JP2003530301A - ウイルスを用いた新生物の処置 - Google Patents

ウイルスを用いた新生物の処置

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ロバート エム． ローレンス，
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ハーベイ ラビン，
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、複製可能でありそれによってＩＦＮ媒介抗ウイルス性応答において欠損を有する新生物細胞を死滅させるウイルス、ならびに癌および大きな腫瘍を含む新生物疾患を処置する際の使用に関する。ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスは、この点で有用である。本発明はまた、癌治療に対するこのようなウイルスの選択、設計、精製および使用のための方法に関する。この方法は、該哺乳動物にインターフェロン感受性の、複製コンピテントクローンＲＮＡウイルスを投与する工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、インターフェロン（ＩＦＮ）により媒介される抗ウイルス応答が欠
損した、新生物性細胞の死を再現し得、そして引き起こし得る、ウイルスに関す
る。ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスは、この点に関して有用である。本発
明はまた、癌および大腫瘍を含む新生物性疾患の処置のための、これらのウイル
スの使用に関する。
【０００２】 （発明の背景） 癌を含む新生物性疾患は、人間における死の主要な原因の１つである。合衆国
において、１３０万を超える新たな癌患者が毎年診断され、そして５５０，００
０が死亡している。身体の二次的な部位に広がる前に、癌を初期に検出すること
は、宿主が生存する機会を大きく増加させる。しかし、癌の初期の検出は、常に
可能なわけではなく、そして可能である場合でさえも、特に高度に悪性の癌の場
合には、処置は満足ではない。癌の処置（化学療法および放射線を含む）は、後
期においてはさほど有効ではなく、特に、新生物増殖が大きく、そして／または
高い全身腫瘍組織量を構築する場合には、有効ではない。（Ｈｉｌｌａｒｄ Ｓ
ｔａｎｌｅｙ、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐｏｒｔｓ、第６１巻、Ｎｏ．
１、１月／２月 １９７７、２９〜３６頁、Ｔａｎｎｏｃｋ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ、４２、４９２１−４９２６、１２月 １９８２を参照のこと）
。
【０００３】 種々のウイルスへの曝露に関連する腫瘍調節が、報告されている。記載された
ウイルスの大部分は、ヒトにおいて病原性であり、そして流行性耳下腺炎および
麻疹が挙げられる。特定の型の癌細胞に対する特異的な他のウイルスの効果もま
た、記載されている。Ｓｍｉｔｈら、（１９５６）Ｃａｎｃｅｒ、９、１２１１
、（頸部癌に対するアデノウイルスの効果）；Ｈｏｌｚａｅｐｆｅｌら、（１９
５７）Ｃａｎｃｅｒ、１０、５５７（表皮腫瘍に対するアデノウイルスの効果）
；Ｔａｙｌｏｒら、（１９７０）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、４
４、５１５（肉腫−１に対するウシエンテロウイルス−１の効果）；Ｓｈｉｎｇ
ｕら、（１９９１）Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７２、２０３１（
Ｆ−６４７（白血病細胞）に対するウシエンテロウイルスＭＺ−４６８の効果）
；Ｓｕｓｋｉｎｄら、（１９５７）ＰＳＥＢＭ、９４、３０９（ＨｅＬａ腫瘍細
胞に対するコクサッキーＢ３ウイルスの効果）；Ｒｕｋａｖｉｓｈｎｉｋｏｖａ
ら、（１９７６）Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ．、２０、３８７（腹水癌に対するイン
フルエンザＡ株の効果）。
【０００４】 最も初期の参考文献は、患者を痘瘡または狂犬病に対してワクチン化する目的
で生弱毒化ウイルスワクチンで処置した、これらの患者における部分的な腫瘍調
節を記載した。ＤｅＰａｃｅ，Ｎ．Ｇ．（１９１２）Ｇｉｎｅｃｏｌｏｇｉａ、
９、８２−８８；Ｓａｌｍｏｎ，Ｐ．およびＢａｉｘ（１９２２）Ｃｏｍｐｔ．
Ｒｅｎｄ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．、８６、８１９−８２０を参照のこと。腫瘍の部
分的な調節および白血病の調節もまた、天然に存在する麻疹感染の間に、注目さ
れた。Ｐａｓｑｕｉｎｕｃｃｉ，Ｇ．（１９７１）Ｌａｎｃｅｔ、１、１３６；
Ｇｒｏｓｓ，Ｓ．（１９７１）Ｌａｎｃｅｔ、１、３９７−３９８；Ｂｌｕｍｉ
ｎｇ，Ａ．Ｚ．およびＺｉｅｇｌｅｒ，Ｊ．Ｌ．（１９７１）Ｌａｎｃｅｔ、２
、１０５−１０６を参照のこと。生流行性耳下腺炎ウイルスに意図的に感染した
９０の癌患者の１つの研究において、部分的な腫瘍調節が、７９の患者において
注目された。Ａｓａｄａ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ、３４、１９０７−１９２８
を参照のこと。これらのウイルスの副作用は一時的であったが、これらのヒト病
原体での感染の重篤な後遺症は、主要な関心事である。
【０００５】 ウイルスを、以下のように分類する［Ｍｕｒｐｈｙ ＡおよびＫｉｎｇｓｂｕ
ｒｙ ＤＷ、１９９０：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．編
）、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、９〜３５頁を参照のこと］：
【０００６】
【化１】 ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉａｅ）（またはヘルペスウイルス
属）のファミリーには、αヘルペスウイルス属（Ｖａｒｉｃｅｌｌａｖｉｒｕｓ
属およびＳｉｍｐｅｘｖｉｒｕｓ属を含む）、βヘルペスウイルス属、およびγ
ヘルペスウイルス属のサブファミリーが含まれる。
【０００７】 ニューカッスル病ウイルス（「ＮＤＶ」）は、パラミクソウイルス科（または
パラミクソウイルス属）のメンバーである。ＮＤＶの天然の宿主は、ニワトリお
よび他の鳥類である。ＮＤＶは、代表的に、動物宿主細胞の表面の特定の分子に
結合し、細胞表面に融合し、そしてその遺伝材料を宿主に注入する。ＮＤＶは、
細胞殺傷性ウイルスである。一旦、細胞内に入ると、ウイルス遺伝子は、宿主細
胞を宿主細胞の死をもたらすウイルスのコピーを作製するよう指示し、他の細胞
を感染するＮＤＶのコピーを放出する。いくつかのウイルスとは異なり、ＮＤＶ
は重篤なヒト疾患を引き起こすことが公知ではない。他の種類のウイルス（例え
ば、ＨＴＬＶ−１、Ｂ型肝炎）とは異なり、パラミクソウイルス属は、発癌性で
あることが公知ではない。腫瘍の一時的な調節は、ＮＤＶに曝露された少数の患
者において、報告された。Ｃｓａｔａｒｙ，Ｌ．Ｋ．（１９７１）Ｌａｎｃｅｔ
、２、８２５を参照のこと。Ｃｓａｔａｒｙは、ニワトリ農夫のニワトリにおけ
るニューカッスル病の流行の間の、そのニワトリ農夫における胃腸癌の調節に注
目した。類似の逸話的な報告において、Ｃａｓｓｅｌ，Ｗ．Ａ．およびＧａｒｒ
ｅｔｔ，Ｒ．Ｅ．（１９６５）Ｃａｎｃｅｒ、１８、８６３−８６８は、原発性
頸部癌の調節に注目し、これは、頸部腫瘍へのＮＤＶの注射に続いて、患者にお
いてリンパ節に拡散した。殺腫瘍性活性の機構は免疫学的であると考えられたの
で、いずれの研究も、ウイルスの直接的な腫瘍細胞傷害性に取り組むためには実
施されなかった。その代わりに、努力は、ＮＤＶの免疫調節効果に焦点を当てた
。例えば、Ｍｕｒｒａｙ，Ｄ．Ｒ．、Ｃａｓｓｅｌ，Ｗ．Ａ．、Ｔｏｒｂｉｎ，
Ａ．Ｈ．，Ｏｌｋｏｗｓｋｉ，Ｚ．Ｌ．、およびＭｏｏｒｅ，Ｍ．Ｅ．（１９７
７）Ｃａｎｃｅｒ、４０、６８０；Ｃａｓｓｅｌ，Ｗ．Ａ．、Ｍｕｒｒａｙ，Ｄ
．Ｒ．、およびＰｈｉｌｌｉｐｓ，Ｈ．Ｓ．（１９８３）Ｃａｎｃｅｒ、５２、
８５６；Ｂｏｈｌｅ，Ｗ．、Ｓｃｈｌａｇ，ＰＪ．、Ｌｉｅｂｒｉｃｈ，Ｗ．、
Ｈｏｈｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．、Ｍａｎａｓｔｅｒｓｋｉ，Ｍ．、Ｍｉｌｌｅｒ
，Ｐ．、およびＳｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ，Ｖ．（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ、６
６、１５１７−１５２３を参照のこと。
【０００８】 腫瘍調節のための特定のウイルスの選択は、偶然の発見または上記引用におけ
る試行錯誤に基づいた。ほんの最近、癌の処置におけるウイルスの使用に関する
、合理的な、機構に基づくアプローチが、ＤＮＡウイルスを使用して開発された
。この型のアプローチの例は、特定の組織起源の腫瘍においてのみ複製する組換
えアデノウイルスベクター（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．ら、１９９７ Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．、５７：２５５９−２５６３）、または特定の重要な調節タンパ
ク質を欠く組換えアデノウイルスベクター（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，ＪＲ．ら、１９
９６ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：３７３−３７６）の開発において見出される。
他の最近のアプローチは、複製が不可能な組換えアデノウイルスベクターを使用
して、いくつかの腫瘍細胞において損失した重大なタンパク質機能を回復するこ
とであった（Ｚｈａｎｇ，ＷＷ．ら、１９９４ Ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈ
ｅｒａｐｙ、１：５−１３）。最後に、単純疱疹ウイルスもまた、腫瘍を特徴付
ける、迅速に分裂する細胞において優先的に複製するよう操作された（Ｍｉｎｅ
ｔａ，Ｔ．ら、１９９４ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５４：３９６３−３９６６
）。
【０００９】 米国出願番号０８／２６０，５３６（その全体が本明細書中に参考として援用
される）は、ＮＤＶまたは他のパラミクソウイルス属の、癌の処置における使用
を開示する。
【００１０】 （ウイルスＩＦＮ導入遺伝子発現） ウイルス治療剤を用いる癌の処置のための、１つの通常のアプローチは、特定
の遺伝子を腫瘍塊に送達するための、ウイルスベクターの使用であった。
【００１１】 組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよびレト
ロウイルスは、全て、インターフェロン遺伝子を、単独でか、または他のサイト
カイン遺伝子との組合せで発現するよう改変された。
【００１２】 Ｚｈａｎｇら（（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳ
Ａ ９３：４５１３−４５１８）において、ヒトインターフェロンのコンセンサ
ス（すなわち、合成）遺伝子を発現する組換えアデノウイルスを使用して、ヌー
ドマウスにおけるヒト乳癌（および他の）異種移植片を処置した。この著者らは
、以下のように結論付けた：「・・・ウイルス腫瘍崩壊と、低病原性のウイルス
との組合せは、それ自体でＩＦＮおよびＩＦＮ遺伝子治療の効果に対して抵抗性
であり、種々の異なる腫瘍（特に、乳癌）の処置のための実りの多いアプローチ
であり得る」。インターフェロン感受性ウイルスに関する本発明とは対照的に、
Ｚｈａｎｇら（１９９６）は、腫瘍の処置における、インターフェロン抵抗性ア
デノウイルスの使用を教示する。
【００１３】 Ｚｈａｎｇら（（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、３：３１
−３８）において、コンセンサスＩＦＮを発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ
）を使用して、ヒト腫瘍細胞をインビトロで形質導入し、続いてヌードマウスに
注射した。形質導入した腫瘍は、腫瘍を形成しないか、または形質導入していな
いコントロールよりゆっくりと増殖したかの、いずれかであった。また、１つの
形質導入したヒト腫瘍細胞を、別の形質導入していない腫瘍の腫瘍塊に注射する
ことにより、大きさが少し減少した。
【００１４】 Ｐｅｐｌｉｎｓｋｉら（（１９９６）Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．、３：
１５−２３）において、ＩＦＮγ（および単独でかまたは組合せでかのいずれか
で発現された他のサイトカイン）を、マウス乳癌モデルにおいて試験した。マウ
スを、組換えワクシニアウイルスでウイルス的に改変した腫瘍細胞で、免疫した
。腫瘍細胞で再チャレンジした場合には、ウイルス的に改変した細胞で免疫した
マウスは、疾患のない生存時間を統計学的に改善した。
【００１５】 Ｇａｓｔｌら（（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２：６２２９−６２
３６）は、ＩＦＮγを発現するレトロウイルスベクターを使用して、腎癌細胞を
インビトロで形質導入した。これらの細胞は、免疫系の機能のために重要な、よ
り高い量の、多数のタンパク質を産生することが示された。
【００１６】 Ｒｅｓｔｉｆｏら（（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７５：１４２３−
１４３１）は、ＩＮＦγを発現するレトロウイルスベクターを使用して、マウス
肉腫細胞株を形質導入し、腫瘍細胞株がより効率的にＣＤ８＋およびＴ細胞に対
するウイルス抗原を提示することを可能にした。
【００１７】 Ｈｏｗａｒｄら（（１９９４）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、７１６：
１６７−１８７）は、ＩＮＦγを発現するレトロウイルスベクターを使用して、
マウスおよびヒトの黒色腫腫瘍細胞を形質導入した。これらの細胞は、免疫機能
のために重要なタンパク質の発現を増加させることが観察された。これらの細胞
はまた、形質導入していない親株と比較して、マウスにおいて、腫瘍形成性がよ
り低く、そして腫瘍特異的ＣＴＬ応答のインビボでの活性化を生じた。
【００１８】 （ウイルス性癌治療のためのアジュバントとしての、治療用量のインターフェ
ロンの使用） ＩＦＮの公知の免疫増強特性に起因して、いくつかの研究は、ＩＦＮタンパク
質の、他のウイルス性癌ワクチン治療と組み合わせての使用を試験した。
【００１９】 Ｋｉｒｃｈｎｅｒら（（１９９５）Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｕｒｏｌ．、１３：１７
１−１７３）において、２０８の患者を、自己由来の腎細胞癌腫瘍細胞、ＮＤＶ
改変された腎細胞癌腫瘍細胞、および致死的に照射された腎細胞癌腫瘍細胞で免
疫し、そして低用量のＩＬ−２またはＩＦＮαと同時に処置した。この著者らは
、この処置レジメンが、局所的に進展した腎細胞癌を有する患者の天然の経過よ
り優れた改善を生じることを記載した。用量は、約３．３×１０3〜２．２×１
０5ＰＦＵ／ｋｇであった。これは、全身アプローチと対照的に、局所治療であ
り、その目的は、抗腫瘍免疫応答を誘導することであった。
【００２０】 Ｔａｎａｋａら（（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ
Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６：２８３−２９３）は、マウスにおける
癌ワクチン治療モデルとして、ＩＦＮαを組換えワクシニアウイルスとともに同
時投与した。この研究は、ＩＦＮを受容しなかったマウスと比較して、ＩＦＮを
受容したマウスにおいて、生存度の統計学的増加を示した。この著者らは、これ
らの動物におけるＣＤ−８陽性Ｔ細胞の誘導の原因が、ＩＦＮの効力であると考
えた。
【００２１】 Ａｒｒｏｙｏら（（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｔｈｅｒ．、３１：３０５−３１１は、結腸癌のマウスモデルを使用して、ＩＦ
Ｎαおよび／またはＩＬ−２の同時治療の、ワクシニアウイルス結腸腫瘍崩壊（
ＶＣＯ）癌処置の効力に対する効果を試験した。この著者らは、ＶＣＯ＋ＩＬ−
２＋ＩＦＮの三重処置が、このマウスモデルにおいて最も有効であることを見出
した。このアプローチは、抗腫瘍活性の機構としての免疫化に依存する。
【００２２】 ＩＦＮを、これらの研究において使用して、癌細胞が免疫系により認識される
能力を増大させた。
【００２３】 （発明の課題） 本発明の課題は、癌を含む疾患の処置のためのウイルスを提供することである
。
【００２４】 本発明のさらなる課題は、癌を含む新生物形成性疾患を処置するためのウイル
スを提供することである。
【００２５】 本発明のさらなる課題は、新生物形成性疾患の治療において使用するための候
補ウイルスが、選択および／またはスクリーニングされる手段を提供することで
ある。
【００２６】 本発明のさらなる課題は、新生物形成性疾患の処置におけるウイルスの治療用
途を増強するための、ウイルスの遺伝子操作のガイダンスを提供することである
。
【００２７】 本発明のさらなる課題は、ウイルス殺傷に対する候補標的細胞の感度を評価す
ることを目的とした、ウイルスによる殺傷のための潜在的な標的細胞をスクリー
ニングする手段を提供することである。
【００２８】 本発明のなおさらなる課題は、ウイルス治療の管理におけるガイダンスを提供
することである。
【００２９】 本発明の課題は、大腫瘍を処置するための方法を提供することである。
【００３０】 本発明のさらなる課題は、精製されたウイルスおよびそれを得るための方法を
提供することである。
【００３１】 （発明の要旨） 本発明は、哺乳動物において新生物をウイルスで感染させる方法に関し、この
方法は、インターフェロン感受性の複製可能なクローンウイルスをこの哺乳動物
に投与する工程を包含し、このウイルスは、ＲＮＡウイルス、ならびにアデノウ
イルス属、パルボウイルス属、パポバウイルス属、イリドウイルス属、およびヘ
ルペスウイルス属のＤＮＡウイルスファミリーからなる群より選択される。
【００３２】 本発明はまた、哺乳動物において新生物をウイルスで感染させる方法に関し、
この方法は、インターフェロン感受性の複製可能なクローンウイルスをこの哺乳
動物に全身投与する工程を包含する。
【００３３】 本発明はまた、哺乳動物において癌を含む新生物を処置する方法に関し、この
方法は、この哺乳動物に、治療有効量のインターフェロン感受性の複製可能なク
ローンウイルスを投与する工程を包含し、このウイルスは、ＲＮＡウイルス、な
らびにアデノウイルス属、パルボウイルス属、パポバウイルス属、イリドウイル
ス属、およびヘルペスウイルス属のＤＮＡウイルスファミリーからなる群より選
択される。
【００３４】 本発明はまた、哺乳動物において、ウイルスで新生物を感染させる方法に関し
、この方法は、１つ以上の変異を、インターフェロンの抗ウイルス活性のブロッ
クに関与する１つ以上のウイルス遺伝子に有するインターフェロン感受性の複製
可能なクローンワクシニアウイルスを、この哺乳動物に投与する工程を包含し、
この遺伝子は、Ｋ３Ｌ、Ｅ３Ｌ、およびＢ１８Ｒからなる遺伝子の群から選択さ
れる。
【００３５】 本発明はまた、哺乳動物において癌を含む新生物を処置する方法に関し、この
方法は、この哺乳動物に、１つ以上の変異を、インターフェロンの抗ウイルス活
性のブロックに関与する１つ以上のウイルス遺伝子に有する、治療有効量のイン
ターフェロン感受性の複製可能なワクシニアウイルスを投与し、この遺伝子は、
Ｋ３Ｌ、Ｅ３Ｌ、およびＢ１８Ｒからなる遺伝子の群から選択される。
【００３６】 本発明はまた、哺乳動物において、ウイルスを用いて少なくとも１ｃｍの大き
さの新生物を感染する方法に関し、この方法は、この哺乳動物に、クローンウイ
ルスを投与する工程を包含し、このウイルスは、以下からなる群より選択される
：（１）ＲＮＡウイルス；（２）ヘパドナウイルス属（Ｈｅｐａｄｅｎａｖｉｒ
ｕｓ）；（３）パルボウイルス属；（４）パポバウイルス属；（５）ヘルペスウ
イルス属；（６）ポックスウイルス属、および（７）イリドウイルス属。
【００３７】 本発明はまた、哺乳動物において新生物を処置する方法に関し、この方法は、
この哺乳動物に、治療有効量のクローンウイルスを投与する工程を包含し、この
ウイルスは、以下：（１）ＲＮＡウイルス；（２）ヘパドナウイルス属（Ｈｅｐ
ａｄｅｎａｖｉｒｕｓ）；（３）パルボウイルス属；（４）パポバウイルス属；
（５）ヘルペスウイルス属；（６）ポックスウイルス属、および（７）イリドウ
イルス属からなる群より選択され、ここでこの新生物は、大きさが少なくとも１
センチメートルである。
【００３８】 本発明はまた、哺乳動物において、腫瘍を処置する方法に関し、この方法は、
この哺乳動物に、治療有効量の腫瘍に対して細胞殺傷性のＲＮＡウイルスを投与
する工程を包含し、ここでこの哺乳動物は、全体重の少なくとも１．５％を構成
する腫瘍荷重（ｂｕｒｄｅｎ）を有する。
【００３９】 本発明はまた、患者から新たに除去した腫瘍細胞または組織をスクリーニング
して、この細胞または組織がウイルスにより殺傷される感度を決定する方法に関
し、この方法は、この細胞または組織を、インターフェロン感受性ウイルスを使
用する、ディファレンシャル細胞傷害性アッセイに供する工程を包含する。
【００４０】 本発明はまた、哺乳動物において抗新生物活性を有するウイルスを同定するた
めの方法に関し、この方法は、以下を包含する：ａ）試験ウイルスを使用して、
ｉ）ＩＦＮ媒介抗ウイルス活性欠損細胞およびｉｉ）ＩＦＮ媒介抗ウイルス活性
に関与する細胞を感染させる工程、ならびにｂ）この試験ウイルスが、ＩＦＮ媒
介抗ウイルス活性欠損細胞を、インターフェロン媒介抗ウイルス活性に関与する
細胞より優先的に殺傷するか否かを決定する工程。
【００４１】 本発明はまた、抗新生物治療において使用するためのウイルスを作製する方法
に関し、この方法は、以下を包含する：ａ）既存のウイルスを、ＩＦＮの抗ウイ
ルス効果の不活化のためにウイルス機構を減少またはアブレーション（ａｂｌａ
ｔｅ）することにより、改変する工程、および必要に応じて、ｂ）上記既存のウ
イルスより低いビルレンスを生じる、弱毒化変異を作製する工程。
【００４２】 本発明はまた、ＲＮＡウイルス、アデノウイルス属、ポックスウイルス属、イ
リドウイルス属、パルボウイルス属、ヘパドナウイルス属、水痘ウイルス属、β
ヘルペスウイルス属、およびγヘルペスウイルス属からなる群より選択されるウ
イルスで処置された哺乳動物において、ウイルス複製を制御する方法に関し、こ
の方法は、抗ウイルス化合物を投与する工程を包含する。
【００４３】 本発明はまた、腫瘍細胞、腫瘍組織、または組織切片をスクリーニングして、
どの腫瘍細胞または組織が、ウイルスが結合することを可能にするかを決定する
方法に関し、この方法は、この細胞、組織または組織切片を、この腫瘍細胞また
は腫瘍組織に存在するウイルスレセプターの量に対して、イムノアッセイまたは
免疫染色に、供する工程を包含する。
【００４４】 本発明はまた、哺乳動物においてウイルスで新生物を感染させる方法に関し、
この方法は、脱感作する用量のインターフェロン感受性の複製可能なクローンウ
イルスをこの哺乳動物に全身投与する工程、その後、少なくとも１つの引き続く
より高い用量のウイルスを投与する工程を包含する。
【００４５】 本発明はまた、哺乳動物において、新生物をウイルスで感染させる方法に関し
、この方法は、インターフェロン感受性の複製可能なクローンウイルスを、この
哺乳動物に、少なくとも４分間の経過にわたって投与する工程を包含する。
【００４６】 本発明はまた、哺乳動物においてウイルスで新生物を感染させる方法に関し、
この方法は、複製可能なクローンウイルスを投与する工程を包含し、このウイル
スは、ニューカッスル病ウイルス株ＭＫ１０７、ニューカッスル病ウイルス株Ｎ
Ｊ Ｒｏａｋｉｎ、シンドビスウイルス、および水疱性口内炎ウイルスからなる
群より選択される。
【００４７】 本発明には、以下が含まれる： ｉ）ペレット化なしで超遠心分離により精製される、クローンパラミクソウイ
ルス属； ｉｉ）タンパク質１ｍｇあたり少なくとも２×１０9ＰＦＵのレベルまで精製
された、クローンパラミクソウイルス属； ｉｉｉ）タンパク質１ｍｇあたり少なくとも１×１０10ＰＦＵのレベルまで精
製された、クローンパラミクソウイルス属； ｉｖ）タンパク質１ｍｇあたり少なくとも６×１０10ＰＦＵのレベルまで精製
された、クローンパラミクソウイルス属； ｖ）タンパク質１ｍｇあたり少なくとも２×１０9ＰＦＵのレベルまで精製さ
れた、クローンＲＮＡウイルス； ｖｉ）タンパク質１ｍｇあたり少なくとも１×１０10ＰＦＵのレベルまで精製
された、クローンＲＮＡウイルス； ｖｉｉ）タンパク質１ｍｇあたり少なくとも６×１０10ＰＦＵのレベルまで精
製された、クローンＲＮＡウイルス； ｖｉｉｉ）インターフェロン感受性であり、そして少なくとも２×１０9ＰＦ
Ｕ／ｍｇタンパク質のレベルまで精製された、クローン細胞殺傷性ＤＮＡウイル
ス； ｉｘ）ａ）１つ以上の変異を、Ｋ３Ｌ、Ｅ３ＬおよびＢ１８Ｒ遺伝子の１つ以
上に有し、そしてｂ）弱毒化変異を、チミジンキナーゼ、リボヌクレオチドレダ
クターゼ、ワクシニア増殖因子、チミジル化キナーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ｄＵＴ
Ｐａｓｅをコードする遺伝子の１つ以上に有する、複製可能なワクシニアウイル
ス； ｘ）Ｋ３Ｌ、Ｅ３ＬおよびＢ１８Ｒからなる群からの２つ以上の遺伝子に１つ
以上の変異を有する、複製可能なワクシニアウイルス； ｘｉ）ヘルペスウイルス属に増加したインターフェロン感受性を有させる、（
２’−５’）Ａアナログの発現において改変を有するヘルペスウイルス属； ｘｉｉ）レオウイルスをインターフェロン感受性にする、ω３において弱毒化
変異を有するレオウイルス； ｘｉｉｉ）インターフェロン感受性であり、そして少なくとも２×１０9ＰＦ
Ｕ／ｍｇタンパク質のレベルまで精製された、複製可能細胞殺傷性ウイルス；な
らびに ｘｉｖ）少なくとも２×１０9ＰＦＵ／ｍｇタンパク質のレベルまで精製され
た、レトロウイルス。
【００４８】 本発明にはまた、以下の方法が含まれる： ｉ）ＲＮＡウイルスを精製する方法であって、ａ）クローンウイルスを生成す
る工程；およびｂ）このクローンウイルスを、ペレット化のない超遠心分離によ
り精製する工程；またはｃ）このクローンウイルスを、引き続くゲル浸透クロマ
トグラフィーを伴うかもしくは伴わない、接線フロー濾過により精製する工程、
を包含する、方法、ならびに ｉｉ）パラミクソウイルス属を精製する方法であって、これらのウイルスを、
ペレット化のない超遠心分離、または引き続くゲル浸透クロマトグラフィーを伴
うかもしくは伴わない、接線フロー濾過により精製する工程、を包含する、方法
。
【００４９】 本発明はまた、哺乳動物において疾患を処置する方法に関し、ここで、疾患し
た細胞は、インターフェロン媒介抗ウイルス応答が欠損しており、この方法は、
この哺乳動物に、治療有効量のインターフェロン感受性の複製可能なクローンウ
イルスを投与する工程を包含する。
【００５０】 本発明はまた、哺乳動物において、ウイルスで新生物を感染させる方法に関し
、この方法は、インターフェロン応答性の複製可能なクローンＲＮＡウイルスを
、この哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００５１】 本発明は、哺乳動物においてウイルス性病因の疾患を処置する方法に関し、こ
の方法は、この哺乳動物に、治療有効量の複製可能なクローンウイルスを投与す
る工程を包含する。
【００５２】 本発明はまた、哺乳動物において新生物を感染させる方法に関し、この方法は
、パラミクソウイルス属、オルトミクソウイルス科、ラブドウイルス科、トガウ
イルス科、フラビウイルス科，ピコルナウイルス科、コロナウイルス科、レオウ
イルス科、ポックスウイスル科、ヘルペスウイルス科、およびパルボウイルス科
からなるファミリーの群より選択されるウイルスを投与する工程を包含する。
【００５３】 本発明はまた、腫瘍腹水を処置する方法に関し、この方法は、インターフェロ
ン感受性の複製可能なクローンウイルスを投与する工程を包含する。
【００５４】 本発明はまた、哺乳動物において疼痛を減少させる方法に関し、この方法は、
インターフェロン感受性の複製可能なクローンウイルスを投与する工程を包含す
る。
【００５５】 本発明はまた、哺乳動物において新生物を処置する方法に関し、この方法は、
この哺乳動物由来のサンプルをイムノアッセイに共し、存在するウイルスレセプ
ターの量を検出する工程、およびレセプターが存在する場合には、このレセプタ
ーを結合する、インターフェロン感受性の複製可能なクローンウイルスを、この
哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００５６】 （発明の詳細な説明） 本発明は、ウイルス複製がインターフェロン（ＩＦＮ）媒介抗ウイルス応答を
欠く新生物細胞を選択的に殺傷する新規な機構の発見に関連する。本発明はまた
、癌および大腫瘍を含む新生物疾患の処置のためのウイルスの選択、設計、精製
、および使用のための方法を提供する。本発明のウイルスは、ＩＦＮ媒介抗ウイ
ルス応答のこれらの細胞における選択的欠損に基づいて、新生物細胞において選
択的に複製し、そしてこれを殺傷する。適当な投薬量のウイルスの投与は、新生
物細胞死を生じ、一方、正常細胞（インタクトなＩＦＮ媒介抗ウイルス応答を有
する）は、ウイルスの複製を制限し、そして殺傷されない。新生物疾患（例えば
、癌）を含む疾患の処置において用いられる、パラミクソウイルス（例えば、Ｎ
ＤＶ）および他のウイルスの使用が、本発明の事項に含まれる。本発明はまた、
新生物疾患の治療薬としての使用に適切な他のウイルスのスクリーニングおよび
操作を教示する。本発明の別の実施形態は、ウイルス療法の候補となる腫瘍組織
を同定する方法を提供する。最後に、本発明はまた、高度に精製されたウイルス
の調製を記載する。
【００５７】 （新生物疾患を処置するためのＮＤＶを含むインターフェロン感受性ウイルス
の使用の理論的根拠） （ＮＤＶは、腫瘍細胞の選択的殺傷を実証する） ニューカッスル病ウイルスは、多くのヒト腫瘍細胞に対して選択的な細胞傷害
性効果を引き起こし、この効果は、ほとんどの正常ヒト細胞では顕著により少な
い。ディファレンシャル細胞傷害性アッセイにおいて、腎臓癌、膵臓癌、肉腫、
黒色腫、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌、小細胞および非小細胞肺癌
、ならびに神経膠芽腫由来のヒト癌細胞が、多くの正常ヒト細胞［腎臓上皮細胞
、線維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、および内皮細胞（実施例１を参
照のこと）］よりも、ＮＤＶに対して約３〜４桁の大きさ分、より感受性である
ことが発見された。ディファレンシャル細胞傷害性アッセイはまた、患者の細胞
または腫瘍組織からの新鮮な単離物にも適用され得る。
【００５８】 インビトロアッセイは、実施例１に記載のようにＮＤＶの殺腫瘍活性を規定す
るために使用される。このアッセイは、５日間における試験細胞培養物の５０％
を殺傷するのに必要なウイルスの量を測定する。実施例２および３は、腫瘍内（
実施例２）または静脈内（実施例３）のいずれかの経路で、ヒト腫瘍異種移植片
を有する無胸腺マウスにウイルスが投与された、インビボ実験の結果を示す。こ
れらの結果は、ＮＤＶが、潜在的な化学療法剤の試験のための標準的な動物モデ
ルにおいて、種々のヒト腫瘍タイプの抑制を引き起こし得ることを示す。
【００５９】 ＮＤＶが、腫瘍内で特異的に複製する証拠は、ウイルス抗原に対する免疫組織
化学染色によって実証された（実施例２）。腫瘍内ウイルス注入の３０分以内に
、腫瘍組織は、ウイルス抗原に対してネガティブであった。しかし、処置の２日
後までに、ウイルス抗原に対する強い免疫染色が、腫瘍内で見られた。このこと
は、腫瘍内でのウイルス複製を示す。重要なことに、ウイルス複製は、腫瘍組織
に特異的であった。なぜなら、近隣の結合組織および皮膚は、ウイルス抗原に対
してネガティブであったからである。
【００６０】 重要なことに、ＮＤＶの効率的な複製は、ＵＶ不活性化非クローンウイルスを
用いる研究において示されるように、ウイルスが感染細胞を殺傷する能力にとっ
て重大である（Ｌｏｒｅｎｃｅ、Ｒ．ら、１９９４、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｉｎｓｔ．、８６：１２２８−１２３３）。
【００６１】 ＮＤＶはまた、腫瘍内および静脈内投与後に大きな腫瘍の抑制を引き起こし得
る（実施例４〜９）。無胸腺マウスにおける大きな皮内Ａ３７５ヒト黒色腫異種
移植片（最大直径が１０ｍｍ以上；腫瘍体積が３００ｍｍ3以上）の腫瘍内ＮＤ
Ｖ処置は、高い割合の腫瘍抑制に至った（実施例４〜８）。大きな皮下ＨＴ１０
８０ヒト線維肉腫異種移植片（最大直径が１０ｍｍ以上）の静脈内ＮＤＶ処置は
、６匹のマウスのうち５匹において完全または部分的な腫瘍抑制に至る（実施例
９）。
【００６２】 （サイトカインのクラスＩインターフェロンファミリーはウイルス感染の重要
なネガティブモジュレーターである） クラスＩインターフェロンは、ＩＦＮα（造血起源の細胞において主に見出さ
れる）およびＩＦＮβ（線維芽細胞および上皮細胞において主に見出される）か
らなる。［Ｊｏｋｌｉｋ、Ｗ．Ｋ．１９９０。Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ。３８３
〜４１０頁、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第二版、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎ
ｉｐｅらにより編集，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；お
よびＳｒｅｅｖａｌｓｅｎ、Ｔ．１９９５．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａ
ｐｙ ｗｉｔｈ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α ａｎｄ β：Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃ
ａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ。３４７〜３６４頁、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａ
ｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、第二版、Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ、Ｊｒ．、Ｓ．Ｈｅ
ｌｌｍａｎ、およびＳ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇにより編集、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐ
ｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ］。ＩＦＮの両タイ
プは、ウイルス複製の二本鎖ＲＮＡ中間体の分解、および二本鎖ＲＮＡにより活
性化されたプロテインキナーゼの活性を介する細胞翻訳の阻害を含む、見かけ上
共通の作用機構によって機能する（Ｊｏｋｌｉｋ、Ｗ．Ｋ．１９９０。Ｉｎｔｅ
ｒｆｅｒｏｎｓ。３８３〜４１０頁、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第二版、Ｂ．Ｎ．Ｆｉ
ｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅらにより編集，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ
．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびその中の参考文献）。いくつかのウイルス（イン
フルエンザ、ＥＢＶ、ＳＶ４０、アデノウイルス、ワクシニア）は、ＩＦＮ系の
１つ以上の経路が不活性化され、従ってこれらウイルスの効率的な複製を可能に
する機構を発展させた（Ｋａｔｚｅ、Ｍ．Ｇ．１９９５．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：７５−７８）。
【００６３】 （広範な種々の腫瘍細胞は、ＩＦＮ依存性機構によるウイルス感染を制限する
能力を欠く） ヒト頚癌細胞（ＨｅＬａ）は、非形質転換線維芽細胞コントロール細胞株より
も、ＩＦＮでの前処置後の水疱性口内炎ウイルス複製の阻害に対して３００倍以
上感受性が低かった（Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉ Ｒ．Ｋ．、１９８３．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７：１６１−１６８）。本発明者
らは、腫瘍形成性ヒト頭頚部癌細胞（ＫＢ）と正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＣＣＤ
９２２−ｓｋ）との同時培養物の感染が、まず両細胞タイプにおけるウイルス複
製、続いて、継続した複製に対する正常細胞における感染の制限、および腫瘍細
胞の殺傷を生じることを発見した（実施例１０）。さらに、ＩＦＮは、正常細胞
によって培養培地に分泌されるものであったが、腫瘍細胞は、抗ウイルス状態を
樹立するために生成される濃度ではＩＦＮに応答し得なかった。ＮＤＶによる殺
傷に対する、正常細胞に対する腫瘍細胞の示差的な感受性におけるＩＦＮの役割
についてのさらなる証拠は、正常線維芽細胞（ＣＣＤ９２２−ｓｋ）または正常
上皮ケラチノサイト細胞（ＮＨＥＫ）が、ＩＦＮに対する中和抗体の存在下でＮ
ＤＶによる感染により感受性になることが示された２つの別の実験において観察
された（実施例１１および１２）。最後に、ＩＦＮの存在下での正常線維芽細胞
（ＣＣＤ９２２−ｓｋ）およびヒト腫瘍細胞（ＫＢ）の並行感染は、正常細胞が
、腫瘍細胞よりも、添加されたＩＦＮの抗ウイルス効果に対して少なくとも１０
０倍感受性であることを明らかにした（実施例１３および１４）。種々の腫瘍細
胞株の同様の試験（９のうち全部）は、ＮＤＶによる殺傷に対する細胞株の相対
的感受性における明らかな相関を示し、そしてこの細胞株がインターフェロン媒
介抗ウイルス応答を発現することができないことを示した（実施例２６）。
【００６４】 （インターフェロンおよび細胞増殖） いくつかの種のインターフェロン（ＩＦＮ）が存在し、これは、α−ＩＦＮ、
β−ＩＦＮ、ω−ＩＦＮ、およびγ−ＩＦＮの天然形態および組換え形態、なら
びに合成のコンセンサス形態を含む（例えば、Ｚｈａｎｇら（１９９６）Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、３：３１−３８に記載のように）。その発
見につながる抗ウイルス活性に加えて、ＩＦＮは、細胞増殖および分化の正常調
節において重要な役割を果たすことが、現在知られている。ＩＦＮは、ネガティ
ブ成長調節因子として考えられており、そしてＩＦＮ活性の機能および調節に関
与するいくつかの鍵となるタンパク質は、正常細胞において腫瘍抑制タンパク質
として作用することが示されている（Ｔａｎａｋａら、１９９４ Ｃｅｌｌ ７
７：８２９−８３９）。さらに、ＩＦＮの抗ウイルス活性をアンタゴナイズする
ことが公知のいくつかの他のタンパク質は、不適切に発現された場合、発癌能を
有することが示されている（以下、Ｂａｒｂｅｒ、ＧＮ、１９９４、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．、Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：４２７８−４２８２を参照のこ
と）。多数のヒト癌由来の細胞は、ＩＦＮをコードする遺伝子が欠失しているこ
とが示されており（Ｊａｍｅｓ、ＣＤ、ら、１９９１、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
，５１：１６８４−１６８８）、そしてＩＦＮ機能の部分的もしくは完全な損失
が、ヒト頚癌（Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ、Ｅ．ら、１９９４ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏ．１４：１４７７−１４８６）、慢性リンパ球性白血病（Ｘｕ、Ｂ．，ら、
１９９４、Ｂｌｏｏｄ、８４：１９４２−１９４９）、および悪性黒色腫細胞（
Ｌｉｎｇｅ、Ｃ．ら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：４２９９−４１
０４）において観察されている。
【００６５】 ＩＦＮ誘導性プロテインキナーゼ（ｐ６８、ＰＫＲ）は、細胞およびウイルス
タンパク質合成の重要な調節因子であることが示されている。ｐ６８キナーゼの
発現または活性を細胞の分化状態に関連付ける相関が明らかになっている。従っ
て、分化の乏しい細胞（例えば、多くの癌に存在する細胞）は、ｐ６８機能を欠
く（Ｈａｉｎｅｓ、Ｇ．Ｋ．ら、１９９３ Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ Ｂ
Ｃｅｌｌ Ｐａｔｈｏｌ．６３：２８９−９５）。ｐ６８活性を欠損する細胞は
、一般に、ウイルス媒介殺傷に感受性である。なぜなら、ｐ６８キナーゼは、Ｉ
ＦＮ誘導性抗ウイルス状態の重要なエフェクターであるからである。ｐ６８の抗
ウイルス活性は、ｐ５８として同定された細胞性タンパク質との直接的な相互作
用を介してアンタゴナイズされ得る。ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてクローン化され
、そして過剰発現された場合、ｐ５８は、細胞に、形質転換表現型および足場独
立増殖を示させ（Ｂａｒｂｅｒ ＧＮら、１９９４ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃ
ａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：４２７８−４２８２）、そして多数のヒト白血病
細胞株は、ｐ５８タンパク質を過剰発現することが示されている（Ｋｏｒｔｈ
ＭＪら、１９９６ Ｇｅｎｅ １７０：１８１−１８８）。ｐ６８キナーゼの活
性はまた、Ｒａｓタンパク質によってアンタゴナイズされ得る。Ｒａｓの変異体
の活性形態を発現する細胞は、二本鎖ＲＮＡによってｐ６８キナーゼの活性化が
不完全であることが示されている（Ｍｕｎｄｓｈａｕ，Ｌ．Ｊ．およびＦａｌｌ
ｅｒ、Ｄ．Ｖ．、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：２３０９２−
２３０９８）。未分化細胞におけるウイルス殺傷に対する感受性は、より分化し
た表現型の誘導によって逆転され得る（Ｋａｌｖａｋｏｌａｎｕ，ＤＶＲおよび
Ｓｅｎ，Ｇ．Ｃ．１９９３ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
９０：３１６７−３１７１）。
【００６６】 （定義） （インターフェロン媒介抗ウイルス応答にコンピテントな細胞）本明細書中で
使用されるように、用語「インターフェロン媒介抗ウイルス応答にコンピテント
な細胞」は、低レベル（例えば、１ｍｌ当たり１０単位）の外因性インターフェ
ロンに、インターフェロンの不在下に較べて、インターフェロン感受性ウイルス
の複製を有意に（少なくとも１０倍、より好都合には少なくとも１００倍、より
好都合には少なくとも１０００倍、および最も好都合には少なくとも１０，００
０倍）減少させることにより、応答する細胞である。ウイルス複製の程度は、ウ
イルスの量（例えば、感染ウイルス、ウイルス抗原、ウイルス核酸）を測定する
ことにより決定される。ＣＣＤ９２２正常線維芽細胞は、インターフェロン媒介
抗ウイルス応答にコンピテントな細胞である。
【００６７】 （インターフェロン媒介抗ウイルス応答を欠く細胞）本明細書において使用さ
れるように、用語「インターフェロン媒介抗ウイルス応答を欠く細胞」は、イン
ターフェロン媒介抗ウイルス応答にコンピテントな細胞について上述した基準を
満たすことが出来ない細胞であり、すなわち、それらは、低レベル（例えば、１
ｍｌ当たり１０単位）の外因性インターフェロンに、インターフェロンの不在下
に較べて、インターフェロン感受性ウイルスの複製を有意に減少させることによ
り、応答できない。ＫＢ口腔癌細胞は、インターフェロン媒介抗ウイルス応答を
欠く細胞である。
【００６８】 （クローナル）用語「クローナル」ウイルスの使用は、以降では、単一感染ウ
イルス粒子由来であって、そして個々の分子クローンが有意な核酸配列相同性を
有するウイルスとして定義される。例えば、配列相同性は、ビリオンの集団から
の少なくとも８つの個々の分子クローンが、３００の連続するヌクレオチドに対
して、９５％より大きい、より好都合には９７％より大きい、より好都合には９
９％より大きい、そして最も好都合には１００％の配列相同性を有するようなも
のである。
【００６９】 （細胞殺傷性（ｃｙｔｏｃｉｄａｌ））本明細書中で使用されるように、用語
「細胞殺傷性」ウイルスは、細胞に感染してその細胞に死を生じさせるウイルス
をいう。
【００７０】 （脱感作）本明細書中で使用されるように、句、脱感作は、ウイルス投与によ
ってもたらされる副作用を減らす薬剤での前処置をいう。
【００７１】 （脱感作用量）本明細書中で使用されるように、句「脱感作用量」は、続くウ
イルス用量の副作用を減らすのに必要とされるウイルス量をいう。
【００７２】 （ディファレンシャル細胞傷害性アッセイ）本明細書中で使用されるように、
句、ウイルスを用いる腫瘍細胞または組織をスクリーニングするための「ディフ
ァレンシャル細胞傷害性アッセイ」は、（ａ）腫瘍細胞、および１つ以上のコン
トロール細胞または組織のウイルス感染；（ｂ）感染より１日以上後の各サンプ
ルについての細胞生存度または死の決定（例えば、実施例１で詳述されるような
、細胞生存度の色素指示薬の使用による）；および（ｃ）結果に基づいて、コン
トロールに比較した、ウイルスに対するサンプルの感受性の概算（例えば、実施
例１で詳述されるようなＩＣ５０決定により）をいう。
【００７３】 （新生物への感染）本明細書中で使用されるように、用語「新生物に感染させ
る」は、新生物細胞または組織にウイルス核酸を進入させることをいう。
【００７４】 （インターフェロン感受性）本明細書中で使用されるように、句「インターフ
ェロン感受性」ウイルス（例えば、ＮＤＶ）は、インターフェロンの不在下に較
べてインターフェロンの存在下で、有意に少なく（少なくとも１０倍、より好都
合には少なくとも１００倍、より好都合には少なくとも１０００倍、および最も
好都合には少なくとも１０，０００倍）複製するウイルスを意味する。これは、
低レベルの外因性インターフェロン（例えば、１ｍｌ当たり１０単位）の存在ま
たは不在下で、インターフェロン媒介抗ウイルス応答にコンピテントな細胞から
得られたウイルスの量（例えば、感染ウイルス、ウイルス抗原、ウイルス核酸）
を測定することにより決定される。
【００７５】 （インターフェロン応答性）本明細書中で使用されるように、句「インターフ
ェロン応答性」ウイルス（例えば、ＮＤＶ）は、１．０のｍｏｉ（感染多重度）
の感染後、未処置細胞におけるよりも、少なくとも５０％少ないウイルス抗原が
、２４時間前処置した細胞において発現され、そして５００単位／ｍｌの外因性
インターフェロンαで維持されるウイルスをいう。この測定は、感染の少なくと
も２４時間後、およびウイルス抗原発現の５０％減少の決定が可能な最初の日に
、インターフェロン媒介抗ウイルス応答にコンピテントな細胞において行われる
。
【００７６】 （新生物および新生物疾患）本明細書中で使用されるように、「新生物」は、
新規な組織増殖（腫瘍、良性増殖（例えば、コンジローム、乳頭腫）、および悪
性増殖（例えば、癌）を含む）を意味する。本明細書中で使用されるように、「
新生物疾患」は、新生物の存在によって発現される疾患をいう。
【００７７】 （複製コンピテント）本明細書中で使用されるように、用語「複製コンピテン
ト」ウイルスは、新生物細胞において感染性子孫を生成するウイルスをいう。
【００７８】 （夾雑卵タンパク質を実質的に含まない）用語「夾雑卵タンパク質を実質的に
含まない」は、オボアルブミンが、（１）１ウェル（幅３．３ｃｍ）当たり１．
７×１０9ＰＦＵのウイルスを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウ
ムポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲル（１ｍｍ厚）で泳動させ；（２）ウイ
ルスタンパク質をゲルからニトロセルロースメンブレンに転写し；そして（３）
ウサギ抗オボアルブミン［４ｍｇ／ｍｌ抗体濃度の１：２００希釈のウサギＩｇ
Ｇ画分（Ｃａｐｐｅｌ、Ｉｎｃ．から）または等価なポリクローナル抗体］の使
用によりオボアルブミンを免疫染色することにより、当業者によって実施される
ようなウェスタンブロットにおいて検出可能ではない、およびより好都合には、
２．４ｎｇ／ｍｌの感度での電気化学発光アッセイにおいて検出可能ではない、
ウイルス純度のレベルをいう。
【００７９】 （治療有効量）本明細書中で使用されるように、用語「治療有効量」は、新生
物疾患の処置をいう場合、所望の効果（例えば、新生物増殖の停止、腫瘍抑制、
臨床状態の改善、または生存増大）を生じるウイルスの量をいう。
【００８０】 （本発明の化合物） 多様な群のウイルスは、新生物性細胞を選択的に殺傷するために用いられる。
天然のウイルスまたは操作されたウイルスは、抗新生物剤として機能し得る。こ
れらのウイルスは、ｉ）新生物性細胞に感染してその死をもたらす；ｉｉ）新生
物性細胞において複製能力がある；そしてｉｉｉ）インターフェロンの抗ウイル
ス効果によって正常細胞の殺傷が制限されている。
【００８１】 本発明の有利な実施形態では、上記の３つの特徴［（ｉ）新生物性細胞に感染
してその死をもたらす；（ｉｉ）新生物性細胞において複製能力がある；そして
（ｉｉｉ）インターフェロンの抗ウイルス効果によって正常細胞の殺傷が制限さ
れている］を保有するウイルスもまた、インターフェロンを誘導する。
【００８２】 本発明の別の有利な実施形態では、上記の３つの特徴を保有するウイルスはま
た、ヒトの新生物の後退を引き起こす；および／または既存の免疫が存在するの
で標的ヒト集団においては中和されない。
【００８３】 別の有利な実施形態では、上記の３つの特徴を保有するウイルスは、腫瘍細胞
に対して細胞殺傷性である。
【００８４】 パラミクソウイルス（本明細書中で用いられる場合、「パラミクソウイルス（
Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）」とは、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のメ
ンバーをいう）は、本発明に従って用いられて、大きな腫瘍を含む新生物または
高い腫瘍荷重（ｂｕｒｄｅｎ）を有する宿主を処置し得る。Ｐａｒａｍｙｘｏｖ
ｉｒｉｄａｅ科は、３つの属を含む：（１）パラミクソウイルス属；（２）麻疹
様ウイルス属（麻疹ウイルス属）；および（３）ＲＳウイルス属（肺炎ウイルス
属）。これらのウイルスは、ＲＮＡゲノムを含む。細胞殺傷性であるＰａｒａｍ
ｙｘｏｖｉｒｉｄａｅウイルス（特に、例えばニューカッスル病ウイルス（「Ｎ
ＤＶ」）および他の鳥類パラミクソウイルス（例えば、トリパラミクソウイルス
２型）のようなパラミクソウイルス）の使用は、本発明の実施の有利な方法であ
る。これらのウイルスのうちの弱毒化した株は、本発明による新生物の処置のた
めに特に有用である。
【００８５】 ＮＤＶは、本発明による特に有利なウイルスである。ＮＤＶは、ニワトリおよ
びニワトリ胚に対するその影響に従って３つの別個のクラスに分類される。「低
ビルレンス」株は、レント原性といわれ、最少致死用量（ＭＬＤ）でニワトリの
胚を殺傷するのに９０〜１５０時間かかる；「中程度のビルレンス」株は、中間
毒力といわれ、ＭＬＤでニワトリの胚を殺傷するのに６０〜９０時間かかる；「
高ビルレンス」株は、短潜伏期性といわれ、ＭＬＤでニワトリの胚を殺傷するの
に４０〜６０時間かかる。例えば、ＨａｎｓｏｎおよびＢｒａｎｄｌｙ，１９５
５（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２：１５６−１５７）、ならびにＤａｒｄｉｒｉら，
１９６１（Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，９１８−９２０）を参照のこと。３つ
のクラスの全てが有用であり、有利には、中間毒力株のＮＤＶ（例えば、ＭＫ１
０７株、ＮＪ Ｒｏａｋｉｎ株およびＣｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ−７０７２６株）
である（実施例２１〜２３を参照のこと）。他の中間毒力の株のリストについて
は、例えば、ＳｃｈｌｏｅｒおよびＨａｎｓｏｎ，１９６８（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
，２：４０−４７）を参照のこと。
【００８６】 特定の目的では、クローンウイルスを得て、特定のウイルス株の遺伝的均質性
を確実にするかまたは遺伝的均質性を上昇させ、そして欠損性妨害粒子を除去す
ることが所望される。クローニングによる欠損性妨害粒子の除去は、感染性粒子
あたりの総ウイルス粒子数（例えば、ＰＦＵあたりの粒子数）によって評価した
場合の最終産物における純度の上昇を可能にする。
【００８７】 クローンウイルスは、当業者に利用可能な任意の方法に従って産生され得る。
例えば、プラーク精製は、クローンウイルスを得るために慣用的に利用される。
例えば、Ｍａａｓｓａｂら，ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒ編，Ｖａｃ
ｃｉｎｅｓ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，
１９９４，７８１−８０１頁を参照のこと。三重プラーク精製が特に所望され、
ここで、所望の特徴（例えば、好ましいサイズ、形状、外観または親株の代表）
を有するプラークは、各回の精製で選択される。クローンウイルスの別の作製手
段は、当業者によって適用可能な組換えＤＮＡ技術による。クローンウイルスを
得る別の手段は、限界希釈の技術を適用する（例えば、感受性細胞の単層を含む
ウェルあたり平均１以下の感染性ウイルス粒子を与えるようなウイルスサンプル
の希釈物の添加による）。
【００８８】 本発明の有利な実施形態では、精製されたウイルスを用いて、新生物性疾患を
処置する。卵由来ウイルスの精製のために有利な方法は、以下の通りである（ウ
イルスは、これらの方法のいずれの工程でもペレット化されない）： （精製方法Ａ） ａ）クローンウイルスを作製する工程（例えば、プラーク精製）、 ｂ）卵にこのクローンウイルスを接種する工程、 ｃ）この卵をインキュベートする工程、 ｄ）この卵を冷蔵する工程、 ｅ）尿膜腔液をこの卵から収集する工程、 ｆ）細胞破片をこの尿膜腔液から除去する工程、 ｈ）ペレット化させずに尿膜腔液を超遠心分離する工程（例えば、不連続なス
クロース勾配を用いる）。
【００８９】 本発明の別の実施形態では、（尿膜腔液からの）細胞破片の除去後かつ超遠心
分離の前に添加されるさらなる工程は、以下からなる： ・尿膜腔液を凍結し次いで解凍する工程、 ・混入した物質をウイルス懸濁物から除去する工程（例えば、遠心分離によっ
て）。
【００９０】 本発明の別の実施形態では、超遠心分離は、連続流超遠心分離によって達成さ
れる。
【００９１】 本発明の１つの実施形態は、複製能力のあるＲＮＡウイルスを精製する方法に
関し、この方法は、以下の工程： ａ）クローンウイルスを生成する工程、およびｂ）このクローンウイルスを、
ペレット化を伴わずに超遠心分離によって精製する工程。
【００９２】 本発明の別の実施形態は、パラミクソウイルス（例えば、ＮＤＶ）を精製する
方法を含み、この方法は、このウイルスを、ペレット化を伴わずに超遠心分離に
よって精製する工程を含む。必要に応じて、この精製工程はさらに、超遠心分離
の前に以下の工程を含む： ａ）プラーク精製してクローンウイルスを生成する工程、 ｂ）卵にこのクローンウイルスを接種する工程、 ｃ）この卵をインキュベートする工程、 ｄ）この卵を冷蔵する工程、 ｅ）この卵から尿膜腔液を収集する工程、および ｆ）この尿膜腔液から細胞破片を除去する工程。
【００９３】 本発明の別の実施形態は、複製能力のあるクローンウイルスを卵または細胞培
養物から精製する方法を含み、この方法は、ウイルスがペレット化される工程を
含まずに超遠心分離する工程を含む（実施例３１を参照のこと）。
【００９４】 本発明の別の実施形態は、パラミクソウイルス（例えば、ＮＤＶ）を精製する
方法を含み、この方法は、このウイルスを連続的接線フロー濾過（ＴＦＦ）によ
って精製する工程を含む。必要に応じて、このウイルスはさらに、ゲル透過クロ
マトグラフィーによって精製され得、ここで、これらの工程の各々は、安定化緩
衝液の存在下で行われる（実施例１５）： ａ）プラーク精製してクローンウイルスを作製する工程、 ｂ）卵にこのクローンウイルスを接種する工程、 ｃ）この卵をインキュベートする工程、 ｄ）この卵を冷蔵する工程、 ｅ）尿膜腔液を卵から収集する工程および緩衝液での尿膜腔液の希釈、 ｆ）細胞破片を、ＴＦＦによってこの尿膜腔液から除去する工程、 ｇ）ＴＦＦによりこのウイルスを精製する工程、 ｈ）ゲル透過クロマトグラフィーによってこのウイルスを精製する工程。
【００９５】 必要に応じて、ゲル透過工程から得られるウイルスは、ＴＦＦを用いて濃縮さ
れ得る。
【００９６】 本発明の別の実施形態は、卵または細胞培養物から複製能力のあるクローンウ
イルスを精製する方法を含み、この方法は、このウイルスを連続接線フロー濾過
（ＴＦＦ）によってウイルスを精製する工程、および必要に応じて続いて、ゲル
透過クロマトグラフィーを行う工程を含み、この工程には必要に応じて、このウ
イルスを濃縮するためのＴＦＦが続き得る。
【００９７】 （クローンウイルス） これらの方法の使用は、少なくとも２×１０9 ＰＦＵ／ｍｇタンパク質まで
の、有利には少なくとも３×１０9 ＰＦＵ／ｍｇタンパク質までの、より有利
には少なくとも５×１０9 ＰＦＵ／ｍｇタンパク質までの、より有利には少な
くとも１．０×１０10 ＰＦＵ／ｍｇタンパク質までの、より有利には少なくと
も２．０×１０10 ＰＦＵ／ｍｇタンパク質までの、より有利には少なくとも３
×１０10 ＰＦＵ／ｍｇタンパク質までの、より有利には少なくとも４×１０10 ＰＦＵ／ｍｇタンパク質までの、より有利には少なくとも５×１０10 ＰＦＵ
／ｍｇタンパク質までの、そして最も有利には少なくとも６×１０10 ＰＦＵ／
ｍｇまでのクローンウイルス［パラミクソウイルス（例えば、ＮＤＶ）を含む］
の精製を可能にする。これらの方法の使用は、ＰＦＵあたりのウイルス粒子の数
が１０未満、より有利には５未満、より有利には３未満、より有利には２未満、
そして最も有利には１．２未満であるレベルまでのクローンウイルス［パラミク
ソウイルス（例えば、ＮＤＶ）を含む］の精製を可能にする。（ＰＦＵあたりの
より低いウイルス粒子数は、より高い程度の純度を示す）。
【００９８】 （ＲＮＡウイルス） 別の実施形態では、これらの方法は、（クローンウイルスについて上記で記載
したレベルまでの）ＲＮＡウイルスの精製を可能にする［（ａ）細胞殺傷性ＲＮ
Ａウイルス；（ｂ）一本鎖ＲＮＡの非分節の、エンベロープに囲まれていないウ
イルス（ｎｏｎ−ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ，ｎｏｎｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｖｉｒｕｓ
）；（ｃ）一本鎖ＲＮＡの分節の、エンベロープに囲まれたウイルス；（ｄ）二
本鎖ＲＮＡの分節の、エンベロープに囲まれていないウイルス；（ｅ）および一
本鎖ＲＮＡの非分節の、エンベロープに囲まれたウイルス（例えば、パラミクソ
ウイルス（例えば、ＮＤＶ）および例えば、レトロウイルスを含む］。
【００９９】 （ＤＮＡウイルス） 別の実施形態では、これらの方法は、以下からなる群より選択されるインター
フェロン感受性細胞殺傷性ウイルスの（クローンウイルスについて上記で記載し
たレベルまでの）精製を可能にする：（ａ）エンベロープに囲まれた、二本鎖Ｄ
ＮＡウイルス（ポックスウイルスを含む）；（ｂ）エンベロープに囲まれていな
い一本鎖ＤＮＡウイルス；および（ｃ）エンベロープに囲まれていない、二本鎖
ＤＮＡウイルス。
【０１００】 （卵由来ウイルス） 別の実施形態では、これらの方法は、夾雑卵タンパク質を実質的に含まないレ
ベルまでの卵由来ウイルスの精製を可能にする。ヒトの治療的使用のためにウイ
ルス調製物における卵タンパク質の量を制限することが好ましい。なぜなら、オ
ボアルブミンのような主要な卵タンパク質はアレルゲンであるからである。
【０１０１】 癌を含む新生物性疾患の処置において有用なウイルスを、表１に示す。ウイル
スの科のメンバーのさらなる例は、その全体が本明細書中に参考として援用され
る「Ｍｕｒｐｈｙ ＡおよびＫｉｎｇｓｂｕｒｙ ＤＷ，１９９０，Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ，第２版（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．編），Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ」に見出され得る。これらのウイルスは必要に応じて、親の株と比
較して改変されたＩＦＮ産生をもたらす天然に存在する改変体（特定の株または
単離体）についてスクリーニングされる。
【０１０２】 本発明の別の実施形態では、候補ウイルスは、天然に存在するのであろうと操
作されたのであろうと、新生物の処置において治療的有用性を提供する能力につ
いて試験される。１つの実施形態では、インターフェロン媒介性抗ウイルス性応
答が欠損した細胞（例えば、ＫＢ頭部および頸部癌細胞）の５０％を殺傷するた
めに必要とされる候補ウイルスの量は、インターフェロン媒介性抗ウイルス性応
答（例えば、正常な皮膚線維芽細胞）においてコンピテントである類似の数の細
胞の５０％を殺傷するために必要とされるウイルスの量に対して比較される。殺
傷する量は、トリパンブルー排除またはＭＴＴアッセイ（実施例１を参照のこと
）を含む多数の手段によって定量される。インターフェロン媒介性抗ウイルス応
答においてコンピテントな細胞を殺傷するために必要な量と比較して、インター
フェロン媒介性抗ウイルス応答が欠損した細胞を殺傷するために必要とされるウ
イルスの量における有意な減少（例えば、少なくとも５倍）は、試験されるウイ
ルスが、新生物の処置において治療的有用性のために必要とされる活性を示すこ
とを示す。他のＮＤＶウイルスおよびシンドビスウイルスは、腫瘍選択的殺傷を
提示するこのような天然に存在するウイルスである（実施例２１〜２３および実
施例２５を参照のこと）。
【０１０３】
【表１】 抗ウイルス状態の確立に関与する因子の理解は、ウイルス治療に応答するらし
い腫瘍についてのスクリーニングアッセイの作製を可能にする。原理的に、生検
から得られた患者由来の腫瘍組織は、ｐ６８キナーゼ、ｐ５８、または抗ウイル
ス状態または細胞分化の調節に関与する他の因子の発現についてスクリーニング
される。他の因子には以下が含まれるがこれらに限定されない：インターフェロ
ン応答因子−１（ＩＲＦ−１）、インターフェロン刺激遺伝子因子−３（ＩＳＧ
Ｆ−３）、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｍｙｂ、およびＩＦＮレセプター。ｃ−Ｍｙｃ、ｃ
−Ｍｙｂ、またはｐ５８の場合において、高レベルの発現は、腫瘍組織または細
胞がウイルス治療についての治療候補であることを示す。ｐ６８、ＩＲＦ−１、
ＩＳＧＦ−３、およびＩＦＮレセプターの場合において、低レベルの発現は、腫
瘍組織または細胞がウイルス治療についての治療候補であることを示す。
【０１０４】 少なくとも３０％のヒト腫瘍は、活性化Ｒａｓ表現型によって特徴付けられる
（Ｂｏｓ，Ｊ．Ｌ．，１９８９，Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓ．４９：４６８２）。活
性化Ｒａｓ表現型は、ｉ）活性化変異を有するＲａｓタンパク質の発現、ｉｉ）
野生型Ｒａｓタンパク質の過剰発現、またはｉｉｉ）調節されないチロシンキナ
ーゼレセプターもしくはＲａｓシグナル伝達経路の他のメンバー（例えば、Ｇｒ
ｂ２またはＳｏｓ）の発現の結果として生じ得る。活性化Ｒａｓ表現型を有する
細胞は、活性化Ｒａｓ表現型を有さない同じ細胞よりも、ＮＤＶ（Ｌｏｒｅｎｃ
ｅ，Ｒ．Ｍ．ら、１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５４：６０１７−６０２
１）またはレオウイルス（Ｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ｅ．Ｓ．ら、１９９８，ＥＭＢＯ
，１７：３３５１−３３６２）による殺傷に対してより感受性であることが示さ
れている。活性化Ｒａｓは、インターフェロンによる応答性遺伝子の誘導（Ｚｕ
ｌｌｏ，Ｊ．Ｎ．およびＦａｌｌｅｒ，Ｄ．Ｖ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．８：５０８０−５０８５）およびｄｓＲＮＡによるＰＫＲの活性化
（Ｍｕｎｄｓｃｈａｕ，Ｌ．Ｊ．およびＦａｌｌｅｒ，Ｄ．Ｖ．１９９２，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２３０９２−２３０９８）を阻害することが示
されている。インターフェロン媒介抗ウイルス応答の誘導においてＰＫＲが果た
す鍵となる役割が与えられると、ＮＤＶおよびレオウイルスによる殺傷に対する
、活性化Ｒａｓ表現型を有する細胞の感受性の増加は、本発明のウイルスによる
インターフェロン媒介抗ウイルス応答が欠損している細胞の選択的殺傷について
のさらに一層の証拠を提供する。
【０１０５】 生検から得られた患者由来の腫瘍組織は、ｉ）活性化Ｒａｓタンパク質、ｉｉ
）ＲａｓのＧＴＰ結合画分（活性型）、ｉｉｉ）ＭＡＰＫの活性化型（例えば、
ＥＲＫ１またはＥＲＫ２）、または活性化Ｒａｓ経路の他の指標の発現について
スクリーニングされ得る。患者標本における活性化Ｒａｓ表現型の存在は、腫瘍
組織がウイルス治療についての治療候補であることを示す。
【０１０６】 本発明の別の実施形態において、一次腫瘍組織または患者生検から得られた細
胞は、培養において増大され、そして適切なウイルス治療による殺傷に対する感
受性について試験される。１つの実施形態において、腫瘍組織培養の５０％を殺
傷するのに必要なウイルスの量は、候補ウイルスのスクリーニングについて上記
のように正常細胞の培養物の５０％を殺傷するのに必要な量に匹敵する。ウイル
ス因子による殺傷に対して、正常な細胞と比較して、腫瘍細胞の感受性の１０倍
以上の増大は、腫瘍細胞が、ウイルス処置の細胞殺傷効果に対して特異的に感受
的であることを示す。本発明のさらなる実施形態において、標的化された腫瘍細
胞が内因的または外因的に供給されたＩＦＮに応答する能力は、ＩＦＮ（α型ま
たはβ型、例えば、１ｍｌあたり１０単位を使用する、実施例２７を参照のこと
）の存在下で上記のスクリーニングを行うことによって決定される。
【０１０７】 ウイルスの付着または侵入のために必要である細胞レセプターの理解は、レセ
プターの高度な発現、および、従って、インターフェロン感受性ウイルスに対し
て増強された感受性を有する腫瘍のさらなるスクリーニングを可能にする。これ
は、ウイルス治療に応答するらしい患者についてのさらなるレベルのスクリーニ
ングである。インターフェロン感受性ウイルスを用いる治療について有利なこと
に、患者の腫瘍は、インターフェロンに対して抵抗性であり、そしてウイルスに
ついての細胞レセプターの高度な発現を有することの両方である。原理的には、
患者由来の血清、腫瘍細胞、組織、または組織切片は、血清中または腫瘍細胞も
しくは腫瘍組織上に存在するウイルスレセプターの量について、イムノアッセイ
または免疫染色によってスクリーニングされる。例えば、シンドビスウイルスは
、哺乳動物細胞に感染する高親和性ラミニンレセプターを利用する（Ｗａｎｇら
、１９９２，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，６６，４９９２−５００１）。この同じレセプ
ターは、転移した癌の種々の異なる型において大量に発現されることが知られて
いる。Ｐａｎｃ−１膵臓癌細胞株および結腸腺癌株ＳＷ６２０は、高レベルの高
親和性ラミニンレセプターｍＲＮＡを発現することが知られており（Ｃａｍｐｏ
ら、１９９２，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １４１：１０７３０１９８３；Ｙｏｗ
ら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８５，６３９４−６
３９８）、そしてシンドビスウイルスに対して高度に感受性である（実施例２５
）。対照的に、直腸腺癌細胞株ＳＷ１４６３は、高親和性ラミニンレセプターｍ
ＲＮＡの非常に低いレベルを発現することが知られており（Ｙｏｗら、（１９８
８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８５，６３９４−６３９８）、そ
してＳＷ６２０細胞よりもＰＰＳＩＮＤＢＩＳ−Ａｒ３３９による殺傷に対して
より抵抗性である、４桁よりも大きな規模である。
【０１０８】 ＮＤＶの存在する株、または他のウイルス（ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイ
ルスを含む）は、正常細胞において変化したＩＦＮ応答（例えば、有利に増加し
たＩＦＮ応答）についてスクリーニングまたは操作される。強力なＩＦＮ応答を
誘発するための能力に加えて、他のウイルスの特性が、そのウイルスについてス
クリーニングされるか、またはそのウイルスに操作される。変化したレセプター
特性（例えば、シンドビスウイルスＰＰＳＩＮＤＢＩＳ−Ａｒ３３９、実施例２
５を参照のこと）または低い神経毒性を有するウイルスは、本発明に含まれる（
例えば、ＮＤＶウイルスＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮ、実施例２４を参照のこと）。有
利なことには、本発明のウイルスは、直接的な細胞−細胞接触を通して伝播する
能力を有する。
【０１０９】 本明細書中に記載される発明は、ＮＤＶについての指標と類似の様式で新生物
の処置のために有用である広範なウイルスの群（表１を参照のこと）を含む。さ
らに、正常な細胞においてＩＦＮ応答を不活性化する機構の存在に起因して、使
用のための天然の候補ではないウイルスは、必要に応じて上記の制限を回避する
ために操作される。未改変のままであった場合、インターフェロン応答を不活性
化する機構を有するウイルスは、そのような機構が除去されたウイルスよりも正
常な細胞に対してより毒性である。本発明は、（１）容易に操作され得るベクタ
ーの開発；および（２）治療用ウイルスのセットの作製を提供する。操作には、
ＩＦＮまたはＩＦＮ応答経路の他のアクチベーターを発現するトランスジーンの
ウイルス発現を可能にするＩＦＮ遺伝子の付加が含まれる。さらなる変更には、
プロドラッグ活性化酵素（例えば、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼまたはシ
トシンデアミナーゼ（Ｂｌｅａｓｅ ＲＭら、１９９４．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃ
ｅｒ ３０Ａ：１１９０−１１９３））の発現の操作、および、免疫系による腫
瘍細胞の標的化を可能にする適切なマーカー抗原の発現が含まれる。さらなる変
更には、レセプターを有する細胞を標的化するレセプターリガンドの発現の操作
が含まれる［例えば、ウイルスに感染した細胞を標的化するための他のウイルス
に対するレセプターの発現（Ｍｅｂａｓｔｓｉｏｎら、１９９７，Ｃｅｌｌ ９
０：８４１−８４７；およびＳｃｈｎｅｌｌ ＭＪら，１９９７，Ｃｅｌｌ ９
０：８４９−８５７）］。
【０１１０】 上記に引用した１つに加えて、いくつかのニューカッスル病ウイルス株は、腫
瘍細胞の選択的殺傷を実証する。中間毒力のニューキャッスル病ウイルスの第２
の株を使用する示差的な細胞毒性アッセイにおいて、腫瘍細胞は、正常細胞より
も３オーダーの規模で、ウイルスによる殺傷に対してより感受性であることが見
出された（実施例２１）。さらに、第３の中間毒力ニューキャッスル病ウイルス
株が示差的細胞毒性アッセイにおいて使用された場合、腫瘍細胞は、ウイルスに
よる殺傷に対して正常細胞よりも８０〜５０００倍、より感受性であった（実施
例２２）。これらの両方の中間毒力ニューカッスル病ウイルス株もまた、ヒト腫
瘍異種移植片を有する無胸腺マウスへの腫瘍内投与後の腫瘍成長の後退を引き起
こした（実施例２３）。
【０１１１】 別個の実験において、３つの別のニューキャッスル病ウイルス株が、無胸腺で
かつ免疫応答性のマウスにおける脳内接種後に研究された。この研究の結果は、
３つすべてのウイルス株が、インタクトな免疫系を有するマウスにおいて十分に
許容されたことを示した。無胸腺マウスの脳への脳内接種は、１つのウイルスが
他の２つよりも有意により良好に許容されたことを明らかにした（実施例２４）
。これらの結果は、単一のウイルス科においてウイルスの特性の重要な相違が存
在し得、そしてより大きな効力または安全性の増加のために治療的に開発され得
ることを実証する。
【０１１２】 腫瘍崩壊性ウイルスを用いた処置後に、効力の増加およびより低い毒性が達成
され得る別の手段は、腫瘍細胞上に優先的に発現される特異的細胞表面レセプタ
ーを必要とする、インターフェロン感受性ウイルスの使用を通してである。シン
ドビスウイルスは、この型の制限の例を提供する。シンドビスウイルスは、高親
和性ラミニンレセプターを使用して哺乳動物細胞に感染する（Ｗａｎｇら、（１
９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，４９９２−５００１）。正常細胞および腫瘍細
胞が、示差的細胞毒性アッセイにおいてシンドビスウイルスで感染された場合、
その両方が腫瘍形成性であり、そして発現された高親和性ラミニンレセプターは
、他の細胞よりもこのウイルスによる殺傷に対してより感受性であることが見出
された（実施例２５）。正常なケラチノサイトは、高親和性ラミニンレセプター
を発現する（Ｈａｎｄら、（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４５，２７１
３−２７１９）が、このアッセイにおいて、シンドビスウイルスによる殺傷に対
して抵抗性であった。さらに、正常ケラチノサイトおよび２つの異なる腫瘍細胞
株のインターフェロン感受性およびラミニンレセプター発現の分析は、ＰＰＳＩ
ＮＤＢＩＳ−Ａｒ３３９が選択的に、ｉ）インターフェロン媒介抗ウイルス応答
が欠損しており、かつｉｉ）高親和性ラミニンレセプターを発現する、腫瘍細胞
を殺傷することを実証する。
【０１１３】 ＰＰＳＩＮＤＢＩＳ−Ａｒ３３９はまた、皮下ＳＷ６２０腺癌腫瘍細胞を有す
る無胸腺マウスにおいてインビボで試験された場合に、強力な腫瘍成長阻害特性
を有する（実施例３２）。
【０１１４】 水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、腫瘍崩壊性ウイルスによる腫瘍選択的な
殺傷の一般化された仮説についての証拠を提供する。すなわち、腫瘍細胞におけ
るインターフェロン応答における固有の欠損は、インターフェロン感受性複製コ
ンピテントウイルスによる殺傷に対して、これらの細胞を感受性にする。外因性
インターフェロンの存在下で、ＶＳＶを使用して非腫瘍形成性ヒトＷＩＳＨ細胞
および腫瘍形成性ＨＴ１０８０またはＫＢ細胞に感染させた場合、腫瘍形成性細
胞が選択的に殺傷された（実施例２６）。さらなる証拠は、実施例３３に提供さ
れる。この実施例において、２つの関連性のないウイルスが、腫瘍細胞株の感染
の際にほぼ同一の挙動を示すことが示される。これらのウイルスの各々に対する
この細胞株の類似の応答性は、２つの関連性のないウイルスの増殖が、この腫瘍
細胞株において類似の機構によって制御されることを実証する。
【０１１５】 以下は、天然に存在する抗インターフェロン活性を除去するように改変した場
合に、ウイルス癌治療のために有用であるウイルスのリストである（表２を参照
のこと）。内因性の抗インターフェロン活性が破壊されたかまたは減少された改
変されたウイルス（有利ではあるが、必ずしも必要でないものとして、抗インタ
ーフェロン改変に加えて弱毒化される、表３を参照のこと）は、癌治療のために
有用である。このリストには、以下に記載されるウイルスが含まれるが、これら
の限定されない。共通のクラスのウイルス間の類似性のために、以下に列挙され
た特定のウイルスの各々について同定された機構もまた、同一のまたは機能的に
類似の機構としてウイルスのクラスの他のメンバー中に存在する。ウイルスのよ
り広いグループは、括弧内に付加されている。任意の手段（天然に存在する変異
ならびに操作された欠失または点変異を含む）を通しての、抗インターフェロン
活性の機能的喪失を有する、以下のようなウイルスは、本発明の方法において有
用である。
【０１１６】 １つ以上の機構を働かせるウイルスは、必要に応じて、１つの、いくつかの、
またはすべての活性において変異を含むように改変される。いくつかの記載され
た活性についての変異は、一般的な科学分野において使用可能である。
【０１１７】 野生型ウイルスの増殖速度と比較して、より遅く増殖する、天然に存在するか
または操作されたウイルスの単離物は、特に有利である。なぜなら、より遅いウ
イルスの増殖速度は、ウイルス複製が細胞または細胞集団を殺傷し得る前に、細
胞または細胞集団を、効率的な抗ウイルス状態を確立するためにインターフェロ
ン応答においてコンピテントにするからである。
【０１１８】 感染された細胞におけるインターフェロン応答の増強を生じるがなお新生物細
胞においてはウイルス複製を可能にする、ウイルスの性質の特定の変化としての
ウイルスの抗インターフェロン活性の無力化は、本発明に含まれる。
【０１１９】 表２は、抗インターフェロン活性を除去するように操作された現存するウイル
スを示す。
【０１２０】 表３は、ビルレンスにおいて弱毒化されるように操作されたウイルスを列挙す
る。
【０１２１】 （表２：抗ＩＦＮ活性を除去するように操作された現存しているウイルス）
【０１２２】
【表２】 （表３：選択されたウイルスにおける既知の弱毒化変異）
【０１２３】
【表３】 （新生物の処置） 本発明は、とりわけ、癌を有する動物における、新生物のウイルス治療に関す
る。有利な実施形態において、本発明は、最も大きな寸法で測定した場合に１セ
ンチメートル（ｃｍ）以上のサイズである腫瘍の処置に関する。本明細書中で使
用される場合、「１ｃｍの腫瘍」とは、少なくとも１つの腫瘍の寸法が１ｃｍの
長さであることを示す。このような腫瘍は、より小さなサイズの腫瘍よりも、ウ
イルス治療に対して、予想されるよりもより感受性であり、より感受性でない場
合には、しばしば少なくともウイルスに対して同様に感受性である。本発明のよ
り有利な局面において、１ｃｍよりも大きな腫瘍（例えば、２ｃｍ以上、約２ｃ
ｍ〜約５ｃｍ、および５ｃｍより大きな腫瘍）が処置される。
【０１２４】 本発明はまた、高度な腫瘍負荷を有する宿主を処置するために使用され得る。
本明細書中で使用される場合、句「腫瘍負荷」とは、体重のパーセントとして表
現された体内の腫瘍の総量をいう。腫瘍負荷（例えば、全体重の約１％〜約２％
）を有する宿主のウイルス治療は、驚くべきほど効果的であり、例えば、腫瘍の
後退および全体の腫瘍負荷の減少を生じる。このことは、とりわけ、予測されな
かった。なぜなら、体重の約２％の腫瘍負荷（例えば、６０ｋｇのヒトにおいて
１ｋｇの腫瘍）は、生命と適合する最大の癌の量である。例えば、Ｃｏｔｒａｎ
ら、Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅ
ａｓｅ、第４版、ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ、１９８９、２５２頁を参照のこと。
実施例においては、マウス宿主におけるメラノーマ癌（例えば、Ａ３７５）につ
いて３９７ｍｍ3までの体積が、ニューキャッスル病ウイルス（例えば、３回プ
ラークから精製したウイルス）を用いる処置に応答して完全な後退を示した。組
織１０００ｍ3が１グラムに等しいと仮定すると、３９７ｍｍ3の体積を有する腫
瘍は、２０グラムのマウスについて、全体重の約２％を含む。
【０１２５】 以下の実施例４〜９に示されるように、腫瘍の後退は、少なくとも１ｃｍのサ
イズである腫瘍を用いて達成されたが、一方、処置していないコントロールマウ
スは、腫瘍負荷より数週間以内に死亡し始めた。このように、このような疾患を
有する動物が、死の２週間以内にあるにも関わらず、首尾良く処置された。従っ
て、本発明に従って、その腫瘍負荷から死に近づいている動物が、ウイルス治療
を用いて効果的に処置され得る。結果として、本発明は、従来の治療（例えば、
化学療法（例えば、メトトレキサート、５−フルオロウラシル）、および放射線
治療）に応答しなかった患者を処置するために使用され得る。
【０１２６】 腹腔内経路を通した投与後の癌の処置のためのＮＤＶの効力もまた、試験され
た。卵巣癌患者の腹水予防モデルを使用して、ＥＳ−２ヒト卵巣癌腫瘍を有する
マウスにおいてＮＤＶの腹腔内注射は、生理食塩水で処理したマウスと比較して
、生存の増大を生じた（実施例１６）。ＥＳ−２細胞が、見かけの腹水モデルに
おいて使用された場合、腹水産生は、生理食塩水コントロールと比較して、ウイ
ルス処理した動物において顕著に減少した（実施例１７）。
【０１２７】 本発明の別の実施形態において、ウイルスの投与は、１）腫瘍関連症状の軽減
（例えば、腹水産生の死亡率、痛みの軽減、および閉鎖性疾患の軽減であるがこ
れらに限定されない）、および２）寿命の延長を生じる。
【０１２８】 ５２の患者がプラーク精製したＮＤＶ単離物を、静脈内経路によって受容した
。処置応答には以下が含まれる：５患者における個々の腫瘍の後退；２患者にお
いて７ヶ月にわたって、２患者において５ヶ月にわたって、および３ヶ月で進行
中の１以上の患者においての疾患の安定；ならびに痛みの薬物適用の減少（実施
例２０）。
【０１２９】 （投与および処方） 本発明の１つの実施形態では、腫瘍細胞または組織をインビトロでスクリーニ
ングして、ウイルスに対して感受性の腫瘍を有する患者を決定する。患者から取
り出された腫瘍細胞（固形腫瘍について、微細な針吸引のような方法によってか
、または卵巣腹水腫瘍について、穿刺によって）を、インビトロで増殖させ、そ
してウイルスと共にインキュベートした。本発明のこの実施形態では、患者を、
それらの腫瘍細胞に対してウイルスが高い活性を有する場合に、治療に選択した
。
【０１３０】 本発明の有利な実施形態では、投与されたウイルスの量が、１つまたはいくつ
かの腫瘍の後退を生じる。本明細書中で使用される場合、用語「後退」は、腫瘍
が、例えば、サイズ、質量、または体積において減少することを意味する。腫瘍
サイズにおける減少は、種々の方法（身体的試験、胸部フィルムまたは他のＸ線
、超音波検査、ＣＴスキャン、ＭＲＩまたは放射性核種（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ）走査手順を含む）によって、実証される。
【０１３１】 種々の型の新生物（癌を含む）が、本発明に従って処置可能である。本発明の
ウイルスは、以下を含むがこれらに限定されない種々の癌を処置するために有用
である；肺癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、結腸腺癌、子宮頸癌腫、子宮内膜癌腫、
卵巣癌腫、膀胱癌腫、ウィルムス腫、線維肉腫、骨肉腫、黒色腫、滑膜肉腫、神
経芽細胞腫、リンパ腫、白血病、脳腫瘍（膠芽腫を含む）、神経分泌癌腫、腎臓
癌腫、頭頸部癌腫、胃癌腫、食道癌腫、弁の癌腫（ｖｕｌｖｕｌａｒ ｃａｒｃ
ｉｎｏｍａ）、肉腫、皮膚癌、甲状腺膵臓癌、および中皮腫。本発明のウイルス
はまた、コンジローム、乳頭腫、髄膜腫、および腺腫を含むが、これらに限定さ
れない種々の良性腫瘍を処置するために有用である。
【０１３２】 治療的有効量のウイルスを、新生物を有する宿主に投与する。投与されるウイ
ルスの用量が、選択されるウイルス、新生物の型、新生物細胞の増殖または転移
の程度、新生物の生物学的部位または身体画分、ウイルスの株、投与経路、投与
スケジュール、投与様式、およびその哺乳動物に投与される任意の他の薬物また
は処置の正体（例えば、照射、化学療法、または外科的処置）に依存して変動す
ることが、当業者によって理解される。これらのパラメーターは、動物モデルに
おける最大耐量（ＭＴＤ）決定、および相対的な身体表面積またはボディマス（
ｂｏｄｙ ｍａｓｓ）の関数としてのヒト投薬量へのスケーリングを通して、決
定される。特定の状況では、１用量より多くのウイルスが与えられることもまた
、理解される。ウイルスのこのような複数回用量の間の最適な間隔は、経験的に
決定され得、そして当該技術の範囲内である。ＮＤＶは一般的に、約３×１０6
〜約５×１０12ＰＦＵのウイルスを投与される。局所投与（例えば、腫瘍内に直
接的に）のためには、少なくとも３×１０6ＰＦＵ、より有利には少なくとも３
×１０7ＰＦＵ、より有利には少なくとも３×１０8ＰＦＵ、より有利には少なく
とも３×１０9ＰＦＵ、より有利には少なくとも３×１０10ＰＦＵ、より有利に
は少なくとも３×１０11ＰＦＵ、そして最も有利には少なくとも５×１０12ＰＦ
Ｕが代表的に使用される。全身投与のためには、体表面積１平方メートルあたり
少なくとも１×１０8ＰＦＵのウイルス、より有利には体表面積１平方メートル
あたり少なくとも１×１０9ＰＦＵのウイルス、より有利には体表面積１平方メ
ートルあたり少なくとも５．９×１０9ＰＦＵのウイルス、より有利には体表面
積１平方メートルあたり少なくとも１．２×１０10ＰＦＵのウイルス、より有利
には体表面積１平方メートルあたり少なくとも４．８×１０10ＰＦＵのウイルス
、より有利には体表面積１平方メートルあたり少なくとも７．２×１０10ＰＦＵ
のウイルス、より有利には体表面積１平方メートルあたり少なくとも９．６×１
０10ＰＦＵのウイルス、そして最も有利には体表面積１平方メートルあたり少な
くとも３．０×１０11ＰＦＵのウイルスの量が使用される。
【０１３３】 静脈内投与のためには、１週間あたり１回、１週間あたり２回、および１週間
あたり３回の用量スケジュールが使用される。本発明に従うウイルス（必要に応
じて、化学療法剤を伴なう）は、以下の種々の経路によって投与され得る：例え
ば、腸内、非経口、経口、鼻内、直腸、鞘内、静脈内（例えば、カテーテルを使
用する）、皮下、腫瘍内（例えば、その組織またはそれを灌流する脈管内に直接
的に）、腫瘍周囲、局所的（ｌｏｃａｌ）、舌下、口腔内、局部的（ｔｏｐｉｃ
ａｌ）、筋内、吸入によって、経皮、膣内、動脈内、頭蓋内、皮内、硬膜外、全
身的、局部的（ｔｏｐｉｃａｌ）、腹腔内、胸膜腔内、嚢内（膀胱腫瘍について
）など。肺腫瘍については、気管支経路（例えば、気管支投与）、経皮経路、ま
たは内視鏡的経路が使用され得る。胃腸腫瘍の内視鏡的注入ならびに直腸腫瘍の
坐剤処置もまた、適切な場合に使用される。
【０１３４】 ＮＤＶを用いたマウス毒性研究によって、静脈内ウイルス投与後の急性毒性は
、サイトカイン媒介反応によって引き起こされるようであることが示された。反
復刺激に対するサイトカイン応答は、最初の誘導事象後に脱感作されるか、また
はダウンレギュレートされることが公知である（Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９
１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１、２３６６−２３７２）。脱感作用量のウイル
スを受容したマウスは、生理食塩水処理コントロールよりも、より高い用量のそ
の後の投与に対して耐性である（実施例１８）。脱感作用量のウイルスを静脈注
射されたマウスは、最初の注射についてビヒクル単独を受容したマウスよりも、
２回目の静脈内用量において約１０倍より高いウイルスに耐性であり得た。
【０１３５】 静脈内経路によって投与されたウイルスの比率は、毒性に有意に影響し得る。
２群の無胸腺マウスを、同一用量のＮＤＶで静脈内処理した。これらは、緩徐（
４分間にわたり０．２ｍｌ）または急速（３０秒間に０．２ｍｌ）のいずれかで
投与された。各群での最大の重量減少の比較によって、急速な注射に対して緩徐
な注射を受けた群において、５０％未満の重量減少が明らかにされた（実施例１
９）。
【０１３６】 臨床試験において、患者は、１週間のクールにわたってプラーク精製されたＮ
ＤＶ分離菌の３回の注射を受けた。これらの条件において、初回用量の脱感作効
果は、２回目および３回目の用量がこの初回用量よりも２〜８倍高い場合におい
てさえ、この２回目および３回目で付随した毒性を弱めた（実施例２０）。これ
らのデータは、実施例１８および２８で示された動物研究によって得られたデー
タに近似する。さらに、臨床試験において、より小さな脱感作用量を用いてより
高い用量が達成可能である場合に、より高い比率の腫瘍後退が着目された（表１
９、実施例２０を参照のこと）。これは、重ねて、動物モデル試験において得ら
れたデータに近似した（実施例２９）。
【０１３７】 癌の処置における腫瘍崩壊性ウイルスの使用に関する１つの懸念は、体液性免
疫応答が治療においておよぼし得る潜在的な阻害効果である。臨床試験において
、１ヶ月後に安定な疾患を示す患者が、処置の第２クールに適格である。従って
、処置の２回目およびその後のクールは、ＮＤＶに対する中和抗体の存在下で投
与される。にもかかわらず、感染性ウイルスが、第２クールについて投薬した後
の患者の尿において見出され得、そして第２クール後に、腫瘍後退が観察された
。これは、高用量のウイルスの投与が、中和抗体の影響を克服し得、そして患者
における感染を確立する証拠を提供する（実施例２０）。本発明の有利な実施形
態では、ウイルス治療の複数回クールが投与される。クールの例としては、以下
が挙げられる：１週間の間、１週間あたり３回のウイルス投与、次いで、３週間
の休止期間；４週間の間、１週間あたり３回のウイルス投与、次いで、２週間の
休止期間；ウイルスの１用量の投与、次いで、４週間の休止期間；６週間の間、
１週間あたり３回の投与、次いで、２週間の休止期間。別の実施形態では、ウイ
ルスの初回用量の投与後に、ウイルスを２週間より長く投与する。
【０１３８】 本発明の有利な実施形態では、脱感作用量が、引き続くより高い用量の前に与
えられる。脱感作用量レベルを、毒性の臨床的指標（例えば、低血圧、疲労、肝
トランスアミナーゼの上昇または他の適切な指標）から決定する。ここで、脱感
作用量レベルは、単回投与についての最大耐量（ＭＴＤ）に等しいか、またはそ
れ未満である。脱感作後、脱感作用量を超えるさらなるウイルス用量が与えられ
る。有利な実施形態では、引き続くウイルス用量は、単回用量ＭＴＤに等しいか
、またはそれよりも高い。例えば、少なくとも１×１０8ＰＦＵ／ｍ2、より有利
には少なくとも３×１０8ＰＦＵ／ｍ2、より有利には少なくとも１×１０9ＰＦ
Ｕ／ｍ2、より有利には少なくとも５．９×１０9ＰＦＵ／ｍ2、そして最も有利
には少なくとも１．２×１０10ＰＦＵ／ｍ2の脱感作ウイルス用量が使用される
。脱感作後、少なくとも１×１０8ＰＦＵ／ｍ2、より有利には少なくとも３×１
０8ＰＦＵ／ｍ2、より有利には少なくとも１×１０9ＰＦＵ／ｍ2、より有利には
少なくとも５．９×１０9ＰＦＵ／ｍ2、より有利には少なくとも２．４×１０10 ＰＦＵ／ｍ2、より有利には少なくとも４．８×１０10ＰＦＵ／ｍ2、そしてより
有利には少なくとも９．６××１０10ＰＦＵ／ｍ2、そして最も有利には少なく
とも３．０×１０11ＰＦＵ／ｍ2のさらなるウイルス用量が使用される。別の実
施形態では、脱感作のために、ＴＮＦα、ＩＬ−２、または他のサイトカインが
、単独または組合せにおいて投与される。
【０１３９】 用量間の時間（脱感作用量と次回用量との間の時間を含む）は、１〜１４日間
であり、有利には１〜７日間である。脱感作用量は、以下の種々の経路によって
投与され得る：例えば、静脈内、腸内、非経口、経口、鼻内、直腸、鞘内、静脈
内、皮下、腫瘍内、腫瘍周囲、局所的（ｌｏｃａｌ）、舌下、口腔内、局部的（
ｔｏｐｉｃａｌ）、筋内、吸入によって、経皮、膣内、動脈内、頭蓋内、皮内、
硬膜外、全身的、局部的（ｔｏｐｉｃａｌ）、腹腔内、胸膜腔内、内視鏡的、気
管支内など。引き続く用量は、脱感作用量と同じ経路によってか、または別の経
路（例えば、静脈内、腸内、非経口、経口、鼻内、直腸、鞘内、静脈内、皮下、
腫瘍内、腫瘍周囲、局所的（ｌｏｃａｌ）、舌下、口腔内、局部的（ｔｏｐｉｃ
ａｌ）、筋内、吸入によって、経皮、膣内、動脈内、頭蓋内、皮内、硬膜外、全
身的、局部的（ｔｏｐｉｃａｌ）、腹腔内、胸膜腔内、内視鏡的、気管支内など
）によって、投与され得る。別の経路による引き続く投薬のためのＩＶ脱感作の
有用性を、実施例２８において実証する。脱感作用量のウイルスを静脈注射され
たマウスは、最初の注射についてビヒクル単独を受容したマウスよりも、２回目
の腹腔内投薬において約５倍より高いウイルスに耐性であり得た。
【０１４０】 臨床試験において、脱感作を使用して達成可能な最大耐量の増加は、実施例２
９に記載されるように、抗腫瘍効力の増加を可能にした。
【０１４１】 必要に応じて、１より多い投与経路が、連続様式または併用様式のいずれかで
使用され得る。併用投与または連続投与のいずれかの経路としては、以下が挙げ
られるが、これらに限定されない：静脈内、腸内、非経口、経口、鼻内、直腸、
鞘内、静脈内、皮下、腫瘍内、腫瘍周囲、局所的（ｌｏｃａｌ）、舌下、口腔内
、局部的（ｔｏｐｉｃａｌ）、筋内、吸入によって、経皮、膣内、動脈内、頭蓋
内、皮内、硬膜外、全身的、局部的（ｔｏｐｉｃａｌ）、腹腔内、胸膜腔内、内
視鏡的、気管支内など。一例は、静脈内での脱感作用量、次いで、腹腔内用量の
投与である。
【０１４２】 本発明の別の有利な実施形態では、ウイルスを、４分間〜２４時間（有利には
、２０〜６０分間）のクールにわたって、静脈内ポンプ、シリンジポンプ（ｓｙ
ｒｉｎｇｅ ｐｕｍｐ）、点滴静注、または低速注入（ｓｌｏｗ ｉｎｊｅｃｔ
ｉｏｎ）を使用することを含む低速注入によって、投与する。
【０１４３】 ウイルス（および必要に応じて、１以上の化学療法剤）は、単回注射によって
か、複数回注射によってか、または同時に投与される。ウイルスを、化学療法剤
（例えば、ブスルファン、シクロホスファミド、メトトレキサート、シタラビン
、ブレオマイシン、プラチナ配位錯体（例えば、カルボプラチンまたはシスプラ
チン）、ドキソルビシン、ダカルバジン、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎ
ｅ）、メルファラン、メルカプトプリン、ビンブラスチン、５‐フルオロウラシ
ル、タキソール、およびレチノイン酸（しかし、これらに限定されない））の投
与の前、同時、または後に投与する。本発明に従うウイルス治療は、必要に応じ
て、他の治療（外科手術、照射、化学療法（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ｔｉｅｒｎｅｙら
編、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、１９９７、特に７８〜９４頁を参照のこと
））を含む）および生物療法と組合せられる。ウイルスを、例えば、以下の生物
学的薬剤：（１）他の腫瘍崩壊性薬剤［例えば、前立腺細胞特異的応答因子の転
写制御下でその遺伝子の１つを有するアデノウイルス（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｓ，Ｒ
．ら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：２５５９−２５６３を参照のこ
と）；ｐ５３に結合し得るＥｌｂポリペプチドをコードしないアデノウイルス（
Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．Ｒ．ら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：３７３−
３７６を参照のこと）；機能的γ３４．５遺伝子産物を発現し得ない単純ヘルペ
スウイルス（Ｍｉｎｅｔａ，Ｔ．ら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ １：９３８−９４３を参照のこと）（しかし、これらに限定されない）］；
（２）サイトカイン［例えば、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）；腫
瘍壊死因子、およびインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６
、およびＩＬ−１０（しかし、これらに限定されない）］；（３）ウイルスベク
ター［例えば、ｐ５３をコードするアデノウイルス（Ｚｈａｎｇ，ＷＷら、１９
９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５−１３を参照のこと）
（しかし、これに限定されない）］；および（４）癌ワクチン。
【０１４４】 本発明の１つの実施形態では、治療は、細胞傷害性であり、かつＩＦＮ機構を
介して腫瘍選択的である抗原性の異なるウイルスを用いた連続処置からなる。本
実施形態は、免疫学的干渉を伴なわずに、延長された期間にわたってウイルス治
療を可能にする。
【０１４５】 別の実施形態は、ＮＤＶ（または、他のウイルス）の投与の前、同時、または
後での、ＩＦＮ（例えば、αＩＦＮ、βＩＦＮ、またはγＩＦＮ）による患者の
処置を包含する。ＩＦＮは、クラスＩ群（α、β、およびω）およびクラスＩＩ
（γ）、ならびに組換えバージョン、ならびにそれらのアナログ（例えば、Ｓｒ
ｅｅｖａｌｓｏｕｎ，Ｔ．、１９９５（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏ
ｆ Ｃａｎｃｅｒ、第２版、Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ，Ｊｒ．、Ｓ．Ｈｅｌｌｍａ
ｎおよびＳ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、３４７−３６４において考察されるよ
うな）から選択される。正常な細胞は、ウイルス感染に対して増強されたＩＦＮ
応答で、ＩＦＮ前処理に応答し、これらの細胞に対してより高い安全性さえも提
供する。ＩＦＮシグナル伝達経路において欠損した腫瘍細胞は、ウイルスによる
殺傷に対して感受性を維持する。これは、さらにより高い用量のウイルス治療が
使用されることを可能にする。ＩＦＮを、ウイルス感染を処置するために有効で
あることが公知である用量およびレジメンについての標準的な臨床指針に従って
、投与する。
【０１４６】 本発明の別の実施形態では、ＩＦＮ応答経路に影響することが公知の他の薬物
もまた、必要に応じて使用し、腫瘍細胞の感受性を増加させるか、またはウイル
ス感染の細胞殺傷効果に対する正常細胞の耐性を増加させる。このクラスの薬物
としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：チロシンキナーゼイン
ヒビター、シメチジン、およびミトコンドリアインヒビター。本発明の治療的ウ
イルスの腫瘍崩壊性活性を増強させるための１つのストラテジーは、ミトコンド
リアの酸化的リン酸化の崩壊が含まれる。好ましい薬剤は、呼吸鎖機能またはミ
トコンドリアタンパク質合成を阻害する、臨床的に受容可能な薬物である。４−
キノロン抗生物質、メナジオン、クロラムフェニコール、クロロキン、およびテ
トラサイクリンは、抗癌ウイルスの腫瘍崩壊性活性を強化するために有用である
。このような薬剤を、腫瘍崩壊性ウイルスの投与の０〜２４時間前に、臨床的に
耐性の用量で投与する。ミトコンドリアインヒビターはまた、必要に応じて、ウ
イルスの後に投与されて、ウイルス複製を支持する腫瘍をさらに感作する。
【０１４７】 低酸素および熱感覚過敏もまた、インターフェロン応答性を調節することが公
知である。従って、本発明の１つの実施形態では、腫瘍の低酸素領域を、治療用
腫瘍崩壊性ウイルスに腫瘍を曝露する前またはその間に酸素処理する。これを達
成するための方法としては、酸化フッ化炭素血液ヘモグロビン置換基、エリトロ
ポイエチン、または血管拡張薬の全身投与が挙げられるが、これに限定されない
。腫瘍の酸素処理はまた、肺を介して空気中の過剰濃度の酸素を送達することに
よって達成される。
【０１４８】 本発明の別の実施形態では、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリンＡ、アザチ
オプリン（ａｚａｔｈｉａｐｒｉｍｅ）、レフルノミド、抗ＣＤ４０リガンド抗
体（Ｆｏｙ，Ｔ．Ｍ．ら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１５６７−
１５７５））および種々のコルチコステロイド調製物（例えば、コルチソル、プ
レドニゾン（ｐｒｅｄｉｓｏｎｅ）、プレドニゾロン、６α−メチルプレドニゾ
ロン、フルドロコルチゾン、コルチコステロン、トリアムシノロン、パラメタゾ
ン、ベタメタゾン（ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅａｎｄ）、およびデキサメタゾ
ン））を、ウイルス投与の前、間または後に投与する。あるいは、免疫刺激化合
物（例えば、リポペプチド）を、ウイルスと共に投与し得る。
【０１４９】 本発明の別の実施形態では、ＴＮＦ−α活性を阻害する薬剤（例えば、ＴＮＦ
−α（実施例３０を参照のこと）、可溶性ＴＮＦ−αレセプター、コルチコステ
ロイド、または他の化合物に対する抗体）を、ウイルスの前、間、または後に投
与する。
【０１５０】 ウイルス感染に応答して産生されるインターフェロンの量が、ヌクレオシド（
Ｍａｃｈｉｄａ，Ｈ．、１９７９、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３
：６４３−６５０）、ヌクレオシド前駆体、または１以上のヌクレオシドの細胞
性濃度を増加させる薬物の使用を通して増加する独立した機構を、必要に応じて
、ウイルス治療に対する補助として使用する。
【０１５１】 特定のプリンヌクレオシドアナログ（例えば、２−クロロデオキシアデノシン
および２’−デオキシコホルマイシン）は、インビボでのインターフェロンの産
生を誘導する。このような化合物を使用して、さらに、腫瘍細胞 対 正常細胞
のインターフェロン感受性の差異をもたらす。そしてこのような化合物は、必要
に応じて、ウイルス治療に対する補助として使用される。
【０１５２】 １つの局面では、有効量のウイルスを、より少ない用量に細分し得、そして同
一腫瘍の異なる位置に同時に注射し得る。連続投与のために、所望される薬剤を
、移植されたミニポンプを介して投与するか、または所望されるポリマー内に浸
透させ、次いで、緩徐な放出または遅延型放出のために、所望される位置（例え
ば、腫瘍内に直接的に）に移植される。
【０１５３】 本発明のウイルスは、それを、少なくとも１つの賦形剤または補助剤、そして
所望される場合には、１以上のさらなる活性化合物と共に適切な用量形態にする
ことによって、薬学的調製物として処方される。調製物は、ヒトおよび獣医学的
医薬の両方に使用される。適切な賦形剤としては、例えば、腸内投与または非経
口投与のために適切な有機物質および無機物質（例えば、水、生理食塩水、組織
培養培地、緩衝液、リシン、シトレート、グリセロールトリアセテート、および
他の脂肪酸グリセリド、ゼラチン、ダイズレシチン、炭水化物（例えば、マンニ
トール、スクロース、ラクトース、またはデンプン）、ステアリン酸マグネシウ
ム、タルク、セルロース、もしくはタンパク質キャリア、または前述の化合物の
組合せ（例えば、マンニトール／リシン、またはマンニトール／リシン／スクロ
ース））が挙げられる。調製物は滅菌され、および／または添加物（例えば、保
存薬または安定剤）を含む。非経口投与（例えば、全身または局所的注射）のた
めに、ウイルス調製物は、例えば、水性懸濁液またはエマルジョンとして処方さ
れる。
【０１５４】 本発明はまた、哺乳動物における疾患を処置する方法に関し、ここで罹患した
細胞は、インターフェロン媒介抗ウイルス応答において欠損を有する。この方法
は、哺乳動物に、治療的有効量のインターフェロン感受性の複製能を有するクロ
ーンウイルスを投与する工程を包含する。例えば、多くのウイルスが、宿主細胞
のインターフェロン媒介性抗ウイルス応答を除去する機構を進化させている。Ｂ
型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスは、世界中で、肝機能不全の原因を引き
起こしている。これらのウイルスは、進行性の肝障害、肝硬変、および肝細胞癌
に関連する。インターフェロンでの処置は、これらの疾患についての現在の標準
的な治療であるが、その集団の大部分は、処置への応答に失敗するか、または治
療終了後に再発を受ける。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の末端タンパク質（ｔｅ
ｒｍｉｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、インターフェロン、および二重鎖ＲＮＡ（
ＰＫＲの公知の活性化因子（Ｆｏｓｔｅｒ，Ｇ．Ｒ．ら、１９９１、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２８８８−２８９２））に対する
細胞性応答を阻害することが示されている。さらに、ＨＢＶのコア抗原は、βイ
ンターフェロン遺伝子の発現を阻害することが示されており（Ｗｈｉｔｔｅｎ，
Ｔ．Ｍ．ら、１９９１、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６５：４６９９−４７０４）、そして
ＨＢＶ関連デルタ因子は、ウサギ小根溶解産物（ｒｅｔｉｃｕｌｏｌｙｓａｔｅ
）においてＰＫＲの活性をブロックすることが示された（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，
Ｈ．Ｄ．ら、１９９６、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７０：５６１１−５６１７）。Ｃ型肝
炎ウイルス（ＨＣＶ）もまた、ＰＫＲプロテインキナーゼを抑制する活性を保有
する。ＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質は、ＰＫＲプロテインキナーゼ活性を直接的
に阻害することが示された（Ｇａｌｅ，Ｍ．Ｊ．ら、１９９８、Ｃｌｉｎ．Ｄｉ
ａｇｎ．Ｖｉｒｏｌ．１０：１５７−１６２）。ＨＢＶまたはＨＣＶ感染につい
ての最初のインターフェロン治療に失敗している患者が、本発明のウイルスでの
処置についての候補者である。治療用ウイルス（１つまたは複数）が、上記の任
意の手段によって投与されるが、有利には、静脈内にか、肝臓内動脈を通して投
与される。
【０１５５】 ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した細胞もまた、インターフェロンの
影響に対して耐性であり、そしてこの耐性は、ＡＩＤＳの存在と相関するという
証拠が存在する（Ｋｕｎｚｉ，Ｍ．Ｓ．ら、１９９５．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉ
ｓ．、１７１：８２２−８２８；Ｅｄｌｉｎ Ｂ．Ｒ．ら、１９９２、Ａｎｎ．
Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１１７：４５７−４６０）。機械的に、ＨＩＶのＴＡＲ
ＲＮＡ領域がＰＫＲと相互作用し、そしてＴＡＲ ＲＮＡの濃度に依存してこ
のキナーゼの活性を活性化または阻害することが示された（Ｍａｉｔｒａ，Ｒ．
Ｋ．ら、１９９４、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０４：８２３−８２７）。さらに、細
胞ＴＲＢＰおよびウイルスＴａｔタンパク質は、ＨＩＶ ＴＡＲ ＲＮＡ領域に
結合し、そしてＰＫＲの活性を阻害することが公知である（Ｄａｖｉｅｓ．Ｐ．
Ｈ．ら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：４７１３−
４７１７；Ｂｒａｎｄ，Ｓ．Ｒ．ら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
２：８３８８−８３９５）。ＨＩＶに感染し、そしてインターフェロンの影響に
対して耐性である細胞が、本発明のウイルスによる殺傷の標的である。
【０１５６】 多くの他のヒトウイルス病原体が、インターフェロン媒介抗ウイルス状態の１
以上の構成要素を阻害することが公知である。アデノウイルスおよびエプスタイ
ン−バーウイルスはすべて、感染した細胞においてＰＫＲの活性化をブロックす
る異常な小ＲＮＡ種を発現することが公知である（概説には、Ｃｌｅｍｅｎｓ，
Ｍ．Ｊ．ら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７６：７７０−７７８を参照のこ
と）。エプスタイン−バーウイルスは、貧弱かつ未分化の鼻咽頭癌腫に加えて風
土性バーキットリンパ腫にほぼ１００％関連し、そして感染性単核細胞症の原因
因子である。ワクシニアウイルスは、それぞれ、ＰＫＲの活性化をブロックし、
そして活性化ＰＫＲキナーゼについての偽基質として供されるタンパク質Ｅ３Ｌ
およびＫ３Ｌをコードすることが示されている（Ｄａｖｉｅｓ，Ｍ．Ｖ．、１９
９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：１６８８−１６９２）。Ｅ３Ｌタンパク質はまた
、細胞性抗ウイルス応答の２’−５’シンテターゼ構成要素を阻害することが示
された（Ｒｉｖａｓ，Ｃ．ら、１９９８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４３：４０６−
４１４）。
【０１５７】 ワクシニアウイルスＥ３Ｌタンパク質のホモログもまた、パラポックスウイル
スのヒトｏｒｆにおいて記載されている（ＭｃＩｎｎｅｓ，Ｃ．Ｊ．、１９９８
、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １７：１０７−１１５）。ワクシニアウイルスはま
た、インターフェロンによる抗ウイルス状態の誘導を阻害するＩ型インターフェ
ロンレセプターの可溶性形態をコードする（Ｓｙｍｏｎｓ，Ｊ．Ａ．、１９９５
、Ｃｅｌｌ ８１：５５１−５６０）。ＰＫＲキナーゼの細胞性インヒビターは
、インフルエンザウイルス（Ｌｅｅ，Ｔ．Ｇ．ら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６２０８−６２１２）またはポリオウイ
ルス（Ｂｌａｃｋ，Ｔ．Ｌ．ら、１９８９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２２４４−
２２５１）に感染した細胞において誘導される。１型単純ヘルペスウイルスはま
た、感染した細胞におけるタンパク質合成のＰＫＲ媒介性遮断をアンタゴナイズ
するタンパク質（γ３４．５）をコードする（Ｃｈｏｕ，Ｊ．ら、１９９５、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１０５１６−１０５２０
）。インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質およびレオウイルスのσ３タン
パク質は、二重鎖ＲＮＡによってＰＫＲの活性化を阻害することが示された（Ｌ
ｕ，Ｙ．ら、１９９５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１４：２２２−２２８；Ｉｍａｎ
ｉ、Ｆ．およびＪａｃｏｂｓ、Ｂ．Ｌ．、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７８８７−７８９１）。抗ウイルス状態の細胞性
確立によるウイルス干渉に関する上記例の各々において、本発明のウイルスでの
感染細胞の処理は、感染した細胞の選択的殺傷へと導く。
【０１５８】 本明細書中で他に示されない限り、本発明のウイルス治療の詳細および条件は
、米国特許出願番号０８／２６０，５３６（この開示は、その全体が本明細書中
で参考として援用される）に従う。上記および図面において引用されたすべての
特許出願、特許、および刊行物の開示全体を、本明細書中で参考として援用する
。
【０１５９】 以下の実施例は、例示的であり、本発明の方法および組成物の制限ではない。
当業者に明らかな、臨床的治療において通常遭遇する種々の条件およびパラメー
ターの他の適切な改変および適応は、本発明の精神および範囲内である。
【０１６０】 （実施例１） （ＰＰＭＫ１０７（ＮＤＶ菌株ＭＫ１０７の３重プラークの精製された単離体
）は、正常ヒト細胞と比較して多くのヒト癌細胞に対して選択的細胞傷害性活性
を示す。） ヒト腫瘍細胞および正常細胞を、２４ウェル細胞培養皿に約８０％のコンフル
エントまで増殖させた。増殖培地を除去し、そしてＰＰＭＫ１０７を、１０6プ
ラーク形成単位（ＰＦＵ）／ウェル〜１０-1ＰＦＵ／ウェルの範囲で、１０倍希
釈で添加した。ウイルス添加を伴わないコントロールウェルを各プレートに対し
て含めた。ウイルスは、揺り動くプラットフォーム上３７℃で９０分間吸着させ
た。インキュベーション期間の終わりに、ウイルスの希釈物を除去し、そして１
ｍｌの増殖培地で置換した。次いで、プレートを５日間、５％ＣＯ２中３７℃で
インキュベートし、次いで、細胞変性効果（ＣＰＥ）の量に関して定性的に評価
した。細胞傷害性は、比色定量ＭＴＴ（２−［４，５−ジメチルチアゾール−２
−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）アッセイ（Ｃｅｌｌ
Ｔｉｔｅｒ ９６，カタログ＃Ｇ４０００、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ ５３７１１）を用いて、５７０ｎｍでモニタ
ーすることによって数量化した。これは、ミトコンドリア酵素活性を検出する（
Ｍｏｓｍａｎ，Ｔ．，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：
５５）。ウイルス処理されたウェルにおける生存度は、未処理コントロールウェ
ルにおける活性のパーセントとして表現した。データは、ＰＦＵ／ウェル対生存
度に関して、コントロールのパーセントとしてグラフにプロットした。ＩＣ５０
を、生細胞の量の５０％減少を引き起こす、ＰＦＵ／ウェル中のウイルスの量と
して計算した。
【０１６１】 結果を表４、５および６に提供する。ＰＰＭＭＫ１０７は、多様なヒト癌細胞
のセットに対して高い程度の細胞傷害性活性を示し、３９の悪性株の内の３０が
、正常ヒト細胞型の相対的非感受性に対して比較して、１０００未満のＩＣ５０
値を有した。ヒト癌細胞の大多数は、ほとんど正常なヒト細胞型より２〜３オー
ダーの大きさが低いＩＣ５０値を有した。
【０１６２】 表４ 細胞傷害性結果の要約
【０１６３】
【表４】 表５．正常ヒト細胞を用いた細胞傷害性アッセイの結果の要約
【０１６４】
【表５】 表６．急速に増殖する正常ヒト細胞を用いた細胞傷害性アッセイの結果の要約
【０１６５】
【表６】 ａ−試験されたヒト胸部上皮細胞（ＨＭＥＣ）は、ウシ下垂体抽出物およびヒ
ト表皮増殖因子を用いた刺激の後、高速な増殖を有した。著しく対照的に、正常
胸部上皮細胞は、ほとんど常に、癌を有する成人女性において非常に低い程度の
増殖を有する。
【０１６６】 （実施例２） （無胸腺マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片（＜１０ｍｍおよび＞５ｍｍ）の
腫瘍内処置に関するＰＰＭＫ１０７の使用） 無胸腺マウスに、１０００万個のヒト腫瘍細胞を用いて皮内注射した。腫瘍が
５と１０ｍｍとの間の範囲のサイズに達した後、ＰＰＭＫ１０７の単一注射（３
×１０8ＰＦＵの用量）または生理食塩水を与えた。ほとんど全ての腫瘍型が、
ＰＰＭＫ１０７で処理されたマウスにおいて、５０％〜１００％の完全または部
分的な後退率を示した（表７を参照のこと）。１つの例外は、Ｕ８７ＭＧ実験の
場合である（実験Ｉ）：ＰＰＭＫ１０７で処置された９つの腫瘍のうちの１つの
みが完全に後退したが、もう２つのウイルス処理された腫瘍は、３２％および２
０％の後退を示し、もう２つのウイルス処理された腫瘍は、生理食塩水コントロ
ールで処理された全ての８つの腫瘍よりもゆっくりとした増殖を有した。腫瘍後
退は、生理食塩水コントロール処理された腫瘍において実質的に存在しなかった
：これらの実験の全てにおいて（表７に列挙されるＡ〜Ｉ）、７３コントロール
腫瘍のうちの１つのみが、後退を示した。多様な腫瘍型が、腫瘍内ＰＰＭＫ１０
７処置に対して応答を示すことが、これらの結果により示される。
【０１６７】 腫瘍内におけるウイルス複製を調べるために、皮下のＨＴ１０８０線維肉腫モ
デルを用いて、ウイルス抗原に対する免疫組織化学的染色（ＮＤＶ Ｐタンパク
質に対するモノクローナル抗体を使用）を実施した。３×１０8ＰＦＵのＰＰＭ
Ｋ１０７の腫瘍内注射の３０分以内では、腫瘍組織はウイルス抗原に対して陰性
であった。しかし、処置後２日目までに、ウイルス抗原に対する強い免疫染色が
腫瘍内で見られ、これは、腫瘍内のウイルス複製を示す。重要なことに、ウイル
ス複製は腫瘍組織に特異的であった。なぜなら、隣接結合組織および皮膚がウイ
ルス抗原に対して陰性であるからである。
【０１６８】 表７．無胸腺マウスにおける皮下ヒト腫瘍異種移植片（＜１０ｍｍおよび＞５
ｍｍ）のＰＰＭＫ１０７腫瘍内処置
【０１６９】
【表７】 （実施例３） （無胸腺マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片（＜８．５ｍｍおよび＞５．５ｍ
ｍ）の静脈内処置に関するＰＰＭＫ１０７の使用） 無胸腺マウスに、１０００万個のヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞を用いて皮内
注射した。腫瘍が５と８ｍｍとの間の範囲のサイズに達した後、ＰＰＭＫ１０７
または生理食塩水の静脈内注射を行った。表８に示すように、最も高いウイルス
用量レベル（１×１０9ＰＦＵ）において、完全な腫瘍後退が７匹全てのマウス
で見られた。３×１０8および６×１０7の単一注射によって、９０％以上の後退
率を生じた。３×１０8の単一静脈内注射は、たった５５％の腫瘍後退率しか与
えなかったが、この用量レベルの３回静脈内注射は、１００％の応答率を生じた
。生理食塩水の静脈内注射を用いて処理されたマウスは、腫瘍後退の形跡を示さ
なかった。これらの結果により、皮下のＨＴ１０８０腫瘍が、ＰＰＭＫ１０７を
用いた静脈内注射処置に対して非常に反応性であることが示された。
【０１７０】
【表８】 （実施例４） （無胸腺マウスにおけるラージＡ３７５黒色腫異種移植片の腫瘍内処置に対し
てＰＰＭＫ１０７を用いる最初の実験） 無胸腺マウスに、１０００万個のＡ３７５ヒト黒色種細胞を用いて皮内注射し
た。１０日後、種々のサイズの腫瘍を、単一注射ＰＰＭＫ１０７（３×１０8、
９×１０8および１．５×１０9ＰＦＵの用量）または生理食塩水を用いて処理し
た。１０〜１１ｍｍの単一最大寸法を有する腫瘍に関しては、９つ全てが、これ
らの用量のＰＰＭＫ１０７を用いた腫瘍内処理に応答して完全に後退し、一方、
８〜９．５ｍｍの単一最大寸法を有する腫瘍に関しては、２４の内の１２個が、
ウイルス治療に応答して完全に後退した（Ｐ＜０．００８；表９、区分Ａ）。生
理食塩水を用いて処理されたいずれのマウスにおいても腫瘍後退は見出されなか
った。
【０１７１】 腫瘍体積によって分類される場合、これらの同じ腫瘍はまた、これらの大きな
腫瘍体積における完全な後退の高いパーセンテージを示した。これらの用量のＰ
ＰＭＫ１０７に応じて、完全な後退が、体積＞３００ｍｍ3（３０４〜３９７ｍ
ｍ3の範囲）を有する１７の腫瘍の内の１４個に、そして体積＜３００ｍｍ3（１
４４〜２９５の範囲；Ｐ＜０．０２３；表９、区分Ｂ）を有する１６の腫瘍の内
の７個に生じた。
【０１７２】 これらの結果から、より感受性でない場合、少なくとも１ｃｍの長さまたは３
００ｍｍ3の体積の腫瘍が、より小さい腫瘍よりも腫瘍内ＰＰＭＫ１０７処置に
少なくとも感受性であることが示される。
【０１７３】 表９．皮内Ａ３７５黒色腫異種移植片の腫瘍内ＰＰＭＫ１０７処置
【０１７４】
【表９】 ａ−ＰＰＭＫ１０７ １０〜１１ｍｍ群 対 ＰＰＭＫ１０７ ８〜９．５ｍｍ
処置群における完全後退に関する、Ｐ＜０．００８ ｂ−ＰＰＭＫ１０７処置された＞３００ｍｍ3群 対 ＰＰＭＫ１０７処置され
た＜３００ｍｍ3ＰＰＭＫ１０７処置群における完全後退に関する、Ｐ＜０．０
２３。
【０１７５】 （実施例５） （無胸腺マウスにおけるラージＡ３７５黒色腫異種移植片の腫瘍内（ｉｎｔｒ
ａｔｕｍｏｒａｌ）処置のために、ＰＰＭＫ１０７を使用した第二の実験） 腫瘍を、実施例４のように、腫瘍細胞接種から１０日後に確立した。処置は、
ＰＰＭＫ１０７の種々の用量（３×１０6ＰＦＵ、３×１０7、３×１０8および
１．５×１０9）または生理食塩水からなった。単一の最も大きな大きさの１０
〜１１．５ｍｍの腫瘍について、完全な後退または部分的な後退（少なくとも５
０％）が、生理食塩水処置マウスのいずれかにおいては後退が発生しなかったこ
とと対照的に、これらの用量を使用して、ＰＰＭＫ１０７で処置したすべての２
８の腫瘍において発生した（表１０、Ａ欄）。
【０１７６】 これらの同一の腫瘍が、腫瘍体積によって分類された場合、３００ｍｍ3を超
える（範囲：３０９〜５２５ｍｍ3）すべての２６の腫瘍が、生理食塩水処置マ
ウスにおいては後退しなかったことと対照的に、ＰＰＭＫ１０７に応答して、完
全または部分的に（少なくとも５０％）に後退した（表１０、Ｂ欄）。
【０１７７】 これらの結果は、少なくとも長さ１ｃｍまたは体積３００ｍｍ3の腫瘍が、腫
瘍内ＰＰＭＫ１０７処置に感受性であることを確認する。
【０１７８】
【表１０】 （実施例６） （無胸腺マウスにおけるラージＡ３７５黒色腫異種移植片の腫瘍内処置のため
に、ＰＰＭＫ１０７を使用した第三の実験） 腫瘍を、実施例４のように、腫瘍細胞接種から１９日後に確立した。腫瘍内処
置は、ＰＰＭＫ１０７の種々の用量（３×１０8、３×１０6、３×１０5、３×
１０4、３×１０3、３×１０2ＰＦＵ）または生理食塩水からなった。単一の最
も大きな大きさの１２．５〜１４ｍｍ（体積範囲：６３２〜７８７ｍｍ3：平均
体積：６９８ｍｍ3）の腫瘍について、少なくとも５０％の腫瘍後退が、生理食
塩水処置マウスの両方においては後退が発生しなかったことと対照的に、３×１
０8ＰＦＵで処置された３匹のマウスのうちの２匹において発生した（表１１）
。単一の最も大きな大きさである１０〜１２ｍｍ（体積範囲：３２０〜６００ｍ
ｍ3；平均体積：４１１ｍｍ3）を有する腫瘍を処置するために、ＰＰＭＫ１０７
（３×１０8ＰＦＵ）の同一の用量を使用して、８匹のマウスのうちの７匹が、
少なくとも２５％の後退を示した（後退を示さなかった生理食塩水処置マウスと
比較して、少なくとも２５％の後退について、Ｐ＜０．００１、表１１）。長さ
１０〜１２ｍｍの腫瘍の腫瘍について、少なくとも２５％の後退がまた、３×１
０6ＰＦＵ、３×１０5ＰＦＵ、３×１０4ＰＦＵおよび３×１０3ＰＦＵで処置さ
れたマウスにおいて観察されたが、３×１０2ＰＦＵまたは生理食塩水で処置さ
れたマウスについては観察されなかった（表１１）。
【０１７９】 これらの結果は、少なくとも長さ１ｃｍまたは体積３００ｍｍ3の腫瘍が、腫
瘍内ＰＰＭＫ１０７処置に感受性であることを確認する。
【０１８０】
【表１１】 （実施例７） （無胸腺マウスにおけるラージＡ３７５黒色腫異種移植片の腫瘍内処置のため
に、ＰＰＭＫ１０７を使用した第四の実験） 最も大きな大きさである１０〜１２ｍｍの腫瘍を、実施例４のように、腫瘍細
胞接種から１３日後に確立した。腫瘍内処置は、ＰＰＭＫ１０７（３×１０8Ｐ
ＦＵ）または生理食塩水の単一の注射からなった。ＰＰＭＫ１０７で処置された
これらの腫瘍の体積は、２９５〜６００ｍｍ3の範囲（平均腫瘍体積は４３７ｍ
ｍ3）であった。各々の処置群におけるマウスの群を、腫瘍組織学のために、０
日目、２日目、３日目、４日目、７日目および１４日目に安楽死させた。最低４
日間観察されたこれらのマウスについて、ＰＰＭＫ１０７で処置された１２匹の
マウスのうちの１１匹が、８匹の生理食塩水群が後退を示さなかったことと比較
して、少なくとも２５％の後退を示した（Ｐ＜０．０００１、表１２）。ＰＰＭ
Ｋ１０７処置から２日後に、２つの腫瘍が、すでに、後退の徴候を示したが、後
退の程度は、２５％未満であった。
【０１８１】 （実施例８） （無胸腺マウスにおけるラージＡ３７５黒色腫異種移植片の腫瘍内処置のため
に、ＰＰＭＫ１０７を使用した第五の実験） 最も大きな大きさである１０〜１２ｍｍの腫瘍を、実施例４のように、腫瘍細
胞接種から２０日後に確立した。腫瘍内処置は、ＰＰＭＫ１０７（３×１０8Ｐ
ＦＵ）または生理食塩水の単一の注射からなった。ＰＰＭＫ１０７で処置された
これらの腫瘍の体積は、３６１〜７５６ｍｍ3の範囲（平均腫瘍体積は５５１ｍ
ｍ3）であった。ＰＰＭＫ１０７で処置された１０匹のマウスのうちの９匹が、
１０匹の生理食塩水群が後退を示さなかったことと比較して、少なくとも２５％
の後退を示した（Ｐ＜０．０００１、表１３）。
【０１８２】 （実施例９） （ラージＨＴ１０８０線維肉腫異種移植片の静脈内処置のために、ＰＰＭＫ１
０７を使用した第一の実験） 無胸腺マウスに、１０００万個のＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞を皮下注射し
た。６日後、腫瘍を、ＰＰＭＫ１０７（１．５×１０9ＰＦＵの用量で）または
生理食塩水の単一の注射で処置した。単一の最も大きな大きさである１０〜１１
ｍｍのこれらの腫瘍について、６つの腫瘍のうちの５つが、生理食塩水処置腫瘍
においては後退しなかったことと比較して、ＰＰＭＫ１０７の単一の静脈内注射
に応答して、完全または部分的に後退した（表１４、Ｐ＜０．０２５）。これら
の結果は、少なくとも１ｃｍの長さの腫瘍が、静脈内ＰＰＭＫ１０７処置に感受
性であることを示す。
【０１８３】
【表１２】
【０１８４】
【表１３】
【０１８５】
【表１４】 （実施例１０） （正常であるが腫瘍細胞ではない細胞からのＰＰＭＫ１０７感染の特異的除去
） ＮＤＶ株ＰＰＭＫ１０７による腫瘍特異的殺傷の機構を試験するために、代表
的な腫瘍細胞を、以下の基準に基づいて選択した：ａ）無胸腺マウスにおいて、
異種移植片として腫瘍を形成する能力：ｂ）腫瘍異種移植片が、ＰＰＭＫ１０７
の投与後、インビボで特異的に殺傷される：ｃ）腫瘍細胞が、耐性の正常細胞を
殺傷するための濃度の数ログ（ｌｏｇ）未満であるウイルス濃度で、インビトロ
でＰＰＭＫ１０７による殺傷を示す；およびｄ）腫瘍細胞が、共培養物として存
在する場合、正常細胞から容易に識別されるはずである。
【０１８６】 ＫＢ頭部および頸部癌腫細胞から構成される異種移植片腫瘍は、ＰＰＭＫ１０
７の単一の腫瘍内注射に応答して、８３％の完全または部分的後退を示し、正常
な初代皮膚線維芽細胞（ＣＣＤ９２２−ｓｋ）よりも、インビトロでのＰＰＭＫ
１０７による殺傷に４ログを超えて感受性であり、そして共培養物として存在す
る場合、ＣＣＤ９２２−ｓｋ細胞から容易に識別される。
【０１８７】 従って、ＫＢおよびＣＣＤ９２２−ｓｋ細胞の共培養物を、０．０００５の感
染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．、細胞当たり添加されたウイルスの比）で感染し、そし
て感染のクールを、ウイルス抗原（ＮＤＶ Ｐタンパク質）についての免疫組織
化学的染色によって５日間追跡した。明らかな細胞死をほとんど伴わないかまた
はまったく伴わない正常細胞の感染は、細胞単層の目視検査によって決定される
ように、２日でピークだった。感染後３日目に、正常細胞におけるウイルス発現
の量は、有意に減少したが、腫瘍細胞の感染がはっきりと明らかであった。ウイ
ルス抗原の量は、４日目および５日目に正常細胞において実質的に消失したが、
腫瘍細胞における感染は、腫瘍細胞集団を介して急速に進行し、共培養物に存在
する腫瘍細胞の大多数の破壊を生じた。
【０１８８】 従って、正常細胞を感染し、そしてＩＦＮの抗ウイルス効果に矛盾しない様式
で、感染を容易に除去した。腫瘍細胞は、正常細胞によって培地へ分泌されたＩ
ＦＮの生理学的に有効な濃度の存在にもかかわらず、応答で抗ウイルス状態を確
立することができず、そして変化しないウイルス増殖によって殺傷された。
【０１８９】 （実施例１１） （インターフェロンが、正常ＣＣＤ９２２−ｓｋ細胞におけるウイルス除去の
重要な成分であることの証明） インターフェロンが、ＣＣＤ９２２−ｓｋ細胞のＰＰＭＫ１０７の感染を除去
する能力を媒介するという仮説を試験した。単独または組み合わせて使用される
、ヒトインターフェロンαまたはヒトインターフェロンβに対するポリクローナ
ル中和抗体を、０．０００５のｍｏｉで、ＰＰＭＫ１０７で感染したＣＣＤ９２
２−ｓｋ細胞の培養物に毎日添加し、そして感染の進行を、３日間追跡した。細
胞に存在するウイルス抗原の量は、中和抗体の濃度に比例して増加し、抗インタ
ーフェロンβ抗体の効果は、抗インターフェロンα抗体の効果よりも著しかった
；線維芽細胞が、インターフェロンのβ形態を主に産生するという報告に矛盾し
ない。
【０１９０】 正常に非感受性の細胞を、インターフェロンに対する中和抗体の添加を介した
ＰＰＭＫ１０７での感染により感受性にする能力は、ＰＰＭＫ１０７による殺傷
に対する正常細胞の感受性と腫瘍細胞の感受性との間の重要な差異が、正常細胞
の能力にあり（しかし、腫瘍細胞の能力にはない）、インターフェロン媒介性抗
ウイルス応答を確立するという仮説を支持する。
【０１９１】 （実施例１２） （インターフェロンβが、他の正常細胞において、ウイルス除去の重要な成分
であることの証明） この実験において、ＰＰＭＫ１０７による殺傷にかなり耐性であることが公知
の別の正常細胞（ＮＨＥＫ、正常ヒト上皮細胞）を、感染細胞の培養物へのポリ
クローナル抗インターフェロンβ抗体の添加を介して、より感受性にしたことが
証明された。ＮＨＥＫ（正常ヒト上皮ケラチノサイト）細胞を、０．０００５ま
たは０．０５のいずれかのｍｏｉで感染し、そしてＮＨＥＫ細胞は、５日間にわ
たって毎日添加された抗体を有した。
【０１９２】 低いｍｏｉ（０．０００５）で感染した培養物において、ウイルス抗原発現の
抗体依存性増大は、感染後５日で明らかであったが、この実験より前には、より
明らかではなかった。０．０５のｍｏｉでＰＰＭＫ１０７で感染した培養物への
抗体添加は、感染後４日および５日で、ウイルス抗原における顕著な増加を生じ
た。感染後２日および３日で、中和抗体の添加は、ウイルス抗原のより少ない蓄
積を生じた（図１）。
【０１９３】 高いｍｏｉサンプル由来の培養上清をまた、ヒトＨＴ１０８０線維肉腫腫瘍細
胞についてのプラークアッセイによって、存在する感染ウイルスの量について滴
定した；本発明者らの実験室における標準アッセイ系。この分析からの結果は、
感染後５日で、偽処置コントロールに関連して、抗体処置培養物において、１９
倍の感染ウイルスの量の増加が存在したことを証明した（図１）。
【０１９４】 これらの結果は、正常細胞が、インターフェロン関連機構を介したＰＰＭＫ１
０７による殺傷から保護される一般的な機構を示唆する。
【０１９５】 （実施例１３） （腫瘍細胞および正常細胞におけるＰＰＭＫ１０７感染に対するインターフェ
ロンβの効果の比較） 高い（ＫＢ）感受性のＰＰＭＫ１０７または中間の（ＨＥｐ２）感受性のＰＰ
ＭＫ１０７の、正常細胞（ＣＣＤ９２２−ｓｋ）および腫瘍細胞の感染に対する
外因性に添加されたインターフェロンβの効果の比較を行った。３つの細胞の別
々の培養物を、０．０００５のｍｏｉで、感染前１日および感染後２日に、２０
単位／ｍｌ、２００単位／ｍｌまたは２０００単位／ｍｌで、インターフェロン
βで処理した。感染後３日で、正常細胞に存在する低レベルのウイルス抗原発現
を、使用されたインターフェロンのすべての用量で排除した。逆に、２単位／ｍ
ｌまたは２００単位／ｍｌの濃度での非常に感受性のＫＢ腫瘍細胞へのインター
フェロンの添加は、ウイルス抗原発現の相対レベルを２倍減少し、完全な抑制は
、１０００単位／ｍｌのインターフェロンの添加の場合であった。中間の感受性
のＨＥｐ−２細胞は、使用されたインターフェロン用量のすべてでウイルス抗原
発現を除去することによって、外因性インターフェロンに応答した（図２）。
【０１９６】 外因性に添加されたインターフェロンβの抗ウイルス効果に対するＫＢ細胞お
よびＣＣＤ９２２−ｓｋ細胞における感受性の型は、ＰＰＭＫ１０７による殺傷
に対するこれらの細胞の感受性に逆比例した。ＨＥｐ−２細胞の、インターフェ
ロンの効果に対して応答する能力は、これらの細胞が、この実験において使用さ
れるインターフェロンの濃度を有効に利用し得ることを示す。同様に、インター
フェロンの高用量に対するＫＢ細胞の応答は、インターフェロン媒介性抗ウイル
ス応答の確立不能が、インターフェロン経路における完全な欠損ではないが、む
しろ正常細胞と比較した相対的非感受性に起因することを示唆する。
【０１９７】 （実施例１４） （ＰＰＭＫ１０７による正常細胞および腫瘍細胞の感染に対する、低濃度のイ
ンターフェロン−βの効果） この実験において、正常（ＣＣＤ９２２−ｓｋ）細胞および腫瘍（ＫＢ）細胞
を、低濃度のインターフェロン−β（０．２単位／ｍｌ、２単位／ｍｌ、および
２０単位／ｍｌ）で、ｍｏｉが０．０５のＰＰＭＫ１０７による感染の１日前お
よび２日後に処置した。
【０１９８】 これらの条件のもとで、正常細胞はウイルス抗原の量の用量依存性減少を経験
したが、一方、腫瘍細胞におけるウイルス抗原の相対レベルは、外因性インター
フェロンの添加により影響されなかった（図３）。
【０１９９】 （実施例１５） （ＰＰＭＫ１０７精製） （方法Ａ） ＰＰＭＫ１０７は、三重プラーク精製によって、中間毒力のニューカッスル病
ウイルスＭａｓｓ−ＭＫ１０７株から誘導した。約１０００ＰＦＵ（プラーク形
成単位）の生ＰＰＭＫ１０７を、各１０日齢の胚含有鶏卵の尿膜腔液腔に接種し
た。３６℃で４６時間のインキュベーションの後、その卵を冷凍し、次いで尿膜
腔液を収集した。細胞および細胞砕片を、１７５０×ｇで３０分間の遠心分離に
よってその尿膜腔液から除去した。次いで清澄化した尿膜腔液（ウイルスを含む
上清）を、２０％／５５％の不連続スクロース勾配に重層し、そして約１００，
０００×ｇで３０分間遠心分離した。精製したウイルスをその２０％／５５％界
面から収集し、そして生理食塩水に対して透析して、そのスクロースを除去した
。
【０２００】 （方法Ｂ） 別の有利な実施形態において、清澄化した尿膜腔液を−７０℃で凍結した。融
解後、その液を１〜４℃で一晩維持し、次いで遠心分離（１７５０×ｇを３０分
間）によってそのウイルス上清から混入物質を除去した。この材料をさらに、上
記のように超遠心分離機にて不連続スクロース勾配を使用して処理した。
【０２０１】 （方法Ｃ） 別の有利な実施形態において、不連続スクロース勾配における超遠心分離を、
連続フロー遠心分離機によって達成した。
【０２０２】 （方法Ｄ） 別の有利な実施形態において、収集した尿膜腔液を、５％マンニトールおよび
１％Ｌ−リジンを含む緩衝液（ｐＨ８．０）（ＭＬ緩衝液）で希釈し、そして清
澄化し、そして公称孔径０．４５μのフィルターを通す接線フロー濾過（ＴＦＦ
）によって、ＭＬ緩衝液と交換する。ＭＬ緩衝液中の清澄化したウイルスを含む
浸透液を収集し、そしてＭＬ緩衝液中にて公称カットオフ３００，０００ダルト
ンのフィルターを通すＴＦＦによって、ウイルスを精製する。ＭＬ緩衝液中の濃
縮された精製ウイルスを、この工程からの保持物として収集し、再びＭＬ緩衝液
で希釈した後、ＭＬ緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ５００（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）ゲル浸透カラムに適用する。精製ウイルスを含む画分を収集し、
プールする。そしてこの画分を、ＭＬ緩衝液を用いる公称カットオフ３００，０
００ダルトンのフィルターを通すＴＦＦによって、再濃縮し得る。
【０２０３】 （結果） （＊クローンウイルス） プラーク精製によるＰＰＭＫ１０７の生成の後、ビリオンの集団由来の個別の
分子クローン８個が、ＮＤＶの融合タンパク質遺伝子内に３００個を超えて連続
するヌクレオチドの同一の配列（例えば、１００％の相同性）を有することを見
出した。ＰＰＭＫ１０７は、高い程度の遺伝的均質性を有する、クローンウイル
スである。
【０２０４】 （＊ＰＦＵ／ｍｇタンパク質） 純度を測定する１つの定量的手段は、ＰＦＵ／ｍｇタンパク質の決定による。
このウイルス調製物の活性を、ＨＴ１０８０を使用するプラークアッセイ法によ
って決定し、そしてこのウイルス調製物のタンパク質含量を、タンパク質スタン
ダードとしてウシ血清を用いるＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｌｏｗｒｅｙ Ａｓｓａｙ（
Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して、決定した。より高い値
が、より高レベルの純度を示す。方法Ａを使用して、少なくとも４．８×１０10 のＰＦＵ／ｍｇ値を達成した（表１５を参照のこと）。方法Ｃを使用して、少な
くとも２．０×１０10のＰＦＵ／ｍｇタンパク質値を達成した。ＮＤＶの中間毒
力株について、この純度測定についての文献値は、見出されなかった。ＮＤＶの
中間毒力株についての最高の評価がこのウイルス調製物（ＮＤＶ ＭａｓｓＭＫ
１０７、ロットＲＵ２（Ｆａａｂｅｒｇ ＫＳおよびＰｅｅｐｌｅｓ、ＭＥ、１
９９８、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６２：５８６；ならびにＢｒａｔｔ，ＭＡおよびＲｕ
ｂｉｎ，Ｈ．１９６７、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３：５９８〜６０８にあるように
調製された））である。このＲＵ２ロットが、１．３×１０9ＰＦＵ／ｍｇタン
パク質のＰＦＵ／ｍｇを有することを見出した。方法Ａにより達成した純度の値
は、Ｐｅｅｐｌｅｓの方法が達成したものの約４０倍良い（表１５を参照のこと
）。
【０２０５】 （＊ＰＦＵあたりの粒子の比） 純度を測定する別の定量的手段は、ＰＦＵあたりの粒子の比の決定による。よ
り低い値が、より高レベルの純度を示す。粒子の計数を、標準的方法を使用して
電子顕微鏡により行った。方法Ａまたは方法Ｂのいずれかを使用して、１付近の
、ＰＦＵあたりの粒子の値を達成した（表１５）。
【０２０６】 表１５．ウイルスの純度
【０２０７】
【表１５】 aＮＴ、試験せず。
【０２０８】 方法ＡおよびＣを使用するウイルス調製もまた、卵タンパク質の混入が実質的
にないレベルまでのＮＤＶの精製を可能にした。方法Ａを使用するＰＰＭＫ１０
７ロット７調製物について、以下：（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲル（１ｍｍ厚）上で泳動した、１．
７×１０9ＰＦＵの精製ウイルス／ウェル（３．３ｃｍ幅）；（２）トランスフ
ァー用のニトロセルロース膜；および（３）ウサギ抗オボアルブミン（４ｍｇ／
ｍｌ抗体濃度の１：２０００希釈のＣａｐｐｅｌウサギＩｇＧ画分）、を使用す
るウェスタンブロットにて、オボアルブミンは検出不可能であった。方法Ｄを使
用しそしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に銀染色して分析したＰＰＭＫ１０７調製物につ
いて、オボアルブミンに対応する何のバンドも観察しなかった。
【０２０９】 （実施例１６） （無胸腺マウスにおける腹水形成ＥＳ−２卵巣癌のＰＰＭＫ１０７処置） この実験において、無胸腺マウス（雌性、ＮＣＲｎｕ／ｎｕ、８週齢）のすべ
てに、１０6のＥＳ−２細胞の腹腔内注射を行った。７日後、腹水が発生する前
に、これらのマウスに生理食塩水またはＰＰＭＫ１０７（１×１０9ＰＦＵ）で
腹腔内処置した。図４に示されるように、生理食塩水と比較して、ＰＰＭＫ１０
７で処置した動物にて顕著な生存の改善が存在した。生理食塩水処置した群のマ
ウスの大多数が、処置後７日目までに腹水を発生し、そして３８日目までに、こ
れらの動物すべてが死亡した。顕著に対照的に、ＰＰＭＫ１０７で処置したマウ
スの９２％が、３８日目まで依然として生存し、そしてこれらの動物の２５％が
、長期生存した（１２０日を超えて生存）。
【０２１０】 （実施例１７） （腹水が存在する場合の無胸腺マウスにおけるＥＳ−２卵巣癌のＰＰＭＫ１０
７処置） この実験において、無胸腺マウス（雌性、ＮＣＲｎｕ／ｎｕ、８週齢）のすべ
てに、１０6のＥＳ−２細胞の腹腔内注射を行った。１４日後、マウスの大多数
が腹水を発生した時に、腹水を有さないマウスを除外し、そして腹水を有するマ
ウスを以下の７つの腹腔内処置群へと無作為化した：０日目に１回のＰＰＭＫ１
０７処置；第１週に２回のＰＰＭＫ１０７処置；週に１回のＰＰＭＫ１０７処置
；週に２回のＰＰＭＫ１０７処置；０日目に１回の生理食塩水処置；第１週に２
回の生理食塩水処置；週に２回の生理食塩水処置。用量１×１０9ＰＦＵ／マウ
スを、各ウイルス処置に使用した。第１回の処置およびさらなるすべての処置の
前に、マウスすべてを、腹水を流出させた。
【０２１１】 腹水の程度を定量し、そして以下のように記録した：
【０２１２】
【化２】 表１６に示されるように、生理食塩水処置した動物すべてが、７日目および１
０日目の両方で、ＰＰＭＫ１０７処置した動物よりも進行した腹水を有した。最
初の処置後７日目に、各生理食塩水群は、３．５を超える腹水スコアを有したが
、一方ＰＰＭＫ１０７処置動物すべてが、３．０以下の腹水スコアを有した。同
様に、最初の処置後１０日目に、各生理食塩水群は、４．５を超える腹水スコア
を有したが、一方ＰＰＭＫ１０７処置動物すべてが、４．１以下の腹水スコアを
有した。これらの結果は、腹水産生が、生理食塩水コントロールと比較して、ウ
イルス処置動物において顕著に減少されたことを示す。
【０２１３】 表１６．腹水が存在する場合の無胸腺マウスにおけるＥＳ−２卵巣癌のＰＰＭ
Ｋ１０７処置
【０２１４】
【表１６】 （実施例１８） （ＰＰＭＫ１０７の引き続く用量の死亡率を減少するための脱感作用量のＰＰ
ＭＫ１０７の使用） Ｃ５７／ＢＬ／６マウス（７週齢）に、生理食塩水かまたは脱感作用量のＰＰ
ＭＫ１０７（３×１０8ＰＦＵ／マウス）のいずれかを０日目に腹腔内注射した
。２日後、各組のマウスをさらに、生理食塩水またはＰＰＭＫ１０７での静脈内
投与（１×１０9ＰＦＵ／マウス、２．５×１０9ＰＦＵ／マウス、５×１０9Ｐ
ＦＵ／マウス、および１×１０10ＰＦＵ／マウスの用量）のための群に細分した
。下記の表１６に示されるように、生理食塩水を使用してマウスを事前処置した
場合、２．５×１０9ＰＦＵ、５×１０9ＰＦＵ、および１×１０10ＰＦＵで引き
続き投与したマウスにて、死亡を記録した。５×１０9ＰＦＵ、および１×１０1 0 ＰＦＵの用量は、生理食塩水で事前処置したマウスに対して１００％致死性で
あった。対照的に、０日目に脱感作用量のＰＰＭＫ１０７を与え、続いて２日後
に１×１０10ＰＦＵまでの用量レベルでＰＰＭＫ１０７注射したマウスのどの群
でも、死亡は観察しなかった。これらのデータは、ＰＰＭＫ１０７が、ＰＰＭＫ
１０７での引き続く投与の致死性を脱感作するために使用され得ることを示す。
さらに、ＰＰＭＫ１０７の最大許容用量が、このウイルスを脱感作剤として使用
する場合、約１桁上昇され得る。
【０２１５】 表１７．ＰＰＭＫ１０７の引き続く用量の死亡率を減少するための脱感作用量
のＰＰＭＫ１０７の使用
【０２１６】
【表１７】 （実施例１９） （よりゆっくりの静脈内注射速度は、ＰＰＭＫ１０７の毒性を減少する） ２２匹の無胸腺マウス（８週齢）に、ケタミン／キシラジンの組み合わせで麻
酔をかけ、そして拘束器に配置してそのマウスの移動を阻害するのを補助し、注
射プロセスの間の、ＰＰＭＫ１０７のゆっくりの注射または迅速な注射のいずれ
かを可能にした。ゆっくりの注射の群について、生理食塩水中４×１０9ＰＦＵ
のＰＰＭＫ１０７を０．２ｍｌを、１０〜１５秒ごとに０．０１ｍＬ与えつつ、
４分間にわたって静脈内注射した。迅速な注射の群に、同じ用量かつ体積だが、
３０秒間にわたって与えた。表１８に示されるように、４分間にわたってその用
量のＰＰＭＫ１０７を受けた動物は、同じＩＶ用量を３０秒間にわたって受けた
動物の半分の最大重量損失を有した（投与後２日目に記録した）。これらの結果
は、ＰＰＭＫ１０７が、このようなよりゆっくりの速度で注射した場合に、より
弱い毒性を有し、そして静脈内投与にとってより安全であることを示す。
【０２１７】 表１８．ＰＰＭＫ１０７のよりゆっくりのＩＶ注射は、毒性の減少を生じる
【０２１８】
【表１８】 （実施例２０） （進行した癌の患者の処置におけるＰＰＭＫ１０７の使用） ＰＰＭＫ１０７は、現在、米国において、静脈内経路によって第１相臨床試験
にて試験されている。現在までに、確立した治療をもはや受けられない進行した
固形腫瘍の患者合計５２人を、ＰＰＭＫ１０７で処置した。これらの患者のうち
１７人に、最初の処置クールとして単回用量を与えた。他の１３人の患者に、最
初の処置クールとして週あたり同じ用量３回を１週間与えた。２２人より多くの
患者に、最初の処置クールとして週あたり３回の用量を１週間与え、第１回の用
量は脱感作用量１２億ＰＦＵ／ｍ2でありそして続く２回はより高用量の２４億
〜９６億ＰＦＵ／ｍ2であった。各患者の腫瘍のサイズを、１月に１回追跡した
。少なくとも安定な疾患の患者（いかなる新規の病巣もない状態で、測定可能な
腫瘍すべての産物の合計にて、２５％未満の増加および５０％未満の減少）が、
各月でのさらなる処置クールに適格であった。
【０２１９】 （癌患者における個々の腫瘍の後退） 個々の腫瘍の後退を、５人の患者にて観察した。この５人の患者は、１人は、
単回用量レジメン、１人は同じ用量の反復レジメン、そして３人の患者は脱感作
用量レジメンであった（表１９）。脱感作レジメンの一部としてより高用量の第
２回および第３回の用量を受けた患者において、同用量反復レジメンにて３回の
同じ用量を受けた患者の場合（８％の腫瘍後退）よりも高い率の腫瘍後退（患者
の１６％）が記録された。
【０２２０】 表１９．ＰＰＭＫ１０７を使用する進行した癌の患者における個々の腫瘍の後
退
【０２２１】
【表１９】 これらの症例を以下にまとめる： （（Ａ）触知可能な結腸転移の腫瘍後退） ６８歳の結腸癌の女性が、その広範な転移のうちに触知可能な腹部腫瘍を有し
た。１２億ＰＦＵ／ｍ2のＰＰＭＫ１０７での単回ＩＶ処置の後、この患者は、
２週間のクールの間に、この単一の腹壁腫瘍の９１％の後退を経験した（下記表
２０）。投与の１日後の腫瘍の寸法（３．７５×３ｃｍ）は、基準寸法である４
×３ｃｍと類似していた。しかし、投与の７日後までに、この腫瘍は、２×２ｃ
ｍまでサイズが減少し、そしてＰＰＭＫ１０７投与の１４日後までサイズが減少
し続けて１．５×１．５ｃｍになった。ＰＰＭＫ１０７処置の前に、この腫瘍の
塊は迅速に成長しており、ＰＰＭＫ１０７投与前の２週間に腫瘍体積が１０６５
％増加した。この患者を研究から除いた。なぜなら、他の場所で腫瘍の増殖が増
加したからである。
【０２２２】 表２０．単回ＩＶ ＰＰＭＫ１０７用量１２億ＰＦＵ／ｍ2の後の、患者番号
１２３（６８歳の転移性結腸癌の女性）における触知可能な腹壁腫瘍のサイズ
【０２２３】
【表２０】 （（Ｂ）乳癌の女性における胸壁腫瘍の後退） ５８歳の乳癌の女性が、視診に明らかな触知可能な胸壁の塊を有した。５．９
億ＰＦＵ／ｍ2の３回用量でのＰＰＭＫ１０７処置の第２のクールの間に、視診
および触診により、彼女の胸壁腫瘍塊は、約９０％減少した。この患者は、第３
の治療クールの後に研究から除いた。なぜなら、他の場所で癌の増殖が増加した
からである。
【０２２４】 （（Ｃ）腹膜中皮腫の患者における腹部腫瘍の後退） ４６歳の腹膜中皮腫の男性が、３つの大きな（８〜１０ｃｍ）塊のそれぞれ、
５０％、４２％および１０％の後退を、脱感作用量１２億ＰＦＵ／ｍ2、続いて
４８億ＰＦＵ／ｍ2での２回用量からなる第１のＰＰＭＫ１０７処置クールの後
に有した。彼の他の残りの腫瘍塊（サイズ９．８ｃｍ）は、この第１の処置クー
ルの後に安定なままであった。この患者は、現在依然として研究中である。彼の
最も最近のＣＴスキャンはなお、彼の転移のうちの２つについて基準線から少な
くとも３０〜６０％の有意な腫瘍後退、そして全体の疾患安定化を示した。
【０２２５】 （（Ｄ）黒色腫の患者における転移性腫瘍の後退） ５７歳の黒色腫の男性が、２つの腫瘍塊の完全な後退を、脱感作用量１２億Ｐ
ＦＵ／ｍ2、続いて４８億ＰＦＵ／ｍ2で２回用量からなる第１のＰＰＭＫ１０７
処置クールの後に有した。ＰＰＭＫ１０７処置の後に消失した２つの腫瘍は、サ
イズが１ｃｍの触知可能な鼡径部の塊および小さい肺転移であった。この患者を
研究から除いた。なぜなら、他の場所で腫瘍の増殖が増加したからである。
【０２２６】 （（Ｅ）結腸癌の患者における肝臓転移の持続した後退） ７９歳の結腸癌の男性の尾状葉における肝臓転移が、第１のＰＰＭＫ１０７処
置の後に５９％後退し、そして第２のクールの後に９７％後退した。脱感作用量
１２億ＰＦＵ／ｍ2からなる処置の後に、７２億ＰＦＵ／ｍ2での２回用量を続け
た。処置前の基準線にて、この腫瘍は、３×３ｃｍであった（１／２×Ｌ×Ｗ2
式に基づいて、腫瘍体積１３．５ｃｍ3）。第１のＰＰＭＫ１０７クールの後、
この腫瘍は５９％減少して、２．８×２ｃｍになった（腫瘍体積５．６ｃｍ3）
。第２のＰＰＭＫ１０７クールの３週間後、尾状葉におけるこの同じ腫瘍の塊は
、３×０．５ｃｍ（腫瘍体積０．３８ｃｍ3）（基準線から９７％の減少）と報
告された。
【０２２７】 （ガンの安定化） 他の２１人の患者（そのすべてが以前に従来のガン治療で腫瘍が進展した）は
、ＰＰＭＫ１０７投薬後、進行ガンの安定化の形で恩恵を受けた。安定な疾患を
有するこれらの患者は、多様なタイプのガン（腎臓ガン、膵臓ガン、乳ガン、膀
胱ガン、胆嚢の胆管ガンおよび肺ガンを含む）を有する患者を代表する。これら
の症例には以下のものが含まれる：（１）腎臓ガン患者において７ヶ月安定な疾
患；（２）肺ガン患者において７ヶ月安定な疾患；（３）膵臓ガン患者における
５ヶ月安定な疾患；（４）別の膵臓ガン患者における５ヶ月安定な疾患；（５）
腎臓ガン患者における３ヶ月（継続中）安定な疾患；（６）胆嚢の胆管ガン患者
における２ヶ月（継続中）安定な疾患。
【０２２８】 （疼痛投薬の減少） 単回投与５９億ＰＦＵ／ｍ2の投薬レベルで１人の患者が、ＰＰＭＫ１０７処
置から、麻酔薬による疼痛投薬の減少により示される、ガンの疼痛の症状軽減の
形で恩恵を受けた。
【０２２９】 （脱感作） 脱感作レジメンにおいて、最初の投薬（１２０億ＰＦＵ／ｍ2）から明確な脱
感作効果が、その同じ週内のその後の投薬に対してみられる。一般に、第２およ
び第３の投薬からの報告された副作用は、こららの用量が最初の用量より２〜８
倍高くても（２４０〜９６０億ＰＦＵ／ｍ2の間）、より低い出現率で、かつよ
りマイルドでみられる。例えば、最初の投薬後には、６８％の患者（等級３の発
熱スパイクがみられた９％を含む）で発熱が報告されたが、第２の投薬後には、
３２％の患者（等級３の発熱の患者はいなかった）で報告されただけであり、そ
して第３の投薬後には５％の患者において報告されたのみであった。別の例では
、最初の投薬後には５０％の患者に悪寒がみられ、第２の投薬後には１８％の患
者でみられ、そして第３の投薬後には１４％の患者のみでみられた。
【０２３０】 別の例では、同じ投薬を繰返した研究では、この多数回投薬レジメン（１週間
の間、１週間あたり５９億ＰＦＵ／ｍ2の３回投薬）において最初４人の患者が
、アセトアミノフェンおよびイブプロフェンでの予防的な解熱処置を受ける代わ
りに受けた最初の投薬後に発熱した。解熱剤を与えられなかった症例でさえ、こ
れらの患者の大部分は、第２および第３の投薬を受けた後に発熱しなかった。し
たがって、週３回のスケジュールにおける最初の投薬の施行が、第２および第３
の投薬の毒性を減少させるという強力な証拠が存在する。
【０２３１】 （血清中の中和抗体を通じての投薬） この第Ｉ相試験における用量範囲（５９億ＰＦＵ／ｍ2以上）を用いると、中
和抗体を生じたとしても、患者にウイルスを効果的に送達し得るという明確な示
唆も存在する。膵臓ガンの７２歳の老女は、１２０億ＰＦＵ／ｍ2の単回投与レ
ベルで、ＰＰＭＫ１０７処置を始めて以来２ヶ月間疾患が安定した。第２のクー
ル（ＰＰＭＫ１０７の単回ＩＶ投薬からなる）が最初の投薬から１ヶ月後（その
患者が血清中に中和抗体を生じたとき）に行われた。その第２のクールの７日後
、患者の尿はＰＰＭＫ１０７について陽性であり、その力価は少なくとも４０Ｐ
ＦＵ／ｍＬであった。
【０２３２】 中和抗体の存在にかかわらず、抗腫瘍効力がこの試験における用量範囲（５９
億ＰＦＵ／ｍ2以上）で達成可能であるとういうさらなる証拠は、胸壁に広がっ
た乳ガンを有する５８歳の老女から得られる。腫瘍退縮を議論するセクションで
述べられるように、この患者の胸壁腫瘍塊は、第２の治療クールの間に約９０％
退縮した。この効果は、最初のクールの後５週目〜６週目の間に生じ、このとき
、抗体は、１：２５６の力価を有し（５週目の初め）そして１：２５６０（６週
目の初めまで）より大きくなった。中和抗体の存在にもかかわらずウイルスがこ
の患者に効果的に送達され得るさらなる証拠は、５週目の終りの陽性尿サンプル
（２０〜４０ＰＦＵ／ｍｌ）によって示された（５週目の初めのその患者のベー
スラインの尿は陰性であった）。
【０２３３】 これらの結果は、これらの患者の血清中のＰＰＭＫ１０７に対する中和抗体は
、第２の処置クールによるウイルスもそのウイルスの抗腫瘍効力も完全には阻害
することが出来なかったことを示す。
【０２３４】 （実施例２１） （ニューカッスル病ウイルスＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮでの細胞毒性アッセイ結果
のまとめ） ヒト腫瘍細胞および正常細胞を、２４ウェル組織培養皿において約８０％コン
フルエントまで増殖させた。増殖培地を取りだし、そしてＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮ
（中間毒力のニューカッスル病ウイルス株Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ Ｒｏａｋｉｎ
−１９４６のプラーク精製クローン）を、１０7プラーク形成単位（ＰＦＵ）／
ウェル〜１ＰＦＵ／ウェルの範囲の１０倍希釈で加えた。ウイルスを加えないコ
ントロールのウェルを、各プレートに含ませた。振盪プラットフォーム上で３７
℃にて９０分間ウイルスを吸着させた。インキュベーション期間の終りに、ウイ
ルス希釈物を取り出し、１ｍｌの増殖培地と交換した。次いで、プレートを５％
ＣＯ2中で３７℃にて５日間インキュベートした。５７０ｎｍでモニターした、
ミトコンドリアの酵素活性を検出する（Ｍｏｓｍａｎ，Ｔ．，１９８３，Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５）呈色ＭＴＴ（２−［４，５−ジメ
チルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）
アッセイ（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６、カタログ＃Ｇ４０００、Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ５３７１１）を使用すること
により細胞毒性を定量化した。ウイルス処置ウェルの生存度を、非処置コントロ
ールウェル中の活性の百分率として表した。データを、（ＰＦＵ／ウェル）対（
コントロールの百分率としての生存度）として、グラフにプロットした。ＩＣ５
０を、生存細胞の量の５０％減少を引き起こすウイルスの量（ＰＦＵ／ウェル）
として算出した。
【０２３５】
【表２１】 これらの結果は、ＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮが、正常皮膚線維芽細胞と比較して、
少なくとも２つの異なるヒト腫瘍細胞（ＨＴ１０８０およびＫＢ）の腫瘍選択的
殺傷を示すことを示す。これら２つの腫瘍細胞株のＩＣ５０値は、正常細胞のＩ
Ｃ５０より、８００倍〜５０００倍低い。
【０２３６】 （実施例２２） （ニューカッスル病ウイルスＰＰＣＯＮＮ７０７２６での細胞毒性アッセイ結
果のまとめ） ヒト腫瘍細胞および正常細胞を、２４ウェル組織培養皿において約８０％コン
フルエントまで増殖させた。増殖培地を取りだし、そしてＰＰＣＯＮＮ７０７２
６（中間毒力のニューカッスル病ウイルス株Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ ７０７２
６−１９４６のプラーク精製クローン）を、１０7プラーク形成単位（ＰＦＵ）
／ウェル〜１ＰＦＵ／ウェルの範囲の１０倍希釈で加えた。ウイルスを加えない
コントロールのウェルを、各プレートに含ませた。振盪プラットフォーム上で３
７℃にて９０分間ウイルスを吸着させた。インキュベーション期間の終りに、ウ
イルス希釈物を取り出し、１ｍｌの増殖培地と交換した。次いで、プレートを５
％ＣＯ2中で３７℃にて５日間インキュベートした。５７０ｎｍでモニターした
、ミトコンドリアの酵素活性を検出する（Ｍｏｓｍａｎ，Ｔ．，１９８３，Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５）呈色ＭＴＴ（２−［４，５−ジ
メチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド
）アッセイ（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６、カタログ＃Ｇ４０００、Ｐｒｏｍｅｇ
ａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ５３７１１）を使用するこ
とにより細胞毒性を定量化した。ウイルス処置ウェルの生存度を、非処置コント
ロールウェル中の活性の百分率として表した。データを、（ＰＦＵ／ウェル）対
（コントロールの百分率としての生存度）として、グラフにプロットした。ＩＣ
５０を、生存細胞の量の５０％減少を引き起こすウイルスの量（ＰＦＵ／ウェル
）として算出した。
【０２３７】
【表２２】 これらの結果は、ＰＰＣＯＮＮ７０７２６が、正常皮膚線維芽細胞と比較して
、少なくとも３つの異なるヒト腫瘍細胞（ＫＢ、Ｕ８７ＭＧおよびＵ３７３ＭＧ
）の腫瘍選択的殺傷を示すことを示す。これら３つの腫瘍細胞株のＩＣ５０値は
、正常細胞のＩＣ５０より、８０倍〜５０００倍低い。
【０２３８】 （実施例２３） （ＰＰＭＫ１０７、ＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮまたはＰＰＣＯＮＮ７０７２６を使
用する無胸腺マウスにおけるＨＴ１０８０線維肉腫異種移植の腫瘍内処置） この実験において、無胸腺マウス（雌性、ＮＣＲｎｕ／ｎｕ、５〜６週齢）に
１０7個のＨＴ１０８０腫瘍細胞を皮下注射した。４日後、腫瘍が６〜８．５ｍ
ｍの大きさに達したとき、マウスに、生理食塩水、ＰＰＭＫ１０７（１×１０8
ＰＦＵ）、ＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮ（１×１０8ＰＦＵ）、またはＰＰＣＯＮＮ７
０７２６（１×１０8ＰＦＵ）を腫瘍内に処置した。下記の表２３に示されるよ
うに、これら３つのウイルス（ＰＰＭＫ１０７、ＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮおよびＰ
ＰＣＯＮＮ７０７２６）で処置したウイルスにおいて腫瘍退縮が見られた。１２
匹のマウスのＰＰＭＫ１０７処置後、４匹で完全な腫瘍退縮が見られ、６匹で部
分的な腫瘍退縮がみられた。１２匹のマウスのＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮ処置後、１
匹で完全な腫瘍退縮が見られ、２匹で部分的な腫瘍退縮がみられた。１２匹のマ
ウスのＰＰＣＯＮＮ７０７２６処置後、３匹で完全な腫瘍退縮が見られ、２匹で
部分的な腫瘍退縮がみられた。生理食塩水で処置した動物のいずれも、腫瘍退縮
は見られなかった
【０２３９】
【表２３】 （実施例２４） （免疫不全無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウスおよび免疫応答性異型接合体（ｎｕ／
＋）マウスにおける脳内注射後のＰＰＭＫ１０７、ＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮ、ＰＰ
ＣＯＮＮ７０７２６の効果） ５６匹の無胸腺マウス（ｎｕ／ｎｕ）および５６匹の免疫応答性異型接合体（
ｎｕ／＋）マウスに、生理食塩水、ＰＰＭＫ１０７、ＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮ、ま
たはＰＰＣＯＮＮ７０７２６のいずれかを定位座標的に脳内に注射した。各タイ
プ８匹の別のマウスを無処置コントロールとして使用した。ウイルスを、２つの
用量レベル（２×１０4または３．５×１０6ＰＦＵ／マウス）のうちの一方で使
用した。下記の表２４に示されるように、２つの用量レベルで３つのウイルスの
それぞれを処置したすべての異型接合体ｎｕ／＋マウスは、非神経学的症状のた
めに安楽死させた低い用量レベルのＰＰＣＯＮＮ７０７２６の１匹のマウスを除
いて、３９日目まで生存した。ＰＰＭＫ１０７、ＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮ、または
ＰＰＣＯＮＮ７０７２６のいずれかで処置した無胸腺ｎｕ／ｎｕ動物は、異型接
合体より有意に低い生存率であった。このことは、３．５×１０6ＰＦＵ／マウ
スという最も高いＰＰＭＫ１０７またはＰＰＣＯＮＮ７０７２６ウイルス用量で
特にそうであった。各ウイルス群においてわずか１３％（８分の１）の無胸腺マ
ウスしか３９日目まで生存しなかった。対照的に、この同じ用量レベル（３．５
×１０6ＰＦＵ／マウス）のＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮを処置したマウスは７５％が
生存した。これらのデータは、ＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮが他のつのウイルス株より
無胸腺マウスの脳においてより良好な耐性であることを示す。
【０２４０】
【表２４】 （実施例２５） （シンドビスウイルスＰＰＳＩＮＤＢＩＳ−Ａｒ３３９を用いた細胞毒性アッ
セイ結果のまとめ） ヒト腫瘍細胞および正常細胞を、２４ウェル組織培養皿において約８０％コン
フルエントまで増殖させた。増殖培地を取りだし、そしてＰＰＳＩＮＤＢＩＳ−
Ａｒ３３９（シンドビスＡｒ−３３９のプラーク精製クローン）を、１０7プラ
ーク形成単位（ＰＦＵ）／ウェル〜１ＰＦＵ／ウェルの範囲の１０倍希釈で加え
た。ウイルスを加えないコントロールのウェルを、各プレートに含ませた。振盪
プラットフォーム上で３７℃にて９０分間ウイルスを吸着させた。インキュベー
ション期間の終りに、ウイルス希釈物を取り出し、１ｍｌの増殖培地と交換した
。次いで、プレートを５％ＣＯ2中で３７℃にて５日間インキュベートした。５
７０ｎｍでモニターした、ミトコンドリアの酵素活性を検出する（Ｍｏｓｍａｎ
，Ｔ．，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５）呈色Ｍ
ＴＴ（２−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテ
トラゾリウムブロマイド）アッセイ（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６、カタログ＃Ｇ
４０００、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ５
３７１１）を使用することにより細胞毒性を定量化した。ウイルス処置ウェルの
生存度を、非処置コントロールウェル中の活性の百分率として表した。データを
、（ＰＦＵ／ウェル）対（コントロールの百分率としての生存度）として、グラ
フにプロットした。ＩＣ５０を、生存細胞の量の５０％減少を引き起こすウイル
スの量（ＰＦＵ／ウェル）として算出した。
【０２４１】
【表２５】 哺乳動物細胞上のシンドビスウイルスの細胞レセプターは、高親和性ラミニン
レセプターである。このレセプターは、上皮系の細胞に主に発現するが、Ｐａｎ
ｃ−１膵臓ガン腫株、およびＳＷ６２０結腸腺ガン細胞株（Ｃａｍｐｏら、（１
９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４１，１０７３−１０８３；Ｙｏｗら、（
１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８５，６３９４−６３９８
）のような多くの転移性ガン細胞においてしばしば過剰発現する。対照的に、直
腸腺ガン細胞株ＳＷ１４６３は、非常に低いレベルの高親和性ラミニンレセプタ
ーｍＲＮＡを発現することが公知であり（Ｙｏｗら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８５，６３９４−６３９８）、そしてＳＷ６２０よ
り、ＰＰＳＩＮＤＢＩＳ−Ａｒ３３９による殺傷に対して４オーダーを超える規
模でより耐性である。これらの結果は、腫瘍形成性で、高レベルの高親和性ラミ
ニンレセプターを発現する細胞は、他の腫瘍細胞または正常細胞より、シンドビ
スクローンＰＰＳＩＮＤＢＩＳ−Ａｒ３３９による殺傷に対してより感受性であ
ることを証明する。
【０２４２】 （実施例２６） （インターフェロンの存在下での腫瘍形成性細胞および非腫瘍形成性細胞のＶ
ＳＶ殺傷） ９６ウェルプレートにおいて、腫瘍形成性ＫＢおよびＨＴ１０８０細胞（３×
１０4細胞／ウェル）および非腫瘍形成性ＷＩＳＨ細胞（２．５×１０4細胞／ウ
ェル）を、２８００〜２２単位／ｍｌの範囲で系列希釈したインターフェロン−
αの存在下に播種し、そして３７℃にて２４時間インキュベートした。次いで、
この細胞に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ、インド株）を１０のＭＯＩで感染さ
せた。細胞を３７℃にて２４時間インキュベートした。５７０ｎｍでモニターし
た、ミトコンドリアの酵素活性を検出する（Ｍｏｓｍａｎ，Ｔ．，１９８３，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５）呈色ＭＴＴ（２−［４，５−
ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイ
ド）アッセイ（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６、カタログ＃Ｇ４０００、Ｐｒｏｍｅ
ｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ５３７１１）を使用する
ことにより細胞毒性を定量化した。ウイルス処置ウェルの生存度を、非処置コン
トロールウェル中の活性の百分率として表した。
【０２４３】
【表２６】 これらの結果は、ＶＳＶが、インターフェロン応答性に欠陥を有する腫瘍細胞
を選択的に殺傷することが可能であることを証明する（実施例２７）。ＷＩＳＨ
細胞（ヒト羊膜細胞）は、インターフェロンに対して効率的に応答するその能力
のため、インターフェロンバイオアッセイにおける使用について十分に確立され
た細胞株である。
【０２４４】 （実施例２７） （ＰＰＭＫ１０７による殺傷に対して感受性または抵抗性である細胞における
インターフェロン応答性） 個々の細胞株を９６ウェルマイクロタイタープレート中でコンフルエント近く
まで増殖させ、５Ｕ／ｍｌと５０００Ｕ／ｍｌの間のＩＦＮαＡで２４時間処理
した。次いでこの培養物にＰＰＭＫ１０７を１．０のＭＯＩで感染させ、そして
さらに２４時間培養した。化学的に固定した後、可溶性指示薬染料を使用する免
疫組織化学によりウイルス発現の量を定量した。ウイルス増殖の量を、インター
フェロンで処理していないコントロール細胞に対する、発現Ｐ抗原の百分率とし
て表す（図５）。このアッセイにおいて、インターフェロン応答性細胞は、イン
ターフェロンに応答して、ウイルス抗原の少なくとも５０％減少を示す。
【０２４５】 この実験の結果は、外因性インターフェロンの抗ウイルス効果に対するこの細
胞株の耐性と、ＰＰＭＫ１０７による殺傷に対するこの細胞株の相対的な感受性
（グラフの説明中で細胞株名の次に括弧内に示されるＩＣ５０値により示される
；図５を参照）との間の強い相関を示す。例えば、５Ｕ／ｍｌのインターフェロ
ンでの前処置後、インターフェロンに非応答性である７種の細胞株のうち６細胞
株（８６％）が、ＰＰＭＫ１０７による殺傷に感受性である。５００Ｕ／ｍｌの
インターフェロンで前処理した場合、すべて（４分の４）の非応答性細胞株がＰ
ＰＭＫ１０７による殺傷に感受性である。
【０２４６】 上記のデータはまた、ＰＰＭＫ１０７または他のインターフェロン感受性ウイ
ルスによる殺傷に対して感受性である可能性がある候補の細胞を同定するスクリ
ーニングアッセイの例を示す。例えば、外因性インターフェロンでの前処理後、
顕著な（例えば、コントロールの５０％より多い）ウイルス抗原を発現する感染
細胞は、インターフェロン欠陥と考えられ、よってウイルス腫瘍崩壊に感受性で
あると考えられる。
【０２４７】 （実施例２８） （その後の腹腔内用量のＰＰＭＫ１０７の致死性を減少させるための脱感作静
脈内用量のＰＰＭＫ１０７の使用） マウスに、０日目に、生理食塩水または脱感作用量のＰＰＭＫ１０７（３×１
０8ＰＦＵ／マウス）のいずれかを静脈内注射した。２日後、マウスの各セット
を、生理食塩水またはＰＰＭＫ１０７（１×１０9、２．５×１０9、５×１０9
、および１×１０10ＰＦＵ／マウス）を腹腔内投与する群にさらに分割した。下
記の表２７に示されるように、生理食塩水を使用してマウスを前処置した場合、
２．５×１０9、５×１０9、および１×１０10ＰＦＵをその後投与したマウスで
死亡が記録された。対照的に、ＩＶ脱感作用量を使用すると、２．５×１０9お
よび５×１０9ＰＦＵ群では死亡は観察されず、１×１０10ＰＦＵ群のマウスで
はわずか３８％の死亡率が観察されたのみであった。これらのデータは、静脈内
経路で与えられたＰＰＭＫ１０７が、その後の別の経路（すなわち、本実施例で
は腹腔内経路）でのこの同じ薬剤の投与の毒性を脱感作するために使用され得る
ことを示す。さらに、ＰＰＭＫ１０７の最大許容腹腔内用量は、脱感作剤として
このウイルスを使用した場合、約５倍上昇し得る。
【０２４８】
【表２７】 （実施例２９） （引き続く腹腔内用量のＰＰＭＫ１０７の抗腫瘍効力を増加させるための脱感
作静脈内用量のＰＰＭＫ１０７の使用） 本実施例では、ＥＳ−２ヒト卵巣癌腫細胞株由来の視覚的に明らかな腹水腫瘍
を有する胸腺欠損マウスを、２日前に静脈内脱感作の有無のいずれかで、あらか
じめ３×１０8ＰＦＵ／マウスのＰＰＭＫ１０７で腹腔内処理した。表２８に示
されるように、生理食塩水で腹腔内処理したコントロールマウスは、腹水腫瘍に
より、速やかに死亡した（処置の９日後までにわずか８％の生存）。最大耐量の
ＰＰＭＫ１０７を腹腔内投与することは、生存率を９日で４６％まで増加させた
。ＩＶ脱感作を用いると、ＰＰＭＫ１０７のより高いＩＰ用量（例えば、２．５
×１０9および５．０×１０9ＰＦＵ）に耐性であり得、そして脱感作を伴わない
最も高い容量（１．０×１０9ＰＦＵ）で達成可能な生存率と比較した場合に、
ほぼ倍の生存率（それぞれ、８３％および７９％）をもたらす。
【０２４９】
【表２８】 （実施例３０） （抗組換えマウスＴＮＦ−α抗血清は、マウスにおけるＰＰＭＫ１０７のＩＶ
致死性をブロックする） 本実施例では、１６匹の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群に、５．０×１０9Ｐ
ＦＵのＰＰＭＫ１０７を静脈内投薬した。５時間前に１６匹のマウスの異なる群
は、抗組換えマウスＴＮＦ−α抗血清（生理食塩水を用いて１：１０希釈したウ
サギ由来の１００μｌ）、等量のコントロールウサギ血清または生理食塩水のい
ずれかを受けた。以下の表２９に示すように、この用量でのＰＰＭＫ１０７の致
死性を、マウスＴＮＦ−αに対するウサギ抗血清を用いて完全にブロックする。
【０２５０】
【表２９】 （実施例３１） （クローンウイルスの精製） 多数のクローンＲＮＡウイルスを、ペレット化を伴わないウイルスの超遠心分
離か、または連続接線流動ろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒ
ａｔｉｏｎ）のいずれかにより精製した。精製のために、以下の方法の１つを行
った： 方法１：実施例１５の方法Ａのとおり 方法２：実施例１５の方法Ｄのとおり 方法３：約７０％のコンフルエンシーのベロ細胞を、０．０１のｍｏｉで感染
させ、そして３７℃で１８時間インキュベートした。感染させた細胞を含むフラ
スコを、−７０℃で凍結した。細胞を、室温で溶解し、次いで収集まで氷上で維
持した。収集のために、細胞を感染の間に存在する培地へとかき取り、そして１
７５０×ｇで４℃にて３０分間清澄化した。清澄化した上清をプールし、そして
２０％／５５％不連続勾配にわたって階層化し、そして約１００，０００×ｇで
３０分間遠心分離した。精製したウイルスを、スクロースの２０％／５５％界面
から収集し、そしてカルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳに対して透
析して、スクロースを取り除いた。
【０２５１】 ウイルス調製物の活性を、ニューカッスル病ウイルスについてＨＴ１０８０細
胞、および水胞性口内炎株についてベロ細胞を用いるプラークアッセイ法により
決定した。ウイルス調製物のタンパク質含有量を、タンパク質標準としてウシ血
清アルブミンを用いて、ＮｏｎｏＯｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｑｕａｎｔｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅ
ｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して決定した。
【０２５２】
【表３０】 これらの結果は、本発明において記載される方法を用いる、高い比活性に対し
て異なるクローンＲＮＡウイルスを精製する能力を実証する。
【０２５３】 （実施例３２） （シンドビスウイルスＰＰＳＩＮＤＢＩＳ−Ａｒ３３９は、ヒト腫瘍細胞異種
移植片を有する無胸腺マウスにおける腫瘍阻害を生じる） 無胸腺マウスに、１０００万個のＳＷ６２０ヒト腺癌腫瘍細胞を皮下注射した
。５日後、この腫瘍（平均サイズ＝７８ｍｍ3）を、ＰＰＳＩＮＤＢＩＳ−Ａｒ
３３９（１０匹のマウス、５×１０6ＰＦＵ）または生理食塩水（９マウス）の
単回注射で処置した。腫瘍サイズおよびマウスの体重を、１週間あたり２回、研
究の終了まで測定した。処置の１２日後、生理食塩水処理したマウスの平均腫瘍
サイズは、平均８９６％（７１．３ｍｍ3〜６３９．１ｍｍ3）まで増加した。
【０２５４】
【表３１】 これらのデータは、ＰＰＳＩＮＤＢＩＳ−Ａｒ３３９の単回注射が、生理食塩
水を用いる処置と比較して有意な腫瘍増殖阻害をもたらすことを示す。ＰＰＳＩ
ＮＤＢＩＳ−Ａｒ３３９を用いる処置はまた、生理食塩水処置群またはウイルス
処置群のいずれかにおける体重減少がないことにより証明されるように、マウス
に十分に耐性である。
【０２５５】 （実施例３３） （無関係のファミリーに属するウイルスが、ヒト腫瘍細胞株において類似の活
性を有する） 細胞傷害性アッセイを、実施例１および２５に記載のように、ＳＷ６２０腺癌
細胞株およびＰＰＭＫ１０７（パラミクソウイルスファミリー）またはＰＰＳＩ
ＮＤＢＩＳ−Ａｒ３３９（トガウイルスファミリー）を用いて行った（図６を参
照のこと）。これらの２つの無関係のウイルスは、別個のレセプターを用いて、
宿主細胞に進入し、そして各ウイルスに固有の機構により複製する。それにもか
かわらず、これらの２つのウイルスによる感染に対するＳＷ６２０細胞株の応答
は、明かに類似し、これらのウイルスによる腫瘍細胞殺傷機構が、共通の要素を
共有することを示す。
【０２５６】 （実施例３４） （無胸腺マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の全身性処置のための化学療法と
組み合わせたＰＰＭＫ１０７の使用） 無胸腺マウスに１０００万個のヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞を皮下注射した
。腫瘍が５〜７ｍｍの範囲に達した後、マウスを処置群に無作為化した。マウス
は、０、２、および４日目の処置の際に生理食塩水ビヒクルの腹腔内注射を受け
た。２×１０7ＰＦＵの用量のＰＰＫＭ１０７または生理食塩水ビヒクルを、２
日目の処置の際にのみ、腹腔内注射の１時間後に静脈内注射により投与した。１
６０ｍｇ／ｋｇの用量のカルボプラチン（ｃａｒｏｂｏｐｌａｔｉｎ）（ｃａｒ
ｂｏ）を、示されるように、０、２、および４日目の処置の際に腹腔内注射によ
り投与した。完全な回復（ＣＲ）および部分的な回復（ＰＲ）を伴う各群の割合
を示す。各処置群は、９匹の腫瘍保有マウスを有した。
【０２５７】
【表３２】 表３２におけるこれらの結果は、皮下ＨＴ１０８０腫瘍が、ＰＰＭＫ１０７を用
いるＩＶ処置に応答性であり、そしてＰＰＭＫ１０７処置の２日前、同日、また
は２日後のカルボプラチンの添加が、ＰＰＭＫ１０７単独またはカルボプラチン
単独のいずれかよりも、より高い割合の腫瘍後退（ＣＲ＋ＰＲ）をもたらすこと
を示す。
【０２５８】 （実施例３５） （無胸腺マウスにおけるヒト１０８０腫瘍異種移植片の全身性処置のためのカ
ルボプラチンと組み合わせたＰＰＭＫ１０７の使用における第２の実験） 無胸腺マウスに、実施例３４のように、１０００万個のヒトＨＴ１０８０線維
肉腫細胞を皮下注射した。マウスは、２日目の処置の際にＰＰＭＫ１０７（６×
１０6または２×１０7ＰＦＵ）の静脈内注射後の０日目の処置の際に、８０ｍｇ
／ｋｇまたは１２０ｍｇ／ｋｇの用量のカルボプラチン（ｃａｒｏｂｏｐｌａｔ
ｉｎ）（ｃａｒｂｏ）、あるいは生理食塩水ビヒクルの腹腔内注射を受けた。完
全な回復（ＣＲ）および部分的な回復（ＰＲ）を伴う各群の割合を示す。各処置
群は、９匹の腫瘍保有マウスを有した。
【０２５９】
【表３３】 表３３におけるこれらの結果は、皮下ＨＴ１０８０腫瘍が、ＰＰＭＫ１０７を用
いるＩＶ処置に各用量レベルで応答性であり、そしてＰＰＭＫ１０７処置の２日
前のいずれかの用量レベルでのカルボプラチンの添加が、ＰＰＭＫ１０７単独ま
たはカルボプラチン単独のいずれかよりも、より高い割合の腫瘍後退（ＣＲ＋Ｐ
Ｒ）をもたらすことを示す。
【０２６０】 （実施例３６） （無胸腺マウスにおけるヒト１０８０腫瘍異種移植片の全身性処置のためのカ
ルボプラチンと組み合わせたＰＰＭＫ１０７の使用における第３の実験） 無胸腺マウスに、実施例３４のように、１０００万個のヒトＨＴ１０８０線維
肉腫細胞を皮下注射した。マウスは、２日目の処置の際にＰＰＭＫ１０７（６×
１０6）の静脈内注射後の０日目の処置の際に、６０ｍｇ／ｋｇの用量のカルボ
プラチン（ｃａｒｏｂｏｐｌａｔｉｎ）（ｃａｒｂｏ）、または生理食塩水ビヒ
クルの腹腔内注射を受けた。完全な回復（ＣＲ）および部分的な回復（ＰＲ）を
伴う各群の割合を示す。各処置群は、８匹のマウスを有したカルボプラチンのみ
の群を除き、９匹の腫瘍保有マウスを有した。
【０２６１】
【表３４】 表３４におけるこれらの結果は、皮下ＨＴ１０８０腫瘍が、ＰＰＭＫ１０７を用
いるＩＶ処置に各用量レベルで応答性であり、そしてＰＰＭＫ１０７処置の２日
前のカルボプラチンの添加が、ＰＰＭＫ１０７単独またはカルボプラチン単独の
いずれかよりも、より高い割合の腫瘍後退（ＣＲ＋ＰＲ）をもたらすことを示す
。
【０２６２】 （実施例３７） （静脈内用量のＰＰＭＫ１０７の致死率を減少させるための副腎皮質ステロイ
ド（デキサメタゾン）の使用） 雌性無胸腺マウス（６〜７週齡）に、デキサメタゾン（ある群は２５ｍｇ／ｋ
ｇの用量、そして別の群は１０ｍｇ／ｋｇの用量）か、または生理食塩水のいず
れかを、０、１、２、３、および４日目に腹腔内注射した。全ての動物に、２日
目に（デキサメタゾンまたは生理食塩水のＩＰ投薬の１時間後に）ＰＰＭＫ１０
７（３×１０9ＰＦＵ／マウス）の静脈内用量を与えた。マウスを観察し、そし
て致死率を以下の表３５で表にする。
【０２６３】
【表３５】 ３×１０9のＰＰＭＫ１０７用量は、生理食塩水コントロールＩＰ投薬を受け
たマウスの６７％を死に至らしめた。デキサメタゾンは、ＰＰＭＫ１０７に起因
する致死率を明らかに低下させた（２５ｍｇ／ｋｇを与えた動物において観察さ
れたわずか７％の死亡率、および１０ｍｇ／ｋｇを与えた動物において観察され
た０％の死亡率を有する）。これらのデータは、副腎皮質ステロイドが、デキサ
メタゾンと同様に、ＰＰＭＫ１０７の静脈内用量の毒性を低下させるために用い
られ得ることを示す。
【０２６４】 上記は、本発明の限定ではなく、例示として示される。多数の改変および変更
は、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく実施され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＮＨＥＫ（正常ヒト上皮ケラチノサイト）細胞におけるウイルス抗原
発現および感染力価に対する抗インターフェロンβ抗体の効果を示す。
【図２】 図２は、異なる細胞（正常ヒト皮膚線維芽細胞ＣＣＤ９２２−ｓｋおよび２つ
のタイプの頭頚部癌腫細胞（ＫＢ細胞およびＨｅｐ２細胞））におけるウイルス
抗原発現に対するインターフェロンの効果を示す。
【図３Ａ】 図３Ａは、ＣＣＤ９２２−ｓｋ細胞におけるウイルス抗原発現に対するインタ
ーフェロンの効果を示す。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、ＫＢ細胞におけるウイルス抗原発現に対するインターフェロンの効
果を示す。
【図４】 図４は、ヒト卵巣ＥＳ−２腫瘍を有し、そして生理食塩水またはＮＤＶのいず
れかで処置された無胸腺マウスについての生存曲線を示す。
【図５】 図５は、多数のヒト腫瘍細胞株および正常細胞株のインターフェロン応答性を
示す。
【図６】 図６は、ＰＰＭＫ１０７およびＰＰＳＩＮＤＢＩＳ−Ａｒ３３９での感染に対
するＳＷ６２０腫瘍細胞株の用量応答を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１１月８日（２００１．１１．８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項２８】 前記コルチコステロイドが、デキサメタゾンである、請求
項２７に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年２月２１日（２００２．２．２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/02 35/02 35/04 35/04 43/00 １０５ 43/00 １０５ １２１ １２１ Ｃ０７Ｊ 5/00 Ｃ０７Ｊ 5/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ローレンス， ロバート エム． アメリカ合衆国 メリーランド 20817， ベゼスダ， ノーウェル ドライブ 9506 (72)発明者 グロエン， ウィリアム エス． アメリカ合衆国 メリーランド 21774， ニュー マーケット， ウィンドソング コート 5746 (72)発明者 ラビン， ハーベイ アメリカ合衆国 メリーランド 20852， ロックビル， ラルストン ロード 11021 (72)発明者 ボン ボーステル， レイド ダブリュ． アメリカ合衆国 メリーランド 20854， ポトマック， フォックス ラン 8310 Ｆターム(参考） 4C084 AA03 AA14 AA19 BA44 CA18 DA14 DA32 MA02 NA14 ZB211 ZB261 ZB271 ZC752 4C086 AA01 AA02 DA10 DA32 MA02 MA04 NA14 ZB21 ZB26 ZB27 ZC75 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 MA01 MA02 NA14 ZB21 ZB26 ZB27 ZC75 4C091 AA01 BB03 BB05 CC01 DD01 EE07 FF01 GG01 HH03 JJ03 KK12 LL01 MM03 NN04 PA03 PA05 PA09 PB02 QQ01 4C206 AA01 AA02 DA35 JB16 KA01 KA13 MA02 MA04 MA11 NA14 ZB21 ZB26 ZB27 ZC75

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ウイルスを用いて哺乳動物における新生物を感染する方法で
    あって、該方法は、該哺乳動物にインターフェロン感受性の、複製コンピテント
    クローンＲＮＡウイルスを投与する工程を包含し、ここで、該ウイルスは、少な
    くとも２０分の期間にわたって投与される、方法。
  2. 【請求項２】 ウイルスを用いて哺乳動物における新生物を感染する方法で
    あって、該方法は、該哺乳動物にインターフェロン感受性の、複製コンピテント
    クローンＲＮＡウイルスを投与する工程を包含し、ここで、該ウイルス用量は、
    少なくとも５．９×１０9ＰＦＵ／ｍ2である、方法。
  3. 【請求項３】 ウイルスを用いて哺乳動物における新生物を感染する方法で
    あって、該方法は、該哺乳動物にインターフェロン感受性の、複製コンピテント
    クローンＲＮＡウイルスを投与する工程を包含し、ここで、該ウイルス用量は、
    少なくとも９．６×１０10ＰＦＵ／ｍ2である、方法。
  4. 【請求項４】 ウイルスを用いて哺乳動物における新生物を感染する方法で
    あって、該方法は、該哺乳動物にインターフェロン感受性の、複製コンピテント
    クローンＲＮＡウイルスを投与する工程を包含し、ここで、該ウイルスは、少な
    くとも３×１０9ＰＦＵ／ｍｇタンパク質の純度のレベルである、方法。
  5. 【請求項５】 ウイルスを用いて哺乳動物における新生物を感染する方法で
    あって、該方法は、以下の工程： 該哺乳動物に、インターフェロン感受性の、複製コンピテントクローンＲＮＡ
    ウイルスを投与する工程； 該哺乳動物に、Ｋ３Ｌ、Ｅ３ＬおよびＢ１８Ｒからなる群から選択される１以
    上の遺伝子において１以上の変異を有する、インターフェロン感受性の、複製コ
    ンピテントクローンワクシニアウイルスを投与する工程；または 該哺乳動物に、アデノウイルス、パルボウイルス、パポバウイルスおよびイリ
    ドウイルスからなる群から選択されるインターフェロン感受性の、複製コンピテ
    ントクローンＤＮＡウイルスを投与する工程、 を包含し、ここで、該ウイルスは、１用量を超えるように投与され、第１用量は
    、脱感作用量であり、そして該第１用量は、静脈内に投与されかつその後の用量
    は、静脈内に投与され、ここで、該その後の用量は、少なくとも４．８×１０10 ＰＦＵ／ｍ2である、方法。
  6. 【請求項６】 ウイルスを有する哺乳動物における新生物を感染する方法で
    あって、該方法は、以下の工程： 該哺乳動物に、インターフェロン感受性の、複製コンピテントクローンＲＮＡ
    ウイルスを投与する工程； 該哺乳動物に、Ｋ３Ｌ、Ｅ３ＬおよびＢ１８Ｒからなる群から選択される１以
    上の遺伝子において１以上の変異を有する、インターフェロン感受性の、複製コ
    ンピテントクローンワクシニアウイルスを投与する工程；または 該哺乳動物に、アデノウイルス、パルボウイルス、パポバウイルスおよびイリ
    ドウイルスからなる群から選択されるインターフェロン感受性の、複製コンピテ
    ントクローンＤＮＡウイルスを投与する工程、 を包含し、ここで、該ウイルスは、１用量を超えるように投与され、第１用量は
    、脱感作用量であり、そして該第１用量は、静脈内に投与されかつその後の用量
    は、静脈内に投与され、ここで、該その後の用量は、少なくとも９．６×１０10 ＰＦＵ／ｍ2である、方法。
  7. 【請求項７】 哺乳動物における新生物を感染する方法であって、該方法は
    、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ラブドウイルス科、トガウ
    イルス科、フラビウイルス科、ピコルナウイルス科、コロナウイルス科、レオウ
    イルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、およびパルボウイルス科
    からなる科の群より選択されるウイルスを投与する工程を包含する、方法。
  8. 【請求項８】 前記トガウイルス科が、シンドビスウイルスである、請求項
    ７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 ウイルスを用いて哺乳動物における新生物を感染する方法で
    あって、該方法は、該哺乳動物にインターフェロン感受性の、複製コンピテント
    クローンＲＮＡウイルスを投与する工程を包含し、ここで該ＲＮＡウイルスは、
    一本鎖ＲＮＡウイルスである、方法。
  10. 【請求項１０】 哺乳動物におけるウイルス性病因の疾患を処置する方法で
    あって、該方法は、該哺乳動物に治療有効量の複製コンピテントクローンウイル
    スを投与する工程を包含する、方法。
  11. 【請求項１１】 前記投与工程が、全身性である、請求項９に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記疾患が、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスまたは
    ヒト免疫不全ウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされ
    る、請求項１０に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記ウイルスが、パラミクソウイルスである、請求項１０
    に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記ＲＮＡウイルスが、ラブドウイルス、トガウイルス、
    フラビウイルス、ピコルナウイルス、およびコロナウイルスからなる群から選択
    される、請求項１０に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記ＲＮＡウイルスが、前記哺乳動物に対して、アデノウ
    イルス、パルボウイルス、パポバウイルスおよびイリドウイルスからなる群から
    選択されるＤＮＡウイルスからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法
    。
  16. 【請求項１６】 ウイルスを用いて哺乳動物における新生物を感染する方法
    であって、該方法は、該哺乳動物にインターフェロン感受性の、複製コンピテン
    トクローンＲＮＡウイルスを投与する工程を包含し、ここで、該方法は、該投与
    工程より前に、ｐ６８プロテインキナーゼ、Ｃ−Ｍｙｃ、Ｃ−Ｍｙｂ、ＩＳＧＦ
    −３、ＩＲＦ−１、ＩＦＮレセプター、およびｐ５８からなる群より選択される
    、タンパク質またはタンパク質をコードするｍＲＮＡ、Ｒａｓ過剰発現、活性変
    異を有するＲａｓ、Ｒａｓシグナル伝達通路の他のメディエータの過剰発現、無
    秩序なレセプターチロシンキナーゼについて、該新生物をスクリーニングする工
    程をさらに包含する、方法。
  17. 【請求項１７】 ウイルスを用いて哺乳動物における新生物を感染する方法
    であって、該方法は、該哺乳動物にインターフェロン感受性の、複製コンピテン
    トクローンＲＮＡウイルスを投与する工程を包含する、方法。
  18. 【請求項１８】 ウイルスを用いて哺乳動物における新生物を感染する方法
    であって、該方法は、該哺乳動物にインターフェロン感受性の、複製コンピテン
    トクローンＲＮＡウイルスを投与する工程を包含し、ここで、複数クールのウイ
    ルスが投与される、方法。
  19. 【請求項１９】 ウイルスを用いて哺乳動物における新生物を感染する方法
    であって、該方法は、該哺乳動物にインターフェロン感受性の、複製コンピテン
    トクローンＲＮＡウイルスを投与する工程を包含し、ここで、該ウイルスは、該
    ウイルスの第１投与後２週間を超えて投与される、方法。
  20. 【請求項２０】 ウイルスを用いて哺乳動物における新生物を感染する方法
    であって、該方法は、該哺乳動物にインターフェロン感受性の、複製コンピテン
    トクローンＲＮＡウイルスを投与する工程を包含し、ここで、ＴＮＦのインヒビ
    ターが、該ウイルスの投与の前、投与の間または投与後に投与される、方法。
  21. 【請求項２１】 前記インヒビターが、ＴＮＦに対する抗体である、請求項
    ２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 ウイルスを有する哺乳動物における新生物を感染する方法
    であって、該方法は、以下の工程： 該哺乳動物に、インターフェロン感受性の、複製コンピテントクローンＲＮＡ
    ウイルスを投与する工程； 該哺乳動物に、Ｋ３Ｌ、Ｅ３ＬおよびＢ１８Ｒからなる群から選択される１以
    上の遺伝子において１以上の変異を有する、インターフェロン感受性の、複製コ
    ンピテントクローンワクシニアウイルスを投与する工程；または 該哺乳動物に、アデノウイルス、パルボウイルス、パポバウイルスおよびイリ
    ドウイルスからなる群から選択されるインターフェロン感受性の、複製コンピテ
    ントクローンＤＮＡウイルスを投与する工程、 を包含し、ここで、該ウイルスは、１用量を超えるように投与され、第１用量は
    、脱感作用量であり、そして該第１用量は、静脈内に投与されかつその後の用量
    は、静脈内に投与され、ここで、該その後の用量は、該第１用量より少なくとも
    ２倍より多い、方法。
  23. 【請求項２３】 ウイルスを用いて哺乳動物における新生物を感染する方法
    であって、該方法は、該哺乳動物にインターフェロン感受性の、複製コンピテン
    トクローンＲＮＡウイルスを投与する工程を包含し、ここで、脱感作剤が、該ウ
    イルスの前に投与される、方法。
  24. 【請求項２４】 前記脱感作剤が、ＴＮＦまたはＴＮＦのインデューサーで
    ある、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記ＴＮＦのインデューサーが、ＩＬ−２、内毒素または
    別のウイルスである、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 ウイルスを用いて哺乳動物における新生物を感染する方法
    であって、該方法は、該哺乳動物にインターフェロン感受性の、複製コンピテン
    トクローンＲＮＡウイルスを投与する工程を包含し、ここで、該方法は、該ウイ
    ルスの投与前、投与の間または投与後に化学療法剤を投与する工程をさらに包含
    し、該化学療法剤は、白金配位錯体である、方法。
  27. 【請求項２７】 前記白金配位錯体が、カルボプラチンである、請求項２６
    に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 ウイルスを用いて哺乳動物における新生物を感染する方法
    であって、該方法は、該哺乳動物にインターフェロン感受性の、複製コンピテン
    トクローンＲＮＡウイルスを投与する工程を包含し、ここで、該方法は、該ウイ
    ルスの投与前、投与の間または投与後に免疫抑制薬を投与する工程をさらに包含
    し、該免疫抑制剤は、コルチコステロイドである、方法。
  29. 【請求項２９】 前記コルチコステロイドが、デキサメタゾンである、請求
    項２８に記載の方法。
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