Ca²⁺水平的紊乱，进而影响细胞对病毒的内吞过程。基于这种原理的假设，推测孕酮对于所有囊膜病毒均应该有抑制其进入细胞的作用。后续实验也证实了这一假设，孕酮对于包括水泡性口炎病毒、鼠痘病毒、伪狂犬病毒和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒在内的多种囊膜病毒均有此作用。由此，孕酮是一种具有广谱性的抗病毒活性化合物。

在本文中，术语“试剂”为用于研究目的，特别是生物学和药学领域研究的试剂，不包括药物。在一个实施方式中，所述试剂为用于研究目的，特别是生物学和药学领域研究的试剂。

另一方面，本发明提供了孕酮及其结构类似物在制备用于在对象中抗囊膜病毒感染的药物中的用途

在本发明中，除非另有说明，术语“抗囊膜病毒感染”包括阻止病毒侵入/进入对象的细胞、在对象的细胞中复制，以及阻止囊膜病毒在对象的细胞中增殖。在一个实施方式中，所述抗囊膜病毒感染为抗所述囊膜病毒进入对象的细胞，抑制所述囊膜病毒在对象的细胞中复制，以及抑制所述囊膜病毒在对象的细胞中增殖。特别地，本发明证实孕酮显著抑制病毒生活周期的早期进入阶段，将病毒拒之于细胞之外，相比于现有的很多抗病毒药物，这可以大大降低对宿主细胞伤害。

在本发明中，术语“抗囊膜病毒感染”还涵盖出于预防性目的对于囊膜病毒感染进行的预防，以及出于治疗性目的对于囊膜病毒感染进行的治疗。上述的术语“治疗”是指疾病、病症或病理状态的完全或部分治愈或消除，包括但不限于选自下列中的一种、或者两种或更多种的组合：减轻或消除引起疾病、病症或病理状态的病因；改善或消除其病理学改变；减轻或消除其一种或多种症状；延缓或停滞其进展；减轻其严重性；降低其发病率；减少其复发；以及改善其预后。术语“预防”是指防止所述疾病、病症或病理状态的发生。

本发明的这种抗病毒感染的方法不同于现有技术中已有的，例如针对某一特定病毒定向涉及的药物，而是通过阻止囊膜病毒进入对象的细胞，来实现对多种不同囊膜病毒的广谱抑制。

本文所用的术语“对象”是指哺乳动物，包括但不限于灵长类动物(如人、猴、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿动物(如大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、白鼬和类似啮齿动物)、兔形目动物、猪科动物(如猪、小型猪)、马科动物、犬科动物、猫科动物等。在一个实施方式中，所述对象是哺乳动物。在一个实施方式中，所述哺乳动物为猪或人。

在一个实施方式中，本发明还涉及治疗或预防有此需要的对象的囊膜病毒感染的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗/预防有效量的孕酮及其结构类似物。

如本文中，术语“治疗/预防有效量”指被给药后会实现所述用途或方法所期望的治疗/预防效力的活性成分的量。在本文所述的用途或方法中，所述孕酮及其结构类似物和/或所述一种或多种其他抗病毒药物的剂量一般取决于多种因素，包括所治疗的个体、病症或病况的严重性、给药的速率及处方医师的判断。

本发明的“药物”可以进一步包括一种或多种其它孕酮结构类似物，和/或一种或多种抗病毒药物，和/或一种或多种药学上可接受/兽医学上可接受的辅料。在一个实施方式中，本发明的药物包括孕酮(可选地一种或多种孕酮结构类似物)与其它一种或多种抗病毒药物的组合。在一个实施方式中，本发明的药物包括孕酮(可选地一种或多种孕酮结构类似物)与一种或多种药学上可接受/兽医学上可接受的辅料的组合。在一个实施方式中，本发明的药物包括孕酮(可选地一种或多种孕酮结构类似物)与其它一种或多种抗病毒药物和一种或多种药学上可接受/兽医学上可接受的辅料的组合。在本文中，术语“药学上可接受/兽医学上可接受的辅料”是本领域技术人员根据常规制药方法可以确定的物质。

本发明已证实孕酮能够在无毒范围内有效的抑制囊膜病毒对细胞的侵入和细胞内的增殖，这使得其今后在相关生物学研究以及抗病毒药物领域均具有广泛的应用前景。

下面通过实施例更详细地说明本发明，但这些实施例并不对本发明构成任何限制，本发明的范围仅由权利要求书定义。

实施例

实施例1孕酮的体内及体外毒性检测

1、实验材料

1.1细胞，化合物，试剂盒

PK15(猪肾上皮细胞)、3D4/21(猪肺泡巨噬细胞)细胞均购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)；CCK试剂盒(ZP328)购自于北京庄盟国际生物基因科技有限公司；孕酮(Progesterone)购自SIGMA公司。Balb/C小鼠(购自郑州大学)、输液器针头、4％PFA、1×PBS、固定四肢用的针头(4个)、剪刀2把、中号钝头镊子1把、小号镊子1把、酒精喷壶、30ml注射器2个、麻醉用乙醚。

1.2实验仪器

Varioskan Flash光谱扫描多功能读数仪(Thermo Fisher,USA)；荧光显微镜(OLYMPUS)。

1.3实验试剂配方

a)苏木精染液

苏木精	2.0g
		95％乙醇	100ml
硫酸铝钾	3.0g
		蒸馏水	100ml
甘油	100ml
		冰醋酸	10ml

称取2g苏木精溶于100ml 95％乙醇中，待溶解后依次加入硫酸铝钾3g，蒸馏水100ml。微波炉加热2min，使其加速溶解，加甘油100ml，冰醋酸10ml，混匀。冷却后过滤，暴露于空气中氧化2周可用。

a)1％盐酸酒精：100ml 75％乙醇中加入1滴/1ml盐酸。

b)0.5％伊红酒精溶液：伊红0.5-1.0g，蒸馏水100ml，充分搅拌至伊红溶液起泡沫后，过滤、除去残渣，取滤液备用。使用前每100ml滴1滴冰醋酸。

c)30％蔗糖溶液：30g蔗糖，1×PBS 100ml，充分溶解。

d)10％甲醛溶液：10ml甲醛，90ml双蒸水。

e)70％乙醇：70ml乙醇，30ml双蒸水。

2、实验方法与结果

2.1细胞培养：PK15细胞在37℃、5％CO₂加湿培养箱中培养，使用含有10％FBS、100U/ml的青霉素和链霉素的DMEM(CORING)培养基；3D4/21细胞在含有10％胎牛血清(PAN)的RPIM 1640(CORING)中培养。细胞至90％汇合度后传代，传代比例1/3-1/4。

2.2孕酮的细胞毒性检测：将细胞按照5ⅹ10³细胞/孔(体积100μl)接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用；用细胞维持液(培养基+2％血清)将孕酮按照0、1、3、10、30μM不同的浓度梯度配制，每个梯度浓度设2个重复孔，分别于药物处理后12、24、36、48、60、72h于培养上清中加入10μl/孔的CCK试剂，置细胞培养箱中培养2h，用Varioskan Flash光谱扫描多功能读数仪读取吸光值，计算细胞存活率。

结果显示(图1B,C)孕酮在30μM范围内、60h前对PK15和3D4/21细胞完全没有细胞毒性，确定了孕酮具有比较安全的使用范围。

在后续实验中，给药剂量按照细胞实验用量为0-30μM。

2.3孕酮处理小鼠体重变化：4-6周龄实验小鼠正常饲喂一周后按体重均分为三组(6只/组)，然后三组分别按0、3、6mg/kg腹腔注射孕酮，3天一次，每天称量小鼠体重并作图。

结果如图1D所示，3mg/kg及6mg/kg孕酮注射小鼠与对照组小鼠相比体重变化几乎无差异,说明孕酮对小鼠具有比较较好的安全范围。

2.4小鼠灌注固定

灌注固定步骤包括1)麻醉；2)固定；3)开胸腔；4)PBS灌注；5)PFA灌注；和6)灌注完成后取心、肝、脾、肺、肾、大脑、小脑、延髓浸入50ml离心管继续固定。

2.5HE染色

1)取材固定

将组织块置于10倍体积以上的4％多聚甲醛溶液中，固定24h。

2)脱水

组织固定后，用流水冲洗一夜，再依次经过梯度酒精脱水。

3)透明

1/2二甲苯+1/2无水乙醇5min，纯二甲苯10min，更换纯二甲苯10min

4)浸蜡

将透明好的组织块浸入盛有石蜡的玻璃瓶中，1/2石蜡+1/2二甲苯半小时，全石蜡1.5h，更换全石蜡1h。

5)包埋、修块

6)切片：厚度5-8μm，刀片倾斜角度为10°～15°。

7)摊片

8)HE染色

9)封片

将切片从二甲苯中取出，擦去组织周围的二甲苯，在组织上滴一小滴树脂，盖上盖玻片。切片封好后，放在切片托盘上待干燥，即可用于观察。

10)染色结果：

细胞核呈蓝色，细胞质呈红色。

结果如图1E所示，HE染色结果表明3mg/kg及6mg/kg孕酮注射小鼠与对照组小鼠相比各个脏器均较正常，无差异。

实施例2、孕酮显著抑制囊膜病毒增殖

1实验材料

水泡性口炎病毒VSV-GFP由河南农业大学李永涛老师馈赠；伪狂犬病毒PRVHN1201由普莱柯生物工程股份有限公司田克恭老师馈赠；猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒PRRSVBJ-4由西北农林大学馈赠；伪狂犬病毒PRV-GFP由武汉病毒所馈赠；鼠痘病毒(ectromeliavirus,ECTV)由本实验室病料分离所得；ADV5-GFP购买于汉恒生物科技有限公司；PK15和Vero细胞系均购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。

2实验仪器

Amersham Imager 600显色仪(GE Healthcare)；LSM800激光共聚焦显微镜(ZEISS)；Beckman CytoFLEX流式细胞仪。

3实验方法及结果

3.1病毒感染

a)化合物预处理细胞：用5％FBS培养基稀释孕酮至不同浓度，然后加入到24孔板细胞中，每孔加入0.5ml，在5％CO₂培养箱中培养，预处理4h。

b)病毒感染：细胞计数：将计数孔中培养基弃去，加入300μl的胰蛋白酶，放于细胞培养箱中消化，然后用细胞计数板计数。病毒稀释：公式为{细胞个数×MOI(感染复数)}÷{TCID₅₀×V(加入病毒液体积)}计算每毫升培养基需要加入的病毒液体积。病毒液的配制需要用无血清的培养基稀释。

c)病毒吸附：用稀释好的病毒液，倍比稀释化合物孕酮。在加入病毒液稀释的化合物前，先用PBS洗一遍细胞，洗去预处理残留的血清及化合物。然后放入细胞培养箱中吸附1h。

d)换维持培养液：吸附1h后，先用PBS洗涤2遍细胞，加入1％FBS的含有不同浓度化合物的培养基。

不同病毒对应的感染细胞系及感染剂量如下：

PK15细胞，PRV-GFP、PRV HN1201(MOI＝0.1&1)；

PK15细胞，VSV-GFP(MOI＝0.001&0.01)；

PK15细胞，ADV5-GFP(MOI＝0.001)；

MARC-145细胞，PRRSV-BJ-4(MOI＝1&10)；

Vero细胞，ECTV(MOI＝1&10)。

3.2流式细胞仪检测病毒感染：用重组的含绿色荧光蛋白的病毒感染PK15细胞。病毒感染后12h，用PBS洗涤细胞并用胰蛋白酶溶液消化。然后离心收集细胞，并将细胞重悬于0.4ml新鲜PBS中。使用Beckman CytoFLEX流式细胞仪进行流式细胞检测GFP阳性细胞比例。使用CytExpert软件分析所得数据。

结果显示如图2A,B,I，孕酮不同浓度均能够显著抑制囊膜病毒PRV-GFP和VSV-GFP病毒的感染，但是对非囊膜病毒ADV5-GFP的增殖并没有显著抑制作用。

3.3病毒的收取

感染24-48h后，显微镜下观察培养板中细胞病变，当病变达到80-90％时，收取病毒。将培养板放入冰箱反复冻融2次，用移液枪吹打板底的细胞，吸出培养基和细胞至EP管中，3900g离心10min，将上清以120μl/管分装到2ml离心管中，-80℃保存时间更长。

3.4TCID₅₀测定

将细胞按1×10⁴细胞/孔种于96孔板，100μl/孔；准备12支干净、无菌的离心管；向每支离心管各加入900μl无FBS的培养基；将病毒倍比稀释10-1-10-12；取100μl病毒原液加入第一个离心管中，混匀，记为10-1稀释；将第一个离心管中的稀释液取100μl加入第二管，混匀，记为10-2稀释；将第二个离心管中的稀释液取100μl加入第三管，…，依次对病毒做12个梯度的倍比稀释至10-12；弃去旧培养基，将病毒稀释液以100μl/孔加入对应的细胞孔；37℃，5％CO₂培养箱中孵育；1h后弃去稀释病毒液，以150μl/孔加入维持液(含1％FBS的培养基)；37℃，5％CO₂培养箱中孵育；4-5天后观察记录病变孔数及稀释度，计算TCID₅₀。

计算方法：找到大于50％和小于50％病变的两列，然后计算比距。

比距＝(大于50％-50％)/(大于50％-小于50％)＝(6/8-4/8)/(6/8-3/8)＝2/3

结果显示如图2C,D,E,F中所示，孕酮不同浓度均能够显著抑制病毒PRV HN1201、VSV-GFP、PRRSV BJ-4和ECTV的感染。

3.5蛋白免疫印迹(western blot)

a)蛋白的收取(60mm dish)

i.提前准备工作，4℃离心机预冷，PBS预冷，取冰(所有操作在冰上进行)。

ii.弃掉每孔中的培养基，加1mL PBS，用细胞刮刮起细胞，吸取细胞液到1.5mL的EP管中，然后离心，条件4℃，1000g，5min。

iii.配RIPA(现配现用)举例如下：600μLRIPA+1.2μL PMSF(1:500)+0.6μLcocktail(1:1000)+0.6μL leu(1:1000)+0.6μL Mg132(1:1000)。

iv.弃离心管中的上清，加入RIPA裂解液120μL/管，然后用1mL注射器抽剪20次，吹打干净针管中的气泡，把针管放到水中抽进水。最高速13200g，10min，at 4℃。

v.吸取上清到1.5ml EP管中(91μL)，可-80℃保存，但是，一般情况当天进行BCA测浓度，然后变性(98℃，10min)，样品处理90μL+30μL 4×loading，有时间直接进行电泳，没时间-20℃保存。

b)BCA蛋白含量测定

按照北京鼎国昌盛生物技术有限公司使用说明书，进行测定(每次必须做标准曲线)。

c)SDS-PAGA电泳

按照实验室常用的免疫印迹方法配制免疫印迹所需试剂和胶。

在电泳槽中加入适量电泳缓冲液(Tank Buffer)1×Tank Buffer后小心拔出梳子，加入样品，用1×上样缓冲液补齐所有的孔(样品的最大体积)，连接电泳系统，先在120V、300mA、300W电压下进行，待溴酚蓝跑到分离胶之后，将电压调至160V、300mA、300W，等溴酚蓝指示剂跑到胶底时结束电泳。卸下胶板，小心剥离胶进行转膜。

d)注意事项

制胶前准备：将玻璃板、样品梳用洗涤剂洗净，用去离子水冲洗数次，再用酒精擦拭、晾干；将洗净的玻璃板在桌面上组装完毕放入玻板夹中，按紧后放入架子固定，即可配胶。倒胶，将制好所需浓度的聚丙烯酰胺分离胶(约5mL-7mL)吸加到两玻板的间隙(1.5mm)中，立即覆盖一层去离子水，置37℃聚合30min-45min，待分离胶凝固聚合后，倒出水，用吸水纸吸净残留去离子水，再将制好的浓缩胶加到分离胶之上，立即插入样品梳，避免样品梳与凝胶之间出现气泡，室温放置30min，等待胶凝固。

e)转膜

以湿转法介绍转膜(PVDF膜)步骤：膜浸泡在甲醇中5min左右；打开转膜架，用缓冲液(预冷的1×Trans Buffer)浸透海绵垫置于转膜架黑色筛孔板上，并依次按“下层海绵-滤纸-膜-凝胶-滤纸-上层海绵”的顺序装置好，避免产生气泡；将固定好的转膜架装入缓冲液槽，注满低温的转膜缓冲液；转膜时，胶对负极，100V、300mA、300W、70min，如转膜成功，则胶上有明显蛋白Marker痕迹。

f)封闭

加入5％的脱脂奶粉(1×TBST配的)，置于摇床振荡封闭1h。封闭结束，膜用1×TBST洗，10min洗2次，5min洗2次，

g)孵育一抗

一抗是用5％的BSA(1×TBST配制)1：500进行稀释的，振荡孵育4℃过夜。吸取一抗放-20℃保存，膜用TBST洗4次，10min洗2次，5min洗2次。

h)孵育二抗

5％的脱脂奶粉(1×TBST配的)1：5000稀释，转移脱色摇床室温振荡1h，1×TBST洗10min洗2次，5min洗2次，共洗4次。

i)采用Thermo的ECL显色试剂盒进行显色，合理调整曝光时间。

结果如图2G H所示，孕酮处理显著抑制PRV和PRRSV病毒的增殖。

实施例3、孕酮显著抑制PRV病毒进入

1、实验材料

1.1细胞，化合物，试剂盒

Cell-LightTM EdU Apollo567(C10338-1)试剂盒购自锐博生物科技有限公司；CellMaskTM质膜染料(C37608)购自分子探针；Mouse anti-PRV gE抗体由普莱柯生物工程股份有限公司田克恭老师馈赠；绝对定量标准质粒gH由本实验室构建；Mouse anti-actin抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；细胞基因组提取试剂盒购自莱枫生物科技有限公司。

2实验仪器

QuantStudioTM6 Flex实时荧光定量PCR仪(Thermo Fisher,USA)；AmershamImager 600显色仪(GE Healthcare)；LSM800激光共聚焦显微镜(ZEISS)。

3实验方法及结果

3.1EdU标记病毒基因组检测PRV病毒进入

a)EdU标记：对于EdU标记，将Vero细胞接种到T75培养瓶中。24h后，用含有20μM 5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)的培养基将病毒稀释至MOI＝30，感染细胞。24h后，通过两个冻融循环采集病毒，并用TCID₅₀测定病毒滴度。

b)EdU标记的PRV病毒进入：将PK15细胞接种在24孔板上，并放上爬片。细胞密度达到80％时，用10μg/ml的孕酮预处理4h，将细胞在冰上预冷1h。然后立即添加含有孕酮的预先冷却的EdU标记病毒(MOI＝15)，并在冰上孵育3h。弃去培养基，用预热的PBS洗两次细胞，然后加入含有孕酮的维持液，于温箱内化15min。取出细胞，立即用1ⅹCellMask^TM质膜染料室温染色15min，用4％PFA的固定细胞15min。细胞用PBS洗两次，将新制备的Apollo反应混合物在室温下避光孵育30min。用PBS洗涤细胞2次，然后用去离子水洗涤细胞2次。取载玻片，加一滴甘油，然后将爬片倒置其上，立即用激光共聚焦显微镜拍照，并用ZEN 2012图像处理软件进行处理，红色(EdU标记的PRV基因组)，绿色(质膜染料)。

如图3A结果显示孕酮处理可以抑制PRV病毒的进入，孕酮处理组大多病毒仍滞留在细胞膜。

3.2绝对定量法检测PRV病毒进入

以2ⅹ10⁵/孔将PK15细胞种于6孔板。当细胞密度至60％左右，用含孕酮的培养基处理细胞，37℃孵育6h。然后将细胞于4℃预冷1h，同时细胞计数，以MOI＝0.1计算所需PRVHN1201病毒量，用配好的病毒液稀释化合物，然后将病毒预冷1h。将细胞用预冷的PBS洗一遍，然后4℃吸附预冷的病毒液1h。PBS洗细胞3次，换成含有孕酮的1％FBS的预热的DMEM，于37℃培养15min。使用细胞刮于冰上刮取6孔板中的细胞，按照莱枫细胞基因组提取试剂盒说明书提取细胞基因组，进行定量检测病毒增殖情况。

结果如图3B所示，PRV病毒的增殖明显受到孕酮加入的抑制，说明孕酮可以显著抑制PRV病毒进入宿主细胞。

3.3免疫印迹法检测PRV病毒进入

BCA蛋白含量测定按照北京鼎国昌盛生物技术有限公司试剂盒的使用说明书进行。

结果如图3C和3D，孕酮处理后病毒糖蛋白gE内化进入细胞的量显著减少，且呈剂量依赖性。

病毒滴度测定法检测PRV病毒进入

a)以1.6ⅹ10⁵/孔将PK15细胞种于12孔板。当细胞密度至60％左右，用不同浓度的孕酮处理细胞，37℃孵育6h。然后将细胞于4℃预冷1h，同时细胞计数，以MOI＝1计算所需PRV HN1201病毒量，然后将病毒预冷1h。细胞用预冷的PBS洗一遍，然后4℃吸附预冷的病毒液1h。PBS洗细胞3次，换成含有不同浓度孕酮的1％FBS的预热的DMEM，于37℃培养。观察细胞病变，当病变至60％左右，通过冻融法收集病毒，通过TCID₅₀检测病毒滴度。

b)TCID₅₀测定：将细胞按1×10⁴细胞/孔种于96孔板，100μl/孔；准备12支干净、无菌的离心管；向每支离心管各加入900μl无FBS的培养基；将病毒倍比稀释10-1-10-12；取100μl病毒原液加入第一个离心管中，混匀，记为10-1稀释；将第一个离心管中的稀释液取100μl加入第二管，混匀，记为10-2稀释；将第二个离心管中的稀释液取100μl加入第三管，…，依次对病毒做12个梯度的倍比稀释至10-12；弃去旧培养基，将病毒稀释液以100μl/孔加入对应的细胞孔；37℃，5％CO₂培养箱中孵育；1h后弃去稀释病毒液，以150μl/孔加入维持液(含1％FBS的培养基)；37℃，5％CO₂培养箱中孵育；4-5天后观察记录病变孔数及稀释度，计算TCID₅₀。

结果如图3F显示，孕酮处理可以显著并剂量依赖的抑制PRV对细胞的侵入。

实施例4、孕酮类似物显著抑制病毒增殖

1实验材料

伪狂犬病毒PRV-GFP由武汉病毒所馈赠；化合物去氢孕酮(Dydrogesterone)、醋酸烯诺孕酮(Nestoron)、甲羟孕酮(Medroxy progesterone)、醋酸氯地孕酮(Chlormadinoneacetate)、醋酸甲地孕酮(Megestrol acetate)、醋酸环丙孕酮(Cyproterone acetate)、11β-羟孕酮(11β-Hydroxyprogesterone)均购自试剂公司MCE。

2实验仪器

Beckman CytoFLEX流式细胞仪。

3实验方法及结果

3.1病毒感染

a)化合物预处理细胞：用5％FBS培养基稀释化合物至不同浓度，然后加入到24孔板细胞中，每孔加入0.5ml，在5％CO₂培养箱中培养，预处理4h。

3.2流式细胞仪检测病毒感染：病毒感染后12h，用PBS洗涤细胞并用胰蛋白酶溶液消化。然后离心收集细胞，并将细胞重悬于0.4ml新鲜PBS中。使用Beckman CytoFLEX流式细胞仪进行流式细胞检测GFP阳性细胞比例。使用CytExpert软件分析所得数据。

结果显示如图4所示，孕酮类似物不同浓度均能够显著抑制PRV-GFP病毒的感染。

实施例5、孕酮在体内抑制PRV病毒的增殖

1、实验材料

1.1细胞，化合物，试剂盒

Balb/C小鼠(购自郑州大学)、输液器针头、4％PFA、1×PBS、固定四肢用的针头(4个)、剪刀2把、中号钝头镊子1把、小号镊子1把、酒精喷壶、30ml注射器2个、麻醉用乙醚、pH6.0柠檬酸缓冲液(抗原修复缓冲液)、PRV重组病毒(含luciferase)由本实验室改造。

1.2实验仪器

荧光显微镜(OLYMPUS)、小动物活体成像仪PerkinElmer IVIS Lumina III。

2、实验方法与结果

2.1小鼠存活实验

8周龄实验小白鼠正常饲喂，腹腔注射孕酮(3mg/kg)周期为3天一次，并于第二次打药后小鼠滴鼻感染PRV(致死剂量)，观察15天统计存活率，结果如图5A。

2.2小鼠病毒感染及组织的采集

8周龄实验小鼠正常饲喂一周后按体重均分为三组(5只/组)，然后三组分别按0、0、3mg/kg腹腔注射孕酮，3天一次。并于第二次打药后小鼠滴鼻感染PRV(致死剂量)，于病毒感染后60h解剖小鼠，将肺组织置于4％多聚甲醛中，取其中一部分冷冻保存于-80℃冰箱，用于提取基因组。

2.3组织的基因组提取和检测

使用动物组织基因组提取试剂盒提取组织基因组，并以样品基因组为模板，以病毒基因gH设计引物，进行绝对定量分析。定量分析结果如图5C所示孕酮处理组有效减少了病毒在小鼠肺组织的增殖。

2.4组织的固定和保存

4％多聚甲醛4℃过夜固定肺组织，PBS缓冲液洗3次，每次10min至1h，于30％、50％乙醇中各10min至1h，4℃保存于70％乙醇中。

2.5组织的包埋、切片、展片及保存

固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54℃石蜡包埋，常规切片，切片厚5μm，贴于处理过的干净载玻片上，34℃烤片过夜，之后收集于载片盒中，4℃密封保存。

2.6石蜡组织切片染色

按照实验室常用步骤将石蜡组织切片并进行HE染色，染色后拍照结果如图5B所示，孕酮处理组有效减少了病毒感染所引起的肺组织炎性浸润。

石蜡组织切片脱蜡、复水步骤：

2.7抗原修复及抗体免疫染色(IHC)

1)将抗原修复缓冲液放入微波炉内煮沸2min,然后将复水后的组织放入缓冲液中，95-100℃持续加热15-20min。

2)缓慢冷却后，经蒸馏水洗2次后，用PBS浸泡5min，即可进行免疫组化抗体染色。

3)封闭和通透：用5％FBS,0.5％Triton的PBS室温处理组织1h。

4)一抗：用5％FBS,0.1％Triton的PBS按1:500稀释gB抗体，4℃过夜孵育组织，100-150μl/片。

5)漂洗：将片子放在片夹盒中(提前装入PBS)，浸泡5分钟每次，洗4次。

6)二抗：用5％FBS,0.1％Triton的PBS按1:1000稀释荧光二抗，室温避光孵育组织1-3h。

7)漂洗：将片子放在片夹盒中(提前装入PBS)，浸泡5分钟每次，洗4次。

8)核染：DAPI进行核染，室温避光10min。

9)漂洗：将片子放在片夹盒中(提前装入PBS)，浸泡5分钟每次，洗4次，蒸馏水洗1次。

10)抗荧光衰减封片剂，10ul/片。

11)利用激光共聚焦显微镜观察、拍照(绿色：PRV gB蛋白；蓝色：细胞核)。

结果如图5D所示，对照组小鼠肺组织中能够检测到PRV病毒gB蛋白，而孕酮处理组小鼠肺组织中几乎无病毒，说明孕酮能对PRV病毒的感染起到较好的保护作用。

2.8小鼠病毒感染及活体成像

8周龄实验小鼠正常饲喂一周后按体重均分为两组(5只/组)，然后三组分别按0、3mg/kg腹腔注射孕酮，3天一次。并于第二次打药后小鼠大腿肌肉注射PRV重组病毒(含luciferase)，于病毒感染后20h，于病毒感染部位注射荧光素酶底物，并于PerkinElmerIVIS Lumina III活体成像仪中进行拍照。结果如图5E所示对照组小鼠感染部位检测到更强的发光反应，而孕酮处理组小鼠组织中发光反应较弱，进一步说明说明孕酮能对PRV病毒的感染起到较好的保护作用。

在本申请中引用的所有出版物和专利申请指明了本公开内容所属领域的技术水平。它们都通过援引以其整体加入本文。

根据以上描述，本领域技术人员可确定本发明的必要特征，并可在不背离本发明精神和范围下对本发明进行各种变化和修改以使其适于各种用途和条件。所有这样的修改和修改也包括在本发明的范围中。因此，本发明的范围应当由所附的权利要求和它们的法律等同方案来确定。

Claims

1.孕酮及其结构类似物在制备用于抑制囊膜病毒进入细胞的试剂中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述孕酮的结构类似物选自以下组中：去氢孕酮(Dydrogesterone)、醋酸烯诺孕酮(Nestoron)、甲羟孕酮(Medroxy progesterone)、醋酸氯地孕酮(Chlormadinone acetate)、醋酸甲地孕酮(Megestrol acetate)、醋酸环丙孕酮(Cyproterone acetate)、和11β-羟孕酮(11β-Hydroxyprogesterone)。

3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述抑制囊膜病毒进入细胞为抑制囊膜病毒对细胞的吸附。

4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述囊膜病毒为选自由以下组成的组的病毒：正粘病毒、副粘病毒、冠状病毒、疱疹病毒、动脉炎病毒、痘病毒、弹状病毒和流感病毒；更优选为选自由以下组成的组的病毒：水泡性口炎病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、鼠痘病毒、新城疫病毒、伪狂犬病毒和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒。

5.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述试剂为用于研究目的，特别是生物学和药学领域研究的试剂。

6.孕酮及其结构类似物在制备用于在对象中抗囊膜病毒感染的药物中的用途；优选其中所述孕酮的结构类似物选自以下组中：去氢孕酮(Dydrogesterone)、醋酸烯诺孕酮(Nestoron)、甲羟孕酮(Medroxy progesterone)、醋酸氯地孕酮(Chlormadinoneacetate)、醋酸甲地孕酮(Megestrol acetate)、醋酸环丙孕酮(Cyproterone acetate)、和11β-羟孕酮(11β-Hydroxyprogesterone)。

7.如权利要求6所述的用途，其中所述抗囊膜病毒感染包括抗所述囊膜病毒对细胞的吸附。

8.如权利要求6或7所述的用途，其中所述囊膜病毒为选自由以下组成的组的病毒：正粘病毒、副粘病毒、冠状病毒、疱疹病毒、动脉炎病毒、痘病毒、弹状病毒和流感病毒；更优选为选自由以下组成的组的病毒：水泡性口炎病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、鼠痘病毒、新城疫病毒、伪狂犬病毒和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒。

9.如权利要求6-8中任一项所述的用途，其中所述对象是哺乳动物，优选是猪或人。