CN110403941B

CN110403941B - 一种广谱抗病毒药物或组合物

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Publication number: CN110403941B
Application number: CN201910664898.5A
Authority: CN
Inventors: 王晓佳; 薛彦; 李翠翠; 杨德吉; 路金金
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-07-23
Filing date: 2019-07-23
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2039-07-23
Also published as: CN110403941A

Abstract

本发明提供一种广谱抗病毒药物或组合物，所述药物或组合物的有效成分为化合物RAF265或其药学上可接受的盐。本发明首次发现RAF265具备广谱高效的抗病毒活性，可高效抑制6科类7种病毒(PRV、HSV‑1、PEDV、FMDV、NDV、VSV、IBDV)感染宿主细胞及小鼠，显著减少小鼠体内病毒量，减轻感染症状。且RAF265细胞毒性较低(CC₅₀/IC₅₀>100)，对鸡胚与小鼠无毒副作用。本发明提供的可高效对抗多种病毒感染的激酶抑制剂，在养殖业和生物医学领域具有广阔的应用前景。

Description

一种广谱抗病毒药物或组合物

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及一种广谱抗病毒药物或组合物。

背景技术

近年来广谱抗病毒制剂相关研究获得长足进展，突破了抗病毒制剂单一宿主，以及广谱类制剂活性相对较弱的瓶颈与限制，部分成果已面临应用。抗病毒制剂研究基于两方面设计，一是从病毒侵染层面，二是从宿主细胞防御层面。从宿主细胞防御层面研究抗病毒制剂，即通过改变或消除为病毒复制所需但是对细胞本身生长并不重要的蛋白或分子，以影响病毒的生命周期，从而达到抗病毒效果。针对宿主细胞的抗病毒制剂，可以在真正意义上达到广谱抗病毒的目的，且可最小化耐药性产生的可能性，因此成为病毒学领域的重要研究方向。Ras/Raf/Mek/Erk细胞信号转导通路对于病毒复制很重要，EGFR-PI3K-Erk1/2-ROCK-LIMK1/2-cofilin转导通路对于病毒入侵很重要。

PEDV、PRV、HSV-1等病毒传染性高，对养殖业和人类健康危害巨大，目前多无特效治疗药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种广谱抗病毒药物或组合物。

本发明的另一目的是提供化合物RAF265及其衍生物的应用。

本发明构思如下：发明人基于功能学筛选，发现激酶抑制剂RAF265可高效抑制病毒感染宿主细胞，IC₅₀为5μM，减少病毒滴度可达4个数量级，且细胞毒性低。RAF265是一种有效的选择性B-Raf(V600E)抑制剂，即特异性靶向Ras/Raf通路突变的细胞增殖和存活，且调节糖与嘧啶代谢。Ras/Raf/Mek/Erk信号级联是一条可被广泛激活的有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路，它能将细胞外信号传递入细胞核内；当细胞中的Raf活性被激活，可增加下游的Erk磷酸化水平，该通路下游关键调节因子Mnk激酶继而磷酸化eIF4E，使后者更倾向于启动帽子结构依赖性翻译。PEDV、PRV、HSV-1等多种病毒均可激活该通路，为病毒基因选择性翻译所用。EGFR-PI3K-Erk1/2-ROCK-LIMK1/2-cofilin转导通路介导的cofilin的磷酸化和去磷酸化，可触发细胞骨架F-actin的重排，许多病毒均可通过利用这个过程，促进自身入侵。本发明首次发现RAF265可通过影响上述2个通路以抑制多种病毒的入侵与复制。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种抗病毒药物或组合物，所述药物或组合物的有效成分为化合物RAF265或其药学上可接受的盐；化合物RAF265的结构如式(1)所示：

所述抗病毒药物或组合物可以是注射给药剂型(如肌注、皮下)，或腔道给药剂型(如口服)。

第二方面，本发明提供化合物RAF265及其衍生物的以下任一应用：

1)用于制备(广谱)抗病毒药物或组合物；

2)用于抗病毒感染，以及减轻、消除病毒感染症状。

所述病毒包括但不限于疱疹病毒科、冠状病毒科、小RNA病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科和双股RNA病毒科的病毒。例如，PRV(伪狂犬病病毒)、HSV(单纯疱疹病毒，如HSV-1型)、PEDV(猪流行性腹泻病毒)、FMDV(口蹄疫病毒)、NDV(新城疫病毒)、VSV(水泡性口炎病毒)、IBDV(鸡传染性法氏囊病病毒)等。

当RAF265的使用浓度为5-50μM时，可高效抑制6科类7种病毒(PRV、HSV-1、PEDV、FMDV、NDV、VSV、IBDV)感染宿主细胞(Vero细胞)，按10mg/kg体重给药量可高效抑制病毒感染小鼠，显著减轻甚至消除感染动物症状。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明首次发现激酶抑制剂RAF265具备广谱高效的抗病毒活性，可高效抑制6科类7种病毒(PRV、HSV-1、PEDV、FMDV、NDV、VSV、IBDV)感染宿主细胞及小鼠，显著减少小鼠体内的病毒量，减轻感染症状，为研制安全可靠的新型生物制剂提供备选。本发明为开发广谱高效抗病毒新药提供依据及可能，为保障农牧业可持续性发展与人类健康提供一种新的安全可靠的技术手段。

附图说明

图1为本发明实施例1中RAF265对PRV病毒毒力的影响。

其中，A：0.1MOI PRV感染Vero细胞，病毒感染时同时加入不同剂量的RAF265(0，10，25，50μM)，孵育1h后，弃掉上清，用PBS洗2遍，加入细胞维持液，细胞培养箱培养24h，观察细胞病变。可见，与不加药组相比，加药组细胞病变减少，且呈剂量依赖性。

B：0.1MOI PRV感染Vero细胞，病毒感染时同时加入DMSO和不同剂量的RAF265(5，10，25，50μM)，孵育1h后，弃掉上清，用PBS洗2遍，加入细胞维持液，细胞培养箱培养24h，进行免疫印迹分析(所用病毒蛋白抗体为PRV-gC)。结果表明，RAF265抑制gC蛋白表达且呈剂量依赖性。

C：经过如上同样处理后，将样品在-80℃反复冻融3次后检测病毒毒力。可见，与加入DMSO相比，加入25μM RAF265时级显著抑制PRV滴度，50μM时抑制病毒滴度达1000倍。

D：经过如上处理后，收集细胞，提取RNA，反转录，进行实时荧光定量PCR实验(RT-PCR)来检测病毒的RNA含量。结果表明，RAF265显著抑制PRV在细胞中的增殖。

E：6周龄小鼠感染PRV，设实验组与对照组，每组10只小鼠，实验组感染后每日口服给药RAF265，浓度为0.01mg/kg，3天后迅速推颈处死采集肝脏组织提取RNA，进行RT-PCR检测，测定肝脏中病毒蛋白US3的mRNA水平。结果显示，RAF265显著抑制PRV在小鼠体内的增殖。

F：将9日龄SPF鸡胚分为6组(3只/组)，每组分别注射RAF265药物0，100，200，300，400，500μM，在37℃培养箱培养10天后，将鸡胚取出观察。结果发现第10天取出的鸡胚无出血现象，表明药物注射入鸡胚10天之内，鸡胚活性良好。

G：取鸡胚肌肉组织作组织切片，结果显示肌肉组织均无炎症产生，这表明该一定剂量的Raf265对鸡胚无毒性作用。

图2为本发明实施例2中RAF265对HSV-1病毒毒力的影响。

其中，A：0.1MOI GFP-HSV-1病毒感染Vero细胞，感染同时，分别加入三种RAF抑制剂，即RAF265，CEP32496和BGB283，作用1h后，弃掉上清，并用PBS洗两遍，在细胞培养箱中培养24小时，荧光显微镜Olympus IX73观察病毒的复制情况，并收集细胞进行免疫印迹实验。结果表明，三种抑制剂中，RAF265抑制病毒效果最好，在25μM的剂量时，在荧光显微镜中几乎观察不到病毒粒子。

B：如上处理后进行免疫印迹分析，与其他两种抑制剂相比，RAF265具有较强的抑制效果。25μM剂量RAF265时可将HSV-1ICP8蛋白的表达抑制到几乎检测不到的水平。

C：0.1MOI HSV-1病毒感染Vero细胞，感染同时，加入不同剂量RAF265，作用1h后，弃掉上清，并用PBS洗两遍，在细胞培养箱中培养24小时，之后进行免疫印迹分析。结果表明，RAF265抑制HSV-1ICP8蛋白的表达且呈剂量依赖性。

D：经以上处理后在-80℃反复冻融3次后检测病毒毒力。可见，25μM剂量时，RAF265能够显著抑制HSV-1的滴度。

E：经过如上处理后，收集细胞，提取RNA，反转录，进行实时荧光定量PCR实验(RT-PCR)来检测病毒的RNA含量。结果表明，RAF265显著抑制PRV在细胞中的增殖。

F：6周龄小鼠感染HSV-1，设实验组与对照组，每组10只小鼠，实验组感染后每日口服给药RAF265，浓度为0.01mg/kg，3天后推颈处死小鼠并采集肝脏组织，提取RNA进行RT-PCR实验，测定肝脏中病毒蛋白ICP0的mRNA水平。结果显示，RAF265显著抑制HSV-1在小鼠体内的增殖。

G：6周龄小鼠感染HSV-1，设实验组与对照组，每组10只小鼠，分别感染HSV-1。实验组感染后给药RAF265，浓度为0.03mg/kg，第一天腹腔给药，第二天口服，此后腹腔给药与口服给药间替进行。实验第6天，推颈处死小鼠后取小鼠的肝脏，用甲醛固定，之后进行免疫组化实验(用HSV-1ICP8蛋白抗体为孵育抗体)。结果显示，相对于未处理组，药物处理组的小鼠肝脏组织中呈黄色或黄棕色的HSV-1ICP8阳性细胞较少，光密度值分析有显著性差异，表明药物处理后HSV-1ICP8蛋白含量显著降低，药物对病毒有显著性抑制作用。

图3为本发明实施例3中RAF265对PEDV病毒毒力的影响。

其中，A：0.1MOI PEDV病毒感染Vero细胞，感染同时，加入不同剂量RAF265，作用1h后，弃掉上清，并用PBS洗两遍，在细胞培养箱中培养24小时，之后进行免疫印迹实验或提取RNA进行RT-PCR实验。结果表明，RAF265对PEDV具有非常强烈的抑制作用，在5μM剂量时，即可将PEDV NP蛋白的表达抑制到检测不到的水平。

B：RT-PCR实验发现，5μM RAF265即可显著抑制PEDV病毒在细胞中的增殖。

C：将Vero细胞接种于24孔板中的15mm盖玻片中，生长12h后，感染PEDV，同时加入25μM的RAF265，感染1h后将上清液弃掉，PBS洗2遍，加入细胞维持液培养1h。用4％的多聚甲醛室温固定15min，PBS洗3遍，每次5min。加入PEDV NP一抗，4℃孵育过夜。收集一抗，玻片用PBS洗3遍，加入TRITC-mouse antibody室温孵育2h。弃掉二抗后，PBS洗3遍，弃掉PBS，并用吸水纸吸干。加淬灭剂(含有DAPI)，并放置于载玻片上，避光保存。激光共聚焦显微镜下观察病毒粒子的入侵情况。可见，加药组细胞周围病毒粒子大量减少，表明RAF265能够抑制病毒的入侵。

D：0.1MOI的PEDV感染Vero细胞，分别于PEDV感染前30min、20min、10min、感染同时、感染后30min、20min、10min加5μM RAF265，在细胞培养箱中培养24h后，收集细胞并进行免疫印迹实验。结果表明，RAF265与病毒同时加入抑制效果最好。

图4为本发明实施例4中RAF265对FMDV病毒毒力的影响。

其中，A：用0.1MOI的FMDV感染Vero细胞，分别在感染后0h、4h、8h后向细胞培养液中加入25μM RAF265，在细胞培养箱中培养24h后，收集细胞，免疫印迹法检测病毒蛋白VP0、VP1、VP2、VP3蛋白的表达。结果表明，在感染后4h、8h后加入RAF265均能抑制FMDV病毒蛋白的表达。

B：用0.1MOI的FMDV感染Vero细胞，分别在感染后2h、4h、8h后向细胞培养液中加入25μM RAF265，在细胞培养箱中培养24h后，收集细胞，提取RNA进行RT-PCR或在。结果表明，感染后2h、4h、8h加入RAF265均能显著抑制FMDV的增殖，其中感染后8h加入药物抑制效果最好。

C：用0.1MOI的FMDV感染Vero细胞，分别在感染后2h、4h、8h后向细胞培养液中加入25μM RAF265，在细胞培养箱中培养24h后，收集细胞，-80℃反复冻融3次后检测病毒毒力。结果表明，RAF265能够显著抑制病毒的滴度。

图5为本发明实施例5中RAF265对NDV病毒毒力的影响。

其中，A：用0.1MOI的GFP-NDV感染Vero细胞，病毒感染的同时加入不同剂量的RAF265(0，5，10，25，50μM)，孵育1h后，弃掉上清，用PBS洗2遍，加入细胞维持液，细胞培养箱培养24h，收集细胞，采用免疫印迹法检测GFP的表达(GFP蛋白抗体购于碧云天，产品编号AG281)。结果表明，RAF265抑能够制NDV蛋白的表达。

B：0.05MOI GFP-NDV病毒感染Vero细胞，感染同时加入不同剂量的RAF265(0，5，10，25，50μM)，作用1h后，弃掉上清，并用PBS洗两遍，在细胞培养箱中培养24小时，荧光显微镜Olympus IX73观察病毒的复制情况。结果表明，RAF265能够有效抑制NDV的复制。

图6为本发明实施例6中RAF265对VSV和IBDV病毒毒力的影响。

其中，A：用0.1MOI的VSV Indiana株病毒感染Vero细胞，病毒感染的同时加入不同剂量的RAF265(0，5，10，25，50μM)，孵育1h后，弃掉上清，用PBS洗2遍，加入细胞维持液，细胞培养箱培养24h，显微镜下观察细胞表面病理变化。结果表明，RAF265呈剂量依赖性抑制VSV引起的细胞病理变化。

B：用0.1MOI的IBDV感染Vero细胞，感染同时加入不同剂量的RAF265(0，5，10，25，50μM)，作用1h后，弃掉上清，并用PBS洗两遍，在细胞培养箱中培养24h，收集细胞，免疫印迹法检测IBDV VP2蛋白的表达(IBDV VP2蛋白抗体由郑世军教授赠送)。结果表明，RAF265抑制IBDV病毒蛋白的表达，25μM剂量时，几乎检测不到病毒蛋白的表达。

C：用0.1MOI的IBDV感染Vero细胞，感染同时加入不同剂量的RAF265(0，5，10，25，50μM)，作用1h后，弃掉上清，并用PBS洗两遍，在细胞培养箱中培养24h，收集细胞，在-80℃反复冻融3次后检测病毒毒力。结果表明，25μM药物时即显著抑制IBDV的病毒滴度。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中涉及的常规试验：

1、细胞的制备

进行Vero细胞传代时使用含有10％胎牛血清和100U青链霉素的DMEM培养液，维持液用含有2％胎牛血清和100U青链霉素的DMEM培养液。

2、病毒的增殖

HSV-1、NDV、VSV、PRV细胞毒的增殖：按照细胞瓶培养液1/10的量接种病毒原液，待细胞病变(如NDV形成大合胞体)达75％(一般为48小时)采用反复冻融法收获病毒，即将细胞瓶放入-80℃冻存后放置室温至部分融化，此时平摇细胞瓶使贴壁细胞脱壁，再次放入-80℃冻存，如此反复3次，使病毒从细胞中释放出来，于-80℃冻存。

NDV鸡胚毒的增殖：9-10日龄鸡胚经尿囊腔接种NDV病毒原液，鸡胚死亡后收集尿囊液测定血凝效价及TCID₅₀，分装后于液氮冻存。

3、病毒效价滴度的测定方法

细胞病变(cytopathic effect，CPE)为致细胞病变作用，指病毒对组织培养细胞侵染后产生的细胞变性，利用此种病变效应可进行病毒定量。病毒感染形成细胞病变常见合胞体(即多个细胞聚集一起形成多核的大细胞)与噬斑(细胞脱落形成空斑)两种。病变融合率为病变细胞占所有细胞的比率。

毒力测定：将细胞毒(VSV、PEDV、PRV)倍比稀释得到细胞毒悬液，用96孔板培养HeLa、Vero细胞至单层，向各孔中加入细胞毒悬液10μL/孔，做12个稀释度及8个重复，于37℃二氧化碳培养箱中放置48小时后观察细胞病变，或记录病变融合率(病变融合率即病变细胞占所有细胞的比率)，重复3次。

空斑形成单位(Plaque-forming unit,PFU)是一种测定病毒感染性比较准确的方法。将适当浓度的病毒悬液接种到生长单层细胞的玻璃平皿或扁瓶中，当病毒吸附于细胞上后，再在其上复盖一层溶化的半固体营养琼脂层，待凝固后，孵育培养。当病毒在细胞内复制增殖后，每一个感染性病毒颗粒在单层细胞中产生一个局限性的感染细胞病灶，病灶逐渐扩大，若用中性红等活性染料着色，在红色的背景中显示出没有着色的“空斑”，清楚可见。由于每个空斑由单个病毒颗粒复制形成，所以病毒悬液的滴度可以用每毫升空斑形成单位(PFU)来表示。用12孔板培养Vero细胞至单层，向各孔中加入加入900ul无血清培养基第一孔加入100ul细胞毒悬液，做10个稀释度，于37℃二氧化碳培养箱中放置48小时后观察细胞病变，每块板留一孔阴性对照，即不加入病毒液。37℃培养1.5h，加入混合好的含1％琼脂糖DMEM 1ml/孔，37℃培养72h。每孔用4％甲醛溶液250ul固定4-6h，将琼脂甩出，自来水冲洗干净(动作轻柔，防止细胞脱落)；每孔加入0.5％结晶紫乙醇溶液200ul，染色15min，自来水洗净。挑选出现20-100个空斑的细胞孔进行计数：

PFU/ml＝空斑数×病毒稀释倍数÷接种体积(ml)。

TCID₅₀计算方法：制备96孔板单层细胞，将病毒做10倍系列稀释，横向接种单层细胞板，每稀释度重复3孔，每日观察细胞病变，记录高于50％和低于50％病变孔的病毒稀释度，计算比距，获得TCID₅₀结果。计算公式为：

(高于50％的病变率-50％)/(高于50％病变率-小于50％病变率)＝比距

比距与接近50％病变率的病毒的稀释度的指数相加，即得指数。

4、免疫印迹实验

①蛋白提取

从二氧化碳培养箱冲取出细胞瓶去细胞生长液。用4℃预冷的PBS洗涤三次，在冰上用细胞刮将细胞刮下，收集在离心管中。4℃，3000PM离心5分钟，除去上清。向沉淀中加入100ul含有1％蛋白酶抑制剂混合物及10％磷酸酶抑制剂混合物的western及IP细胞裂解液。冰上作用30分钟后，超声波裂解，裂解2s，停2s，重复8次。之后，6000rpm离心10min，上清即所提取的细胞蛋白。使用BCA蛋白定量试剂盒，按照说明书对所得蛋白样品进行定量，使用PBS将蛋白浓度调整一致。

②蛋白电泳

取90μL蛋白样品，加入23.5μL 5×SDS-PAGE Loading buffer混匀。在干热器上100℃煮样10min，同时配置10％分离胶及5％浓缩胶。将制备好的蛋白样品，以每孔20ul体积上样，然后70V恒压电泳。待样品全部进入分离胶后改为120V恒压电泳。待溴酚蓝跑到合适位置后停止电泳。

③免疫印迹

根据目的条带裁剪合适大小的PVDF膜并做好标记，在甲醇中浸泡处理3min。同时，将电泳后的凝胶从玻璃板上取下，浸泡于膜转移缓冲液中。从电转移仪中的阴极依次按照海绵-滤纸-蛋白凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵的顺序铺好，并用玻璃棒彻底清除气泡，夹紧夹子，恒压90V转印2h。

按照不同抗体的说明书要求合适比例稀释一抗。将PVDF膜放入杂交袋中，加入稀释好的一抗4℃孵育过夜。第二天取出PVDF膜置于有PBST的平皿中，回收一抗。将盛有PVDF膜的平皿放在侧摆摇床上摇动5min洗涤，洗涤3次。用PBST以1：10000比例稀释HRP标记的IgG二抗。在洗涤好的膜上加入稀释好的二抗，室温孵育45分钟。加入PBST洗涤3次，每次5分钟。使用ECL化学发光物进行显色，并使用凝胶成像系统收集结果。

5、免疫组化实验

①取材

颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，迅速剪取所需的组织，尽可能不要损伤所需要的部分。

②切片制备

(1)固定

将切好的组织(<5mm³)用生理盐水组织洗一下，立即投入4％多聚甲醛(PFA)或10％中性福尔马林(NBF)中固定，根据组织大小和松密程度室温4-48h。

(2)洗涤

材料经固定后，水或酒精冲洗，数小时或过夜，去除组织内固定液及结晶沉淀。

(3)脱水

将组织依次经70％、80％、90％各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95％、100％各2次，每次20min。

(4)透明

用纯酒精、二甲苯等量混合液浸润材料1-2h，再换纯透明剂(二甲苯、苯、氯仿、正丁醇)。

(5)浸蜡和包埋

放入二甲苯和石蜡各半的混合液，再放入熔化的石蜡中浸润，透蜡时间根据组织大小而定。浸蜡之后放入包埋盒用石蜡进行包埋。

(6)切片

切片厚度为4-6μm。

(7)贴片与烤片

先在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，蜡片于温水中(45℃左右)中展平，捞至玻片上铺正，将载玻片放入45℃温箱中干燥。

③脱蜡与复水

脱蜡前，对玻片进行烘烤，56℃2-3h，其后浸入二甲苯3x5min。然后逐渐用水环境替代切片样本中的二甲苯，复水后的所有步骤，切片都要处在水环境中，防止干片。

④抗原修复

加入胃蛋白酶(Pepsin)，使终浓度为0.1％，主要用于细胞间质或基底膜抗原的修复。

⑤淬灭

(1)灭活内源性过氧化物酶：基于HRP检测系统，常用的去除内源性过氧化物酶的方法是3％过氧化氢水溶液，时间不宜过长，最好室温10min。

(2)去除内源性生物素：基于生物素检测系统，在采用生物素方法染色前也可以将组织切片进行0.01％卵白素溶液室温处理20min，使其结合位点饱和，以消除内源性生物素的活性。

(3)灭活碱性磷酸酶(AP)：最常用的方法是将左旋咪唑(以每毫升加24mg)加入底物液中并保持pH值为7.6-8.2，能除去大部分内源性碱性磷酸酶。

⑥封闭

利用含5％山羊血清的TBST进行封闭，室温1h。

⑦一抗和二抗孵育

按照说明书推荐的稀释液及比例进行稀释，4℃孵育过夜。之后用TBST清洗3次，每次5min。接着利用ABC法或LSAB法原理进行二抗孵育。

⑧检测-复染

常用的染料：苏木精，靶标为细胞核，蓝色或紫色；

核固红：靶标为细胞核，红色

⑨清洗、脱水、封片、观察

清洗：TBST清洗3次，每次5min。脱水后根据显色的底物选择封固剂，之后观察。

实施例1 RAF265对PRV病毒毒力的影响

用0.1MOI的PRV Fa株感染Vero细胞，病毒感染时同时加入不同剂量的RAF265(0，10，25，50μM)(用DMSO配制，下同)，孵育1h后，弃掉上清，用PBS洗2遍，加入细胞维持液，细胞培养箱培养24h，观察细胞病变。结果表明，RAF265能够抑制PRV引起的细胞病变且呈剂量依赖性(图1A)。

用0.1MOI的PRV Fa株感染Vero细胞，病毒感染的同时加入不同剂量的RAF265(0，5，10，25，50μM)，孵育1h后，弃掉上清，用PBS洗2遍，加入细胞维持液，细胞培养箱培养24h，收集细胞，采用免疫印迹法检测病毒蛋白gC蛋白的表达，或在-80℃反复冻融3次后检测病毒毒力。结果表明，RAF265抑制gC蛋白表达且呈剂量依赖性。与不加药相比，加入25μMRAF265能够显著抑制PRV滴度，50μM时抑制病毒滴度差异达3个数量级(图1B和C)。

用0.1MOI的PRV Fa株感染Vero胞，病毒感染的同时加入不同剂量的RAF265(0，5，10，25，50μM)，孵育1h后，弃掉上清，用PBS洗2遍，加入细胞维持液。细胞培养箱培养24h后，弃掉上清，收集细胞，提取RNA，反转录，进行实时荧光定量PCR实验(RT-PCR)来检测病毒的RNA含量。结果表明，RAF265显著抑制PRV在细胞中的增殖(图1D)。

6周龄小鼠感染PRV Fa株，设实验组与对照组，每组10只小鼠，实验组感染后每日口服给药RAF265，浓度为0.01mg/kg，3天后迅速推颈处死采集肝脏组织提取RNA，进行RT-PCR检测，测定肝脏中病毒蛋白US3的mRNA水平。结果显示，RAF265显著抑制PRV在小鼠体内的增殖(图1E)。

RAF265的毒性实验：

9日龄SPF鸡胚，分为6组(3只/组)，每组每只分别注射RAF265药物0，100，200，300，400，500μM。在37℃培养箱培养10天后，取肌肉组织，做组织切片。结果发现，在第10天取出鸡胚，发现小鸡无出血现象，同时组织切片显示无炎症产生。结果表明药物注射入鸡胚10天之内，鸡胚活性良好，该药物对鸡胚无毒性作用(图1F和G)。

实施例2 RAF265对HSV-1病毒毒力的影响

0.1MOI GFP-HSV-1病毒(Xin-Jing L et al.,2011)感染Vero细胞，感染同时，分别加入三种RAF抑制剂，即RAF265、CEP32496和BGB283(CAS号分别为927880-90-8、1188910-76-0和1446090-79-4，均用DMSO溶解)，作用1h后，弃掉上清，并用PBS洗两遍，在细胞培养箱中培养24小时，荧光显微镜Olympus IX73观察病毒的复制情况，并收集细胞进行免疫印迹实验。结果表明，三种抑制剂中，RAF265抑制病毒效果最好，在25μM的剂量时，在荧光显微镜中几乎观察不到病毒粒子(图2A)。同样，免疫印迹实验中，相比于其他两种抑制剂，25μMRAF265可将HSV-1ICP8蛋白的表达抑制到几乎检测不到的水平(图2B)。

0.1MOI HSV-1病毒感染Vero细胞，感染同时，加入不同剂量RAF265，作用1h后，弃掉上清，并用PBS洗两遍，在细胞培养箱中培养24小时，之后进行免疫印迹实验或在-80℃反复冻融3次后检测病毒毒力。结果表明，RAF265抑制HSV-1ICP8蛋白的表达且呈剂量依赖性(图2C)。且25μM剂量时，RAF265能够显著抑制HSV-1的滴度(图2D)。

用0.1MOI的HSV-1感染Vero细胞，病毒感染的同时加入不同剂量的RAF265(5，10，25，50μM)，孵育1h后，弃掉上清，用PBS洗2遍，加入细胞维持液。细胞培养箱培养24h后，弃掉上清，收集细胞，提取RNA，反转录，进行实时荧光定量PCR实验(RT-PCR)来检测病毒的RNA含量。结果表明，RAF265显著抑制PRV在细胞中的增殖(图2E)。

6周龄小鼠感染HSV-1，设实验组与对照组，每组10只小鼠，实验组感染后每日口服给药RAF265，浓度为0.01mg/kg，3天后推颈处死小鼠并采集肝脏组织，提取RNA进行RT-PCR实验，测定肝脏中病毒蛋白ICP0的mRNA水平。结果显示，RAF265显著抑制HSV-1在小鼠体内的增殖(图2F)。

6周龄小鼠感染HSV-1，设实验组与对照组，每组10只小鼠，分别感染HSV-1。实验组感染后给药RAF265，浓度为0.03mg/kg，第一天腹腔给药，第二天口服，此后腹腔给药与口服给药间替进行。实验第6天，推颈处死小鼠，取小鼠的肝脏，用甲醛固定，之后进行免疫组化实验(HSV-1ICP8蛋白抗体作为孵育抗体，购于Santa Cruz Biotechnology，产品编号为sc-53329)。结果表明，相对于对照组，药物处理后后，实验组小鼠肝脏组织中呈黄色或黄棕色的HSV-1ICP8阳性细胞较少，光密度值分析有显著性差异，表明HSV-1ICP8蛋白含量显著降低(图2G，表1)。

表1小鼠肝组织HSV-1ICP8平均光密度统计结果

注:药物处理组与未处理组相比，^*P＜0.05 ^**P＜0.01。

实施例3 RAF265对PEDV病毒毒力的影响

0.1MOI PEDV CV777株病毒(Sun et al.,2015)感染Vero细胞，感染同时，加入不同剂量RAF265，作用1h后，弃掉上清，并用PBS洗两遍，在细胞培养箱中培养24小时，之后进行免疫印迹实验或提取RNA进行RT-PCR实验。结果表明，RAF265对PEDV具有非常强烈的抑制作用，在5μM剂量时，即可将PEDV NP蛋白的表达抑制到检测不到的水平(图3A)。RT-PCR实验时，5μM RAF265即可显著抑制PEDV病毒在细胞中的增殖(图3B)。

将Vero细胞接种于24孔板中的15mm盖玻片中，生长12h后，感染PEDV CV777株病毒，同时加入25μM的RAF265，感染1h后将上清液弃掉，PBS洗2遍，加入细胞维持液培养1h。用4％的多聚甲醛室温固定15min，PBS洗3遍，每次5min。加入PEDV NP一抗(购于AlphaDiagnostic International，产品编号为PEDV12-M)，4℃孵育过夜。收集一抗，玻片用PBS洗3遍，加入TRITC-mouse antibody室温孵育2h。弃掉二抗后，PBS洗3遍，弃掉PBS，并用吸水纸吸干。加淬灭剂(含有DAPI)，并放置于载玻片上，避光保存。激光共聚焦显微镜下观察病毒粒子的入侵情况。结果表明，RAF265能够抑制病毒的入侵(图3C，箭头所指为病毒粒子)。

0.1MOI的PEDV CV777株病毒感染Vero细胞，分别于PEDV感染前30min、20min、10min、感染同时、感染后30min、20min、10min加5μM RAF265，在细胞培养箱中培养24h后，收集细胞并进行免疫印迹实验。结果表明，RAF265与病毒同时加入抑制效果最好(图3D)。

实施例4 RAF265对FMDV病毒毒力的影响

用0.1MOI的FMDV感染Vero细胞，分别在感染后0h、4h、8h后向细胞培养液中加入25μM RAF265，在细胞培养箱中培养24h后，收集细胞，免疫印迹法检测病毒蛋白VP0、VP1、VP2、VP3蛋白的表达。结果表明，在感染后4h、8h后加入RAF265均能抑制FMDV病毒蛋白的表达(图4A)。

用0.1MOI的FMDV感染Vero细胞，分别在感染后2h、4h、8h后向细胞培养液中加入25μM RAF265，在细胞培养箱中培养24h后，收集细胞，提取RNA进行RT-PCR或在-80℃反复冻融3次后检测病毒毒力。结果表明，感染后2h、4h、8h加入RAF265均能显著抑制FMDV的增殖，其中感染后8h加入药物抑制效果最好(图4B)，且RAF265能够显著抑制病毒的滴度(图4C)。

实施例5 RAF265对NDV病毒毒力的影响

用0.1MOI的GFP-NDV(Li et al.,2013)感染Vero细胞，病毒感染的同时加入不同剂量的RAF265(0，5，10，25，50μM)，孵育1h后，弃掉上清，用PBS洗2遍，加入细胞维持液，细胞培养箱培养24h，收集细胞，采用免疫印迹法检测GFP的表达(GFP蛋白抗体购于碧云天，产品编号AG281)。结果表明，RAF265抑能够制NDV蛋白的表达(图5A)。

0.05MOI GFP-NDV病毒感染Vero细胞，感染同时加入不同剂量的RAF265(0，5，10，25，50μM)，作用1h后，弃掉上清，并用PBS洗两遍，在细胞培养箱中培养24小时，荧光显微镜Olympus IX73观察病毒的复制情况。结果表明，RAF265能够有效抑制NDV的复制(图5B)。

实施例6 RAF265对VSV和IBDV病毒毒力的影响

用0.1MOI的VSV Indiana株病毒(Wang et al.,2016a)感染Vero细胞，病毒感染的同时加入不同剂量的RAF265(0，5，10，25，50μM)，孵育1h后，弃掉上清，用PBS洗2遍，加入细胞维持液，细胞培养箱培养24h，显微镜下观察细胞表面病理变化。结果表明，RAF265呈剂量依赖性抑制VSV引起的细胞病理变化(图6A)。

用0.1MOI的IBDV(由中国农业大学动物医学院郑世军教授赠送，参见Fu M etal.,2018)感染Vero细胞，感染同时加入不同剂量的RAF265(0，5，10，25，50μM)，作用1h后，弃掉上清，并用PBS洗两遍，在细胞培养箱中培养24h，收集细胞，免疫印迹法检测IBDV VP2蛋白的表达或在-80℃反复冻融3次后检测病毒毒力。结果表明，RAF265抑制IBDV病毒蛋白的表达，25μM剂量时，几乎检测不到病毒蛋白的表达(图6B)。并且，25μM药物时即显著抑制IBDV的病毒滴度(图6C)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献：

(1)Xin-Jing L,et al.Construction of a Recombinant BAC-HSV-1 Strain HFwith a GFP Reporter Gene and Characterization of Its Infectious Progeny Virus[J].Chinese Journal of Virology,2011,27(3):238-43.

(2)D.Sun,et al.Analysis of protein expression changes of the Vero E6cells infected with classic PEDV strain CV777 by using quantitative proteomictechnique[J].Virol.Methods,218(2015),pp.27-39.

(3)C.G.Li,et al.A Cholesterol Tag at the N Terminus of the RelativelyBroad-Spectrum Fusion Inhibitory Peptide Targets an Earlier Stage of FusionGlycoprotein Activation and Increases the Peptide\"s Antiviral Potency InVivo[J].Journal of Virology,2013,87(16):9223-32.

(4)P.Wang,et al.The nucleolar protein GLTSCR2 is required forefficient viral replication[J].Scientific Reports,2016,6(1):36226.

(5)Fu M,et al.gga-miR-454 suppresses infectious bursal disease virus(IBDV)replication via directly targeting IBDV genomic segment B and cellularSuppressors of Cytokine Signaling 6(SOCS6)[J].Virus Research,2018:S0168170218301540.

Claims

1.化合物RAF265在制备抗病毒药物或组合物中的应用，其中，化合物RAF265的结构如式(1)所示：

所述病毒为伪狂犬病病毒、单纯疱疹病毒、猪流行性腹泻病毒、口蹄疫病毒、新城疫病毒、水泡性口炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒。