CN1477964A - 应用病毒治疗肿瘤 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可以复制并可在干扰素介导的抗病毒应答中杀伤肿瘤细胞的病毒，以及这些病毒在治疗肿瘤性疾病中的应用，所述肿瘤性疾病包括癌症和巨大肿瘤。在这一点上，RNA和DNA病毒均可应用。本发明还涉及这些病毒的筛选、设计、纯化和在肿瘤治疗方面的应用。

Description

应用病毒治疗肿瘤
                      发明领域
本发明涉及可以复制并可在干扰素(IFN)介导的抗病毒应答中杀死肿瘤细胞的病毒。在这一点上，RNA和DNA病毒均可应用。本发明还涉及这些病毒在治疗肿瘤性疾病中的应用，所述肿瘤性疾病包括癌症和巨大肿瘤。
                      发明背景
包括癌症在内的肿瘤性疾病是导致人类死亡的首要因素之一。在美国，每年有超过130万的新确诊癌症病例和55万的死亡病例。在癌症转移到身体第二个部位之前的早期探察，可以大大增加宿主的存活机会。但是，癌症的早期探察并非总是可行，甚至在早期探察成功的时候，治疗也往往不尽如人意，特别是高度恶性的癌症病例。癌症的治疗包括化疗和放疗，对晚期病例疗效差强人意，特别是当肿瘤生长相当巨大和/或肿瘤负荷较大时。(见Hillard Stanley，癌症治疗报告，第61卷，第1期，1977年1/2月，29-36页，Tannock，癌症研究，第42卷，4921-4926页，1982年12月)。
与暴露于多种病毒有关的肿瘤消退业已有所报道。所述的绝大多数病毒对人类具有致病性，包括流行性腮腺炎病毒和麻疹病毒。其他特定病毒对特定类型癌症细胞的作用也已有报道。Smith等，(1956)癌症，9，1211(腺病毒对宫颈癌的作用)；Holzaepfel等，(1957)癌症，10，557(腺病毒对上皮性肿瘤的作用)；Taylor等，(1970)国立癌症研究所杂志，44，515(牛肠病毒-l对肉瘤-l的作用)；Shingu等，(1991)普通病毒学杂志，72，2031(牛肠病毒MZ-468对白血病细胞F-647的作用)；Suskind等，(1957)PSEBM，94，309(柯萨奇B3病毒对HeLa肿瘤细胞的作用)；Rukavishnikova等，(1976)病毒学学报，20，387(甲型流感病毒株对腹水肿瘤的作用)。
最早的文献描述了应用减毒病毒活疫苗而使肿瘤部分消退的现象，上述治疗是为了使患者获得针对天花或狂犬病的免疫能力。见DePace，N.G.(1912)Ginecologia，9，82-88；Salmon，P.& Baix(1922)Compt.Rend.Soc.Biol.，86，819-820。在自然感染麻疹的病例中，也已观察到肿瘤的部分消退和白血病的消退。见Pasquinucci，G.(1971)柳叶刀，1，136；Gross，S.(1971)柳叶刀，1，397-398；Bluming，A.Z.和Ziegler，J.L.(1971)柳叶刀，2，105-106。在一项有90名癌症患者参加的研究中，患者自愿感染流行性腮腺炎活病毒，结果在79名患者中出现了肿瘤的部分消退。见Asada(1994)癌症，34，1907-1928。尽管这些病毒的副作用是暂时的，但感染这些人类病原体的严重后遗症是人们关注的一个焦点。
                    × × × ×
病毒分类如下[见Murphy A和Kingsbury DW主编，病毒学，第2版，1990，(Ed.Field，B.N.)，Raven出版社，纽约，9-35页]：分类特征                  病毒科名称RNA病毒ssaRNA，正义链，         细小核糖核酸病毒科，嵌杯状病毒科未分段，无包膜，ss RNA，正义链，          披膜病毒科，黄病毒科未分段，                  冠状病毒科有包膜ss RNA，反义链，          棒状病毒科，线状病毒科未分段，                  副粘病毒科有包膜ss RNA，反义链，          正粘病毒科有片段，有包膜ss RNA，双义链，          布尼病毒科，沙粒病毒科有片段，有包膜dsbRNA，正义链，         呼肠病毒科，双RNA病毒科有片段，无包膜ss RNA，DNA复制过程中，   逆转录病毒科正义链，未分段，有包膜DNA病毒ss/dsDNA，无包膜          嗜肝DNA病毒科ss DNA，无包膜            细小病毒科dsDNA，无包膜             乳多空病毒科，腺病毒科dsDNA，有包膜             疱疹病毒科，痘病毒科，虹彩病毒科ass＝单链bds＝双链
疱疹病毒科(疱疹病毒)中包括α-疱疹病毒(包括生殖器水痘病毒和生殖器单纯疱疹病毒)，β-疱疹病毒和γ-疱疹病毒三个亚科。
新城疫病毒(NDV)是副粘病毒科(或副粘病毒)中的一员。NDV的自然宿主是鸡及其他禽类。典型的NDV可与动物宿主细胞表面的特定分子结合，然后与细胞表面融合，并将其遗传物质射入宿主细胞内。NDV是一种细胞致死性病毒。一旦进入细胞，病毒基因就会指导宿主细胞生成病毒拷贝，并导致宿主细胞的死亡，释放NDV拷贝，感染其他细胞。与一些病毒不同，尚未发现NDV可致人类任何严重疾病。与其他种类病毒(如HTLV-1，乙型肝炎病毒)不同，尚未发现副粘病毒可致癌。
在一小部分暴露于NDV的患者中，曾有报道肿瘤的一过性消退，见Csatary，L.K.(1971)柳叶刀，2，825。Csatary观察到，一名养鸡农民的胃肠癌在其养殖的鸡群流行新城疫时消退。在一个类似的轶闻报道中，Cassel，W.A.和Garrett，R.E.观察到在一例已经有淋巴结转移的宫颈癌患者中，向宫颈肿瘤注射NDV后，原位宫颈癌消退。见(1965)癌症，18，863-868。由于肿瘤杀伤活性的机制一直被认为与免疫有关，因此旨在阐述病毒对肿瘤具有直接细胞毒作用的工作一直没有开展。相反，研究人员一直致力于揭示NDV的免疫介导效应。见，如Murray，D.R.，Cassel，W.A.，Torbin，A.H.，Olkowski，Z.L.，& Moore，M.E.(1977)癌症，40，680；Cassel，W.A.，Murray，D.R.，& Phillips，H.S.(1983)癌症，52，856；Bohle，W.，Schlag，PJ.，Leibrich，W.，Hohenberger，P.，Manasterski，M.，Miller，P.，和Schirrmacher，V.(1990)癌症，66，1517-1523。
在上述参考文献中，导致肿瘤消退的特定病毒的筛选基于运气或试验以及失误。仅仅在最近，才开发出基于机制研究并有理论支持的应用DNA病毒治疗癌症的方法。这类方法的一个实例是在研发重组腺病毒载体时发现的，该载体仅能在发生于特定组织的肿瘤中复制(Rodriguez，R.等，1997癌症研究，57：2559-2563)，或在那些缺乏某种关键调节蛋白的肿瘤中复制(Bischoff，JR等，1996科学，274：373-376)。最近的另一种方法是应用不具有复制能力的重组腺病毒载体来恢复某些肿瘤细胞已经丧失的一种重要蛋白功能(Zhang，WW等，1994癌症基因治疗，1：5-13)。最后，单纯疱疹病毒业已经工程修饰，优先在快速分裂的细胞中复制，而快速分裂正是肿瘤的特征所在(Mineta，T.等，1994癌症研究，54：3963-6966)。
申请号08/260,536的美国专利公布了应用NDV或其他副粘病毒治疗癌症，在此全文引入作为参考。
病毒干扰素转基因表达
应用病毒疗法治疗癌症的一种常用方法是利用病毒载体，将特定基因给予肿瘤瘤体。
重组腺病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒和逆转录病毒均已经修饰，单独表达干扰素基因或与其他细胞因子基因联合表达。
在Zhang等发表的文章中((1996)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA93：4513-4518)，表达人干扰素同质(即合成)基因的重组腺病毒用于在裸鼠上治疗人乳腺癌(和其他)异种移植物。作者总结道“……将病毒的溶瘤细胞作用和致病性低的病毒结合，该病毒本身对干扰素或干扰素基因治疗有抗性，可能成为一种治疗多种不同肿瘤的富有成效的方法，特别是对乳腺癌”。与本发明涉及干扰素敏感性病毒不同，Zhang等(1996)应用了干扰素耐药性腺病毒治疗肿瘤。
在Zhang等发表的文章中((1996)癌症基因治疗，3：31-38)，表达同质干扰素基因的腺伴随病毒(AAV)用来在体外转导人肿瘤细胞，然后给裸鼠注射。转导的肿瘤细胞或者根本未形成肿瘤，或者较未转导的对照组生长缓慢。而且，将一种转导的人肿瘤细胞注射入另一种肿瘤瘤体，结果可导致未转导肿瘤的体积缩小。在Peplinski等的文章中((1996)肿瘤外科学纪事，3：15-23)，γ干扰素(和其他细胞因子，单独表达或联合表达)在小鼠乳腺癌模型中得到了检测。用经重组痘苗病毒修饰过的肿瘤细胞免疫小鼠。当再次暴露于肿瘤细胞时，经病毒修饰细胞免疫的小鼠无瘤存活时间延长，并具有统计学意义。
Gastl等((1992)癌症研究，52：6229-6236)应用表达γ干扰素的逆转录病毒载体体外转导肾肿瘤细胞。结果显示，对免疫系统功能至关重要的许多蛋白质在这些细胞中的产量大幅提高。
Restifo等((1992)实验医学杂志，175：1423-1431)应用表达γ干扰素的逆转录病毒载体转导鼠肉瘤细胞系，使肿瘤细胞系可以向CD8+T细胞更有效地提呈病毒抗原。
Howard等((1994)纽约科学院纪事，716：167-187)应用表达γ干扰素的逆转录病毒载体转导鼠和人黑色素瘤细胞。结果发现，对免疫功能至关重要的蛋白质在这些细胞的表达增加。这些细胞较之未转导的亲本细胞系对小鼠的致瘤性弱，并可在体内激活肿瘤特异性CTL反应。
应用治疗剂量的干扰素作为肿瘤病毒治疗的佐剂
众所周知，由于干扰素具有免疫增强作用，几项研究检测了干扰素与其他癌症病毒疫苗治疗的联合应用。
在Kirchner等的文章中((1995)世界泌尿学杂志，13：171-173)，208名患者应用经NDV修饰、放射致死的自体肾细胞癌肿瘤细胞免疫，并联合小剂量IL-2或α干扰素治疗。作者表示，这种治疗方案使局部晚期的肾细胞癌患者的自然病程得到改善。治疗剂量约为3.3×105PKU/kg。这是局部治疗，与系统治疗不同，目的是诱导抗肿瘤免疫反应。
Tanaka等((1994)强调肿瘤免疫学的免疫治疗杂志，16：283-293)给小鼠联合应用α干扰素和重组痘苗病毒，作为癌症疫苗疗法模型。该研究显示，接受干扰素的小鼠较之未接受的小鼠存活能力具有统计学意义的改善。作者将干扰素的效果归功于在动物中诱导了CD8阳性T细胞。
Arroyo等((1990)癌症免疫学与免疫治疗，31：305-311)应用结肠癌小鼠模型，检测了α干扰素和/或IL-2联合治疗对痘苗病毒结肠瘤细胞溶解剂(VCO)治疗癌症效果的影响。结果发现，VCO+IL-2+IFN的三联疗法在该鼠模型中是最有效的。这一方法有赖于免疫是抗治疗活性的机制。
在上述研究中，干扰素用于增强免疫系统对肿瘤细胞的识别能力。
                     发明目的
本发明的一个目的是为包括癌症的疾病治疗提供病毒。
本发明的另一个目的是为包括癌症的肿瘤性疾病的治疗提供病毒。
本发明的另一个目的是提供一种方法，该方法可以选择和/或筛查用于肿瘤性疾病治疗的备选病毒。
本发明的另一个目的是提供病毒遗传工程学指导，用以在治疗肿瘤性疾病时增加其治疗效用。
本发明的另一个目的是提供一种方法，用该方法可以筛选病毒治疗的潜在靶细胞，目的是评价备选靶细胞对病毒杀伤力的敏感性。
本发明的另一个目的是提供病毒治疗管理的指导。
本发明的一个目的是提供一种治疗巨大肿瘤的方法。
本发明的另一个目的是提供纯化的病毒以及获得纯化病毒的方法。
                     发明概述
本发明涉及应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法，包括将具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒给予哺乳动物。所述病毒选自腺病毒、细小病毒、乳多空病毒、虹彩病毒和疱疹病毒科的RNA病毒和DNA病毒。
本发明还涉及应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法，包括将具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒系统性给予哺乳动物。
本发明还涉及一种治疗哺乳动物包括癌症在内的肿瘤性疾病的方法，该方法包括将治疗有效剂量的具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒给予哺乳动物。所述病毒选自腺病毒、细小病毒、乳多空病毒、虹彩病毒和疱疹病毒科的RNA病毒和DNA病毒。
本发明还涉及应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法，包括将具有复制能力的干扰素敏感性克隆痘苗病毒给予哺乳动物。所述痘苗病毒在一个或多个病毒基因上具有一个或多个突变，所述病毒基因与干扰素抗病毒活性的阻断有关，选自K3L，E3L和B18R基因。
本发明还涉及一种治疗哺乳动物包括癌症在内的肿瘤性疾病的方法，该方法是将治疗有效剂量的具有复制能力的干扰素敏感性痘苗病毒给予哺乳动物。所述痘苗病毒在一个或多个病毒基因上具有一个或多个突变，所述病毒基因与干扰素抗病毒活性的阻断有关，选自K3L，E3L和B18R基因。
本发明还涉及应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法，该肿瘤至少1cm。所述方法包括将选自(1)RNA病毒；(2)嗜肝DNA病毒；(3)细小病毒；(4)乳多空病毒；(5)疱疹病毒；(6)痘病毒；和(7)虹彩病毒的克隆病毒给予哺乳动物。
本发明还涉及一种治疗哺乳动物肿瘤的方法，包括将治疗有效剂量的克隆病毒给予哺乳动物，所述病毒选自(1)RNA病毒；(2)嗜肝DNA病毒；(3)细小病毒；(4)乳多空病毒；(5)疱疹病毒；(6)痘病毒；和(7)虹彩病毒。这里，肿瘤的大小至少1厘米。
本发明还涉及一种治疗哺乳动物肿瘤的方法，包括将治疗有效剂量的肿瘤细胞致死性RNA病毒给予哺乳动物，所述哺乳动物的肿瘤负荷至少占总体重1.5％。
本发明还涉及一种方法，该方法可用于筛选从患者处得到的新鲜肿瘤细胞或组织，并测定该细胞或组织对病毒杀伤力的敏感性，包括应用干扰素敏感性病毒，采用差异细胞毒试验，检测细胞或组织。
本发明还涉及在哺乳动物中鉴别病毒抗肿瘤活性的方法，包括a)应用备检病毒感染i)有干扰素介导的抗病毒活性缺陷的细胞，和ii)具有干扰素介导的抗病毒活性的细胞，和b)测定备选病毒是否优先杀伤有干扰素介导的抗病毒活性缺陷的细胞，而非具有干扰素介导的抗病毒活性的细胞。
本发明还涉及制备用于抗肿瘤治疗的病毒的方法，包括a)修饰现有病毒，以降低或消除病毒灭活干扰素抗病毒作用的病毒机制，并任选b)创建一种减毒突变，结果使其较现有病毒的毒力弱。
本发明还涉及一种在哺乳动物中控制病毒复制的方法，该哺乳动物应用选自RNA病毒、腺病毒、痘病毒、虹彩病毒、细小病毒、嗜肝DNA病毒，水痘病毒、β疱疹病毒和γ疱疹病毒的病毒治疗，包括给予抗病毒化合物。
本发明还涉及筛查肿瘤细胞、肿瘤组织或组织切片的方法，该方法可以测定哪些肿瘤细胞或组织允许病毒结合，包括将肿瘤细胞、组织或组织切片应用免疫试验或免疫染色，显示肿瘤细胞或肿瘤组织上存在的病毒受体量。
本发明还涉及应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法，包括在随后的至少一次大剂量病毒给予前，将脱敏剂量的具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒系统给予。
本发明还涉及应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法，包括将具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒给予哺乳动物，整个过程至少持续4分钟。
本发明还涉及应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法，包括将具有复制能力的克隆病毒给予，所述病毒选自新城疫病毒株MK107，新城疫病毒株NJ Roakin，新培斯病毒和疱疹性口炎病毒。
本发明包括：
i)应用无沉淀超速离心法纯化的克隆副粘病毒；
ii)一种纯化至至少2×109PFU/mg蛋白水平的克隆副粘病毒；
iii)一种纯化至至少1×1010PFU/mg蛋白水平的克隆副粘病毒；
iv)一种纯化至至少6×1010PFU/mg蛋白水平的克隆副粘病毒；
v)一种纯化至至少2×109PFU/mg蛋白水平的克隆RNA病毒；
vi)一种纯化至至少1×1010PFU/mg蛋白水平的克隆RNA病毒；
vii)一种纯化至至少6×1010PFU/mg蛋白水平的克隆RNA病毒；
viii)一种细胞致死性克隆DNA病毒，所述病毒对干扰素敏感，纯化至至少2×109PFU/mg蛋白水平；
ix)一种具有复制能力的痘苗病毒，所述病毒a)在一个或多个K3L、E3L和B18R基因中含有一个或多个突变，和b)在编码胸腺嘧啶脱氧核苷激酶、核苷酸还原酶、痘苗生长因子、胸苷酸激酶、DNA连接酶、dUTP酶的基因中具有一个或多个减毒突变；
x)一种具有复制能力的痘苗病毒，所述病毒在选自K3L、E3L和B18R的两个或多个基因中含有一个或多个突变；
xi)一种(2’-5’)A类似物表达被修饰的疱疹病毒，该修饰使疱疹病毒对干扰素的敏感性增强；以及
xii)一种在ω-3存在减毒突变的呼肠病毒，所述突变使病毒对干扰素敏感；
xiii)一种具有复制能力的细胞致死性病毒，所述病毒干扰素敏感，并纯化至至少2×109PFU/mg蛋白水平；
xiv)一种纯化至至少2×109PFU/mg蛋白水平的呼肠病毒。
本发明还包括下述方法：
i)一种纯化RNA病毒的方法，包括以下步骤a)产生克隆病毒；以及b)应用无沉淀超速离心法纯化所述病毒；或c)应用切线层流过滤法纯化所述克隆病毒，随后可进行或不进行凝胶渗透层析；以及
ii)一种纯化副粘病毒的方法，包括应用无沉淀超速离心法纯化所述病毒，或应用切线层流过滤法纯化所述病毒，随后可进行或不进行凝胶渗透层析。
本发明还涉及在哺乳动物中治疗疾病的方法，在所述疾病中致病细胞对干扰素介导的抗病毒应答有缺陷，所述方法包括将治疗有效剂量的具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒给予哺乳动物。
本发明还涉及应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法，包括将具有复制能力的干扰素敏感性克隆RNA病毒给予哺乳动物。
本发明还涉及哺乳动物病毒性疾病的治疗，包括将治疗有效剂量的具有复制能力的克隆病毒给予哺乳动物。
本发明还涉及感染哺乳动物肿瘤的方法，包括给予选自副粘病毒科、正粘病毒科、棒状病毒科、披膜病毒科、黄病毒科、细小核糖核酸病毒科、冠状病毒科、呼肠病毒科、痘病毒科、疱疹病毒科和细小病毒科的病毒。
本发明还涉及治疗肿瘤腹水的方法，包括给予具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒。
本发明还涉及减轻哺乳动物疼痛的方法，包括给予具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒。
本发明还涉及治疗哺乳动物肿瘤的方法，包括应用免疫试验方法测定从所述哺乳动物获得的样本病毒受体的存在量，并且如果受体存在，将能与受体结合的具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒给予哺乳动物。
                     附图简述
图1显示了抗β干扰素抗体对病毒抗原表达和NHEK(正常人上皮角化细胞)细胞内感染滴度的影响。
图2显示了β干扰素对不同细胞中(正常人皮肤成纤维细胞CCD922-sk和两种类型的头颈部肿瘤细胞(KB和Hep2细胞))病毒抗原表达的影响。
图3A显示了干扰素对CCD922-sk细胞中病毒抗原表达的影响，图3B显示了干扰素对KB细胞中病毒抗原表达的影响。
图4显示了携带人卵巢ES-2肿瘤的无胸腺小鼠在生理盐水或NDV治疗下的生存曲线。
图5显示了一组人肿瘤细胞系和正常细胞系对干扰素的反应性。
图6显示了SW620肿瘤细胞系对PPMK107和PPSINDBIS-Ar339感染的剂量反应。
                     发明详述
本发明涉及一种新机制的发现，通过该机制，病毒复制可以选择性杀伤对干扰素(IFN)介导的抗病毒应答具有缺陷的肿瘤细胞。本发明还提供了筛选、设计、纯化和应用病毒治疗包括癌症和巨大肿瘤在内的肿瘤性疾病的方法。基于肿瘤细胞具有选择性干扰素介导的抗病毒应答缺陷，本发明的病毒在这些肿瘤细胞中可以选择性复制并杀伤这些细胞。将适宜剂量的病毒给予后可导致肿瘤细胞死亡，而正常细胞由于拥有完整的干扰素介导的抗病毒应答，可以限制病毒的复制，从而不被杀伤。本发明的主题包括应用副粘病毒，如NDV和其他病毒治疗包括肿瘤性疾病如癌症在内的疾病。本发明还教导如何筛选和制备适用于肿瘤性疾病治疗的其他病毒。本发明的另一个实施方案包括鉴定备选肿瘤组织是否适用病毒治疗的方法。最后，本发明还阐述了高纯度病毒的制备方法。
应用干扰素敏感性病毒包括NDV治疗肿瘤性疾病的理论基础
NDV显示对肿瘤细胞的选择性杀伤作用
新城疫病毒对多种人肿瘤细胞具有选择性细胞毒作用，而对绝大多数正常人细胞的作用明显趋弱。在差异细胞毒试验中发现，源于肾癌、胰腺癌、肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、结肠癌、前列腺癌、小细胞和非小细胞肺癌以及成胶质细胞瘤的人肿瘤细胞对NDV较很多正常人细胞【肾上皮细胞、成纤维细胞、角化细胞、黑色素细胞以及上皮细胞(见实施例1)】敏感3-4个数量级。差异细胞毒试验还可用以新鲜分离患者细胞或肿瘤组织。
实施例1描述了用以界定NDV肿瘤杀伤活性的体外试验。试验测定了杀伤50％在5天内培养的试验细胞所需的病毒量。实施例2和3显示了体内试验的结果，试验中，病毒通过瘤体内(实施例2)或静脉内(实施例3)途径给予携带人肿瘤异种移植物的无胸腺小鼠。结果显示，在检测化疗药物潜力的标准动物模型中，NDV可以使多种类型的人类肿瘤消退。
应用病毒抗原免疫组化染色显示了NDV在肿瘤中特异性复制的证据(实施例2)。瘤体内注射病毒30分钟内，病毒抗原在肿瘤组织中呈现阴性。但治疗2天后，肿瘤内加强免疫染色可以看见病毒抗原，提示病毒在肿瘤内复制。重要的是，病毒在肿瘤组织内特异性复制，因为与肿瘤邻近的结缔组织和皮肤，病毒抗原呈阴性。
重要的是，如应用UV灭活的非克隆病毒进行的研究所示(Lorence，R.等，1994，国立癌症研究所杂志，86：1228-1233)，NDV的有效复制对于病毒杀伤感染细胞至关重要。
NDV瘤体内或静脉内给予后还可导致巨大肿瘤的消退(实施例4-9)。无胸腺小鼠瘤体内NDV治疗巨大皮内A375人类黑色素瘤异种移植物(最大径≥10mm；肿瘤体积≥300mm3)导致肿瘤的高消退率(实施例4-8)。无胸腺小鼠静脉内NDV治疗巨大皮下HT1080人类纤维肉瘤异种移植物(最大径≥10mm)，结果在6只小鼠中有5只发生了肿瘤完全或部分消退(实施例9)。
细胞因子I类干扰素家族是病毒感染的重要负性调节因子
I类干扰素包括主要从原始造血细胞中发现的α干扰素和主要从成纤维细胞和上皮细胞中发现的β干扰素。【Joklik，W.K.1990，干扰素，383-410页。病毒学，第2版，B.N.Fields，D.M.Knipe等编辑，Raven出版有限公司，纽约；以及Sreevalsan，T.1995，应用α和β干扰素进行生物治疗：临床预试验研究，347-364页。癌症的生物治疗，第2版，V.T.DeVita，Jr.，S.Hellman，和S.A.Rosenberg，J.B.LiPPincott公司，费城。】两种类型的干扰素通过基本相同的作用机制发挥功能，包括降解病毒复制的中间产物双链RNA，抑制通过双链RNA激活的蛋白激酶的活性，从而抑制细胞翻译(Joklik，W.K.1990，干扰素，383-410页。病毒学，第2版，B.N.Fields，D.M.Knipe等编辑，Raven出版有限公司，纽约；以及该书引用的参考文献)。其他几种病毒(流感病毒，EB病毒，SV40，腺病毒，痘苗)通过一个或多个途径抑制干扰素系统的机制，也使病毒可以有效复制(Katze，M.G.，1995，微生物趋势，3：75-78)。
多种肿瘤细胞缺乏通过干扰素依赖机制限制病毒感染的能力
人宫颈癌细胞(HeLa)在用干扰素预处理后，对疱疹性口炎病毒复制的抑制敏感性较未转化的成纤维对照细胞系弱300多倍(Maheshwari R.K.，1983，生物化学与生物物理学研究评论，17：161-168)。本专利发明人发现，感染共同培养的致瘤性人头颈部肿瘤细胞(KB)和正常人皮肤成纤维细胞(CCD922-sk)，结果显示开始时病毒在两种细胞内均有复制，然后，在正常细胞内感染受到限制，而在肿瘤细胞中，病毒持续复制，并杀伤肿瘤细胞(实施例10)。而且，尽管正常细胞向培养基中分泌干扰素，但在建立的抗病毒状态下，肿瘤细胞在产生的浓度下对干扰素无反应。通过两个分离的试验，获得了干扰素在NDV杀伤肿瘤细胞和正常细胞不同敏感性中所起作用的进一步证据，在所述试验中，正常成纤维细胞(CCD922-sk)或正常上皮角化细胞(NHEK)在干扰素中和抗体存在的情况下，对NDV感染变得更加敏感(实施例11和12)。最后，在干扰素存在的情况下，平行感染正常成纤维细胞(CCD922-sk)和人肿瘤细胞(KB)，结果发现，正常细胞对添加的干扰素的抗病毒作用较之肿瘤细胞敏感至少100倍(实施例13和14)。多个肿瘤细胞系(总共9个)的相似测试发现，细胞系对NDV的杀伤相对敏感性与该细胞系对干扰素介导的抗病毒应答无能之间存在清晰的相互关联(实施例26)。
干扰素和细胞生长
目前存在几种类型的干扰素(IFN)，包括天然和重组形式的α干扰素、β干扰素、ω干扰素和γ干扰素，以及合成同质形式的干扰素(如，Zhang等(1996)癌症基因治疗，3：31-38所述)。除了导致其被发现的抗病毒活性，众所周知，干扰素在细胞生长和分化的自然调节中起重要作用。干扰素被认为是一种负性生长调节因子，几种参与干扰素活性功能发挥和调节的关键蛋白质业已显示在正常细胞中作为肿瘤抑制蛋白存在(Tanaka等，1994，细胞，77：829-839)。而且，其他几种拮抗干扰素抗病毒活性的蛋白质业已显示，在表达不当时，具有致瘤潜力(见下，Barber，GN，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：4278-4282)。源于多种人类癌症的细胞业已显示编码干扰素的基因缺失(James，CD等，癌症研究，51：1684-1688)，并且在人宫颈癌(Petricoin，E等，1994，分子细胞生物学，14：1477-1486)、慢性淋巴细胞性白血病(Xu，B等，1994，血液，84：1942-1949)、和恶性黑色素瘤细胞(Linge，C.等，1995，癌症研究，55：4099-4104)中观察到干扰素功能的部分或完全丧失。
业已显示，干扰素诱导性激酶(p68，PKR)是一种细胞和病毒蛋白合成的重要调节因子。将p68激酶的表达与活性和细胞分化状态联系起来的相互关系业已显见。因此，分化不好的细胞，如那些在许多癌症中发现的细胞，往往有p68功能的缺陷(Haines，G.K.等，1993，Virchows Arch B CeU Pathol.，63：289-95)。缺乏p68活性的细胞通常对病毒介导的杀伤敏感，因为p68激酶是干扰素诱导的抗病毒状态的一种重要效应物质。p68的抗病毒活性可以通过与被定义为p58的细胞蛋白直接作用而被拮抗。当在NIH3T3细胞中克隆并过量表达时，p58可使细胞表现转化表型并呈非锚定依赖型生长(BarberGN等，1994，Proc Natl Acad Sci USA，91：4278-4282)，并且很多人白血病细胞系业已显示过量表达p58(Korth MJ等，1996，基因，170：181-188)。p68激酶活性还可被Ras蛋白拮抗。表达突变、激活形式Ras的细胞显示，不能通过双链RNA激活p68激酶(Mundshau，L.J.，和Faller，D.V.，1992，生物化学杂志，267：23092-23098)。
未分化细胞对病毒杀伤的敏感性可通过给予分化程度高的表型而逆转(Kalvakolanu，DVR和Sen，G.C.1993，Proc Natl Acad SciUSA，90：3167-3171)。
                     定义
具有干扰素介导的抗病毒应答能力的细胞。这里应用的术语“具有干扰素介导的抗病毒应答能力的细胞”是指对低水平(如，10单位/ml)外源性干扰素有反应的细胞，所述反应是指相对于没有干扰素存在的情况，干扰素敏感性病毒的复制能力显著下降(至少10倍，更优选至少100倍，更优选至少1000倍，最优选至少10,000倍)。病毒复制的程度通过检测病毒量来测定(如，感染病毒，病毒抗原，病毒核酸)。正常成纤维细胞CCD922是具有干扰素介导的抗病毒应答能力的细胞。
干扰素介导的抗病毒应答缺陷细胞。这里应用的术语“干扰素介导的抗病毒应答缺陷细胞”是指不符合上述具有干扰素介导的抗病毒应答能力的细胞标准的细胞，即，这些细胞对低水平(如，10单位/ml)外源性干扰素无反应，所述反应是指相对于没有干扰素存在的情况，干扰素敏感性病毒的复制能力显著下降。口腔肿瘤细胞KB是干扰素介导的抗病毒应答缺陷细胞。
克隆的。应用的术语“克隆的”病毒定义为从单个感染病毒颗粒获得的病毒，并且单独的分子克隆具有显著的核酸序列同源性。例如，序列同源是指在病毒中选取至少8个单独的分子克隆，在300个以上相邻核苷酸范围内，序列特异性高于95％，更优选高于97％，更优选高于99％，最优选为100％。
细胞致死性。这里应用的术语“细胞致死性”病毒是指能够感染细胞并导致细胞死亡的病毒。
脱敏。这里应用的词组脱敏是指应用一种制剂进行预处理，以减轻病毒给予引起的副作用。
脱敏剂量。这里应用的词组“脱敏剂量”是指为减轻随后给予病毒引起的副作用而需要的病毒量。
差异细胞毒试验。这里应用的词组“差异细胞毒试验”是应用病毒筛查肿瘤细胞或组织，指a)病毒感染肿瘤细胞以及一种或多种对照细胞或组织；b)在感染一天或多天以后，测定每个样本的细胞存活力或死亡量(如，实施例1详细描述的应用染色指示剂测定细胞的活力)；以及c)根据结果，就可以估计样本相对于对照组对病毒的敏感性(如，实施例1详细描述的IC50测定)。
感染肿瘤。这里应用的术语“感染肿瘤”是指将病毒核酸给予肿瘤细胞或组织。
干扰素敏感。这里应用的词组“干扰素敏感”病毒(如NDV)是指相对于无干扰素的情况，在有干扰素存在的情况下，复制能力显著减弱(至少减弱10倍，优选至少减弱100倍，更优选至少减弱1000倍，最优选至少减弱10,000倍)的病毒。在有或无低水平外源性干扰素(如10单位/ml)的情况下，收获具有干扰素介导的抗病毒应答能力的细胞中的病毒，通过检测病毒量(如感染病毒，病毒抗原，病毒核酸)来确定上述病毒复制能力。
干扰素反应性。这里应用的词组“干扰素反应性”病毒(如NDV)是指在1.0moi(多样性感染)感染后的病毒，在经500单位/ml外源性α干扰素持续预处理24小时的细胞表达的病毒抗原，较未处理细胞至少少50％。测定是在感染后至少24小时，具有干扰素介导的抗病毒应答能力的细胞中进行的，并且，在第1天，就会检测到病毒抗原表达50％的下降。
肿瘤和肿瘤性疾病。这里应用的“肿瘤”是指新生的组织，包括肿瘤、良性生长(如湿疣，乳头瘤)和恶性生长(如癌症)。这里应用的“肿瘤性疾病”是指表现为肿瘤的疾病。
具有复制能力。这里应用的术语“具有复制能力”的病毒是指在肿瘤细胞中可以产生感染后代的病毒。
基本无污染鸡卵蛋白。术语“基本无污染鸡卵蛋白”是指病毒纯度的水平，这里本领域的技术人员应用Western印迹法检测不到卵白蛋白，所述方法包括1)每孔(宽3.3cm)病毒量为1.7×109PFU，进行SDS-PAGE(十二烷基硫代硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶(厚1mm)；2)将病毒蛋白从凝胶转移到硝化纤维膜上；以及3)应用兔抗卵白蛋白抗体【兔IgG片段，将4mg/ml抗体浓度(购自Cappel公司)1∶200稀释，或多克隆抗体等价物】进行卵白蛋白的免疫染色，以及，更优选，应用敏感度为2.4ng/ml的电化学发光试验检测不到卵白蛋白。
治疗有效剂量。这里应用的术语“治疗有效剂量”是指在治疗肿瘤性疾病时，可以产生预期效应，如肿瘤生长停止、肿瘤消退、临床病情改善或存活增加的病毒数量。
                     本发明化合物
多组病毒被用来选择性杀伤肿瘤细胞。自然存在的或工程学生产的病毒均可作为抗肿瘤剂发挥作用。这些病毒i)感染肿瘤细胞导致其死亡；ii)在肿瘤细胞内具有复制能力；以及iii)由于干扰素的抗病毒效应，在正常细胞中的杀伤作用受限。
在本发明的一个优选实施方案中，具有上述三种特征【(i)感染肿瘤细胞导致其死亡；(ii)在肿瘤细胞内具有复制能力；以及(iii)由于干扰素的抗病毒效应，在正常细胞中的杀伤作用受限】的病毒也可诱导干扰素。
在本发明的另一个优选实施方案中，具有上述三种特征的病毒也可导致人类肿瘤的消退；和/或在靶定人群中，不会由于已经存在的免疫而被中和。
在另一个优选实施方案中，具有上述三种特征的病毒对肿瘤细胞来说，是细胞致死性的。
根据本发明，副粘病毒(这里应用的“副粘病毒”指副粘病毒科中的一员)可用来治疗肿瘤，包括巨大肿瘤或宿主肿瘤负荷大。副粘病毒科科包括三类：(1)副粘病毒；(2)麻疹样病毒(麻疹病毒)；以及(3)呼吸道合胞病毒(肺病毒)。这些病毒含有RNA基因组。应用细胞致死性副粘病毒科病毒，特别是副粘病毒，如新城疫病毒(“NDV”)和其他禽类副粘病毒如II型禽类副粘病毒，是实践本发明的优选方法。根据本发明，这些病毒的减毒株在肿瘤治疗中特别有用。
根据本发明，NDV是一种特别优选的病毒。根据其对鸡和鸡胚的影响，NDV可分为不同的三型。“低毒力”株又称为lentogenic，是指在最低致死剂量(MLD)下需要90-150小时杀死鸡胚；“中等毒力”株又称为mesogenic，是指在MLD下需要60-90小时杀死鸡胚；“高毒力”株又称为velogenic，是指在MLD下需要40-60小时杀死鸡胚。见如Hanson和Brandly，1955(科学，122：156-157)；以及Dardiri等，1961(Am.J.Vet.Res.，918-920)。这三型病毒都可应用，优选NDV的中等毒力株，如MK107株，NJ Roakin株和Connecticut-70726株(见实施例21-23)。其他中等毒力株明细单见如Schloer和Hanson，1968(病毒学杂志，2：40-47)。
为了某种目的，希望通过去除缺陷的干扰颗粒获得克隆病毒以保证或增加某一病毒株的遗传同质性。通过克隆的方法去除缺陷的干扰颗粒可以增加终产物的纯度，该纯度通过每感染颗粒中病毒颗粒的总数(如颗粒数/PFU)来评价。
技术人员可利用任何可行的方法生产克隆病毒。如噬斑纯化法是获得克隆病毒的常规方法。见如Maassab等，Plotkin和Mortimer编辑，疫苗，费城：W.B.Saunders公司，1994，781-801页。特别推荐三重噬斑纯化法，该方法在每轮纯化过程中选择一块符合预期特征的平板，如优选的大小、形状、外观或代表亲本株。生产克隆病毒的其他方法可应用本领域技术人员熟知的重组DNA技术。生产克隆病毒的另一种方法是应用限制稀释技术(如将病毒样本稀释液加入含单层易感细胞的微孔板内，并使每孔平均感染病毒颗粒数等于或少于1)。
在本发明的一个优选实施方案中，纯化病毒被用来治疗肿瘤性疾病。下面给出了纯化鸡卵获得性病毒的优选方法(在这些方法的任何步骤中，病毒都没有聚集呈颗粒状)。
纯化方法A
a)生产克隆病毒(如噬斑纯化法)
b)用克隆病毒接种鸡卵
c)孵育鸡卵
d)冷藏鸡卵
e)从鸡卵中收获尿囊液
f)从尿囊液中去除细胞残留
g)用无沉淀超速离心法离心尿囊液(如用不连续蔗糖梯度超速离心法)
在本发明的另一个实施方案中，在超速离心之前和(从尿囊液)中去除细胞残留之前，增加了一些步骤，包括：
●冷冻然后解冻尿囊液
●从病毒悬液中去除污染物质(如通过离心的方法)
在本发明的另一个实施方案中，超速离心是通过连续层流超速离心法完成的。
本发明的一个实施方案涉及纯化具有复制能力的RNA病毒的方法，包括的步骤：
a)生产克隆病毒，以及b)通过无沉淀超速离心法纯化所述克隆病毒。
本发明的另一个实施方案涉及纯化副粘病毒(如NDV)的方法，包括应用无沉淀超速离心法纯化病毒。在超速离心之前，可以任选的其他纯化步骤包括：
a)噬斑纯化生产克隆病毒，
b)用克隆病毒接种鸡卵，
c)孵育鸡卵，
d)冷藏鸡卵，
e)从鸡卵中收获尿囊液，以及
f)从尿囊液中去除细胞残留。
本发明的另一个实施方案涉及从鸡卵或细胞培养液中纯化具有复制能力的克隆病毒的方法，包括超速离心的步骤，但不包括产生病毒沉淀颗粒的步骤(实施例31)。
本发明的另一个实施方案涉及纯化副粘病毒(如NDV)的方法，包括应用连续切线层流过滤法(TFF)纯化病毒。还可任选另外的凝胶渗透层析纯化病毒，其中，所述每一步骤均在稳定缓冲液的存在下完成(实施例15)：
a)噬斑纯化生产克隆病毒，
b)用克隆病毒接种鸡卵，
c)孵育鸡卵，
d)冷藏鸡卵，
e)从鸡卵中收获尿囊液并用缓冲液稀释尿囊液，
f)通过TFF从尿囊液中去除细胞残留
g)通过TFF纯化病毒
h)通过凝胶渗透层析纯化病毒
通过凝胶渗透层析收获的病毒还可任选应用TFF浓缩。
本发明的另一个实施方案涉及从鸡卵或细胞培养液中纯化具有复制能力的克隆病毒的方法，包括应用连续切线层流过滤法(TFF)纯化病毒，之后任选凝胶渗透层析，层析后也可任选TFF浓缩病毒。
克隆病毒
应用这些方法可以将克隆病毒【包括副粘病毒(如NDV)】纯化至至少2×109PFU/mg蛋白质，优选至少3×109PFU/mg蛋白质，更优选至少5×109PFU/mg蛋白质，更优选至少1.0×1010PFU/mg蛋白质，更优选至少2.0×1010PFU/mg蛋白质，更优选至少3×1010PFU/mg蛋白质，更优选至少4×1010PFU/mg蛋白质，更优选至少5×1010PFU/mg蛋白质，最优选至少6×1010PFU/mg蛋白质。
应用这些方法可以将克隆病毒【包括副粘病毒(如NDV)】纯化至某一水平，在该水平，每PFU病毒颗粒数少于10，更优选少于5，更优选少于3，更优选少于2，最优选少于1.2。(每PFU病毒颗粒数低代表纯度高)。
RNA病毒
在另一个实施方案中，这些方法可以纯化(至上述克隆病毒水平)RNA病毒【包括(a)细胞致死性RNA病毒；(b)未分段、无包膜的单链RNA病毒；(c)有片段、有包膜的单链RNA病毒；(d)有片段、无包膜的双链RNA病毒；(e)以及未分段、有包膜的单链RNA病毒(如副粘病毒(如NDV)以及如逆转录病毒)】。
DNA病毒
在另一个实施方案中，这些方法可以纯化(至上述克隆病毒水平)干扰素敏感性细胞致死性病毒，所述病毒选自(a)有包膜的双链DNA病毒(包括痘病毒)；(b)无包膜的单链DNA病毒；以及(c)无包膜的双链DNA病毒。
鸡卵获得性病毒
在另一个实施方案中，这些方法可以将鸡卵获得性病毒纯化至基本不含污染鸡卵蛋白的水平。在人类治疗性应用的病毒制剂中，优选限制鸡卵蛋白量，因为大部分鸡卵蛋白如卵白蛋白是致敏原。
                       × × × ×
表1显示了用于治疗包括癌症在内的肿瘤性疾病的病毒。在“Murphy A和Kingsbury DW，1990，病毒学，第2版(Ed.Fields，B.N.)，Raven出版社，纽约”中可以发现其他病毒科成员的实例，在此全文引入。任选这些病毒筛查自然发生的变异(特定病毒株和分离株)，所述变异导致变异病毒株与亲本病毒株在干扰素产生方面不同。
在本发明另一个实施方案中，对无论自然发生还是工程学生产的备选病毒，在肿瘤治疗方面，均进行了治疗能力的检测。在一个实施方案中，比较了杀伤50％干扰素介导的抗病毒应答缺陷性细胞，如头颈部肿瘤细胞KB所需的备选病毒量和杀伤50％相同数量的具有干扰素介导的抗病毒应答能力的细胞，如正常皮肤成纤维细胞所需的病毒量。杀伤量可以应用包括台盼兰排除法或MTT试验的任一方法进行定量(见实施例1)。杀伤干扰素介导的抗病毒应答缺陷性细胞所需病毒量较杀伤具有干扰素介导的抗病毒应答能力的细胞所需病毒量显著减少(如至少5倍)，说明受检病毒具有肿瘤治疗所需的治疗能力。其他NDV病毒和新培斯病毒就是具有肿瘤选择性杀伤能力的自然发生的病毒(见实施例21-23，和25)。
      表1.用于癌症治疗的自然发生的病毒
病毒分类 病毒科 病毒实例
RNA，反义链 副粘病毒科 新城疫病毒
II型禽类副粘病毒
麻疹病毒
流行性腮腺炎病毒
人副流感病毒
正粘病毒科 流感病毒
棒状病毒科 疱疹性口炎病毒
RNA，正义链 披膜病毒 新培斯病毒
塞姆利基森林病毒
黄病毒科 黄热病病毒(减毒)
细小核糖核酸病毒 鼻病毒
牛肠病毒
冠状病毒科 禽感染性支气管炎病毒
人冠状病毒
RNA，双链 呼肠病毒科 呼肠病毒
轮状病毒
DNA 痘病毒科 痘苗病毒
疱疹病毒科 I型单纯疱疹病毒
了解在抗病毒状态建立时涉及的因子可以创建筛查可能对病毒治疗发生反应的肿瘤的方法。原则上，可以筛查通过活检获得的患者肿瘤组织p68激酶、p58或其他与抗病毒状态或细胞分化调节有关的因子的表达。其他因子包括但不限于干扰素反应因子-1(IRF-1)，干扰素刺激基因因子-3(ISGF-3)，c-Myc，c-Myb和干扰素受体。如果c-Myc，c-Myb或p58高水平表达，表示肿瘤组织或细胞可备选用于病毒治疗。如果，IRF-1，ISGF-3和干扰素受体低水平表达，表示肿瘤组织或细胞可备选用于病毒治疗。
至少30％的人类肿瘤具有激活的Ras表型特征(Bos，J.L.，1989，癌症研究，49：4682)。Ras表型的激活可由于下述原因导致，i)突变激活Ras蛋白表达，ii)野生型Ras蛋白高表达，或iii)酪氨酸激酶受体或其他Ras信号途径成员如Grb2或Sos不受调控的表达。具有激活Ras表型的细胞较没有激活Ras表型的相同细胞，对NDV(Lorence，R.M.等，1994，癌症研究，54：6017-6021)和呼肠病毒(Strong，J.E.S.等，1998，EMBO，17：3351-3362)的杀伤更加敏感。激活的Ras业已显示可以抑制干扰素诱导的反应基因(Zullo，J.N.和Faller，D.V.，1988，分子细胞生物学，8：5080-5085)和dsRNA诱导的PKR活化(Mundschau，L.J.和Faller，D.V.，1992，生物化学杂志，267：23092-23098)。设定PKR在干扰素介导的抗病毒应答的诱导过程中起关键作用，具有激活Ras表型的细胞对NDV和呼肠病毒的杀伤敏感性增强，这一事实为利用本发明病毒选择性杀伤干扰素介导的抗病毒应答缺陷性细胞提供了更多的证据。
通过活检获得的患者肿瘤组织可用来筛查i)激活的Ras蛋白，ii)Ras的GTP结合片段(活性形式)，iii)MAPK的活性形式(如ERK1或ERK2)，或其他Ras途径激活指示物质的表达。患者标本激活Ras表型的存在提示肿瘤组织可备选病毒治疗。
本发明的另一个实施方案，将活检获得的患者原代肿瘤组织或细胞培养扩增，然后测定对适宜病毒疗法的杀伤敏感性。在一个实施方案中，如上述，比较了杀伤50％肿瘤组织培养细胞所需的病毒量和杀伤50％正常培养细胞所需的病毒量，用以筛选备选病毒。肿瘤细胞对病毒制剂的杀伤敏感性较正常细胞高10倍或以上，说明该肿瘤细胞对病毒治疗的细胞致死性效应特别敏感。在本发明的一个进一步实施方案中，还测定了靶肿瘤细胞对内源性或外源添加的干扰素(应用α或β干扰素，如10单位/ml，见实施例27)的反应能力，测定方法是在干扰素存在的情况下，进行上述筛选。
理解病毒粘附或进入所需的细胞受体，可以进一步筛查受体高表达从而对干扰素敏感性病毒更加敏感的肿瘤。这是对可能对病毒治疗有反应的患者进行的另一水平筛查。优选应用干扰素敏感性病毒进行治疗，患者的肿瘤可能对干扰素有耐药性，同时高表达病毒的细胞受体。原则上，患者的血清、肿瘤细胞、组织或组织切片均应通过免疫试验或免疫染色的方法筛查血清、肿瘤细胞或肿瘤组织上的病毒受体量。例如，新培斯病毒就是通过高亲和力的层粘连蛋白受体感染哺乳动物细胞(Wang等，1992，病毒学杂志，66：4992-5001)。现已得知，这种受体在多种转移癌上大量表达。这种高亲和力的层粘连蛋白受体mRNA在胰腺癌细胞系Panc-1和结肠腺癌细胞系SW620上表达水平很高(Campo等，1992，美国病理学杂志，141：107301983；Yow等，(1988)Proc.Natl Acad Sci，85，6394-6398)，而且这两种细胞对新培斯病毒表达高度敏感(实施例25)。相反，直肠腺癌细胞系SW1463表达的高亲和力层粘连蛋白受体mRNA水平很低(Yow等，(1988)Proc.Natl Acad Sci，85，6394-6398)，对PPSINDBIS-Ar339的杀伤耐受性较SW620细胞高4个数量级。
筛查或工程学合成了在正常细胞中对干扰素反应不同(如，优选对干扰素反应增强)的现存NDV，或其他病毒，包括RNA和DNA病毒。除了具有对干扰素很强的反应能力，还筛查了其他病毒特征，或通过工程学手段，将其他病毒特征给予病毒。受体特异性发生改变(如新培斯病毒PPSINDBIS-Ar339，见实施例25)或神经毒性降低的病毒也包括在本发明内(如NDV病毒PPNJROAKIN，见实施例24)。本发明优选具有通过细胞直接接触进行传播能力的病毒。
这里描述的本发明包括很宽泛的病毒类型(见表1)，所述病毒通过与NDV很相似的方式用于肿瘤治疗。另外，由于在正常细胞中抑制干扰素反应的机制存在，一些不宜应用的天然病毒可以任选工程学手段来规避上述限制。如果不经修饰，具有抑制干扰素反应机制的病毒对正常细胞的毒性较那些去除了该机制的病毒大。本发明提供(1)易于操作的载体的研发；以及(2)创建一系列治疗病毒。操作包括添加干扰素基因，使病毒转基因表达干扰素或其他干扰素反应途径激活因子。其他的改变还包括利用工程学手段表达前药激活酶，如疱疹病毒胸腺嘧啶脱氧核苷激酶或胞嘧啶脱胺酶(Blaese RM等，1994，欧洲癌症杂志，30A：1190-1193)，以及表达适宜的标记抗原，使免疫系统可以瞄准肿瘤细胞。另外的改变包括应用工程学手段使之表达靶细胞携带的这些受体的配体【如，一些病毒感染靶细胞，就表达这些病毒的受体(见Mebastsion等，1997，细胞，90：841-847；以及Schnell MJ等，1997，细胞，90：849-857)】。
除了上述的一种新城疫病毒，还有几种新城疫病毒株显示可以选择性杀伤肿瘤细胞。在应用第二株中等毒力的新城疫病毒进行差异细胞毒试验中发现，对该病毒的杀伤，肿瘤细胞较正常细胞敏感3个数量级(实施例21)。另外，在应用第三株中等毒力的新城疫病毒进行差异细胞毒试验中发现，对该病毒的杀伤，肿瘤细胞较正常细胞敏感80-5000倍(实施例22)。将这两种中等毒力的新城疫病毒直接给予携带人肿瘤异种移植物的无胸腺小鼠肿瘤瘤体后，可导致肿瘤生长消退(实施例23)。
在分离的实验中，通过给具有免疫能力的无胸腺小鼠脑内接种，分别研究了这三种不同新城疫病毒的安全性。研究结果显示，具有完整免疫系统的小鼠可以很好地耐受这三种病毒。无胸腺小鼠脑内接种揭示，其中一种病毒的耐受性显著优于其他两种(实施例24)。这些结果显示，在单一的病毒科中，可以存在病毒特性的重要差异，并可在治疗方面开发，使其具有更好的疗效和更高的安全性。
应用溶瘤细胞性病毒治疗后，另一种提高疗效、减低毒性的方法是使用干扰素敏感性病毒，这需要肿瘤细胞优选表达特定的细胞表面受体。Sinbdis病毒为这种限制提供了一个实例。新培斯病毒通过高亲和力层粘连蛋白受体哺乳动物细胞(Wang等，(1992)病毒学杂志，66：4992-5001)。在差异细胞毒试验中，当正常细胞和肿瘤细胞同时感染新培斯病毒时发现，致瘤性和表达高亲和力层粘连蛋白受体的细胞对该病毒的杀伤较其他细胞更敏感(实施例25)。在该试验中，表达高亲和力层粘连蛋白受体的正常角化细胞(Hand等，(1985)癌症研究，45：2713-2719)对新培斯病毒的杀伤具有耐受性。而且，对正常角化细胞和两种不同肿瘤细胞系的干扰素敏感性和层粘连蛋白受体表达水平的分析发现，PPSINDBIS-Ar339选择性杀伤肿瘤细胞，所述肿瘤细胞i)对干扰素介导的抗病毒应答有缺陷，并且ii)表达高亲和力层粘连蛋白受体。
在皮下携带腺癌细胞SW620的无胸腺小鼠的体内试验发现，PPSINDBIS-Ar339具有很强的肿瘤生长抑制作用(实施例32)。
疱疹性口炎病毒(VSV)为溶瘤细胞性病毒选择性杀伤肿瘤的一般假说提供了证据，该假说是指肿瘤细胞对干扰素反应的固有性缺陷致使这些细胞对具有复制能力的干扰素敏感性病毒的杀伤作用敏感。在有外源性干扰素存在的情况下，应用VSV感染人非致瘤性细胞WISH和致瘤性细胞HT1080或KB，结果致瘤性细胞被选择性杀伤(实施例26)。其他证据在实施例33中提供。在该实施例中，两种不相关病毒在感染肿瘤细胞系是，表现了基本相同的行为。该细胞系对这两种病毒的相似反应显示，这两种不相关病毒在该肿瘤细胞系中的生长受相似机制的控制。
下面列出了病毒明细单，这些病毒经除去自然发生的抗干扰素活性修饰后，可用于病毒癌症治疗(见表2)。内源性抗干扰素活性被摧毁或减弱的修饰病毒(优选但非必须，除抗干扰素外还有减毒修饰，见表3)可用于癌症治疗。该明细列表包括但不限于下述病毒。由于同一类型的病毒间具有相似性，下面列出的每种特定病毒已经鉴定的机制，也存在于该类病毒的其他成员中，表现为相同或功能类似的机制。更宽泛的病毒组在圆括号内添加。通过任何方法，包括自然发生的突变，以及应用工程学手段去除或点突变获得的如下具有抗干扰素活性功能丧失的病毒，可用于本发明的方法。
特别优选自然发生或通过工程学手段获得的较野生型病毒生长率生长缓慢的分离病毒株，因为病毒生长缓慢，可以在病毒复制杀伤细胞或细胞群之前，使具有干扰素反应能力的细胞或细胞群建立有效的抗病毒状态。
本发明还包括，作为病毒特征的特定改变，病毒抗干扰素活性无能导致感染细胞干扰素反应的增强，但病毒仍可在肿瘤细胞中复制。
表2显示了应用工程学手段去除抗干扰素活性的现存病毒。
表3列举了应用工程学手段使毒性减弱的病毒。
               表2.应用工程学手段去除抗干扰素活性的现存病毒
病毒种类 病毒科 病毒 抗干扰素活性 参考文献
RNA 呼肠病毒科 呼肠病毒 ω-3 Imani和Jacobs(1988)Proc NatlAcad Sci USA，85：7887-7891
DNA 痘病毒科 痘苗病毒 K3L Beattle等，(1991)病毒学，183-419
E3L Beattle等，(1996)病毒基因，12：89-94
B18R Symons等，(1995)细胞，81：551-560
腺病毒科 多种亚型 VA-1转录本 Mathews和Shenk(1991)病毒学杂志，64：5657-5662
α疱疹病毒科 HSV-1 γ34.5基因产物 Cho等(1996)Proc Natl Acad SciUSA，92：10516-10520
                        表3.筛选病毒中目前所知的减毒突变
病毒种类 病毒科 病毒 减毒 参考文献
RNA 呼肠病毒科 呼肠病毒 ω-1 Springs和Fields(1982)自然，297：68-70
轮状病毒 牛病毒株(WC3) Clark(1988)感染性疾病杂志，158：570-587
披膜病毒科 新培斯病毒 减毒突变存在于在E1和E2编码区 Polo和Johnston(1990)病毒学杂志，64：4438-4444
DNA 痘病毒科 痘苗病毒 痘苗生长因子 Buller等(1985)病毒学，164：182
胸腺嘧啶脱氧核苷激酶 Buller等(1985)自然，317：813-815
胸苷酸激酶 Hughes SJ等(1991)生物化学杂志，266：20103-20109
DNA连接酶 Kerr等(1991)EMBO杂志，10：4343-4350
核苷酸还原酶 Child等(1990)病毒学，174：625-629
dUTP酶 Perkus等(1991)病毒学，180：406-410
腺病毒科 多种亚型 Ad-4，Ad-7以及Ad-21 Takafugi等(1979)感染性疾病杂志，140：48-53
α疱疹病毒科 HSV-1 胸腺嘧啶脱氧核苷激酶 Field和Wildy(1978)卫生学杂志，81：267-277
核苷酸还原酶 Goldstein和Weller(1988)病毒学，166：41-51
γ34.5基因产物 Chou等(1995)Proc Natl AcadSci USA，92：10516-10520
b’a’c’倒转重复 Meigner等(1988)感染性疾病杂志，162：313-322
                 肿瘤治疗
本发明涉及肿瘤的病毒治疗，特别是患有癌症的动物。在一个优选实施方案中，本发明涉及最大径测量大小≥1厘米(cm)的肿瘤的治疗。肿瘤应用的“1cm肿瘤”是指肿瘤至少一个径的长度为1cm。这种肿瘤对病毒治疗较预期更加敏感，较之更小的肿瘤，如果对病毒不是更加敏感，通常也与之相同。本发明更优选的一个方面，是治疗超过1cm的肿瘤，如≥2cm的肿瘤，2-5cm的肿瘤，以及超过5cm的肿瘤。
本发明还可用来治疗肿瘤负荷高的宿主。这里应用的词组“肿瘤负荷”是指机体内肿瘤的总量，用体重的百分比表示。对于肿瘤负荷约为总体重1％-2％的宿主，病毒治疗惊人的有效，如导致肿瘤消退或肿瘤总负荷的降低。这一点原来根本没有想到，因为肿瘤负荷约为总体重2％(如一个60公斤的人将有一个1公斤的肿瘤)，几乎是生命可以承受的最大瘤体。见如Cotran等，罗宾逊疾病病理学基础，第4版，WB Saunders，1989，252页。在实施例中，携带体积高达397mm3黑色素瘤(如A375)的小鼠宿主，在用新城疫病毒(如经三重噬斑纯化的病毒)治疗后，显示了完全消退反应。设定1000mm3的组织重量相当于1克，体积为397mm3的肿瘤大约相对于一只20克小鼠总体重的2％。
如下实施例4-9所示，大小至少1cm的肿瘤治疗后获得了消退，而未治疗的对照动物却在数周内死于肿瘤。但是，尽管两周内就会死亡，这些患病动物还是得到成功救治。因此，根据本发明，一个处于肿瘤终末期的动物可以应用病毒疗法有效治疗。因而，本发明可被用来治疗对传统疗法无反应的患者，所述传统疗法如化疗，如氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶，和放疗。
还检测了NDV通过腹膜内给药治疗肿瘤的疗效。应用卵巢癌的腹水预防模型，给携带ES-2人卵巢癌的小鼠腹膜内注射NDV，结果发现，较之用生理盐水治疗的小鼠，生存率提高(实施例16)。当ES-2细胞用于腹水阳性模型，应用病毒治疗的动物较之生理盐水处理的对照组，腹水产量明显减少(实施例17)。
在本发明的另一个实施方案中，应用病毒导致1)肿瘤相关性症状的缓解，如但不限于腹水生产率的降低，疼痛的缓解，以及梗阻性疾病的缓解，和2)生命的延长。
52名患者通过静脉途径接受了噬斑纯化的NDV分离病毒株。肿瘤反应包括：5名患者中独立肿瘤的消退；2名患者病情稳定7个月，2名患者5个月，在1名以上的患者中，在3个月时疾病继续发展；疼痛治疗减少(实施例20)。
                     给药方法和制剂
在本发明的一个实施方案中，体外筛查肿瘤细胞或组织以鉴定这些肿瘤患者对病毒治疗是否敏感。从患者患处取出的肿瘤细胞(提取细胞的方法，如实体瘤的细针穿刺或卵巢腹水肿瘤的腹水穿刺法)体外生长并与病毒共同孵育。在本发明的该实施方案中，如果病毒对肿瘤细胞有高活性，这些患者就入选治疗。
在本发明的一个优选实施方案中，给予的病毒量导致肿瘤或多个肿瘤的消退。这里应用的术语“消退”是指肿瘤萎缩，如大小、重量或体积。肿瘤大小的萎缩可用多种方法测定，包括体检，胸片或其他x线检查，超声，CT扫描，MRI或放射性核苷扫描。
根据本发明，包括癌症在内的多种类型的肿瘤都是可以治疗的。本发明的病毒可用于治疗多种癌症，包括但不限于肺癌，乳腺癌，前列腺癌，结肠腺癌，宫颈癌，子宫内膜癌，卵巢癌，膀胱癌，Wilm肿瘤，纤维细胞肉瘤，骨肉瘤，黑色素瘤，恶性滑膜瘤，成神经细胞瘤，淋巴瘤，白血病，脑癌包括成胶质细胞瘤，神经内分泌肿瘤，肾癌，头颈部肿瘤，胃癌，食管癌，女性外阴肿瘤，肉瘤，皮肤癌，甲状腺胰腺癌，以及间皮瘤。本发明病毒还可用于治疗多种良性肿瘤，包括但不限于湿疣，乳头瘤，脑脊膜瘤以及腺瘤。
将治疗有效剂量的病毒给予肿瘤宿主。本领域的技术人员应当理解，给予病毒的剂量由于以下因素而有差异，这些因素包括所选的病毒，肿瘤的类型，肿瘤细胞的生长范围或转移，肿瘤生长的生物位置或机体屏障，病毒株，给药途径，给药时间，给药方式，并鉴定哺乳动物正在接受的其他药物或治疗，如放疗、化疗或手术治疗。这些参数通过最大耐受剂量(MTD)定义，MTD是通过动物模型测定的，并通过相对体表面积或体重功能换算出人用剂量。还应理解，在某些特定情况下，病毒给药会超过1次。病毒多剂量给药的最适间隔时间属于本领域已经掌握的技术，可根据经验决定。NDV通常的给药剂量约为3×106-5×1012PFU病毒。对于局部给药(如直接注入瘤体)，典型应用总量至少为3×106PFU，更优选至少3×107PFU，更优选至少3×108PFU，更优选至少3×109PFU，更优选至少3×1010PFU，更优选至少3×1011PFU，最优选至少5×1012PFU。对于系统给药，应用剂量至少为1×108PFU病毒/m2体表面积，更优选至少为1×109PFU病毒/m2体表面积，更优选至少为5.9×109PFU病毒/m2体表面积，更优选至少为1.2×1010PFU病毒/m2体表面积，更优选至少为4.8×1010PFU病毒/m2体表面积，更优选至少为7.2×1010PFU病毒/m2体表面积，更优选至少为9.6×1010PFU病毒/m2体表面积，最优选至少为3.0×1011PFU病毒/m2体表面积。
对于静脉内给药，给药剂量时间可应用每周一次，每周两次或每周三次。根据本发明的病毒，任选与化疗药物共同应用时，可通过多种途径给药，如经肠道，不经肠道，口服，鼻腔，直肠，胸腔内，静脉内(如应用导管)，皮下，肿瘤瘤体内(如直接给予肿瘤组织或给予供血血管)，围肿瘤，局部，舌下，口腔，局部外用，肌内，吸入给药，经皮，阴道，动脉内，颅内，皮内，硬脑膜外，系统，局部外用，腹膜内，胸膜内，囊内(膀胱癌)等。对于肺癌，可以应用支气管途径(如支气管给药)，皮内途径，或内镜途径。在适宜的情况下，还可应用内镜注射治疗胃肠道肿瘤，以及栓剂治疗直肠肿瘤。
NDV鼠毒性研究显示静脉内给予病毒后的急性毒性反应与细胞因子介导的反应非常相似。众所周知，在首次诱导事件之后，细胞因子对重复刺激的反应下调，或脱敏(Takahashi等，(1991)癌症研究，51：2366-2372)。接受脱敏剂量病毒的小鼠，较接受生理盐水处理的对照小鼠，可以更好地耐受随后给予的大剂量病毒(实施例18)。接受静脉内注射脱敏剂量病毒的小鼠，较在第一次注射时仅接受介质的小鼠，在接受第二次静脉内给药时，可以多耐受大约10倍的病毒。
病毒静脉途径给药的速率可以显著影响其毒性。给两组无胸腺小鼠静脉注射相同剂量的NDV，一组给药较慢(4分钟0.2ml)，一组较快(30秒0.2ml)。比较两组体重减轻最大值发现，缓慢注射组体重减轻较快速注射组少50％(实施例19)。
在临床试验中，患者在一周内接受3次噬斑纯化NDV分离株注射。在这种情况下，首剂脱敏治疗减轻了第二和第三剂相关性毒性，甚至在第二和第三剂比首剂剂量高2-8倍时(实施例20)。实施例18和28显示了这些数据以及在动物研究中获得的相似数据。在临床试验中还进一步发现，在应用小剂量脱敏从而可以应用更高剂量治疗时，肿瘤的消退率也更高(见表19，实施例20)。这与在动物模型试验中获得的数据一致(实施例29)。
应用溶瘤细胞性病毒治疗肿瘤的一个令人关注的问题是体液免疫反应的潜在抑制可能对治疗有所影响。在临床研究中，1个月后仍显示疾病稳定的患者可以进行第二疗程的治疗。因此，第二以及随后疗程的治疗是在存在NDV中和抗体的情况下进行的。但是，在第二疗程给药后，可以在患者的尿中发现感染病毒，并在第二疗程后观察到肿瘤消退，这些现象提供了给予大剂量病毒可以克服中和抗体的作用，并在患者体内发生感染的证据(实施例20)。在本发明的一个优选实施方案中，给予了多疗程病毒治疗。一个疗程的实例包括：给予病毒每周3次，共1周，随后休息3周；给予病毒每周3次，共4周，随后休息2周；给予病毒1剂，随后休息4周；给予病毒每周3次，共6周，随后休息2周。在另一个实施方案中，在给予首剂病毒后，给药病毒2周以上。
在本发明的一个优选实施方案中，在随后给予高剂量之前，先给予一剂脱敏剂。脱敏剂量水平可通过临床毒性指征如低血压、疲劳、肝脏转氨酶升高或其他适宜指标来决定，其中脱敏剂量水平等于或低于单次给药的最大耐受剂量(MTD)。脱敏之后，再给予高于脱敏剂量的病毒。在一个优选实施方案中，随后的病毒剂量等于或大于单次给药的MTD。例如，应用的脱敏剂量至少为1×108PFU/m2，更优选至少3×108PFU/m2，更优选至少1×109PFU/m2，更优选至少5.9×109PFU/m2，最优选至少1.2×1010PFU/m2。脱敏后，应用的再次给予的病毒剂量至少为1×108PFU/m2，更优选至少3×108PFU/m2，更优选至少1×109PFU/m2，更优选至少5.9×109PFU/m2，更优选至少2.4×1010PFU/m2，更优选至少4.8×1010PFU/m2，更优选至少9.6×1010PFU/m2，最优选至少3.0×1011PFU/m2。在另一个实施方案中，脱敏还单独或联合应用了α肿瘤坏死因子，IL-2或其他细胞因子。
给药剂量之间的时间框架包括脱敏剂量和下一次给药之间的时间框架为1-14天，优选1-7天。脱敏剂量可通过多种途径给药，如静脉内，经肠道，不经肠道，口服，鼻腔，直肠，胸腔内，静脉内，皮下，肿瘤瘤体内，围肿瘤，局部，舌下，口腔，局部外用，肌内，吸入给药，皮内，阴道，动脉内，颅内，皮内，硬脑膜外，系统，局部外用，腹膜内，胸膜内，内镜，支气管内等。随后的剂量可通过与脱敏剂量相同的途径给药，或通过任一途径给药，如静脉内，经肠道，不经肠道，口服，鼻腔，直肠，胸腔内，静脉内，皮下，肿瘤瘤体内，围肿瘤，局部，舌下，口腔，局部外用，肌内，吸入给药，皮内，阴道，动脉内，颅内，皮内，硬脑膜外，系统，局部外用，腹膜内，胸膜内，内镜，支气管内等。实施例28显示了应用静脉注射给予脱敏剂，应用其他途径给予随后的剂量。静脉注射脱敏剂量病毒的小鼠较之在第一次注射时仅接受介质的小鼠，在腹膜内给予第二剂量时，可多耐受大约5倍的病毒。
实施例29描述了在临床预试验中，应用脱敏方法可以增加最大耐受剂量，从而使抗肿瘤疗效增加。
任选的，可以序贯或同时应用一种以上的给药途径。同时或序贯给药的途径包括但不限于静脉内，经肠道，不经肠道，口服，鼻腔，直肠，胸腔内，静脉内，皮下，肿瘤瘤体内，围肿瘤，局部，舌下，口腔，局部外用，肌内，吸入给药，皮内，阴道，动脉内，颅内，皮内，硬脑膜外，系统，局部外用，腹膜内，胸膜内，内镜，支气管内等。一个实例就是静脉内给药脱敏剂量，最后腹膜内给予另一剂量。
在本发明的另一个优选实施方案中，病毒通过缓慢注入的方式给予，包括应用静脉泵，泵式注射器，静脉点滴或缓慢注射，注射时程4分钟-24小时，优选20-60分钟。
一种病毒可与任选的一种或多种化疗药物同时注射、分开多次注射或连续注射。病毒可与化疗药(如但不限于：白消安，环磷酰胺，氨甲蝶呤，阿糖胞苷，争光霉素，铂复合物如卡铂或顺铂，阿霉素，氮烯咪胺，gemcitabine，马法兰，巯基嘌呤，长春碱，5-氟尿嘧啶，taxol，和维甲酸)同时、或在化疗药注射之前或之后注射。根据本发明的病毒还可任选与其他治疗联合，包括手术治疗、放疗、化疗(见如，现代医学诊断与治疗，Tierney等编辑，Appleton & Lange，1997，特别是78-94页)、以及生物治疗。病毒可以在给予生物物质之前、同时或之后给予，所述生物物质如(1)其他溶瘤细胞制剂【如但不限于：其中一个基因在前列腺细胞特异性反应元素转录控制下的腺病毒(见RodriqRes，R.等，1997，癌症研究，57：2559-2563)；不编码能够与p53结合的E1b多肽的腺病毒(见Bischoff，J.R.等，1996，科学，274：373-376)；不表达γ34.5功能性基因产物的单纯疱疹病毒(见Mineta，T.等，1995，自然医学，1：938-943)】；(2)细胞因子(如但不限于：集落刺激因子如GM-CSF，肿瘤坏死因子，和白血病介素如IL-1，IL-2，IL-6和IL-10)；(3)病毒载体【如但不限于编码p53的腺病毒(见Zhang，WW等，1994，癌症基因治疗，1：5-13)】；以及(4)癌症疫苗。
在本发明的一个实施方案中，治疗包括应用具有独特抗原的病毒的系列治疗，所述病毒通过干扰素机制具有细胞毒性和肿瘤选择性。该实施方案使病毒治疗可以在没有免疫干扰的情况下延长一段时间。
另一个实施方案涉及应用NDV(或其他病毒)治疗患者，在给予病毒之前、同时或之后应用干扰素(如α干扰素，β干扰素或γ干扰素)。干扰素选自I类(α干扰素，β干扰素和ω干扰素)或II类(γ干扰素)，以及重组干扰素及其类似物，例如Sreevalsoun，T.1995所述(癌症的生物治疗，第2版，V.T.DeVita，Jr.，S.Hellman，和S.A.Rosenberg编辑，J.B.Lippincott公司，费城，347-364页)。对干扰素有反应的正常细胞在应用加强干扰素预处理后，对给予的病毒感染更加安全。干扰素信号途径缺陷性肿瘤细胞则仍然对病毒的杀伤作用敏感。这使我们可以应用更高剂量的病毒进行治疗。干扰素的剂量和给药方案按照有效治疗病毒感染的标准临床规范给予。
在本发明的另一个实施方案中，已知可以影响干扰素反应途径的其他药物也可任选应用，旨在增加肿瘤细胞的敏感性，或增强正常细胞对病毒感染细胞杀伤效应的耐受性。这类药物包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂，西咪替叮和线粒体抑制剂。增强本发明治疗性病毒溶瘤细胞活性的策略涉及阻断线粒体的氧化磷酸化作用。优选的制剂是抑制呼吸链功能或线粒体蛋白合成的能够临床应用的药物。4-quinolone抗生素，甲萘醌，氯霉素，氯喹和四环素均可用于增强抗癌病毒的溶瘤细胞活性。这些制剂以临床耐受剂量在给予溶瘤细胞病毒前0-24小时给予。线粒体抑制剂还可任选在病毒给药后给予，目的是进一步支持病毒在敏感肿瘤中的复制。
组织缺氧和高热已知也可调节干扰素反应。因此，在本发明的一个实施方案中，在肿瘤暴露于治疗性溶瘤细胞病毒之前或期间，氧化肿瘤的缺氧区域。达成的方法包括但不限于，系统给予氧化碳氟血红蛋白替代物，促红细胞生成素，或血管扩张剂。肿瘤的氧化还可通过肺呼吸氧浓度高于正常值的空气达成。
在本发明的另一个实施方案中，在给予病毒的同时或之前、之后应用免疫抑制剂，如环胞菌素A，咪唑硫嘌呤，来氟米特，抗CD40配体抗体(Foy，T.M.等，1993，实验医学杂志，178：1567-1575)，以及多种皮质类固醇制剂，如氢化可的松，强的松，氢化波尼松，6α-甲基氢化波尼松，氟氢可的松，肾上腺酮，去炎松，醋酸对氟米松，倍他米松，以及地塞米松。此外，免疫刺激剂，如脂多肽也可与病毒共同应用。
在本发明的另一个实施方案中，在给予病毒的同时或之前、之后应用能抑制TNF-α活性的制剂，如抗TNF-α抗体(见实施例30)，可溶性TNF-α受体，皮质类固醇，或其他化合物。
通过应用核苷(Machida，H.，1979，微生物免疫学，23：643-650)、核苷前体或可以增加细胞内一种或多种核苷浓度的药物，可以增加病毒感染所致的干扰素生成量，这一独立机制可在病毒治疗中任选作为佐剂。
某种嘌呤核苷类似物，如2-氯脱氧腺嘌呤和2’-脱氧助间型霉素，体内可以减少干扰素的产量。这些化合物可以用来进一步影响肿瘤细胞相对于正常细胞对干扰素敏感性的差异，并可任选作为病毒治疗的佐剂。
一方面，有效剂量的病毒可以再分装为更小剂量单位，并同时注射到同一肿瘤的不同部位。对于连续给药，可以通过埋植的微量泵将所需药物给予，也可将它注入预期的聚合物，然后移植到所需部位(如直接移植到肿瘤瘤体)，缓慢或延迟释放。
本发明病毒作为药用制剂来制备，包括将之与至少一种赋形剂或辅助剂制成适宜的剂量形式，并且如果需要，还可与一种或多种进一步活性化合物组合。所得制剂可用于人类和兽医。适宜的赋形剂包括，如适于肠道或非肠道给药的有机或无机物质，如水、生理盐水、组织培养基、缓冲液、赖氨酸、柠檬酸盐、三醋酸甘油和其他脂肪酸甘油、白明胶、大豆卵磷脂、碳水化合物如甘露醇、蔗糖、乳糖或淀粉、硬脂酸镁、云母、纤维素或蛋白载体、或前述化合物的组合物，如甘露醇/赖氨酸、或甘露醇/赖氨酸/蔗糖。制剂经消毒，并/或含有添加剂，如防腐剂或稳定剂。用于非肠道给药，如系统给药或局部注射，病毒制剂制备成如水性悬液或乳剂。
本发明还涉及一种治疗哺乳动物疾病的方法，所述疾病的致病细胞具有干扰素介导的抗病毒应答缺陷，所述方法包括给哺乳动物应用治疗有效剂量的具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒。例如，很多病毒发展了消除宿主细胞干扰素介导的抗病毒应答的机制。乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒是导致世界范围内肝功能障碍的首要原因。这些病毒与进行性肝损伤、肝硬化和肝细胞癌有关。目前应用干扰素是治疗这些疾病的标准疗法，但有大部分人对该疗法没有反应，或在治疗终止后复发。乙型肝炎病毒(HBV)的终末蛋白业已显示可以抑制细胞对干扰素和双链RNA的反应，双链RNA已知是PKR的激活剂(Foster，G.R.等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：2888-2892)。此外，HBV的核心抗原业已显示抑制β干扰素基因的表达(Whitten，T.M.等，1991，病毒学杂志，65：4699-4704)，并且HBV相关性Δ物质业已显示阻断PKR在兔reticulolysates中的活性(Robertson，H.D.等，1996，病毒学杂志，70：5611-5617)。丙型肝炎病毒(HCV)也具有抑制PKR蛋白激酶的活性。HCV的NS5A蛋白业已显示可以直接抑制PKR蛋白激酶活性(Gale，M.J.等，1998，病毒学临床诊断，10：157-162)。HBV或HCV感染患者首次干扰素治疗失败后，可以备选应用本发明病毒治疗。可以应用任何上述方法给予治疗性病毒，但优选静脉内或肝动脉内给药。
有证据显示，人免疫缺损病毒(HIV)感染细胞也对干扰素的作用耐受，而且这种耐受与艾滋病的存在相关(Kunzi，M.S.等，1995，感染性疾病杂志，171：822-828；Edlin B.R.等，1992，内科学纪事，117：457-460)。从机制上讲，HIV的TAR RNA区域业已显示可与PKR作用，并依赖TAR RNA浓度，或激活或抑制PKR激酶的活性(Maitra，R.K.等，1994，病毒学，204：823-827)。此外，细胞TRBP和病毒Tat蛋白已知可与HIV TAR RNA区域结合，并抑制PKR活性(Davies，P.H.等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.，91：4713-4717；Jbrand，S.R.等，1997，生物化学杂志，272：8388-8395)。耐受干扰素效应的HIV感染细胞可作为靶向细胞被本发明的病毒杀伤。
很多其他人类致病病毒已知抑制一种或多种干扰素介导的抗病毒状态组分。已知腺病毒和EB病毒均表达大量在感染细胞中阻断PKR活性的小RNA(综述见Clemens，M.J.等，1994，Biochimie，76：770-778)。EB病毒除与分化不良或未分化鼻咽癌相关外，还与地方性Burkitt淋巴瘤几乎100％相关，并是感染性单核细胞增多症的致病物质。痘苗病毒业已显示编码蛋白E3L和K3L，它们可以分别阻断PKR激活，并充当假性PKR激酶激活物质(Davies，M.V.，1993，病毒学杂志，67：1688-1692)。E3L蛋白还可抑制细胞抗病毒应答2’-5’合成酶组分(Rivas，C.等，1998，病毒学，243：406-414)。
痘苗病毒E3L蛋白同质类似物在人类副痘病毒中曾有描述(McInnes，C.J.，1998，病毒基因，17：107-115)。痘苗病毒还编码可溶性I型干扰素受体，该受体抑制干扰素诱导的抗病毒状态(Symons，J.A.，1995，细胞，81：551-560)。流感病毒(Lee，T.G.等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6208-6212)或脊髓灰质炎病毒(Black，T.L.等，1989，病毒学杂志，63：2244-2251)感染细胞可诱导PKR激酶细胞抑制因子。I型单纯疱疹病毒编码的一种蛋白(γ34.5)可以拮抗在感染细胞中PKR介导的蛋白合成关闭(Chou，J.等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：10516-10520)。流感病毒的NS1蛋白和呼肠病毒的ω-3蛋白业已显示，通过双链RNA抑制PKR的激活(Lu，Y.等，1995，病毒学，214：222-228；Imani，F.和Jacobs，B.L.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：7887-7891)。在上述每个病毒干扰细胞建立抗病毒状态的实例中，应用本发明病毒治疗感染细胞均可导致感染细胞的选择性杀伤。
除非另外指明，本发明病毒治疗的细节和条件与美国专利申请系列号08/260,536相同，该专利公开内容的全文在此引入，作为参考。上述所有申请、专利和发表文章的全部公开内容在此引入，作为参考。
                 × × × ×
下述实施例阐述了本发明的方法和组合物，但非对它们的限制。对于在临床治疗中遇到的多种情况的其他适宜修改和调整也在本发明的意旨和范围之内，所述调整和修改对本领域技术人员来说显而易见。
                     实施例1
PPMK107(NDV株MK107的三重噬斑纯化分离株)显示了相对于正常人类细胞，对多种人类肿瘤细胞的选择性细胞毒作用。
在24孔组织培养平板上，人类肿瘤细胞和正常细胞生长至大约80％汇合。移去生长基质，以10倍稀释比例加入PPMK107，范围为106平板形成单位(PFU)/孔-10-1PFU/孔。每个平板都包括未加入病毒的对照孔。在摇摆平台上37℃吸收病毒90分钟。在孵育期结束时，移去病毒稀释液，加入1ml的生长基质。然后在37℃5％CO2条件下孵育5天，定性测定细胞病变效应(CPE)的量。细胞毒性应用MTT(2-[4，5-二甲基噻唑-2-yll-2，5-联苯四唑溴)比色法(细胞滴度96，分类号#G4000，Promega公司，Madison WI 53711)定量测定，在570nm测定线粒体酶活性(Mosman，T.，1983，免疫学方法杂志，65：55)。病毒处理孔的活力用未接受病毒处理对照孔活性的百分比表示。数据应用PFU/孔比对照活力百分比绘图。IC50应用导致存活细胞50％下降的每孔病毒的PFU量来计算。
结果如表4，5和6所示。PPMMK107显示了对多种人类肿瘤细胞的细胞毒活性，在39中恶性细胞系中，有30种IC50值较相对不敏感的正常人类细胞系低1000。大部分人类肿瘤细胞的IC50值较绝大多数人类正常细胞低2-3个数量级。
             表4.细胞毒性结果概要
肿瘤类型  细胞系 IC-50(PFU/ml)
纤维肉瘤  HT1080  2
胰腺癌  PANC-1  3
肾癌  CAKI-1  8
 CAKI-2  11
 A498  15
肺癌(非小细胞型)  H-1299(lowpassage)  26
 A427  2
 A549  13
黑色素瘤  SKMEL2  8
 SKMEL3  2
 SKMEL5  4
 A375  37
 MALME-3M  778
 HT144  28
乳腺癌  SKBR3  10
 MDA-MB-468  44
 ZR75-1  78
卵巢癌  SW626  4
 PA-1  4
 ES-2  13
 SKOV-3  24
 OVCAR3  34
成胶质细胞瘤  U87MG  25
 U373MG  765
 U138  38
 A172  207
膀胱癌  HT1197  3
 UM-UC-3  54
HT1376  422
成神经细胞瘤 IMR-32  41
宫颈癌 HeLa  4
前列腺癌 DU-145  31
PC3  3.1 E+03
结肠癌 SW620  55
HT29 ＞1.0 E+0.6
头颈部肿瘤 KB  4
A253  2.7 E+03
FaDu  2.9 E+03
Hep-2  1.5 E+04
神经上皮瘤 SK-N-MC  20
小细胞癌(肺) DMS-114  48
DMS-153  1.1 E+05
NCI-H345  1.2 E+06
小细胞癌(前列腺) NCI-H660  1.0 E+05
白血病(AML) K562  5.4 E+04
淋巴瘤(Burkitt’s) Ramos ＞1.0 E+06
Daudi ＞1.0 E+06
表5.应用正常人类细胞细胞毒试验结果概要
细胞类型 细胞 IC50(PFU/孔)
角化细胞 NHEK  9.0×106
成纤维细胞 CCD-922  1.4×105
NHDF  8.1×103
上皮细胞 HPAEC  5.2×104
肾细胞 RPTEC  2.7×104
黑色素细胞 NHEM  5.1×104
星型细胞 NHA  3.8×103
  表6.应用快速增殖性正常人类细胞细胞毒试验结果概要
         增殖速度
细胞类型     体外     体内 IC50(PFU/孔)
骨髓细胞，富CD34+细胞达50％  中度-高度 高 6.2×103
乳腺上皮细胞  非常低a 高a 30
a-测试的人类乳腺上皮细胞(HMEC)在牛垂体提取物和人类上皮细胞生长因子的刺激下增殖速率高。恰恰相反，在患有癌症的成年女性体内，正常乳腺上皮细胞的增殖速率通常非常低。
                     实施例2
应用PPMK107瘤体内治疗无胸腺小鼠人类肿瘤异种移植物(＜10mm和＞5mm)
无胸腺小鼠皮内注射1千万人类肿瘤细胞。在肿瘤大小达到5-10mm时，给予单剂PPMK107(剂量为3×108PFU)或生理盐水。在应用PPMK107肿瘤的小鼠中，几乎所有类型的肿瘤都呈现50％-100％的完全或部分消退(见表7)。唯一的例外是应用U87MG的试验的实例(试验I)：尽管应用PPMK107治疗的9例肿瘤中只有1例完全消退，超过2例的病毒处理肿瘤显示32％和20％消退，相对于生理盐水处理的所有8例对照肿瘤，有超过2例的病毒处理的肿瘤显示肿瘤生长缓慢。在生理盐水处理的对照肿瘤中，肿瘤消退完全缺如。在所有这些试验中(表7显示的试验A-I)，73例对照肿瘤中只有1例显示消退。这些结果提示多种类型的肿瘤都对瘤体内PPMK107治疗有反应。
为检测病毒在肿瘤内的复制，应用HT1080皮下纤维肉瘤模型进行了病毒抗原(应用抗NDV P蛋白单克隆抗体)的免疫组化染色。肿瘤瘤体内注射3×108PFU PPMK107 30分钟内，肿瘤组织没有病毒抗原。但是，治疗后2天，加强免疫染色可以在肿瘤内看到病毒抗原，提示病毒在肿瘤内复制。重要的是，病毒复制具有肿瘤组织特异性，因为邻近的结缔组织和皮肤病毒抗原阴性。表7.PPMK107瘤体内治疗无胸腺小鼠皮下人类肿瘤异种移植物(＜10mm并＞5mm)
  肿瘤     肿瘤类型 试验编号   剂量  N   完全消退   完全+部分消退
HT1080 纤维肉瘤  ABB  3.00E+083.00E+083.00E+08  1298     1188     1188
 PA-1 卵巢癌  D  3.00E+08  9     9     9
 KB 口腔癌  E  3.00E+08  12     7     10
 SKMEL5 黑色素瘤  F  3.00E+08  8     5     7
 A375 黑色素瘤  GH  3.00E+083.00E+08  81     51     74
 U87Mg 成胶质细胞瘤  I  3.00E+08  9     1     1
                     实施例3
应用PPMK107静脉内治疗无胸腺小鼠人类肿瘤异种移植物(＜8.5mm并＞5.5mm)
无胸腺小鼠皮内注射1千万人类HT1080纤维肉瘤细胞。在肿瘤生长大小达到5-8mm时，静脉注射PPMK107或生理盐水。如表8所示，在最高病毒剂量水平(1×109PFU)，在所有的7只小鼠中均出现肿瘤完全消退。单剂注射3×108和6×107可导致肿瘤消退率超过90％。在单剂静脉注射3×108，只有55％肿瘤消退率时，以该剂量水平静脉注射3次，可产生100％的反应率。静脉生理盐水处理的小鼠，没有显示肿瘤消退的证据。这些结果提示皮下HT1080肿瘤对PPMK107静脉治疗具有非常反应性。表8.PPMK107静脉内治疗无胸腺小鼠皮下人类HT1080纤维肉瘤异种移植物(＜8.5mm并＞5.5mm)
    剂量     给药程序   N   完全消退   完全+部分消退   消退％
1.00E+09 注射1次   7     7     7   100％
3.00E+08 注射1次   10     9     10   100％
6.00E+07 注射1次   11     10     10   91％
2.00E+07 注射1次   11     5     6   55％
2.00E+07 隔天注射，共3次   7     5     7   100％
生理盐水 注射1次   10     0     0   0％
生理盐水 隔天注射，共3次   6     0     0   0％
                     实施例4
应用PPMK107瘤体内治疗无胸腺小鼠大型A375黑色素瘤异种移植物的首次试验
无胸腺小鼠皮内注射1千万A375人类黑色素瘤细胞。10天后，单剂注射PPMK107(剂量为3×108，9×108和1.5×109PFU)或生理盐水治疗不同大小的肿瘤。对于最长单径10-11mm的这些肿瘤，应用所述剂量PPMK107瘤体内治疗的所有9例肿瘤完全消退，而对于最长单径为8-9.5mm的这些肿瘤，24例中有12例对病毒治疗发生反应，完全消退(P＜0.008，表9，A部分)。应用生理盐水处理的小鼠，没有治疗消退。
根据肿瘤体积分类的这些相同肿瘤还提示，肿瘤体积大的肿瘤，完全消退百分比高。对所述剂量PPMK107发生的反应，在肿瘤体积＞300mm3(范围为304-397mm3)的17例肿瘤中有14例完全消退，在肿瘤体积＜300mm3(范围为144-295；P＜0.023；表9，B部分)的16例肿瘤中有7例完全消退。
这些结果提示长度至少为1cm或体积300mm3的肿瘤，对瘤体内PPMK107治疗较较小的肿瘤，如果不是更加敏感，至少也同样敏感。
表9.瘤体内PPMK107治疗皮内A375黑色素瘤异种移植物
A.肿瘤根据最长单径分类
    肿瘤单径：8-9.5mm 肿瘤单径：10-11mm
治疗   剂量   完全消退     ％   N   完全消退   ％
PPMK107PPMK107PPMK107总计生理盐水 1.5×1099.0×1083.0×108     888246     273120   25％88％38％50％0％   33390     3339  100％100％100％100％a0％
B.肿瘤根据肿瘤体积分类
肿瘤体积：＜300mm3 肿瘤体积：＞300mm3
治疗   剂量   完全消退     ％   N   完全消退   ％
PPMK107PPMK107PPMK107总计生理盐水  1.5×1099.0×1083.0×108     646168     23270   33％75％33％44％0％   575171     374140   60％100％80％82％b0％
a-应用PPMK107治疗的10-11mm组较8-9.5mm组完全消退P＜0.008。
b-体积＞300mm3的PPMK107治疗组较＜300mm3的PPMK107治疗组完全消退P＜0.023。
                     实施例5
应用PPMK107瘤体内治疗无胸腺小鼠大型A375黑色素瘤异种移植物的第二次试验
如实施例4，肿瘤细胞接种后10天形成肿瘤。治疗包括多种剂量的PPMK107(3×106PFU，3×107，3×108，和1.5×109)或生理盐水。对于最长单径10-11mm的肿瘤，应用所述剂量PPMK107治疗的所有28例肿瘤发生了完全或部分消退(至少50％)，而生理盐水处理的小鼠，却没有消退(表10，A部分)。
当这些相同的肿瘤根据肿瘤体积进行分类时，所有肿瘤体积＞300mm3(范围为309-525mm3)的26例肿瘤对PPMK107发生反应，完全或部分消退(至少50％)，而生理盐水处理的小鼠，却没有一例消退(表10，B部分)。
这些结果确证，长度至少为1cm或体积300mm3的肿瘤对瘤体内PPMK107肿瘤敏感。
表10.瘤体内PPMK107治疗皮内A375黑色素瘤异种移植物
A.10-11.5mm的肿瘤(肿瘤根据最长单径分类)
治疗     剂量 完全消退   ％   完全+部分    ％
1.5×1093×1083×1073×106所有PPMK107组生理盐水     7777286     7655230 100％86％71％71％82％0％     7777280   100％100％100％100％100％
B.肿瘤＞300mm3(肿瘤根据肿瘤体积分类)
治疗 剂量     N 完全消退   ％   完全+部分     ％
 1.5×1093×1083×1073×106所有PPMK107组生理盐水     7766265     7644210 100％86％67％67％81％0％     7766260   100％100％100％100％100％0％
                     实施例6
应用PPMK107瘤体内治疗无胸腺小鼠大型A375黑色素瘤异种移植物的第三次试验
如实施例4，肿瘤细胞接种后10天形成肿瘤。瘤体内治疗包括多种剂量的PPMK107(3×108，3×106，3×105，3×104，3×103，3×102PFU)或生理盐水。最长单径为12.5-14mm的肿瘤(体积范围632-787mm3，平均体积698mm3)，应用3×108PFU治疗，3只小鼠中有2只发生至少50％的肿瘤消退，相反，在生理盐水处理的2只小鼠中无消退(表11)。应用相同剂量的PPMK107(3×108PFU)治疗最长单径为10-12mm的肿瘤(体积范围320-600mm3，平均体积411mm3)，8只小鼠中有7只发生至少25％的肿瘤消退(至少消退25％相对于生理盐水处理的小鼠无消退，p＜0.001，表11)。应用3×106PFU，3×105PFU，3×104PFU，3×103PFU治疗，肿瘤长径为10-12mm的小鼠也发生了至少25％的肿瘤消退，但应用3×102PFU或生理盐水处理的小鼠没有消退(表11)。
这些结果确证，长度至少为1cm或体积300mm3的肿瘤对瘤体内PPMK107肿瘤敏感。
表11.应用PPMK107瘤体内治疗A375黑色素瘤异种移植物(大小至少10mm)的第三次试验
              消退
治疗     N  肿瘤12.5-14mm 平均体积 完全消退  部分a ＞25％和50％b  消退总数c  消退％c
   体积范围
3.0E+08     3     632-787     698     1     1     0     2     67
3.0E+08     2     717-860     788     0     0     0     0     0
  肿瘤10-12mm
    体积范围
3.0E+08     8     320-600     411     0     3     4     7     088     d
3.0E+08     8     425-662     502     0     0     2     2     025
3.0E+05     8     245-600     421     0     0     1     1     013
3.0E+04     8     336-600     477     0     0     1     1     013
3.0E+03     8     281-542     349     2     0     0     2     25
3.0E+02     8     281-662     372     0     0     0     0     0
生理盐水     8     379-666     518     0     0     0     0     0
a-部分消退的定义是消退小于100％，但大于或等于50％。
b-“消退＞25％和＜50％”定义为肿瘤消退大于25％并小于50％。
c-包括所有消退小于25％的肿瘤。
d-肿瘤消退大于25％在3E+08组相对于生理盐水组P＜0.0001。
                     实施例7
应用PPMK107瘤体内治疗无胸腺小鼠大型A375黑色素瘤异种移植物的第四次试验
如实施例4，肿瘤细胞接种后13天形成最大径10-12mm的肿瘤。瘤体内治疗包括单剂注射3×108PFU PPMK107或生理盐水。应用PPMK107治疗的肿瘤体积范围为295-600mm3(平均肿瘤体积437mm3)。每一治疗组的小鼠分别在0，2，3，4，7和14天应用无痛致死术处死，进行治疗组织学检测。在那些观察最短时间为4天的小鼠中，应用PPMK107治疗的12只小鼠有11只出现肿瘤至少25％的消退，而8只生理盐水组没有一只出现肿瘤消退(P＜0.0001，表12)。PPMK107治疗后2天，有2例肿瘤已经显示消退征象，但消退程度小于25％。
                     实施例8
应用PPMK107瘤体内治疗无胸腺小鼠大型A375黑色素瘤异种移植物的第五次试验
如实施例4，肿瘤细胞接种后20天形成最大径10-12mm的肿瘤。瘤体内治疗包括单剂注射3×108PFU PPMK107或生理盐水。应用PPMK107治疗的肿瘤体积范围为361-756mm3(平均肿瘤体积551mm3)。应用PPMK107治疗的10只小鼠中有9只出现肿瘤至少25％的消退，而10只生理盐水组没有一只出现肿瘤消退(P＜0.0001，表13)。
                     实施例9
应用PPMK107静脉内治疗大型HT1080纤维肉瘤异种移植物的第一次试验
无胸腺小鼠皮下注射1千万HT1080人类纤维肉瘤细胞。6天后，应用单剂PPMK107(剂量为1.5×109PFU)或生理盐水注射治疗。对于最大单径为10-11mm的肿瘤，应用单剂静脉注射PPMK107治疗的6例肿瘤中，5例出现完全或部分消退，而生理盐水处理的肿瘤却无一例消退(表14，P＜0.025)。这些结果提示，长度至少为1cm的肿瘤对静脉内PPMK107治疗敏感。
表12.应用PPMK107瘤体内治疗A375黑色素瘤异种移植物的第四次试验(大小至少10mm)
无痛致死术处死时间     消退
   治疗    治疗后     N 完全消退   部分a ＞25％和50％b  消退总数c    消退％c
 3.0E+08     14天     3     0     2     1     3     100
 3.0E+08     7天     3     0     2     1     3     100
 3.0E+08     4天     3     0     2     1     3     100
 3.0E+08     3天     3     0     0     2     3     67
 3.0E+08     所有PPMK107组     12     0     6     5     11     92     d，e
 生理盐水     14天     2     0     0     0     0     0
 生理盐水     7天     2     0     0     0     0     0
 生理盐水     4天     2     0     0     0     0     0
 生理盐水     3天     2     0     0     0     0     0
 生理盐水     所有生理盐水组     8     0     0     0     0     0
a-部分消退的定义是消退小于100％，但大于或等于50％。
b-“消退＞25％和＜50％”定义为肿瘤消退大于25％并小于50％。
c-包括所有消退小于25％的肿瘤。
d-12只PPMK107治疗组小鼠完全或部分消退，相对于8只生理盐水组小鼠，P＜0.03。
e-12只PPMK107治疗组小鼠所有肿瘤至少25％消退，相对于8只生理盐水组小鼠，P＜0.0001。
表13.应用PPMK107瘤体内治疗A375黑色素瘤异种移植物的第五次试验(大小至少10mm)
             消退
治疗  N 完全消退  部分a ＞25％和50％b  消退总数c  消退％c
3.0E+08  10     0     4     5     9     90  d，e
生理盐水  10     0     0     0     0     0
a-部分消退的定义是消退小于100％，但大于或等于50％。
b-“消退＞25％和＜50％”定义为肿瘤消退大于25％并小于50％。
c-包括所有消退小于25％的肿瘤。
d-PPMK107治疗组完全或部分消退，相对于生理盐水组，P＜0.05。
e-PPMK107治疗组所有肿瘤至少25％消退，相对于生理盐水组，P＜0.0001。表14.静脉内治疗无胸腺小鼠皮下HT1080人类纤维肉瘤异种移植物。肿瘤大小＝10-11mm
    治疗   剂量     N 完全消退     ％ 完全+部分消退 ％
  PPME107  1.5E+09     6     4     67a     5   83a
  生理盐水     4     0     0     0   0
aPPMK107治疗组完全或部分消退(消退至少50％)，相对于生理盐水组，P＜0.025(应用Fisher精确检测法)。
                     实施例10
正常细胞而非肿瘤细胞可以特异清除PPMK107感染
为检测NDV株PPMK107特异性杀伤肿瘤机制，根据以下标准选择代表性肿瘤细胞：a)具有在无胸腺小鼠体内形成肿瘤异种移植物的能力；b)给予PPMK107后，体内肿瘤异种移植物可被特异性杀伤；c)PPMK107体外杀伤肿瘤细胞的病毒浓度低于杀伤耐受、正常细胞浓度的几个对数值；以及d)在共同培养时，肿瘤细胞与正常细胞易于区分。
包括KB头颈部肿瘤细胞的异种移植物肿瘤，在单剂肿瘤瘤体内注射PPMK107后显示83％的完全或部分消退率，较PPMK107体外杀伤正常原代皮肤纤维细胞(CCD922-sk)敏感4个对数值，而且KB头颈部肿瘤细胞在与CCD922-sk细胞共同培养时，非常易于区分。
因此，共同培养的KB和CCD922-sk细胞在0.0005多样性感染(m.o.i.，每孔添加病毒的比例)中被感染，感染后5天，应用免疫组化染色显示病毒抗原(NDV P蛋白)。正常细胞的感染在2天时达峰值，通过观察单层细胞发现，只有很少的细胞死亡或没有明显细胞死亡。感染后第3天，正常细胞中病毒表达量显著下降，而肿瘤细胞的感染则非常明显。正常细胞病毒抗原的量在第4、5天基本消失，而肿瘤细胞的感染则通过肿瘤细胞群发展迅速，导致在共同培养基中，大部分肿瘤细胞的破坏。
因此，正常细胞感染后，可以通过与干扰素抗病毒效应相同的方式容易地清除感染。虽然正常细胞分泌到培养基中的干扰素呈现生理有效浓度，但肿瘤细胞不能建立抗病毒状态应答，由于病毒不受遏制的生长而导致自身死亡。
                     实施例11
显示在正常CCD922-sk细胞中干扰素是一种重要的病毒清除成分
干扰素介导CCD922-sk细胞清除PPMK107感染这一假说受到检测。单独或联合应用抗人α干扰素或β干扰素多克隆中和抗体，每日将抗体加入感染了PPMK107的CCD922-sk细胞培养基中，moi为0.0005，追踪感染进程3天。细胞呈现的病毒抗原量与中和抗体浓度呈比例增加，而且抗β干扰素抗体较抗α干扰素抗体的效果显著；与文献报导成纤维细胞主要产生干扰素一致。
通过添加抗干扰素中和抗体，使正常不敏感细胞对PPMK107感染更加易感的能力，支持了一个假说，该假说认为正常细胞和肿瘤细胞对PPMK107杀伤的敏感性差异主要在于正常细胞，而非肿瘤细胞，具有建立干扰素介导的抗病毒应答能力。
                     实施例12
显示在其他正常细胞中β干扰素是一种重要的病毒清除成分
在此试验中，另一种已知对PPMK107杀伤具有非常抵抗能力的正常细胞(NHEK，正常人上皮细胞)受到检测，通过在感染细胞培养基中添加抗β干扰素多克隆抗体，可以使该细胞更加敏感。moi0.0005或0.05感染NHEK(正常人上皮角化细胞)，每日添加抗体，共5天。
在低moi(0.0005)感染培养基中，抗体依赖性病毒抗原表达增加在感染后5天清晰显示，但在试验更早期不明显。在以moi 0.05感染PPMK107的培养基中添加抗体，导致感染后第4、5天病毒抗原显著增加。感染后第2、3天添加中和抗体导致病毒抗原的少量积聚(图1)。
高moi样本的培养上清应用人HT1080纤维肉瘤肿瘤细胞平板试验滴定测量感染病毒的量；应用我们实验室标准试验体系。这一分析结果显示，感染后5天，相对于模仿处理对照组，抗体处理培养基的感染病毒量增加了19倍(图1)。
这些结果提示，正常细胞不被PPMK107杀伤的通用保护机制是由干扰素介导的机制。
                     实施例13
比较β干扰素对PPMK107感染肿瘤和正常细胞的影响
添加外源性β干扰素对感染正常细胞(CCD922-sk)、PPMK107高度敏感(KB)或中度敏感(HEp2)肿瘤细胞的影响进行了比较。三种细胞的分离培养基在moi 0.0005感染前1天、感染后2天，应用20，200或2000单位/mlβ干扰素处理。感染后3天，正常细胞表达的低水平病毒抗原，在干扰素所有剂量组均消失。相反，高度敏感的KB肿瘤细胞在添加浓度为2或200单位/ml干扰素后，病毒抗原表达相对水平降低了2倍，而在1000单位/ml干扰素的处理下受到完全抑制。中等敏感的HEp2细胞对外源性干扰素的反应是在所有干扰素应用剂量组，病毒抗原表达消失(图2)。
KB和CCD922-sk细胞对外源性添加的β干扰素的抗病毒效应敏感性与这些细胞对PPMK107杀伤敏感性成反比。HEp2细胞对干扰素效应具有应答能力提示，这些细胞可以有效利用本试验应用浓度的干扰素。相似地，KB细胞对高剂量干扰素有应答提示，KB细胞不能建立干扰素介导的抗病毒应答并非在于干扰素途径上绝对缺陷，而是相对于正常细胞不敏感。
                     实施例14
低浓度β干扰素对PPMK107感染正常和肿瘤细胞的影响
在本试验中，在PPMK107moi 0.05感染前1天、感染后2天，应用浓度为0.2，2或20单位/mlβ干扰素处理。
在这些情况下，正常细胞显示了病毒抗原量的剂量依赖性降低，而肿瘤细胞的病毒抗原相对水平却不受添加外源性干扰素的影响(图3)。
                     实施例15
PPMK107的纯化
方法A
通过三重噬斑纯化法从中等毒力的新城疫病毒株Mass-MK107获得PPMK107。将大约1000PFUs(平板形成单位)的活PPMK107接种到10天的鸡胚尿囊中。36℃孵育46小时后，冷藏鸡卵，然后收获尿囊液。通过1750×g离心30分钟，去除细胞和细胞残留。将澄清的尿囊液(含病毒的上清液)置于20％/55％不连续蔗糖梯度基质中，以大约100,000×g离心30分钟。在20％/55％界面上收获纯化的病毒，并通过生理盐水透析去除蔗糖。
方法B
在另一个优选实施方案中，澄清的尿囊液在-70℃冷冻。解冻后，液体在1-4℃下过夜，然后通过离心(1750×g，30分钟)从病毒悬液中去除污染物质。获得的物质进一步应用上述不连续蔗糖梯度超速离心法处理。
方法C
在另一个优选实施方案中，不连续蔗糖梯度超速离心法通过连续层流超速离心法完成。
方法D
在另一个优选实施方案中，收获的尿囊液用含有5％甘露醇和1.0％l-赖氨酸，pH8.0的缓冲液(ML缓冲液)稀释，并应用ML缓冲液，通过切线层流过滤法(TFF)澄清、交换尿囊液，滤器的过滤孔大小为0.45。收集含有澄清病毒的ML渗透缓冲液，再次通过TFF纯化ML缓冲液中的病毒，所用滤器的过滤分离点是300,000道尔顿。收集通过此步骤被保留的物质，即溶于ML缓冲液中的浓缩纯化病毒，用ML缓冲液稀释后，上到用ML缓冲液平衡的Sephacryl S500(Pharmacia公司)凝胶渗透柱上。集中收集含纯化病毒的部分，应用ML缓冲液通过TFF再次浓缩含纯化病毒的部分，所用滤器的过滤分离点是300,000道尔顿。
结果
*克隆病毒
通过噬斑纯化法制备PPMK107后，发现病毒群落中有8种独立分子克隆，在NDV融合蛋白基因超过300个相邻核苷区域具有相同序列(如，100％同源)。PPMK107是一种具有高度遗传同质性的克隆病毒。
*PFU/mg蛋白
检测纯度的一种定量方法是测定PFU/mg蛋白。病毒制剂的活性通过应用HT1080的平板试验法测定，病毒制剂的蛋白含量通过改良Lowrey法(伯乐公司，Hercules，CA)测定，在该方法中，牛血清作为蛋白标准物。所得值越高，提示纯度水平越高。应用方法A，获得的PFU/mg蛋白值至少为4.8×1010(见表15)。应用方法C，获得的PFU/mg蛋白值至少为2.0×1010(见表15)。对于中等毒力的NDV病毒株，应用这种纯度测定方法获得的文献值尚未发现。对于中等毒力的NDV病毒株最好的评估是病毒制剂(NDVMassMK107，标号RU2，如Faaberg KS和Peeples，ME所述方法制备，1988，病毒学杂志，62：586；以及Bratt，MA和Rubin，H.，1967，病毒学，33：598-608)。这种标号RU2的病毒PFU/mg蛋白为1.3×109PFU/mg蛋白。应用方法A获得的纯度值大约大约好于应用Peeples方法获得的纯度值的40倍(见表15)。
*颗粒/PFU比率
检测纯度的另一种定量方法是测定颗粒/PFU比率。比值越低，说明纯度水平越高。颗粒计数应用标准方法通过电子显微镜完成。应用方法A或方法B，得到的颗粒/PFU值接近1(表15)。
               表15.病毒纯度
病毒制备方法   病毒   标号   PFU/mg蛋白   颗粒/PFU优选方法A     PPMK107   L2     4.8×1010     0.80L4     6.9×1010     NTaL5     6.6×1010     NTL6     7.7×1010     0.55L7     6.1×1010     NT优选方法C     PPMK107  D004    2.0×1010     0.32D005    4.5×1010     0.52D010    4.4×1010     NT优选方法D     PPMK107  RD2     5.6×1010     NTRD3     5.0×1010     NT
aNT，未测定。
应用方法A和C制备的病毒还可使NDV的纯度达到几乎不含污染鸡卵蛋白的水平。对于应用方法A制备的标号7的PPMK107制剂，应用Western印迹法检测不到卵白蛋白，所述Western印迹法应用(1)每孔(宽3.3cm)纯化病毒量为1.7×109PFU，进行SDS-PAGE(十二烷基硫代硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶(厚1mm)；(2)转移到硝化纤维膜上；以及(3)应用兔抗卵白蛋白抗体(Cappel公司兔IgG片段，抗体浓度4mg/ml，1∶200稀释)。方法D制备的PPMK107应用SDS-PAGE分析后银染，未观察到卵白蛋白相关性染带。
                     实施例16
PPMK107治疗无胸腺小鼠腹水形成ES-2卵巢癌
在该试验中，所有无胸腺小鼠(雌性，NCR nu/nu，8周龄)腹膜内注射106ES-2细胞。7天后，腹水产生前，应用生理盐水或PPMK107(1×109PFU)腹膜内治疗。如图4所示，应用PPMK107治疗的动物较生理盐水处理的动物，生存显著改善。生理盐水处理组大部分小鼠治疗后7天产生腹水，所有试验动物在第38天全部死亡。与其恰恰相反，应用PPMK107治疗的小鼠在第38天，有92％存活，其中的25％获得长期存活(存活＞120天)。
                     实施例17
PPMK107治疗已存在腹水的无胸腺小鼠ES-2卵巢癌
在该试验中，所有无胸腺小鼠(雌性，NCR nu/nu，8周龄)腹膜内注射106ES-2细胞。14天后，大多数小鼠产生腹水，排除未产生腹水的小鼠，将有腹水的小鼠随机分为7个腹膜内治疗组(在第0天给予1次PPMK107治疗；在第1周给予2次PPMK107治疗；每周1次PPMK107治疗；每周2次PPMK107治疗；在第0天给予1次生理盐水治疗；在第1周给予2次生理盐水治疗；每周2次生理盐水治疗)。每次病毒治疗应用的剂量是1×109PFU/鼠。所有小鼠在第一次治疗以及所有添加治疗前排腹水。
腹水程度按以下定量、记录：
腹水评分 腹水程度
1.0 试验动物表现正常-少量或没有腹水
3.0 腹部轻微胀大；试验动物具有正常功能
3.0 腹部胀大；试验动物行动弛缓，背部弓起，步态蹒跚
4.0 腹部完全胀大；试验动物垂死
5.0 腹水产生后死亡
如表16所示，在第7天和第10天，所有生理盐水处理的试验动物较PPMK107治疗的动物有更多腹水。首次治疗后7天，每个生理盐水处理组的腹水评分均高于3.5，而所有PPMK107治疗动物腹水评分等于或低于3.0。相似地，首次治疗后10天，每个生理盐水处理组的腹水评分均高于4.5，而所有PPMK107治疗动物腹水评分等于或低于4.1。这些结果提示相对于生理盐水处理的对照组，病毒治疗的动物腹水产量显著减少。
表16.PPMK107治疗已存在腹水的无胸腺小鼠ES-2卵巢癌
治疗 小鼠数量 第7天腹水评分 第10天腹水评分
生理盐水，1次 12  4.3  4.7
生理盐水，2次 12  3.7  4.6
生理盐水，每周2次 12  4.3  4.8
PPMK107，1次 17  3.0  4.1
PPMK107，2次 17  2.3  3.6
PPMK107，每周1次 17  2.6  2.6
PPMK107，每周2次 17  2.2  3.6
                    实施例18
应用脱敏剂量PPMK107降低随后剂量PPMK107的致死性
第0天给C57BL/6小鼠(7周龄)静脉注射生理盐水或脱敏剂量的PPMK107(3×108PFU/鼠)。2天后，每批小鼠再进一步分成若干亚组，静脉给予生理盐水或PPMK107(剂量为1×109，2.5×109，5×109，和1×1010PFU/鼠)。如下表16所示，当应用生理盐水预处理小鼠时，随后给予剂量2.5×109，5×109，和1×1010PFU的小鼠有死亡记录。对于生理盐水预处理的小鼠，5×109，和1×1010PFU的剂量是100％致死性的。相反，在第0天给予脱敏剂量PPMK107、2天后注射PPMK107的任意一组小鼠中，甚至在剂量高达1×1010PFU时，也没有小鼠死亡。这些数据提示PPMK107可被用来脱敏，降低随后给予的相同制剂的致死性。而且，当应用该病毒作为脱敏剂时，PPMK107的最大耐受剂量可以增加大约一个数量级。表17.应用脱敏剂量PPMK107降低随后剂量PPMK107的致死性
 组 第0天注射 第2天给予 小鼠数量 死亡数量 致死性％
 1 生理盐水 生理盐水  8  0  0
 2 生理盐水 PPMK107，1.0E+09  8  0  0
 3 生理盐水 PPMK107，2.5E+09  8  3  38
 4 生理盐水 PPMK107，5.0E+09  8  8  100
 5 生理盐水 PPMK107，1.0E+10  8  8  100
 6  PPMK107，3E+08 生理盐水  8  0  0
 7  PPMK107，3E+08 PPMK107，1.0E+09  8  0  0
 8  PPMK107，3E+08 PPMK107，2.5E+09  8  0  0
 9  PPMK107，3E+08 PPMK107，5.0E+09  8  0  0
 10  PPMK107，3E+08 PPMK107，1.0E+10  8  0  0
                     实施例19
缓慢静脉注射降低PPMK107的毒性
22只无胸腺小鼠(8周龄)应用氯胺酮/甲苯噻嗪联合麻醉，然后置于控制装置中，以抑制小鼠在注射过程中的挣扎，使缓慢或快速注射PPMK107成为可能。缓慢注射组是将溶于生理盐水的4×109PFU的PPMK107 0.2ml在4分钟内静脉注射，也就是每10-15秒给予0.01ml。而快速注射组则在30秒内接受相同剂量、体积的病毒。如表18所示，在4分钟内接受PPMK107的动物，最大体重减轻(在给药后2天记录)几乎是在30秒内接受相同静脉注射剂量的动物的一半。这些结果提示，静脉给予PPMK107，如果注射速度如此缓慢，PPMK107是较少毒性，比较安全的。
表18.缓慢静脉注射PPMK107导致毒性降低
组 给药时程 小鼠数量 最大体重减轻百分比
快速注射4E+09  30秒 11  12％
缓慢注射4E+09  4分钟 11  6％
                     实施例20
应用PPMK107治疗癌症晚期患者
PPMK107目前正在美国进行I期临床试验，给药途径是静脉内。到目前为止，总共有52例用现有疗法无法控制的晚期实体瘤患者，应用PPMK107进行治疗。其中17名患者在第一疗程时接受了单剂治疗。另外13名患者在第一疗程时，接受了每周3次相同剂量的治疗1周。22患者在第一疗程时，接受了每周3次剂量的治疗1周，首剂为脱敏剂量的120亿PFU/m2，随后两剂给予更高剂量为240-960亿PFU/m2。每名患者的肿瘤大小每月随访一次。至少保持疾病稳定状态的患者(在没有任何新病变的情况下，所有可测定肿瘤产物的总量增加少于25％，降低少于50％)，每月可以接受另外的疗程。
癌症患者独立肿瘤的消退
在5名患者中(1名患者应用单剂治疗方案，1名患者应用重复相同剂量方案，3名患者应用脱敏剂量方案；表19)观察到独立肿瘤的消退。应当注意，在接受作为脱敏方案一部分的高剂量第2、3剂的患者中，肿瘤消退率(16％的患者)较在重复相同剂量方案中接受3剂相同剂量的患者(8％肿瘤消退)高。
表19.应用PPMK107治疗癌症晚期患者的独立肿瘤消退
方案 在该剂量水平治疗的患者数量 肿瘤消退的患者数量 肿瘤消退的患者％ 肿瘤消退的癌症类型
单剂 17  17例中1例 6％ 结肠癌
重复相同剂量 13  13例中1例 8％ 乳腺癌
脱敏剂量后给予两剂更高剂量 22(19例进行了评估) 19例中3例 16％ 间皮瘤黑色素瘤结肠癌
总计 52(49例进行了评估) 49例中5例 10％ 如上所示
这些病例总结如下：
(A)有明显转移的结肠癌的肿瘤消退
一名患有广泛转移结肠癌的68岁妇女，在腹部有一个可触及的转移肿瘤。在单剂静脉注射120亿PFU/m2的PPMK1072周后，这名患者经历了该单独腹壁肿瘤91％的消退(下表20)。给药后1天测量的肿瘤大小(3.75×3cm)与基线测量值(4×3cm)相似。但是，给药后7天，肿瘤缩小到2×2cm，并持续缩小到给予PPMK107 14天后的1.5×1.5cm。在给予PPMK107治疗前，该肿瘤生长迅速，在给予PPMK107前2周，该肿瘤体积的增长是1065％。该患者由于其他部位肿瘤的生长增大而从此项研究中取消。
表20.123号患者(68岁，女性，患有转移性结肠癌)在接受单剂静脉注射120亿PFU/m2PPMK107后腹壁可触摸肿瘤的大小
日期 给药后时间 肿瘤大小(长×宽，cm3) 肿瘤体积(0.5×长×宽×宽，cm3) 肿瘤体积的缩小％
7/23/98  0天 4×3  18.  -
7/24/98  1天 3.75×3  16.9  6％
7/30/98  7天 2×2  4.0  78％
8/6/98  14天 1.5×1.5  1.7  91％
(B)患有乳腺癌的妇女胸壁肿瘤的消退
患有乳腺癌的58岁妇女在胸壁上有一个肉眼可见、可以触及的肿块。在应用59亿PFU/m2的PPMK107治疗的第二疗程中，通过肉眼观察和触摸，患者胸壁肿瘤大小降低～90％。该患者在第3疗程的治疗后，也由于其他部位肿瘤的生长增大而从此项研究中取消。
(C)腹膜间皮瘤患者腹部肿瘤的消退
患有腹膜间皮瘤的46岁男性患者，在接受第一疗程的PPMK107治疗后，3个巨大(8-10cm)肿块分别消退50％，42％和10％，所述治疗包括120亿PFU/m2的脱敏剂量，以及随后两剂480亿PFU/m2。第一疗程治疗后，该患者的另一个巨大肿瘤(9.8cm大小)仍保持稳定状态。该患者目前仍在研究中。该患者最近一次的CT检查提示，他的两个转移瘤较基线有显著消退，至少30-36％，整体疾病状态保持稳定。
(D)黑色素瘤患者转移肿瘤的消退
患有黑色素瘤的57岁男性患者，在接受第一疗程的PPMK107治疗后，有2个肿瘤完全消退，所述治疗包括120亿PFU/m2的脱敏剂量，以及随后两剂480亿PFU/m2。在PPMK107治疗后消失的2个肿瘤，一个是腹股沟处1cm大小的可触及肿块，另一个是肺转移瘤。该患者由于其他部位肿瘤的生长增大而从此项研究中取消。
(E)结肠癌患者肝转移瘤的持续消退
患有结肠癌的79岁男性患者，在接受第一疗程的PPMK107治疗后，肝尾叶的一个转移瘤消退59％，在第二疗程后，消退97％。所述治疗包括120亿PFU/m2的脱敏剂量，以及随后两剂720亿PFU/m2。治疗前，该肿瘤的基线大小为3×3cm(肿瘤体积为13.5cm3，计算公式为1/2×长×宽2)。第一疗程PPMK107治疗后，该肿瘤缩小59％，至2.8×2cm(肿瘤体积为5.6cm3)。第二疗程PPMK107治疗后3周，这一位于肝尾叶的同一肿瘤大小报告为3×0.5cm(肿瘤体积为0.38cm3)，相对于基线值，缩小97％。
癌症稳定
其他21名以前应用传统癌症疗法，肿瘤持续进展的患者，在应用PPMK107治疗后，晚期癌症进入稳定状态，使这些患者受益。这些进入疾病稳定状态的患者代表包括肾癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胆管癌和肺癌的多种癌症类型。这些病例包括：(1)肾癌患者疾病稳定7个月；(2)肺癌患者疾病稳定7个月；(3)胰腺癌患者疾病稳定5个月；(4)另一胰腺癌患者疾病稳定5个月；(5)肾癌患者疾病持续稳定3个月；(6)胆管癌患者疾病持续稳定2个月。
疼痛用药减少
一个患者应用单剂59亿PFU/m2剂量水平的PPMK107治疗后，由于镇痛药用量减少，说明患者由于癌症疼痛症状减轻而受益。
脱敏
在脱敏方案中，首剂(120亿PFU/m2)的脱敏效应在同一周随后用药后可以清晰显现。通常，第二剂和第三剂给药报告的副作用更轻微，发生率更低，甚至在这些剂量较首剂高2-8倍时(240-960亿PFU/m2)。例如，首剂后，曾有68％的患者报告发热(包括9％的患者3度高热)，但在第二剂后仅有32％的患者报告发热(没有3度发热)，第三剂后仅有5％的患者报告。另一个实例是，首剂后50％的患者寒战，而第二剂后寒战的患者为18％，第三剂后仅有14％的患者寒战。
另一个实例是，在重复相同剂量的研究中，接受这一多剂量治疗方案(每周三剂59亿PFU/m2，一周)的头4个患者在首剂后，尽管接受了应用对乙酰氨基酚和布洛芬的预防性退热治疗，还是出现了发热。这些患者的大部分在甚至没有接受退热治疗的情况下，在接受第二剂和第三剂后没有发热。因此，有强有力的证据表明，每周三次方案的首剂给药可以降低第二剂和第三剂的毒性。
血清存在中和抗体的给药
该I期研究应用的剂量范围(≥59亿PFU/m2)清楚显示，即使患者已经产生了中和抗体，还是能够有效地将病毒传递给患者。一个患有胰腺癌的72岁女性患者，自从接受120亿PFU/m2单剂PPMK107治疗后，疾病处于稳定状态2个月。第二疗程是在首剂后一个月进行的(包括单剂PPMK107静脉注射)，当时在患者血清中已产生中和抗体。第二疗程后7天，患者尿样检测PPMK107呈阳性，滴度至少为。
其他证据也提示尽管存在中和抗体，应用该试验剂量范围(≥59亿PFU/m2)可以获得抗肿瘤效应，这一证据是从一例58岁乳腺癌患者得到的，该患者的癌症已扩展到胸壁。如在探讨肿瘤消退的部分所示，在第二疗程的治疗中，该患者胸壁肿瘤消退～90％。这一效应发生在第一疗程后5-6周，也就是该患者的抗体滴度从1∶256(第5周开始时)上升到＞1∶2560(第6周开始时)时。其他证明尽管存在中和抗体，但病毒依然有效地传递给该患者的证据是，在第5周末(该患者在第5周开始时的基线尿检为阴性)，尿样检测阳性(20-40PFU/mL)。
这些结果提示，第二疗程这些患者血清中的抗PPMK107中和抗体即不能完全抑制病毒，也不能抑制病毒的抗肿瘤效应。
                     实施例21
新城疫病毒PPNJROAKIN细胞毒试验结果总结
在24孔组织培养平板上，人类肿瘤细胞和正常细胞生长至大约80％汇合。移去生长基质，以10倍稀释比例加入噬斑纯化的中等毒力新城疫病毒株新泽西Roakin-1946，即PPNJROAKIN，范围为107平板形成单位(PFU)/孔-1PFU/孔。每个平板都包括未加入病毒的对照孔。在摇摆平台上37℃吸收病毒90分钟。在孵育期结束时，移去病毒稀释液，加入1ml的生长基质。然后在37℃5％CO2条件下孵育5天。细胞毒性应用MTT(2-[4，5-二甲基噻唑-2-yI]-2，5-联苯四唑溴)比色法(细胞滴度96，分类号#G4000，Promega公司，MadisonWI 53711)定量测定，在570nm测定线粒体酶活性(Mosman，T.，1983，免疫学方法杂志，65：55)。病毒处理孔的活力用未接受病毒处理对照孔活性的百分比表示。数据应用PFU/孔比对照活力百分比绘图。IC50应用导致存活细胞50％下降的每孔病毒的PFU量来计算。
表21.PPNJROAKIN细胞毒试验结果总结
细胞类型         细胞系   IC(PFU/孔) 纤维肉瘤          HT1080       13.8头颈部肿瘤          KB         2.4正常成纤维细胞   CCD922sk     1.2×104
这些结果提示，PPNJROAKIN显示了相对于正常皮肤成纤维细胞，对至少两种不同的人类肿瘤细胞(HT1080和KB)具有肿瘤选择性杀伤作用。对两种肿瘤细胞系的IC50值较正常细胞低800-5000倍。
                     实施例22
新城疫病毒PPCONN70726细胞毒试验结果总结
在24孔组织培养平板上，人类肿瘤细胞和正常细胞生长至大约80％汇合。移去生长基质，以10倍稀释比例加入噬斑纯化的中等毒力新城疫病毒株Connecticut 70726-1946，即PPCONN70726，范围为107平板形成单位(PFU)/孔-1PFU/孔。每个平板都包括未加入病毒的对照孔。在摇摆平台上37℃吸收病毒90分钟。在孵育期结束时，移去病毒稀释液，加入1ml的生长基质。然后在37℃5％CO2条件下孵育5天。细胞毒性应用MTT(2-[4，5-二甲基噻唑-2-yl]-2，5-联苯四唑溴)比色法(细胞滴度96，分类号#G4000，Promega公司，Madison WI 53711)定量测定，在570nm测定线粒体酶活性(Mosman，T.，1983，免疫学方法杂志，65：55)。病毒处理孔的活力用未接受病毒处理对照孔活性的百分比表示。数据应用PFU/孔比对照活力百分比绘图。IC50应用导致存活细胞50％下降的每孔病毒的PFU量来计算。
表22.PPCONN70726细胞毒试验结果总结
细胞类型         细胞系   IC(PFU/孔) 头颈部肿瘤          KB         18.1成胶质细胞瘤       U87MG       12.7成胶质细胞瘤       U373MG      879正常成纤维细胞     CCD922sk   7.3×104
这些结果提示，PPCONN70726显示了相对于正常皮肤成纤维细胞，对至少三种不同的人类肿瘤细胞(KB，U87MG和U373MG)具有肿瘤选择性杀伤作用。对两种肿瘤细胞系的IC50值较正常细胞低80-5000倍。
                     实施例23
应用PPMK107，PPNJROAKIN或PPCONN70726瘤体内治疗无胸腺小鼠HT1080纤维肉瘤异种移植物
在该试验中，无胸腺小鼠(雌性，NCR nu/nu，5-6周龄)皮下注射107HT1080肿瘤细胞。4天后，当肿瘤生长达到6-8.5mm大小时，瘤体内应用PPMK107(1×108PFU)，PPNJROAKIN(1×108PFU)或PPCONN70726(1×108PFU)治疗小鼠。如下表23所示，应用三种病毒(PPMK107，PPNJROAKIN和PPCONN70726)治疗的小鼠出现肿瘤消退。PPMK107治疗后，12只小鼠中有4只肿瘤完全消退，6只部分消退。PPNJROAKIN治疗后，12只小鼠中有1只肿瘤完全消退，2只部分消退。PPCONN70726治疗后，12只小鼠中有3只肿瘤完全消退，2只部分消退。应用生理盐水处理的小鼠中，没有一只出现肿瘤消退。
表23.应用三种病毒(PPMK107，PPNJROAKIN和PPCONN70726)中的一种治疗无胸腺小鼠HT1080纤维肉瘤的肿瘤消退。每种病毒的治疗剂量为1×108PFU。
               消退
治疗 小鼠数量 部分(PR) 完全(CR)  PR+CR(％)
PPMK107  12  6  4  10(83％)
PPNJROAKIN  12  2  1  3(25％)
PPCONN707726  12  2  3  5(42％)
生理盐水  11  0  0  0(0％)
                     实施例24
免疫缺损的无胸腺小鼠(nu/nu)和有免疫能力的杂合体小鼠(nu/+)脑内注射PPMK107，PPNJROAKIN或PPCONN70726的效应
56只无胸腺小鼠(nu/nu)和56只有免疫能力的杂合体小鼠(nu/+)应用脑内空间定位技术给予脑内注射生理盐水，PPMK107，PPNJROAKIN或PPCONN70726。每种小鼠中都有另外8只作为无治疗对照组。应用的病毒剂量是两种剂量水平中的一种(2×104或3.5×106PFU/鼠)。如下表24所示，所有应用两种剂量水平的三种病毒处理的杂合体小鼠(nu/+)在39天内存活，只有1只应用低剂量PPCONN70726处理的小鼠被无痛处死，处死原因不是因为神经系统症状。应用PPMK107或PPCONN70726处理的无胸腺nu/nu动物较杂合体生存显著减少。特别是对于最高剂量的PPMK107或PPCONN70726病毒，所用剂量为3.5×106PFU/鼠，在每个病毒处理组中，在39天内只有13％(8只小鼠中有1只)无胸腺动物存活。相反，相同剂量水平(3.5×106PFU/鼠)PPNJROAKIN处理的无胸腺小鼠有75％存活。这些数据显示，PPNJROAKIN较其他两种病毒株在无胸腺小鼠大脑内可以更好地耐受。
表24.脑内注射PPMK107，PPNJROAKIN或PPCONN70726后的小鼠存活
 脑内注射 小鼠数量 第39天的存活％
 nu/+  未处理  8   100
 nu/+  生理盐水  8   100
 nu/+  PPMK107，2E+04  8   100
 nu/+  PPMK107，3.5E+06  8   100
 nu/+  PPCONN70726，2E+04  8   88*
 nu/+  PPCONN70726，3.5E+06  8   100
 nu/+  PPNJROAKIN，2E+04  8   100
 nu/+  PPNJROAKIN，3.5E+06  8   100
 nu/nu  未处理  8   100
 nu/nu  生理盐水  8   100
 nu/nu  PPMK107，2E+04  8   75
 nu/nu  PPMK107，3.5E+06  8   13
 nu/nu  PPCONN70726，2E+04  8   75
 nu/nu  PPCONN70726，3.5E+06  8   13
 nu/nu  PPNJROAKIN，2E+04  8   100
 nu/nu  PPNJROAKIN，3.5E+06  8   75
*该治疗组未存活的一只小鼠由于非神经系统症状被无痛致死。
                     实施例25
新培斯病毒PPSINDBIS-Ar339细胞毒试验结果总结
在24孔组织培养平板上，人类肿瘤细胞和正常细胞生长至大约80％汇合。移去生长基质，以10倍稀释比例加入噬斑纯化的新培斯病毒株Ar-339，即PPSINDBIS-Ar339，范围为107平板形成单位(PFU)/孔-1PFU/孔。每个平板都包括未加入病毒的对照孔。在摇摆平台上37℃吸收病毒90分钟。在孵育期结束时，移去病毒稀释液，加入1ml的生长基质。然后在37℃5％CO2条件下孵育5天。细胞毒性应用MTT(2-[4，5-二甲基噻唑-2-yl]-2，5-联苯四唑溴)比色法(细胞滴度96，分类号#G4000，Promega公司，Madison WI 53711)定量测定，在570nm测定线粒体酶活性(Mosman，T.，1983，免疫学方法杂志，65：55)。病毒处理孔的活力用未接受病毒处理对照孔活性的百分比表示。数据应用PFU/孔比对照活力百分比绘图。IC50应用导致存活细胞50％下降的每孔病毒的PFU量来计算。
表25.PPSINDBIS-Ar339细胞毒试验结果总结
细胞类型          细胞系    IC50(PFU/孔)胰腺癌            Panc-1*      69直结肠癌          SW620*       13直结肠癌          SW1463      1.8×105非小细胞肺癌      A427        ＞1×106非小细胞肺癌      A549        5.2×104肾癌              A498        2.4×104肾癌              Caki-1      3.4×104纤维肉瘤          HT1080      7.4×105正常角化细胞      NHEK        2.0×105正常成纤维细胞    CCD922sk    1.6×105
*已知细胞过量表达高亲和力层粘连蛋白受体mRNA。
哺乳动物细胞对新培斯病毒的细胞受体是高亲和力层粘连蛋白受体，该受体主要在上皮系细胞中表达，但通常在多种转移癌症细胞上过量表达，如胰腺癌Panc-1细胞系，以及结肠腺癌SW620细胞系(Campo等，(1992)美国病理学杂志，141：1073-1083；Yow等，(1988)Proc.Natl Acad Sci，85：6394-6398)。相反，已知直肠腺癌SW1463细胞系高亲和力层粘连蛋白受体mRNA表达水平非常低(Yow等，(1988)Proc.Natl Acad Sci，85：6394-6398)，对PPSINDBIS-Ar339的杀伤耐受性较SW620细胞高4个数量级。这些结果提示具有致癌性并表达高亲和力层粘连蛋白受体的细胞，较其他肿瘤或正常细胞对新培斯病毒克隆PPSINDBIS-Ar339的杀伤更加敏感。
                     实施例26
在干扰素存在的情况下，VSV杀伤致癌和非致癌细胞
在有系列稀释α干扰素的96孔板接种致癌细胞KB、HT1080(3×104细胞/孔)以及非致癌细胞WISH(2.5×104细胞/孔)，α干扰素的范围为2800-22单位/ml，37℃孵育24小时。如何用疱疹性口炎病毒(VSV，Indiana株)以moi 10感染这些细胞。对照组包括没有干扰素的孔，以及没有干扰素或病毒的孔。细胞37℃孵育24小时。细胞毒性应用MTT(2-[4，5-二甲基噻唑-2-yl]-2，5-联苯四唑溴)比色法(细胞滴度96，分类号#G4000，Promega公司，Madison WI53711)定量测定，在570nm测定线粒体酶活性(Mosman，T.，1983，免疫学方法杂志，65：55)。病毒处理孔的活力用未接受病毒处理对照孔活性的百分比表示。
表26.VSV对外源性干扰素处理细胞的杀伤活性比较
    有活力细胞百分比
WISH  HT1080  KB
  0U/ml IFN  0  0  0
  100U/ml IFN  50  6  0
  1000U/ml IFN  95  20  12
这些结果显示VSV可以选择性杀伤具有干扰素应答缺陷的肿瘤细胞(见实施例27)。WISH(人类羊膜细胞)细胞是已经良好建立的用于干扰素生物试验的细胞系，因为它们具有对干扰素有效应答的能力。
                     实施例27
对PPMK107杀伤作用敏感或耐受细胞的干扰素反应性
各种细胞系在96微孔板内生长至接近汇合，应用5和5000单位/mlα干扰素处理24小时。然后用PPMK107以moi 1.0感染培养细胞，并继续培养24小时。化学固定后，病毒表达量用可溶性指示剂免疫组化法量化。病毒生长量用相对于未接受干扰素处理的对照孔P抗原表达百分比代表(图5)。在此试验中，干扰素反应性细胞对干扰素作出应答，表达抗原显示至少50％的下降。
该试验结果显示，在细胞系对外源性干扰素抗病毒效应的耐受性和这些细胞对PPMK杀伤敏感性(见图5，用在图例细胞系名称后面圆括号内显示的IC50值表示)之间有强关联。例如，在5单位/mlα干扰素预处理后，对干扰素无反应能力的7个细胞系中有6个(86％)对PPMK杀伤敏感；在500单位/ml干扰素预处理后，对干扰素无反应能力的所有细胞系(4个中有4个)对PPMK杀伤敏感。
上述数据还为鉴定对PPMK107或其他干扰素敏感病毒的杀伤敏感的备选细胞提供了筛查试验方法。例如，在外源性干扰素预处理后，感染细胞明显表达(如，超过对照50％以上)病毒抗原可以认为是干扰素缺陷，因此对病毒的溶瘤细胞作用敏感。
                     实施例28
静脉应用脱敏剂量PPMK107可以降低随后腹膜内给予PPMK107的致死性
第0天给小鼠静脉注射生理盐水或脱敏剂量的PPMK107(3×108PFU/鼠)。2天后，每批小鼠再进一步分成若干亚组，腹膜内给予生理盐水或PPMK107(剂量为1×109，2.5×109，5×109，和1×1010PFU/鼠)。如下表27所示，当应用生理盐水预处理小鼠时，随后给予剂量2.5×109，5×109，和1×1010PFU的小鼠有死亡记录。对于生理盐水预处理的小鼠，剂量2.5×109，5×109，和1×1010PFU的致死性分别为25％，50％和100％。相反，应用静脉脱敏的小鼠，在剂量为2.5×109，5×109PFU的组中没有死亡，在剂量为1×1010PFU组中死亡率仅为38％。这些数据提示静脉给予PPMK107可被用来脱敏，降低随后通过其他方式(在此实施例中，是腹膜内途径)给予的相同制剂的毒性。而且，当应用该病毒作为脱敏剂时，PPMK107的最大耐受剂量可以增加大约5倍。
表27.静脉应用脱敏剂量PPMK107可以降低随后腹膜内给予PPMK107的致死性
 组  第0天注射  第2天给予 小鼠数量 死亡数量 致死性％
 1  生理盐水  生理盐水  8  0  0
 2  生理盐水  PPMK107，1.0E+09  8  0  0
 3  生理盐水  PPMK107，2.5E+09  8  2  25
 4  生理盐水  PPMK107，5.0E+09  8  4  50
 5  生理盐水  PPMK107，1.0E+10  8  8  100
 6  PPMK107，3E+08  生理盐水  8  0  0
 7  PPMK107，3E+08  PPMK107，1.0E+09  8  0  0
 8  PPMK107，3E+08  PPMK107，2.5E+09  8  0  0
 9  PPMK107，3E+08  PPMK107，5.0E+09  8  0  0
 10  PPMK107，3E+08  PPMK107，1.0E+10  8  3  38
                     实施例29
应用脱敏剂量的PPMK107增加随后腹膜内给予的PPMK107的抗肿瘤效应
在该实施例中，具有肉眼可见腹水肿瘤的无胸腺小鼠应用腹膜内给予的PPMK107治疗，所述腹水肿瘤来源于人卵巢癌细胞系ES-2，治疗前2天，或者静脉应用3×108PFU/鼠脱敏，或者不脱敏。如表28所示，腹膜内应用生理盐水处理的对照小鼠迅速死于腹水肿瘤，处理后第9天的存活率仅为8％。腹膜内给予最大耐受剂量PPMK107可以在第9天增加存活百分比至46％。应用静脉脱敏，较未脱敏小鼠可以耐受更高剂量的PPMK107，如2.5×109和5×109PFU，导致存活率几乎翻番(分别为83％和79％)，而未脱敏小鼠可以达到的最高剂量是1.0×109PFU。
表28.携带人卵巢癌ES-2腹水肿瘤的小鼠应用腹膜内PPMK107治疗后的存活
IP处理组(PFU/鼠) 无静脉脱敏的生存(第9天) 静脉脱敏的生存(第9天)
生理盐水  2/24(8％)  3/24(13％)
1.0E+09  11/24(46％)  11/24(46％)
2.5E+09a  剂量高于MTD  20/24(83％)
5.0E+09a  剂量高于MTD  19/24(79％)
a-未脱敏时，剂量高于MTD，但脱敏后，剂量低于MTD。
                     实施例30
抗重组鼠αTNF抗血清可以阻断小鼠静脉注射PPMK107的致死性
在该试验中，16只雌性C57BL/6小鼠一组，静脉注射5.0×109PFU的PPMK107。在处理前5小时，不同组的16只小鼠分别接受抗重组鼠αTNF抗血清(100ul兔血清，用生理盐水1∶10稀释)、相同数量的对照兔血清或生理盐水。如下表29所示，应用兔抗鼠αTNF抗血清可以完全阻断该剂量PPMK107的致死性。
表29.静脉注射5.0E+09PPMK107前应用抗重组鼠αTNF抗血清预处理小鼠的死亡率
PV701剂量 预处理 死亡率
2.5E+09PFU/mouse 生理盐水 5/16
对照兔血清 7/16
抗重组αTNF抗血清 0/16-a
a-死亡率与生理盐水和兔血清对照处理组有显著差异(P＜0.05，Fisher精确检测法)。
                     实施例31
克隆病毒的纯化
很多RNA病毒是通过无沉淀超速离心病毒或随后的切线层流过滤法纯化的。应用下述方法之一纯化：
方法1：如实施例15的方法A。
方法2：如实施例15的方法B。
方法3：Vero细胞在生长至大约70％汇合时，以moi 0.01感染Vero细胞，37℃孵育18小时。然后将装有感染细胞的长颈瓶-70℃冷藏。室温下解冻细胞，然后冰浴至收获。收获时，将细胞刮下，放入感染培养基，4℃1750×g离心澄清30分钟。收集上清液，并置于20％/55％不连续梯度中，以大约100,000×g离心30分钟。在20％/55％界面上收获纯化的病毒，并通过不含钙、镁的PBS透析去除蔗糖。
病毒制剂的活性通过平板试验法测定，新城疫病毒应用HT1080细胞，疱疹性口炎病毒应用Veco细胞。病毒制剂中的蛋白含量通过NanoOrange蛋白定量试剂盒(分子探针股份有限公司，Eugene，OR)测定，应用牛血清白蛋白作为蛋白标准。
表30.通过无沉淀超速离心法或切线层流过滤法纯化的多种克隆RNA病毒的特异活性
病毒 病毒克隆 纯化方法 特异活性(PFU/mg蛋白)
新城疫-MK107病毒株 PPMK107  1  1.3E+11
新城疫-MK107病毒株 PPMK107  2  1.0E+11
新城疫-Roakin病毒株 PPNJROAKIN  1  1.0E+11
新城疫-ConnH病毒株 PPCONN70726  1  2.1E+10
疱疹性口炎-Indiana病毒株 PPVSV  3  4.5E+9
这些结果显示了应用本发明所述方法纯化不同克隆RNA病毒至高特异活性的能力。
                     实施例32
新培斯病毒PPSINDBIS-Ar339可以导致携带人肿瘤细胞异种移植物无胸腺小鼠的肿瘤抑制
无胸腺小鼠皮下注射1千万人类腺癌肿瘤细胞SW620。5天后，单剂PPSINDBIS-Ar339(10只小鼠，5×106PFU)或生理盐水(9只小鼠)注射治疗肿瘤(平均大小＝78mm3)。每周两次测量肿瘤大小和小鼠体重，直至研究结束。治疗后12天，生理盐水处理组小鼠平均肿瘤大小增长平均为896％(从71.3mm3到639.1mm3)。
表31.应用PPSINDBIS-Ar339瘤体内治疗人结肠腺癌SW620异种移植物
治疗后时间 肿瘤生长抑制a
5天 89％
9天 90％
12天 87％
a-肿瘤生长抑制％＝(对照组增长％-肿瘤组增长％)×100/对照组增长％
这些数据显示单剂注射PPSINDBIS-Ar339较生理盐水可以显著抑制肿瘤生长。小鼠对PPSINDBIS-Ar339治疗耐受良好，证据是无论在生理盐水组还是病毒治疗组，均未出现体重减轻。
                     实施例33
属于不相关科的病毒显示了对人类肿瘤细胞系的相似活性
如实施例1和25所述，应用SW620腺癌细胞系和PPMK107(副粘病毒科)或PPSINDBIS-Ar339(披膜病毒科)进行了细胞毒试验(见图6)。这两种不相关病毒通过不同受体进入宿主细胞，并通过每种病毒独特的机制复制。但是，SW620细胞系对这两种病毒感染的反应却及其相似，提示这些病毒杀伤肿瘤细胞的机制可能通过共同的要素。
                     实施例34
应用PPMK107联合化疗系统治疗无胸腺小鼠人类肿瘤异种移植物
无胸腺小鼠皮下注射1千万人纤维肉瘤细胞HT1080。在肿瘤生长达到5-7mm大小后，将小鼠随机分组。小鼠在第0，2，4天接受腹膜内注射生理盐水媒介基质。在第2天，腹膜内注射1小时后，静脉注射PPMK107，剂量为2×107pFU或生理盐水。在第0，2或4天腹膜内注射卡铂(carbo)，剂量为160mg/kg。每组完全消退(CR)和部分消退(PR)的百分比显示如下。每个治疗组有9只携带肿瘤的小鼠。表32.PPMK107联合卡铂系统治疗无胸腺小鼠皮下人类HT1080纤维肉瘤异种移植物
治疗     CR+PR(％)
生理盐水，第0，2，4天     0
PPMK107，第2天     44
卡铂，第0天     0
卡铂，第2天     11
卡铂，第3天     11
PPMK107，第2天卡铂，第0天     67
PPMK107，第2天卡铂，第2天     78
PPMK107，第2天卡铂，第4天     55
表32显示的这些结果提示，皮下HT1080肿瘤对静脉注射PPMK107治疗有反应，在PPMK107处理前2天、同一天或处理后2天联合卡铂治疗，肿瘤消退(CR+PR)百分比较单独应用PPMK107或单独应用卡铂高。
                     实施例35
应用PPMK107联合卡铂系统治疗无胸腺小鼠人类HT1080肿瘤异种移植物的第二次试验
如实施例34，无胸腺小鼠皮下注射1千万人纤维肉瘤细胞HT1080。在治疗的第0天，给小鼠腹膜内注射卡铂(carbo)，剂量为80mg/kg或120mg/kg，或生理盐水媒介基质，然后在治疗的第2天，静脉注射PPMK107(剂量为，6×106，或2×107PFU)。每组完全消退(CR)和部分消退(PR)的百分比显示如下。每个治疗组有9只携带肿瘤的小鼠。表33.PPMK107联合卡铂系统治疗无胸腺小鼠皮下人类HT1080纤维肉瘤异种移植物
  治疗     剂量   CR+PR(％)
 生理盐水     0
 PPMK107  6E+06PFU     22
 PPMK107  2E+07PFU     56
 卡铂  80mg/kg     33
 卡铂  120mg/kg     22
 PPMK107卡铂  6E+06PFU80mg/kg 78
 PPMK107卡铂  6E+06PFU120mg/kg 44
 PPMK107卡铂  2E+07PFU80mg/kg 67
 PPMK107卡铂  2E+07PFU120mg/kg 100
表33显示的这些结果提示，皮下HT1080肿瘤对每个剂量水平的静脉注射PPMK107治疗均有反应，在PPMK107处理前2天联合任一剂量的卡铂治疗，肿瘤消退(CR+PR)百分比较单独应用PPMK107或单独应用卡铂高。
                     实施例36
应用PPMK107联合卡铂系统治疗无胸腺小鼠人类HT1080肿瘤异种移植物的第三次试验
如实施例34，无胸腺小鼠皮下注射1千万人纤维肉瘤细胞HT1080。在治疗的第0天，给小鼠腹膜内注射卡铂(carbo)，剂量为60mg/kg，或生理盐水媒介基质，然后在治疗的第2天，静脉注射PPMK107(剂量为6×106PFU)。每组完全消退(CR)和部分消退(PR)的百分比显示如下。每个治疗组有9只携带肿瘤的小鼠，但卡铂单独治疗组有8只小鼠。
表34.PPMK107联合卡铂系统治疗无胸腺小鼠皮下人类HT1080纤维肉瘤异种移植物
治疗     CR+PR(％)
生理盐水     0
PPMK107     44
卡铂     25
PPMK107卡铂     89
表34显示的这些结果提示，皮下HT1080肿瘤对静脉注射PPMK107治疗有反应，在PPMK107处理前2天联合卡铂治疗，肿瘤消退(CR+PR)百分比较单独应用PPMK107或单独应用卡铂高。
                     实施例37
应用皮质类固醇(地塞米松)降低静脉注射PPMK107的致死性
雌性无胸腺小鼠(6-7周龄)在第0，1，2，3和4天腹膜内注射地塞米松(一组的剂量为25mg/kg，另一组的剂量为10mg/kg)或生理盐水。所有动物在第2天(腹膜内注射地塞米松或生理盐水1小时后)静脉注射(剂量为3×109PFU/鼠)。观察动物，并将致死性列于下表33。
表35.应用地塞米松降低静脉注射PPMK107的致死性
组 第0，1，2，3和4天腹膜内治疗 第2天静脉治疗     致死性(％)
 1 地塞米松(25mg/kg) PPMK107，3.0E+09     7
 2 地塞米松(10mg/kg) PPMK107，3.0E+09     0
 3 生理盐水 PPMK107，3.0E+09     67
腹膜内给予生理盐水的对照小鼠，剂量为3×109的PPMK107可使67％小鼠致死。地塞米松可以显著降低PPMK107的致死性，给予25mg/kg地塞米松的小鼠，观察到的死亡率仅为7％，而给予10mg/kg地塞米松的小鼠，观察到的死亡率为0％。这些数据提示皮质类固醇如地塞米松可用于降低静脉注射PPMK107的毒性。
                    × × × ×
前述内容旨在描述本发明，而非限制本发明。在不背离本发明真正意旨和范围的情况下，可以进行多种改变和修饰。

Claims (156)

1.应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法，包括将具有复制能力的干扰素敏感性克隆RNA病毒给予所述哺乳动物。
2.应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法，包括将具有复制能力的克隆RNA病毒给予所述哺乳动物，其中所述病毒对干扰素具有敏感性。
3.治疗哺乳动物肿瘤的方法，包括给所述哺乳动物应用治疗有效剂量的具有复制能力的干扰素敏感性克隆RNA病毒。
4.权利要求1的方法，其中RNA病毒在有干扰素存在的情况下，相对于无干扰素存在的情况，复制减少至少100倍。
5.权利要求1的方法，其中RNA病毒在有干扰素存在的情况下，相对于无干扰素存在的情况，复制减少至少1000倍。
6.权利要求1的方法，其中所述给予病毒的步骤是系统性给予。
7.权利要求1的方法，其中所述肿瘤是癌症。
8.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人类。
9.权利要求1的方法，其中所述克隆病毒是经噬斑纯化的。
10.权利要求1的方法，其中所述克隆病毒源于重组克隆病毒。
11.权利要求1的方法，其中所述RNA病毒是副粘病毒。
12.权利要求11的方法，其中所述副粘病毒纯化至至少2×109PFU/mg蛋白水平。
13.权利要求11的方法，其中所述副粘病毒纯化至至少1×1010PFU/mg蛋白水平。
14.权利要求11的方法，其中所述副粘病毒纯化至至少6×1010PFU/mg蛋白水平。
15.权利要求11的方法，其中所述副粘病毒纯化至颗粒/PFU比率不大于5的水平。
16.权利要求11的方法，其中所述副粘病毒纯化至颗粒/PFU比率不大于3的水平。
17.权利要求11的方法，其中所述副粘病毒纯化至颗粒/PFU比率不大于1.2的水平。
18.权利要求11的方法，其中所述副粘病毒是II型禽副粘病毒。
19.权利要求11的方法，其中所述副粘病毒是NDV。
20.权利要求11的方法，其中所述副粘病毒是流行性腮腺炎病毒。
21.权利要求11的方法，其中所述副粘病毒是人类副流感病毒。
22.权利要求1的方法，其中所述RNA病毒选自棒状病毒，披膜病毒，黄病毒，呼肠病毒，细小核糖核酸病毒和冠状病毒。
23.权利要求22的方法，其中所述披膜病毒是新培斯病毒。
24.权利要求22的方法，其中所述呼肠病毒在ω-3上有修饰。
25.权利要求22的方法，其中所述呼肠病毒在ω-1上有减毒突变。
26.权利要求22的方法，其中所述呼肠病毒是减毒轮状病毒。
27.权利要求26的方法，其中所述轮状病毒是轮状病毒WC3。
28.应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法，包括将具有复制能力的干扰素敏感性克隆痘苗病毒给予所述哺乳动物，所述痘苗病毒在一个或多个病毒基因上具有一个或多个突变，所述病毒基因选自K3L，E3L和B18R基因。
29.应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法，包括将具有复制能力的克隆痘苗病毒给予所述哺乳动物，所述痘苗病毒在一个或多个病毒基因上具有一个或多个突变，所述病毒基因选自K3L，E3L和B18R基因，其中，所述病毒对干扰素敏感。
30.应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法，包括将有效治疗剂量的具有复制能力的干扰素敏感性克隆痘苗病毒给予所述哺乳动物，所述痘苗病毒在一个或多个病毒基因上具有一个或多个突变，所述病毒基因选自K3L，E3L和B18R基因。
31.权利要求30的方法，其中所述哺乳动物是人类。
32.权利要求30的方法，其中所述痘苗病毒是具有减毒突变的痘苗病毒，突变基因选自编码痘苗生长因子，胸腺嘧啶脱氧核苷激酶、胸苷酸激酶、DNA连接酶、核苷酸还原酶、和dUTP酶的基因。
33.应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法，包括将具有复制能力的干扰素敏感性克隆DNA病毒给予所述哺乳动物，所述DNA病毒选自腺病毒，细小病毒，乳多空病毒和虹彩病毒。
34.应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法，包括将具有复制能力的克隆DNA病毒给予所述哺乳动物，所述DNA病毒选自腺病毒，细小病毒，乳多空病毒和虹彩病毒，其中，所述病毒对干扰素敏感。
35.治疗哺乳动物肿瘤的方法，包括将治疗有效剂量的具有复制能力的干扰素敏感性克隆DNA病毒给予所述哺乳动物，所述DNA病毒选自腺病毒，细小病毒，乳多空病毒和虹彩病毒。
36.权利要求33的方法，其中所述哺乳动物为人类。
37.权利要求33的方法，其中所述腺病毒在VA1转录本上有修饰，导致所述腺病毒对干扰素敏感。
38.权利要求37的方法，其中所述腺病毒选自Ad-4，Ad-7和Ad-21疫苗株。
39.应用病毒感染哺乳动物治疗的方法，包括将具有复制能力的干扰素敏感性克隆疱疹病毒给予所述哺乳动物。
40.应用病毒感染哺乳动物治疗的方法，包括将具有复制能力的克隆疱疹病毒给予所述哺乳动物，其中所述病毒对干扰素敏感。
41.治疗哺乳动物肿瘤的方法，包括将治疗有效剂量的具有复制能力的干扰素敏感性克隆疱疹病毒给予所述哺乳动物。
42.权利要求41的方法，其中所述疱疹病毒是β疱疹病毒或γ疱疹病毒亚科中的成员。
43.权利要求41的方法，其中所述疱疹病毒是α疱疹病毒亚科中的成员，但不是HSV-1。
44.权利要求41的方法，其中所述哺乳动物是人类。
45.权利要求41的方法，其中所述疱疹病毒是α疱疹病毒亚科中的成员，其(2’-5’)An类似物表达降低。
46.权利要求45的方法，其中所述疱疹病毒是具有减毒突变的疱疹病毒，减毒突变选自编码胸腺嘧啶脱氧核苷激酶、核苷酸还原酶的基因或在b’a’c’倒转重复位点存在缺失。
47.权利要求45的方法，其中所述疱疹病毒在γ34.5基因有修饰。
48.权利要求41的方法，其中所述疱疹病毒在γ34.5基因有修饰，在编码胸腺嘧啶脱氧核苷激酶的基因上存在减毒突变，或在b’a’c’倒转重复位点或功能类似物位点存在缺失。
49.权利要求41的方法，其中所述疱疹病毒是具有减毒突变的疱疹病毒，减毒突变选自编码胸腺嘧啶脱氧核苷激酶、核苷酸还原酶的基因或在b’a’c’倒转重复位点存在缺失。
50.权利要求1的方法，其中所述肿瘤是一种癌症，所述癌症选自肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌和脑癌。
51.权利要求1的方法，其中所述肿瘤是一种实体瘤。
52.权利要求50的方法，其中所述脑癌是成胶质细胞瘤。
53.权利要求1的方法，其中所述病毒含有编码干扰素的基因，使病毒表达干扰素。
54.权利要求1的方法，其中所述病毒含有编码前药激活酶的基因。
55.权利要求1的方法，进一步包括在给予所述病毒之前、期间或之后，给予干扰素。
56.权利要求55的方法，其中所述干扰素选自·-干扰素，·-干扰素，·-干扰素，·-干扰素和合成的同质形式干扰素。
57.权利要求1的方法，进一步包括在给予所述病毒之前、期间或之后，给予酪氨酸激酶抑制剂。
58.权利要求1的方法，进一步包括给予一种化合物，所述化合物选自嘌呤核苷类似物、酪氨酸激酶抑制剂、西咪替叮和线粒体抑制剂。
59.权利要求1的方法，进一步包括在给予所述病毒之前、期间或之后，给予一种化疗药物。
60.权利要求1的方法，进一步包括在给予所述病毒之前、期间或之后，给予一种细胞因子。
61.权利要求1的方法，进一步包括在给予所述病毒之前、期间或之后，给予一种免疫抑制剂。
62.权利要求1的方法，进一步包括给予病毒复制控制剂量的化合物，所述化合物选自干扰素，利巴韦林，无环鸟苷，方昔洛韦(famciclovir)和更昔洛韦。
63.权利要求1的方法，其中所述给药方法是静脉内和肿瘤瘤体内。
64.应用病毒感染哺乳动物大小至少1厘米肿瘤的方法，包括将选自(1)RNA病毒；(2)嗜肝DNA病毒；(3)细小病毒；(4)乳多空病毒；(5)疱疹病毒；(6)痘病毒；和(7)虹彩病毒的克隆病毒给予所述哺乳动物。
65.治疗哺乳动物肿瘤的方法，包括给所述哺乳动物应用治疗有效剂量的克隆病毒，所述病毒选自(1)RNA病毒；(2)嗜肝DNA病毒；(3)细小病毒；(4)乳多空病毒；(5)疱疹病毒；(6)痘病毒；和(7)虹彩病毒，其中所述肿瘤大小至少1厘米。
66.权利要求64的方法，其中所述肿瘤体积至少300mm3。
67.权利要求64的方法，其中所述RNA病毒是副粘病毒。
68.权利要求67的方法，其中所述副粘病毒是NDV。
69.权利要求64的方法，其中所述哺乳动物是人类。
70.权利要求64的方法，其中所述给药方法是静脉内或肿瘤瘤体内。
71.权利要求64的方法，其中所述副粘病毒纯化至至少2×109PFU/mg蛋白水平。
72.权利要求68的方法，其中所述NDV是中等毒力株。
73.权利要求65的方法，其中所述肿瘤是癌性的。
74.治疗哺乳动物肿瘤的方法，包括将治疗有效剂量的细胞毒性RNA病毒给予所述哺乳动物的所述肿瘤，其中所述哺乳动物的肿瘤负荷占所述哺乳动物总体重的至少1.5％。
75.权利要求74的方法，其中所述肿瘤对化疗无反应。
76.筛选从患者处得到的新鲜肿瘤细胞或组织的方法，可以测定该细胞或组织对病毒杀伤力的敏感性，包括应用干扰素敏感性病毒，采用差异细胞毒试验，检测组织样本。
77.权利要求76的方法，还进一步包括筛查所述细胞或组织中蛋白或编码蛋白的mRNA，Ras过量表达，含有活化突变的Ras，其他Ras信号途径介导因子过量表达，不受调控的酪氨酸激酶受体的步骤，所述蛋白选自p68蛋白激酶，C-Myc，C-Myb，ISGF-3，IRF-1，干扰素受体，以及p58。
78.鉴定病毒在哺乳动物中抗肿瘤活性的方法，包括
a)应用测试病毒感染i)干扰素介导的抗病毒活性缺陷性细胞；以及ii)具有干扰素介导的抗病毒活性能力的细胞，并且
b)测定所述测试病毒是否优先杀伤所述干扰素介导的抗病毒活性缺陷性细胞，而非所述具有干扰素介导的抗病毒活性能力的细胞。
79.权利要求78的方法，其中所述干扰素介导的抗病毒活性缺陷性细胞是人类头颈部肿瘤细胞KB。
80.权利要求78的方法，其中所述具有干扰素介导的抗病毒活性能力的细胞是人类皮肤成纤维细胞。
81.制备用于抗肿瘤治疗的病毒的方法，包括：
a)通过降低或消除灭活干扰素抗病毒效应的病毒机制修饰现存病毒，并任选
b)创建减毒突变
82.控制病毒在病毒处理的哺乳动物中复制的方法，包括应用抗病毒化合物，所述病毒选自RNA病毒，腺病毒，痘病毒，虹彩病毒，细小病毒，嗜肝DNA病毒，水痘病毒，β疱疹病毒和γ疱疹病毒。
83.权利要求82的方法，其中所述抗病毒化合物是干扰素。
84.权利要求82的方法，其中所述抗病毒制剂选自利巴韦林，无环鸟苷，方昔洛韦和更昔洛韦。
85.权利要求82的方法，其中所述抗病毒制剂是针对该病毒的中和抗体。
86.应用无沉淀超速离心法纯化的克隆副粘病毒。
87.纯化至至少2×109PFU/mg蛋白的克隆副粘病毒。
88.权利要求87的克隆副粘病毒，其中所述副粘病毒在鸡卵内生长，基本不含污染鸡卵蛋白。
89.权利要求87的克隆副粘病毒，其中所述副粘病毒颗粒/PFU比率不大于5。
90.权利要求87的克隆副粘病毒，其中所述副粘病毒颗粒/PFU比率不大于3。
91.权利要求87的克隆副粘病毒，其中所述副粘病毒颗粒/PFU比率不大于1.2。
92.纯化至至少1×1010PFU/mg蛋白的克隆副粘病毒。
93.纯化至至少6×1010PFU/mg蛋白的克隆副粘病毒。
94.权利要求87的副粘病毒，其中所述病毒是细胞致死性的。
95.权利要求87的副粘病毒，其中所述副粘病毒是新城疫病毒。
96.权利要求95的NDV病毒，其中所述NDV是细胞致死性的。
97.权利要求95的NDV病毒，其中所述NDV是中等毒力株。
98.纯化至至少2×109PFU/mg蛋白的克隆RNA病毒。
99.权利要求98的RNA病毒，其中所述病毒具有复制能力。
100.具有复制能力的细胞致死性病毒，所述病毒对干扰素敏感，并纯化至至少2×109PFU/mg蛋白水平。
101.权利要求100的细胞致死性病毒，其中所述病毒是克隆的。
102.细胞致死性克隆DNA病毒，所述病毒对干扰素敏感，并纯化至至少2×109PFU/mg蛋白水平。
103.权利要求102的细胞致死性DNA病毒，其中所述病毒是痘病毒。
104.权利要求103的痘病毒，其中所述痘病毒是痘苗病毒，所述痘苗病毒在一个或多个病毒基因上具有一个或多个突变，所述病毒基因选自K3L，E3L和B18R基因。
105.具有复制能力的痘苗病毒，含有a)在一个或多个K3L、E3L和B18R基因中含有一个或多个突变，和b)在编码胸腺嘧啶脱氧核苷激酶、核苷酸还原酶、痘苗生长因子、胸苷酸激酶、DNA连接酶、dUTP酶的基因中具有一个或多个减毒突变。
106.具有复制能力的痘苗病毒，所述病毒在选自K3L、E3L和B18R的两个或多个基因中含有一个或多个突变。
107.在(2’-5’)A类似物表达上有修饰的疱疹病毒。
108.在ω-3上有突变的呼肠病毒，并纯化至至少2×109PFU/mg蛋白水平。
109.在ω-1和ω-3上有突变的呼肠病毒。
110.纯化RNA病毒的方法，包括以下步骤：
a)产生克隆病毒，以及
b)应用无沉淀超速离心法纯化所述克隆病毒。
111.权利要求110所述方法，其中所述RNA病毒具有复制能力。
112.纯化副粘病毒的方法，包括应用无沉淀超速离心法纯化所述病毒。
113.权利要求112的方法，其中在所述超速离心之前的其他纯化步骤包括：
a)噬斑纯化产生克隆病毒，
b)用克隆病毒接种鸡卵，
c)孵育鸡卵，
d)冷藏鸡卵，
e)从鸡卵中收获尿囊液，以及
f)从尿囊液中去除细胞残留。
114.权利要求112的方法，其中所述副粘病毒是NDV。
115.应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法，包括将具有复制能力的干扰素敏感性RNA病毒给予所述哺乳动物。
116.权利要求1的方法，其中所述病毒选自新城疫病毒MK107病毒株，新城疫病毒NJRoakin病毒株，新培斯病毒和疱疹性口炎病毒。
117.应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法，包括给予选自新城疫病毒MK107病毒株，新城疫病毒NJRoakin病毒株，新培斯病毒和疱疹性口炎病毒的克隆病毒。
118.权利要求1或权利要求28或权利要求33的方法，其中所述病毒给予超过1剂。
119.权利要求118的方法，其中首剂是脱敏剂量。
120.权利要求119的方法，其中所述首剂通过静脉给药，随后的剂量也通过静脉给药。
121.权利要求119的方法，其中所述首剂通过静脉给药，随后的剂量腹膜内给药。
122.权利要求119的方法，其中所述首剂通过静脉给药，随后的剂量动脉内给药。
123.治疗哺乳动物肿瘤的方法，包括通过免疫试验方法检测所述哺乳动物样本的病毒受体存在量，如果该受体存在，就将能与该受体结合的具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒给予所述哺乳动物。
124.权利要求123的方法，这里所述病毒是新培斯病毒，所述受体是高亲和力层粘连蛋白受体。
125.权利要求1或权利要求28或权利要求33的方法，其中所述病毒在至少4分钟内给予。
126.治疗腹水肿瘤的方法，包括给予具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒。
127.减轻哺乳动物疼痛的方法，包括给予具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒。
128.权利要求1的方法，其中所述病毒在至少20分钟内给予。
129.权利要求1的方法，其中所述病毒剂量至少为5.9×109PFU/m2。
130.权利要求1的方法，其中所述病毒剂量至少为9.6×1010PFU/m2。
131.权利要求1的方法，其中所述病毒纯化至至少3×109PFU/mg蛋白水平。
132.权利要求120的方法，其中所述随后剂量至少为4.8×1010PFU/m2。
133.权利要求120的方法，其中所述随后剂量至少为9.6×1010PFU/m2。
134.感染哺乳动物肿瘤的方法，包括给予选自副粘病毒科，正粘病毒科，棒状病毒科，披膜病毒科，黄病毒科，细小核糖核酸病毒科，冠状病毒科，呼肠病毒科，痘病毒科，疱疹病毒科和细小病毒科的病毒。
135.权利要求134的方法，其中所述披膜病毒是新培斯病毒。
136.权利要求1的方法，其中所述RNA病毒是单链RNA病毒。
137.治疗哺乳动物病毒性疾病的方法，包括将治疗有效剂量的具有复制能力的克隆病毒给予所述哺乳动物。
138.权利要求136的方法，其中所述给药步骤是系统性的。
139.权利要求137的方法，其中所述疾病由选自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或人类免疫缺损病毒的病毒导致。
140.权利要求137的方法，其中所述病毒是副粘病毒。
141.权利要求137的方法，其中所述RNA病毒选自棒状病毒，披膜病毒，黄病毒，细小核糖核酸病毒和冠状病毒。
142.权利要求137的方法，其中所述RNA病毒选自DNA病毒，所述DNA病毒选自腺病毒，细小病毒，乳多空病毒和虹彩病毒，至所述哺乳动物。
143.权利要求1的方法，其中进一步包括在给予步骤之前，筛查所述肿瘤中蛋白或编码蛋白的mRNA，Ras过量表达，含有活化突变的Ras，其他Ras信号途径介导因子过量表达，不受调控的酪氨酸激酶受体，所述蛋白选自p68蛋白激酶，C-Myc，C-Myb，ISGF-3，IRF-1，干扰素受体，以及p58。
144.应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法，包括将具有复制能力的干扰素敏感性克隆RNA病毒给予所述哺乳动物。
145.权利要求1的方法，其中，给予多疗程的病毒。
146.权利要求1的方法，其中所述病毒在首次给药后超过2周，再给予。
147.权利要求1的方法，其中，在给予所述病毒之前、期间或之后给予TNF抑制剂。
148.权利要求147的方法，其中所述抑制剂是TNF抗体。
149.权利要求120的方法，其中所述的随后剂量至少大于首剂2倍。
150.权利要求1的方法，其中，在给予所述病毒前，给予一种脱敏剂。
151.权利要求150的方法，其中所述的脱敏剂是TNF或TNF诱导剂。
152.权利要求151的方法，其中所述TNF诱导剂是IL-2，内毒素或另一种病毒。
153.权利要求59的方法，其中所述化疗药物是铂配位化合物。
154.权利要求153的方法，其中所述铂配位化合物是卡铂。
155.权利要求61的方法，其中所述的免疫抑制剂是皮质类固醇。
156.权利要求155的方法，其中所述皮质类固醇是地塞米松。
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