CN101056646A - 重组新城疫病毒 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是增加溶瘤性NDV的治疗活性。用包括重组核酸的新城疫病毒可以解决这个问题，其中核酸编码当被感染病毒的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的结合蛋白。结合蛋白属于下面的组：天然配体或遗传学修饰的配体、天然受体的重组可溶性结构域或其修饰形式、肽配体、抗体分子及其衍生物或抗体样分子例如锚蛋白重复序列分子或其衍生物。

Description

重组新城疫病毒

引言

本发明涉及用于治疗疾病，特别是用于溶瘤性肿瘤治疗的重组RNA病毒，优选地是副粘病毒，优选地是新城疫病毒(NDV)。生成的重组病毒编码结合蛋白(抗体、锚蛋白重复序列分子、肽等)、前体药物转换酶和/或蛋白酶，并造成这些分子在感染病毒的肿瘤细胞内的选择性表达。这些结合蛋白、前体药物转换酶和/或蛋白酶的活性都增强了病毒的抗肿瘤作用。本发明还描述了这些修饰病毒的生产以及其用于癌症治疗的用途。

背景技术

新城疫病毒

Chiocca(2002)综述了常常用于肿瘤治疗的溶瘤性病毒。新城疫病毒已经被用作试验性治疗药物超过了40年，Sinkovics和Horvath(2000)对此有所综述。在Alexander(1988)的书中描述了常见的新城疫病毒。NDV株PV701正被开发作为治疗胶质瘤的抗癌药物(Lorence等，2003)。NDV株MTH68已经被用作试验性癌症治疗药物，并已经施用给人体超过30年(Csatary et al.，2004)。

在Stojdl等(2003)的文章中，所有被测试的细胞系中有80％在感染水泡性口膜炎病毒(VSV)之后都有着干扰素应答的缺陷。可以推测出相似百分比的肿瘤细胞系将易感于NDV的感染，因为VSV和NDV都是单分子负链RNA病毒目的成员。也已经显示出NDV在肿瘤细胞内的选择性复制的机制是依据于细胞的抗病毒的干扰素应答的缺陷(见例如US：20030044384)。

重组副粘病毒

EP-A-0702085涉及遗传学加工过的传染性复制型非节段性负链RNA病毒突变体，其包括病毒基因组的可读框、拟基因区或基因间区内的插入和/或缺失。

WO 99/66045涉及从病毒基因组的全长cDNA分子中获得的遗传学加工过的NDV病毒。

WO 00/62735涉及肿瘤治疗的方法，其包括施用干扰素敏感的、复制型克隆性RNA病毒，例如NDV。

在WO 01/20989(PCT/US00/26116)中，描述了用重组溶瘤性副粘病毒治疗肿瘤患者的方法。通过施用复制型副粘病毒使得肿瘤缩小。描述了各种能被用于遗传加工病毒基因组以提高溶瘤性能的方法。

WO 03/005964涉及包括编码细胞因子的核酸的重组VSV。

US 6,699,479描述了以低水平表达V蛋白并在编辑位点(editinglocus)上包括核苷酸取代的NDV突变体。

US 2004/0170607涉及通过施用非常见人类病原体的病毒治疗黑色素瘤。

NDV的遗传学加工

利用如在EP-A-0702 085中所述的反求遗传学技术可以遗传学加工NDV。已知能制备出包括附加核酸的重组NDV构建体，所述核酸编码分泌型碱性磷酸酶(Zhao and Peeters，2003)、绿荧光蛋白(Engel-Herbert etal.，2003)、传染性粘液囊病病毒的VP2蛋白(Huang et al.，2004)、流感病毒血凝素(Nakaya et al.，2001)、和氯霉素乙酰转移酶(Huang et al.，2001)(Krishnamurthy et al.，2000)。还没有构建出用于治疗人类疾病的这些重组NDV。这些重组NDV被用于研究NDV的基础病毒学或开发家禽的疫苗株。因为亲代病毒株是NDV的轻型毒株(lentogenic strains)，所以这些病毒株都不具有显著的溶瘤性能。

发明内容

本发明涉及具有增强的溶瘤性活性的RNA病毒例如NDV。更具体地，本发明涉及RNA病毒，特别涉及包含具有治疗癌症的治疗活性的重组核酸的新城疫病毒，其中所述核酸编码结合蛋白、前体药物转换酶和/或蛋白酶，当所述结合蛋白、前体药物转换酶和/或蛋白酶在感染病毒的肿瘤细胞内表达时，其具有治疗活性。

更优选地是包含一种或多种转基因的溶瘤性病毒，例如NDV，其中转基因编码结合蛋白、和前体药物转换酶和/或蛋白酶。不同特异性的组合是有可能的。

本发明还涉及如上所述的重组蛋白的核衣壳，其包括与衣壳蛋白复合的病毒RNA，或者涉及分离形式的病毒RNA和/或与所述病毒RNA互补的RNA。

本发明还涉及DNA，例如编码病毒RNA的cDNA和/或与所述病毒RNA互补的DNA。此外，本发明涉及肿瘤疾病的预防或治疗。

具体实施方式

病毒

本发明一般涉及RNA病毒，优选地涉及负链RNA病毒，更优选地涉及这些具有溶瘤性能以及可以被遗传加工的病毒。这些病毒是：

-副粘病毒，优选地是新城疫病毒(NDV)、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、仙台病毒；

-正粘病毒，优选地是流感病毒；

-杆状病毒，优选地是水泡性口膜炎病毒。

因此，本发明的主题是包含具有至少一种转基因的核酸的重组溶瘤性RNA病毒，其中该转基因的核酸编码结合蛋白，当所述结合蛋白被感染病毒的肿瘤细胞表达时，其具有治疗活性。

本发明的另一主题是包含具有至少一种转基因的核酸的重组溶瘤性RNA病毒，其中该转基因的核酸编码前体药物转换酶，当所述前体药物转换酶被感染病毒的肿瘤细胞表达时，其具有治疗活性，所述RNA病毒优选地与所述前体药物相组合。

本发明的另一主题是包含具有至少一种转基因的核酸的重组溶瘤性RNA病毒，其中该转基因的核酸编码蛋白酶，当所述蛋白酶被感染病毒的肿瘤细胞表达时，其具有治疗活性。

本发明的病毒优选地表现出肿瘤选择性的感染，这造成了所编码的转基因发生肿瘤选择性的表达。

本发明的重组溶瘤性病毒可以携带有至少一种转基因基因，其独立地选自编码结合蛋白、前体药物转换酶和/或蛋白酶的转基因。

优选地，本发明的病毒是负链RNA病毒，更优选地是副粘病毒。

就本发明而言，具有至少一种转基因的核酸是包含异源于本发明的重组RNA病毒所基于的溶瘤性RNA病毒的基因的核酸。术语“异源”指的是整个基因或其一部分，其可以是基因的编码区或其一部分。

异源基因可以是人工序列，或者可以从天然来源中获得，或者可以通过将选自从天然来源获得的序列和/或人工序列中的至少两种序列进行重组而获得。“天然来源”包括动物例如哺乳动物、植物、真菌、和微生物例如细菌、原虫和病毒，其可以与本发明的其它溶瘤性RNA病毒有所不同。转基因也可以编码融合蛋白。哺乳动物包括人和小鼠。

在特别优选的实施方式中，本发明的病毒是新城疫病毒(NDV)，最优选地是NDV株MTH68。NDV可以是轻型毒株(lentogenic strain)、中等毒力株(mesogenic strain)或强毒株(velogenic strain)。特别优选地是中等毒力的或强毒的NDV株。病毒优选地是复制型的。

病毒的遗传学加工

如上所述，用于遗传学加工RNA病毒的方法是公知的。此外，例如Bell等(2002)综述了对溶瘤性病毒的遗传学加工。Russell(2002)综述了作为病毒治疗性药物的RNA病毒。在此通过引用将这些文档的所有内容并入本申请。

结合蛋白

在本发明的溶瘤性重组RNA病毒中，至少一种转基因可以编码结合蛋白。

结合蛋白是当在靶细胞内表达时能结合所述细胞和/或邻近细胞的组分的蛋白。优选地，结合蛋白是结合细胞内组分的蛋白。

在一个优选的实施方式中，结合蛋白属于下面的组：天然配体或遗传学修饰过的配体；天然受体的重组可溶性结构域或其修饰形式，例如肽或多肽配体；抗体分子和其片段及衍生物或抗体样分子及其衍生物。

Ladner和Ley(2001)给出了对高亲和力的结合构架的不完全的综述。

如上所述的结合蛋白可以是人源的、鼠源的或密切相关来源的或者是嵌合形式即蛋白可以是包括来自不同物种例如人和小鼠的序列的融合蛋白。

基于以上描述的重组结合分子可以是单体的、二聚体的、三聚体的、四聚体的或多聚体的分子以及双特异性的或多特异性的分子。

优选的结合蛋白选自具有治疗活性的结合蛋白。

如上所述的天然配体可以是生长因子或肽。遗传学修饰过的配体可以是天然存在的生长因子或肽的类似物。

如上所述的天然受体的重组可溶性结构域或其修饰形式是重组表达的细胞表面受体和/或其片段的可溶性的细胞外结构域、重组表达的细胞粘附分子和/或其片段的可溶性的细胞外结构域。

上面提及的抗体分子可以是具有任何已知的特异性和同种型的单克隆免疫球蛋白抗体、其片段和/或其与效应物蛋白融合的片段。抗体分子可以是嵌合的、人源化的或人抗体。抗体片段含有至少一个抗体的抗原结合结构域。在文献中已经广泛地描述了抗体片段(例如Allen(2002)的综述，在此通过引用将其并入本申请)。优选的实例是单链Fv片段、Fab片段、F(ab2’)、结构域缺失形式(叫作迷你抗体)、和其它免疫活性部分、片段、段和其它更小的或更大的部分抗体结构，其中后者具有充分的靶向性能或免疫学刺激或抑制活性，这使得其在本发明的方法中具有治疗上的用途。

这些抗体可以源自应用转基因小鼠的杂交瘤克隆试验或者源自噬菌体展示选择、核糖体展示选择或对含有人抗体序列的抗体文库的集落过滤筛选(colony filter screening)或相关的方法学。

具有如上所述的抗体样性能的结合蛋白可以是遗传修饰过的蛋白或其结构域，其中一种或多种肽环在其氨基酸水平上是随机化的，使得通过噬菌体展示、核糖体展示、集落过滤筛选或相关方法学可以富集具有针对任一抗原的高特异性的高亲和力的结合分子。所选的蛋白通常具有高的热稳定性和热力学稳定性，并且可以在重组表达系统例如大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物表达载体内较好地表达。这些具有抗体样性能的结合蛋白的实例是如Binz等(2004)所述的锚蛋白重复序列蛋白、如Skerra(2000)所述的lipocalins、如DE199 32 688.6所述的伽玛晶体蛋白、如Hogbom等(2003)或Nord等(2000)所述的修饰蛋白A支架(亲和体(affibodies))或纤维结合蛋白构架等。抗体样分子可以是单体的或重复的分子，或者可以被构建为单链分子或多链分子，其中抗体样分子具有充分的靶向性能或免疫学刺激或抑制活性，使得其在本发明的方法中具有治疗上的用途。

具有附加功能的结合分子

结合蛋白可以是包括治疗一个例如来自抗体和异源结构域的结合结构域的融合蛋白。“异源”的含义与针对异源基因所作讨论中的含义相同。

如上所述的结合蛋白能够将有效负荷(payload)转运到疾病特异性部位(例如肿瘤)，作为所谓的细胞内抗体(intrabody)或作为细胞外有用的结合蛋白。所转运的有效负荷可以是异源的结构域，例如毒素如人RNAse(De Lorenzo et al.，2004)(Zewe et al.，1997)、假单胞外毒素(Chaudhary et al.，1989)(Kreitman and Pastan，1995)(Batra et al.，1992)、白喉毒素(Kreitman et al.，1993)(Chaudhary et al.，1990)(Batra et al.，1991)、或酶例如β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶(Roffler et al.，1991)(Wang etal.，1992)(Bosslet et al.，1992)、β-葡糖苷酶(Rowlinson-Busza，1992)、羧肽酶(Antoniw et al.，1990)(Bagshawe et al.，1988)、具有治疗疗效的β-内酰胺酶、或具有细胞因子活性例如IL-2、IL-12、TNF-α、IFN-β、或GM-CSF的免疫刺激性蛋白(见例如Allen(2002)的综述)。

在另一个实例中，上述的结合蛋白本身就具有拮抗性或激动性效力，这是治疗有用的。拮抗性/阻断性结合分子是VEGF异质性抗体Avastin(Ferrara et al.，2004)、HER2/neu受体阻断性抗体Herceptin(Noonberg andBenz，2000)或EGF受体阻断性抗体Erbitux(Herbst and Langer，2002)。激动性结合分子可以是诱导例如凋亡(Georgakis et al.，2005)或者对DNA、RNA或蛋白具有调节活性(例如诱导转录，稳定蛋白)的结合分子。综述(Adams and lo Weiner，2005)描述了也可以被整合到溶瘤性病毒内的各种治疗性抗体。

前体药物转换酶

在本发明的溶瘤性重组RNA病毒中，至少一种转基因可以编码前体药物转换酶。

前体药物是治疗活性化合物的衍生物或前体，其可以被酶转化成为活性化合物。前体药物转换酶是能够将前体药物转化成治疗活性药物的酶。

因此，本发明的主题是包括作为活性成分的本发明的重组溶瘤性病毒、本发明的病毒基因组、本发明的病毒反基因组、和/或本发明的DNA分子以及任选的药学可接受的载体、稀释剂和/或佐剂的药用组合物，其中病毒、病毒基因组、反基因组和/或DNA分子包括至少一种编码前体药物转换酶的转基因。药物组合物还可以包括可以被病毒、病毒基因组、反基因组和/或DNA分子所编码的前体药物转换酶转化成为治疗活性化合物的前体药物。药物组合物可以适合于治疗和/或缓解增殖性疾病。

前体药物可以与作为活性成分的本发明的重组溶瘤性病毒、本发明的病毒基因组、本发明的病毒反基因组、和/或本发明的DNA分子一起被配制成单个组合物，或者前体药物可以被配制成不同于溶瘤性病毒制剂的组合物。

如果本发明的溶瘤性重组RNA病毒编码前体转换酶，本发明的溶瘤性病毒可以造成在感染病毒的靶细胞(特别是肿瘤细胞)内选择性表达前体药物转换酶，所述靶细胞通常不能或者没有充分表达前体药物转换酶。因此，在治疗所需治疗的对象的过程中，前体药物在靶细胞(特别是肿瘤细胞)内被特异地转化成了药物活性化合物，但是其在非靶细胞(特别是所治疗对象的健康细胞)内基本上不会被转化成治疗活性化合物。因此，与单独利用治疗活性化合物的治疗相比较，减少了治疗活性化合物的不需要的副作用。

就本发明而言，前体药物可以是适用于治疗和/或缓解增殖性疾病的治疗活性化合物的衍生物或前体，其中前体药物可以被前体药物转换酶所转化。前体药物可以是本领域普通技术人员已知的化合物。衍生物和/或前体是本领域普通技术人员已知的。

优选地，前体药物基本上是无药物活性的和/或无毒的。

本发明的前体药物转换酶的实例是β-葡糖醛酸糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、羧肽酶、β-内酰胺酶、D-氨基酸氧化酶。更多的实例是本领域普通技术人员已知的。

优选地，前体药物基本上是无药物活性的和/或无毒的。

可以从选自哺乳动物、植物、真菌、和微生物例如细菌、原虫和病毒的有机体中获得前体药物转换酶。

前体药物转换酶和前体药物的最优选的组合是大肠杆菌β-葡糖醛酸糖苷酶和可以被β-葡糖醛酸糖苷酶转化成活性的细胞毒化合物的前体药物。实例是HMR1826(阿霉素-葡糖苷酸)，其可以被转化成阿霉素，阿霉素是一种已知的治疗癌症的化合物。

本发明的另一主题是用于治疗增殖性疾病，特别是高增殖性疾病例如癌症的方法，其包括给所需治疗的对象施用药用有效量的

(a)包括至少一种编码前体药物转换酶的转基因的本发明的重组溶瘤性病毒、本发明的病毒基因组、本发明的病毒反基因组、和/或本发明的DNA分子，和

(b)适用于治疗增殖性疾病的前体药物，其中前体药物可以被(a)的前体药物转换酶转化成为药物活性化合物。

本方法可以包括施用包括组分(a)和(b)的单个药物组合物，或者可以包括施用两种不同的药物组合物，其中一种包括组分(a)以及另一种包括组分(b)。

蛋白酶

在本发明的溶瘤性重组RNA病毒中，至少一种转基因编码蛋白酶。

因此，本发明的主题是包括作为活性成分的本发明的重组溶瘤性病毒、本发明的病毒基因组、本发明的病毒反基因组、和/或本发明的DNA分子和任选的药学可接受载体、稀释剂和/或佐剂的药物组合物，其中病毒、病毒基因组、反基因组和/或DNA分子包括至少一种编码蛋白酶的转基因。药物组合物可以适合于治疗和/或缓解增殖性疾病。

如果本发明的溶瘤性重组RNA病毒编码蛋白酶，本发明的溶瘤性病毒造成了在感染病毒的靶细胞(特别是肿瘤细胞)内选择性表达，所述靶细胞通常不能或者没有充分地表达蛋白酶。因此，在治疗所需治疗的对象的过程中，蛋白酶可以不可逆地降解靶细胞内的靶多肽，据此抑制了靶细胞的增殖和/或生长或者杀死靶细胞，但是其基本上不能降解非靶细胞(特别是所治疗对象的健康细胞)内的靶分子。按照这种策略，就可以减少蛋白酶治疗的不需要的副作用。

优选地，蛋白酶是序列特异性蛋白酶。更优选的是特异地降解靶多肽的蛋白酶。蛋白酶可以是天然来源的或者可以源自任一物种或者其可以被遗传加工。本领域普通技术人员例如根据公开的序列数据库可以确定出适用于特异地降解预定靶多肽的氨基酸序列。US 2005-0175581和US 2004-0072276描述了生产具有预定底物特异性的加工蛋白的蛋白酶。在此通过引用将两个文档并入本申请。

本发明的靶分子可以是下面所述的作为结合蛋白的靶点的任一靶分子。

本发明的另一主题是用于治疗增殖性疾病，特别是高增殖性疾病例如癌症的方法，其包括给所需治疗的对象施用药学有效量的包含至少一种编码蛋白酶的转基因的本发明的重组溶瘤性病毒、本发明的病毒基因组、本发明的病毒反基因组、和/或本发明的DNA分子。

本发明的转基因可以编码如上定义的前体药物转换酶、如上定义的结合分子和/或如上定义的蛋白酶的融合蛋白。特别优选的是前体药物转换酶和结合分子的融合蛋白或者蛋白酶和结合分子的融合蛋白。

治疗应用

本发明首次表明可以在感染溶瘤性病毒的肿瘤细胞内功能地表达编码结合蛋白、前体药物转换酶和/或蛋白酶的转基因。因此，本发明涉及包括作为活性成分的如上所示的病毒、病毒的核衣壳、病毒基因组或编码病毒基因组和/或反基因组的DNA分子以及任选的药学可接受的载体、稀释剂和/或佐剂的药物组合物。

可以提供溶液、悬浮液、冻干物或任何其它合适形式的药物组合物。除了活性成分外，组合物可以包含本领域抑制的载体、缓冲剂、表面活性剂和/或佐剂。可以例如口服地、局部地、经鼻、经肺或经局部注射或静脉内施用组合物。根据疾病的类型、患者的病变和体重、施用途径等施用药学有效量的药物组合物。优选地，每次应用施用10⁹到10¹²个病毒颗粒、10⁸到10¹¹个病毒颗粒、10⁷到10¹⁰个病毒颗粒、或10⁶到10⁹个病毒颗粒。任选地，溶瘤性治疗可以与其它的肿瘤治疗例如手术、放疗和/或化疗例如环磷酰胺治疗和/或高温治疗组合在一起。

根据本发明，重组溶瘤性副粘病毒可以表达可溶性结合蛋白、前体转换酶和/或蛋白酶，其可以保留在感染细胞内或者可以被分泌，例如抗体、抗体片段、锚蛋白重复序列蛋白或其它如下所示的结合分子。还没有描述过RNA病毒例如新城疫病毒的溶瘤株可以表达这种蛋白。

作为示例，本申请选用NDV株MTH68，因为其具有固有的溶瘤性能，从对患者的试验性临床治疗中得到了很有希望的数据(Sinkovics andHorvath，2000)。但是，原则上而言，大多数具有多碱基融合蛋白降解位点的NDV株都可以被用作治疗肿瘤的溶瘤剂。反求遗传学技术适用于所有病毒株。

如上所述的结合蛋白已经被证实具有高的治疗潜能。

溶瘤性NDV与具有如上所述性能的治疗性结合蛋白、前体药物转换酶和/或蛋白酶的组合将具有两种治疗药物的累加的或者甚至协同的作用。溶瘤性自我复制型病毒将结合蛋白、前体药物转换酶和/或蛋白酶靶向于优选的作用位点，其中可以高局部浓度地原位表达所述的结合蛋白、前体药物转换酶和/或蛋白酶。预计这种蛋白表达是高选择性的，而具有其相应作用模式的结合蛋白、前体药物转换酶和/或蛋白酶将增加NDV的内在的治疗性溶瘤性活性。根据所用病毒的复制能力性质以及在肿瘤细胞内的选择性复制，预计所表达的转基因(结合蛋白、前体药物转换酶和/或蛋白酶)的量与肿瘤的量大致成比例。

抗体分子或抗体样分子或其衍生物都是NDV系统所用的理想的结合蛋白。抗体分子是广泛研究的对象，现在已有产生无免疫原性的、高选择性的和高亲和力的抗体分子的技术。与标准治疗相比较，高浓度抗体分子的局灶表达造成了效应物分子的非常显著的激动性或拮抗性效力或有效的靶向作用以及更低的毒性表征。

预计抗体样分子在NDV系统中的应用甚至是更为优越的。与正常抗体相比较，这些分子被设计成选择性的高亲和的结合力以及非常高的热稳定性和产量。对于基于锚蛋白的抗体样分子而言，可以依据相应的优化靶向作用、结合力、抑制或活化作用的目标调整分子的重复性能。在一个锚蛋白分子内也可以组合不同的结合特异性，开拓了一个锚蛋白重复序列分子连接一些具有不同结合特异性的单元的可能性。该模块结构容许比抗体更大的蛋白表面的多价结合，其对于阻断蛋白-蛋白相互作用是极为重要的。模块结构也可以被开发成仅用单个阻断性锚蛋白重复序列蛋白阻断一些效应物。

因为锚蛋白重复序列分子甚至在还原条件下都是极为稳定的，所以这些分子可以被设计成靶向于细胞内的蛋白(“细胞内抗体”)。

编码结合蛋白的序列的文库与NDV用于体内靶点鉴定的用途也是可能的。

结合分子或/和蛋白酶的可能靶点可以是靶细胞或靶细胞周围的细胞外基质的所有结构，其可以被所述的结合蛋白或/和蛋白酶所识别，其与某些类型的病理表型相关。这些结构可以是结构蛋白、酶、生长因子、生长因子受体、整联蛋白、转录因子等。

本发明可以包括甚至不能通过小分子(蛋白-蛋白相互作用、DNA结合等)而成为可药性的(drugable)靶点。

预期溶瘤性NDV和如上所述的治疗性结合蛋白、前体药物转换酶和/或蛋白酶的组合可用于治疗炎性疾病例如类风湿关节炎和癌症。

对于癌症的治疗，可以靶向于造成癌症发生的所有途径。这些途径是：生长因子的自给自足、对生长抑制(抗生长)信号的不敏感性、凋亡逃逸、无限复制的潜能、持续的血管生成、和组织浸润及转移。文献(Hanahan and Weinberg，2000)中给出了对这些途径的概述。涉及肿瘤发生过程的以及可以被所述方法所靶向的信号途径是受体酪氨酸激酶途径(RTK)途径、RB和p53途径、凋亡途径、APC途径、HIF1途径、GLI途径、PI3K途径、和SMAD途径。Vogelstein和Kinzler(2004)给出了对这些信号途径的详细描述。

所述结合蛋白可以干扰的其它信号途径是ras、Wnt和Hedgehog途径，例如可以阻断蛋白-蛋白相互作用。

能有益地干涉癌症细胞中的上述途径的结合蛋白的实例是：

-自主活性的生长因子受体(例如EGFR、Met)的阻断蛋白

-生长因子的竞争性结合剂(拮抗剂)

-Rb-磷酸化的阻断蛋白

-E2F依赖性转录的阻断蛋白

-p53的稳定剂

-抗凋亡蛋白(例如Bcl-2)的拮抗型结合剂

-细胞周期蛋白的拮抗型结合剂

-Ras效应物(例如GEF)的拮抗型结合剂

-低氧诱导蛋白(例如HIF1α)的拮抗型结合剂

-干扰二聚体化或DNA结合或辅助因子结合(例如Myc/Max)的转录因子的抑制剂

-分化诱导剂

-smad信号传导/转移的抑制剂

-信号粘附相互作用(钙粘素、整联蛋白例如α5β1、αvβ3)的抑制剂

-降解细胞外基质的酶(例如MMP)的抑制剂

-促血管生成配体的拮抗型结合剂(例如可溶性VEGF-R)

-有丝分裂激酶(例如PIK-1)的抑制剂

-促血管生成受体的拮抗型结合剂

-支架复合物形成(例如KSR/Ras)的抑制剂

-翻译起始(eIF4E、EIF2a)的抑制剂

本发明的蛋白酶、前体药物转换酶和/或经前体药物转换酶源自本发明的前体药物的治疗活性化合物也可以有益地干涉癌症细胞的上述途径。

定义

新城疫病毒

副粘病毒含有负极性的单链RNA基因组，其基因组长度为15-19kb(野生型)并且基因组含有6-10个基因。病毒的被膜是由表面糖蛋白和源自宿主细胞的膜部分组成的。表面糖蛋白(F和HN或H或G)介导病毒出入宿主细胞。核衣壳位于被膜内，它含有RNA基因组和核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)，这些蛋白负责细胞间的病毒转录和复制。基质(M)蛋白连接病毒被膜和核衣壳。除了这些编码结构蛋白的基因外，副粘病毒也可以含有“辅助”基因，它们可能是散落于上面所提及的基因内的附加的转录单元。辅助基因几乎都是与P转录单元重叠的ORF。在(Lamb，2001)中可以发现对副粘病毒的综合描述。

NDV是属于单分子负链RNA病毒目的副粘病毒科的Avulavirus属的原型成员。病毒基因是单链的负义RNA，其编码6种主要蛋白：核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(HN)、和聚合酶蛋白(L)。通过编辑P蛋白mRNA，可以翻译一种或两种附加的蛋白V(和W)。

按照NDV病毒对鸡的致病力可以将NDV病毒株分为：强毒株(高毒力)，其可以造成所有年龄鸡的急性致死性感染；中等毒力株(中等毒力)，仅仅造成幼年鸡的死亡；和轻型毒株(无毒力)，表现为轻微形式或非显著形式的病变。通过9天大的含胚卵的鸡胚在与杀死胚胎的最小致死剂量的病毒孵育之后的平均死亡时间(MDT)可以确定出NDV分离株的强毒、中等毒力和轻型毒株的分型。NDV毒力的决定子之一可能是前体F蛋白的裂解位点。

Alexander(1988)和Lamb(2001)详细地表征了NDV。

重组病毒

重组病毒表示在其基因组RNA序列中具有经遗传加工的明确的改变的病毒。该改变可能是一个或多个插入、缺失、点突变或其组合。

本发明的重组RNA病毒可以包括天然(未修饰)RNA病毒的全部基因组序列或者其衍生序列，以及可以附加地包括至少一个重组转录盒。该至少一个转录盒可以位于病毒基因组的两个基因(转录单位)之间。在这种情况中，至少一个转录盒的两侧是转录起始和终止序列。至少一个转录盒也可以位于病毒基因组的转录单元内。在这种情况中，不需要附加的转录起始和终止序列。

至少一个转录盒可以包括限制性位点例如Pad或/和AscI，它们可以是唯一的。如果存在两个转录盒，它们可以包括不同的限制性位点。

优选地，本发明的RNA病毒包括一个或两个重组转录盒。

在本发明的至少一个转录盒中，存在可以如下所述的编码结合蛋白、前体药物转换酶或蛋白酶的转基因。

病毒基因组的每两个基因(转录单元)之间的基因间区适合于引入至少一个重组转录盒。如果存在超过一个重组转录盒，它们可以位于相同的或不同的基因间区。图1描述了位于一个基因间区内的两个重组转录盒的实例。优选地，至少一个重组转录盒位于病毒的F和HN基因之间，特别是如果本发明的RNA病毒是重组新城疫病毒。

副粘病毒的基因组大小没有已知的上限。因此，引入到本发明的重组RNA病毒内的转基因的数目和大小也没有上限。优选地，转基因的大小最大到约10kb，更优选地最大到约5kb，最优选地到约2kb。

本发明的重组RNA病毒优选地携带有最多5个转基因，更优选地最多4个转基因，甚至更优选地最多3个转基因，最优选地为1个或2个转基因。如果本发明的重组病毒携带有至少两个转基因，它们可以是相同的或不同的转基因。本发明的重组RNA病毒可以携带有超过一个拷贝的特定转基因，特别是2、3、4或5个拷贝。

在转基因的表达(包括病毒RNA转录成mRNA以及mRNA的翻译)中，使用了表达控制序列例如转录起始和终止序列以及控制翻译的序列。可以使用RNA病毒的表达控制序列，所述RNA病毒可以是本发明的重组RNA病毒所基于的RNA病毒。具体而言，可以从RNA病毒中获得转录起始和终止序列。也可以从靶细胞中获得表达控制序列，特别是控制翻译和/或蛋白转运的序列。

由于副粘病毒的复制机制，基因组或反基因组的RNA通常不表现为裸RNA。基因组和反基因组RNA与核蛋白组装在一起。因此，本发明的另一主题是本发明的重组溶瘤性RNA病毒的核衣壳。核衣壳包括编码RNA病毒的基因组或反基因组的RNA分子和核衣壳蛋白。核衣壳也可以包括聚合酶蛋白L或/和磷蛋白P。

本发明的主题也是如上所述的本发明的基因组的反基因组。

本发明的另一个部分是编码本发明的重组溶瘤性RNA病毒的基因组和/或反基因组的DNA分子。DNA分子可以是质粒。可以用本发明的DNA分子遗传加工本发明的RNA病毒。此外，可以用DNA分子生成本发明的RNA病毒。因此，DNA可以与转录控制序列例如原核的或真核的转录控制序列可操纵地连接。

本发明的DNA分子的实例是pflMTH68鼠IgG EDB(图2)。

本发明的基因组、反基因组、核衣壳和/或DNA分子可以包含至少一个转基因，所述至少一个转基因可以位于如上所述的转录盒内。如上面所讨论的那样，转基因可以编码结合蛋白、前体药物转换酶和/或蛋白酶。

本发明的另一个部分是用于生产包含表达编码本发明的重组溶瘤性病毒的基因组和/或反基因组的DNA分子的重组溶瘤性RNA病毒的方法。

本发明的另一个部分是包含本发明的重组溶瘤性病毒、本发明的病毒基因组、本发明的病毒反基因组和/或本发明的DNA分子的细胞。细胞可以是原核细胞或真核细胞。细胞可以是细胞系，特别是哺乳动物细胞系，更特别是人或鼠细胞系。在本发明的用于生产本发明的RNA病毒的方法中可以使用所述细胞。用于转录DNA分子的合适的系统是本领域普通技术人员已知的，例如原核细胞例如大肠杆菌或真核系统例如HeLa或CHO。

另一个部分是溶瘤性RNA病毒、其基因组或反基因组或DNA分子，其包含副粘病毒的全组基因或者副粘病毒的一组基因，其中至少一个基因或基因间区被遗传修饰，以及还包含如上所述的至少一个重组转录盒。可以用这种病毒、基因组或反基因组或DNA分子生产药物和/或治疗癌症。这种RNA病毒、基因组、反基因组或DNA分子适用于通过遗传加工技术构建出重组副粘病毒，特别是重组新城疫病毒，以便能够往转录盒内引入重组序列。对此，至少一个转录盒可以包括一个限制性位点。如果存在超过一个的转录盒，转录盒的独特的限制性位点可以有所不同。实例是图1的质粒pflMTH68_Asc_Pac。

相关治疗

治疗癌症表示抑制肿瘤生长，优选地通过感染在一定的时间间隙内杀死肿瘤细胞或者阻断增殖。NDV在肿瘤细胞内选择性地复制。

本发明的病毒可以用于治疗增殖性疾病，特别是高增殖性疾病。优选地，可以用所述的病毒治疗肿瘤，优选地可以治疗选自由肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌和脑瘤组成的组中的癌症。

更优选地，可以治疗实体瘤。

更优选地，可以治疗具有低增殖率的肿瘤。

具有低增殖率的肿瘤的实例是前列腺癌或乳腺癌。

更优选地，可以治疗脑瘤。

更优选地，可以治疗成胶质细胞瘤。

重组RNA病毒的生产

如在Romer-Oberdorfer et al.(1999)中所述的那样，可以构建出本发明的重组RNA病毒，特别是重组NDV。新核酸序列的构建是在cDNA水平，然后其在真核细胞内被翻译成为RNA，这利用了下面的质粒：

pCITE P、pCITE N、pCITE L、pX8δT flNDV

NDV可以是任一新城疫病毒株，更优选地是其野生形式为溶瘤性的病毒株。

在EP0702085(Conzelmann KK)中描述了质粒pX8δT。

最初可以从表达T7聚合酶的细胞例如BHK T7细胞或者从经T7聚合酶临时转染的CHO细胞中回收到本发明的重组RNA病毒，特别是重组NDV。可以在细胞如293、CEC32、HT29或A431中扩增。也可以在含胚鸡卵的尿囊液中扩增。

重组RNA病毒，特别是重组NDV储存于下面的条件中。重组RNA病毒(特别是NDV)在5％D-甘露醇/1％(w/v)L-赖氨酸/pH 8.0或标准细胞培养液中都是稳定的。

在-20℃下最多可储存1个月。

在-80℃下最多可储存10年。

重组NDV作为药物的用途

本发明的重组RNA病毒，特别是本发明的纯化的重组NDV可以作为药物，因为其显示出了药学作用。

本发明的重组RNA病毒，特别是本发明的NDV都是药物，特别是用于预防和/或治疗癌症的药物，特别是用于预防和/或治疗肺癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌的药物。

本发明包含与药学可接受的载体和稀释剂组合的作为药物的本发明的重组RNA病毒，特别是本发明的NDV。在Remington′s PharmaceuticalScience，15^th ed.Mack Publishing Company，Easton Pennsylvania(1980)中描述了这些载体和稀释剂。所用的病毒滴度的范围可以是从10⁹到10¹²pfu/剂量、从10⁸到10¹¹pfu/剂量、从10⁷到10¹⁰pfu/剂量或从10⁶到10⁹pfu/剂量，这依赖于治疗的适应症。

因此，本发明的另一主题是包含本发明的重组溶瘤性病毒、本发明的病毒基因组、或本发明的DNA分子以及药学可接受的载体、稀释剂和/或佐剂的药物组合物。本发明的药物组合物可以被用于预防或/和治疗增殖性疾病例如癌症。

本发明的药物组合物可以包含本发明的重组溶瘤性RNA病毒(特别是本发明的NDV)的乳剂，可以通过吸入、静脉内输注、皮下注射、腹腔内注射或肿瘤内注射使用所述药物组合物。

本发明的另一主题是用于预防或/和治疗增殖性疾病(特别是癌症)的方法，包括给所需治疗的对象施用药学有效量的本发明的药物组合物。药学有效量是治愈或抑制疾病的本发明的溶瘤性RNA病毒，特别是本发明的NDV、本发明的病毒基因组、或本发明的DNA分子的滴度。

对于治疗疗效而言，可接受的剂量是不同的，并取决于例如构建体、患者、和施用途径以及癌症类型。

优选地，对象(患者)是哺乳动物，更优选地是人患者。

本发明的另一个方面是本发明的重组RNA病毒特别是本发明的NDV病毒、本发明的病毒基因组、或本发明的DNA分子用于生产用于治疗癌症的药物的用途。

下面的图表和实施例进一步地阐述了本发明。

附图说明

图1描述了质粒pflMTH68_Asc_Pac，其包含NDV的全部基因组以及两个分别包含独特的限制性位点AscI或Pad的转录盒。核苷酸序列描述了F和HN之间的包括两个重组转录盒的基因间区(SEQ ID NO：5)。

图2描述了质粒pflMTH68鼠IgG ED-B，其以pflMTH68_Asc_Pac为基础并包括编码抗ED-B抗体MOR03257(见德国专利申请DE10 200405 0101.7-43的权利要求42)的轻链和重链的序列，轻链和重链每个都被插入于其中一个转录盒内。

图3描述了用含有抗ED-B IgG抗体MOR03257的基因的NDVMTH146感染CHO或HT29细胞造成了抗体被表达到细胞悬浮液内。在感染后24个小时，达到了约20％最大表达水平的水平。在感染后约72个小时，达到了抗体的最大表达水平。作为对照，用MTH115(含有β-葡糖醛酸糖苷酶)感染细胞。在这些细胞中，没有检测到IgG。

图4用免疫荧光证实经MTH146感染的细胞表现出与经重组抗体MOR03257染色完全相同的染色模式。

图5用免疫组化证实受MTH146感染细胞的悬浮液产生了与从稳定转染的肿瘤血管的239细胞中表达(其中存在ED-B)得到的纯化αED-B抗体MOR03257相同的染色模式。

图6证实静脉内注射MTH87造成了小鼠异种移植模型的肿瘤内表达GFP。

图7描述了β-葡萄糖醛酸酶在受MTH115感染的HeLa细胞内的表达。

图8描述了β-葡萄糖醛酸酶在受MTH115感染的细胞系内的表达水平。

图9和图10描述了HMR1826和MTH115在选择性杀死肿瘤细胞方面的协同作用。

实施例

实施例1：用造成抗体表达的转基因生成重组NDV

用NDV的溶瘤株MTH68得到病毒RNA。利用RT-PCR，获得了一些cDNA的片段，并且在多步克隆方法中，所述cDNA片段被组装到完整基因组cDNA内，所述cDNA被克隆到载体pX8δT(Schnell et al.，1994)内，生成了质粒pflMTH68。该载体可以被用于转染，以便从表达T7聚合酶的细胞系内拯救出重组病毒。

将两个附加的转录盒克隆到NDV MTH68(pflMTH68)的全长基因组质粒的唯一的Sfil限制性位点内，所述转录盒位于编码F蛋白和HN蛋白的基因之间。将两个DNA寡核苷酸：Sfi正向(5′-aggccttaattaaccgacaacttaagaaaaaatacgggtagaacggcctgag-3’，SEQ ID NO：1)和Sfi反向(5′-aggccgttctacccgtattttttcttaagttgtcggttaattaaggcctctc-3′，SEQ IDNO：2)退火，随后将其连接到pflMTH68的Sfil位点内。

用PacI切割所形成的质粒pflMTH68Pac，并将另一个由Asc正向(5′cgggcgcgccccgacaacttaagaaaaaatacgggtagaacagcagtcttcagtcttaat-3′，SEQID NO：3)和Asc反向(5′-taagactgaagactgctgttctacccgtattttttcttaagttgtcggggcgcgcccgat-3′，SEQ ID NO：4)组成的dsDNA寡核苷酸插入到PacI限制性位点内，据此破坏其中一个侧向的PacI识别位点并插入唯一的AscI位点。所形成的质粒称作pflMTH68 Asc Pac。该质粒具有两个附加的被插入到病毒F和HN基因之间的转录盒。两个转录盒的侧面都是相同的病毒转录起始和终止序列(图1)。盒1含有唯一的PacI限制性位点，盒2含有用于唯一的AscI限制性位点，所述限制性位点都用于插入转基因cDNA。

将抗纤维结合素(MOR03257)的外在结构域B(ED-B)的重组的功能阻断性治疗性抗体的重链和轻链分别克隆到两个附加的唯一的限制性位点AscI和PacI内。将抗ED-B抗体的鼠Igλ轻链插入到AscI位点内。将抗ED-B抗体的鼠IgG重链插入到PacI位点内。将插入物和接头序列的总长度调整到碱基数目为6的倍数，以便遵循重组病毒的完整基因组长度的6法则。所形成的质粒称作pflMTH68鼠IgG ED-B(图2)。

利用用于拯救重组NDV的标准技术(转染表达T7的BHK细胞)，生成了含有两个附加的编码抗ED-B IgG抗体的两条链的基因的病毒。该病毒被称作MTH146。

实施例2：重组新城疫病毒的抗体表达。受MTH146感染的细胞生成了识别其抗原ED-B纤维结合素的抗体(ELISA)。

材料和方法

将HT29(人结肠癌)和CHO(中国仓鼠卵巢)细胞按每孔4×10⁵个细胞种植于6孔板内。之后，用MOI为0.01的病毒MTH146(含有抗ED-B抗体的基因)或病毒MTH115(含有无关的分泌性转基因β-葡糖醛酸糖苷酶的基因)感染细胞，一式三份。

在感染后0h、20h、30h、2d、3d、6d的时间点上，取出细胞悬浮液的上清液，并进行抗体滴度测定。

用ELISA测定出抗体滴度。用重组抗原ED-B涂层塑料板孔。往孔内加入含有抗体的组织培养上清液或标准的已知量的重组抗体。在洗涤之后，用HRP-缀合的抗鼠IgG的二抗检测结合抗体。利用纯化的重组抗体(质粒转染细胞所表达的)作为标准物，可以测定出病毒产生的抗体的浓度。

结果

MTH146的感染造成了抗体被表达到细胞悬浮液内，所述抗体与其靶点ED-B特异性结合(图3)。用表达无关分泌型转基因的病毒(MTH115)感染相同的细胞在细胞悬浮液的ED-B ELISA检测中并没有产生信号。在HT29肿瘤细胞中，悬浮液中的抗体浓度达到了滴度约为8μg/ml(结合IgG)，其是生物学活性的有效浓度。在CHO细胞中，上清液中的抗体滴度达到了＞20μg/ml。

实施例3：病毒表达的抗体与其靶点的结合：免疫荧光

材料和方法

将鼠F9畸胎癌细胞种植于6孔板内。用MTH146(抗ED-B抗体)或MTH115(无关转基因β-葡糖醛酸糖苷酶)感染细胞或假感染细胞。

在感染2天后，用4％甲醛固定细胞。洗涤细胞并通过用Cy3缀合的抗小鼠IgG的二抗的染色观察显像出结合抗体。作为阳性对照，在固定之前用5μg/ml重组α-ED-B IgG孵育被假感染的细胞1小时。

结果

阴性对照没有显示出F9细胞的显著染色。受MTH146感染的细胞显示出与经重组抗体染色完全相同的染色模式(图4)。因此，可以推断出病毒感染造成了和重组抗体一样与其抗原结合的正确抗体的产生。病毒产生的抗体浓度也足以得到与5μg/ml浓度的抗体相似的染色。这与估计的病毒所表达的抗体的浓度在5μg/ml的范围内是一致的。

实施例4：病毒表达的抗体与其靶点的结合：免疫组化

材料和方法

将小鼠体内以皮下异种移植物形式生长的SK-MEL黑色素瘤的冷冻保存的组织切片(10μm)用冷丙酮固定10分钟，PBS洗涤并用抗体染色。从稳定转染的293细胞中表达得到的纯化的α-ED-B IgG抗体MOR03257(用于染色的浓度为5μg/ml)作为对照。阴性对照仅仅与缓冲剂孵育，而不与一抗孵育。用未稀释的受重组病毒感染的293细胞的上清液进行染色。在染色之前，通过紫外线处理灭活病毒。受MTH146感染的细胞生成了α-ED-B IgG抗体，用不会产生转基因抗体的重组病毒感染对照的受感染细胞。通过蛋白A-过氧化物酶检测以及二氨基联苯作为底物的染色显像出结合抗体。用苏木精QS复染切片。用Zeiss Axiophot显像系统进行照相存档。

结果

当没有与抗体孵育或者与对照病毒感染的293细胞的组织培养上清液孵育时，都没有观察到冷冻切片的特异染色。用从稳定转染的293细胞中表达得到的纯化的α-ED-B抗体的染色显示出存在ED-B的肿瘤血管的特征性信号。与受MTH146感染的细胞的上清液的孵育也生成了相同的染色模式(图5)。这证实病毒表达的抗体也能够与其肿瘤组织内的靶点ED-B特异性结合，以及受感染细胞的上清液中的浓度足以得到与5μg/ml纯化抗体相当的信号。

实施例5：重组NDV在体内的肿瘤选择性复制

这个实施例证实了静脉内注射表达GFP的溶瘤性病毒MTH87造成了小鼠异种移植模型中的肿瘤表达GFP。

MiaPaCa胰腺癌异种移植物皮下生长于裸鼠体内。每两天一次用1×10⁹pfu的MTH87(具有GFP转基因的NDV)重复(6x)处理小鼠。

在末次处理后第21和34天时，处死小鼠并切片。在荧光显微镜下直接分析器官切片(约2mm)，以检测GFP表达(图6)。肿瘤切片的照片显示出GFP表达。在下面的任一器官内都没有发现这种GFP的表达：脾脏、肝脏肺、心脏、肾脏、小肠和肾上腺。

从器官中重新分离NDV(MTH87)

为了证实复制病毒存在于肿瘤内而不是其他器官内，在组织培养基的单层病毒敏感性HT29细胞上孵育器官切片(约2mm厚度)。之后，计数出表达GFP的HT29细胞，其表示受到了源自器官或肿瘤的MTH87的感染。仅仅能够从肿瘤切片中重分离出MTH87，未能从任一测试器官中重分离出MTH87。从每个肿瘤的6个肿瘤切片中，至少4个的病毒重分离均为阳性。阴性器官是：脾脏、肺、心脏、肾脏、小肠、和肾上腺(测试没有包括其他器官)。

这些结果说明重组病毒MTH87在肿瘤组织而不是其他器官内选择性地复制。在末次静脉内注射病毒数天后都可检测到病毒复制。

实施例6：产生表达抗体-效应物融合蛋白L19-IL2的溶瘤性NDV

融合蛋白L19-IL2是抗体靶向的细胞因子。抗体片段L19针对于纤维结合素的外在结构域B，其主要表达于肿瘤血管的周围，但是也在肿瘤基质内表达。

细胞因子白介素-2诱导T细胞的增殖并激活NK细胞。目前低剂量的游离的、非靶向的白介素-2(Proleukin)被用于治疗肾细胞癌(RCC)。因为其高的全身毒性，Proleukin的临床应用是有限的。已经显示出经抗体例如L19对IL-2的靶向转运可以被用于给肿瘤转移治疗有效剂量，同时保持IL-2的非毒性的全身水平。L19-IL2的肿瘤特异性转运和表达组合了溶瘤性病毒的肿瘤选择性和L19抗体片段的附加的肿瘤选择性以及IL-2的强效应物活性。

材料和方法：

产生表达融合蛋白L19-IL2的重组NDV

质粒pflMTH68Pac含有NDV MTH68的全部基因组序列以及一个附加的具有唯一PacI限制性位点的转录盒。将编码融合蛋白L19-IL2的DNA转基因克隆到PacI位点内。转基因包括Kozak序列CCACC(细胞外分泌的信号肽)以及融合蛋白L19-IL2的cDNA(Carnemolla et al.，2002)。基因组的总长度被调整到6的倍数，以遵循病毒基因组长度的“6倍规则”。用标准的病毒拯救技术从用含有L19-IL2基因的全长病毒基因组质粒转染的表达T7的细胞中拯救出重组病毒。所形成的病毒被称作MTH201。在组织培养物中或在鸡卵的尿囊液中培养病毒，以生成高滴度病毒。

小鼠F9畸胎癌异种移植试验

在同系的F9小鼠畸胎癌模型中进行治疗研究。小鼠F9畸胎癌模型是快速生长的同系肿瘤，其特征是主要在肿瘤血管周围以及在肿瘤基质内都有ED-B-纤维结合素的高水平表达。

将50％基质胶内的2×10⁶个F9肿瘤细胞皮下种植到裸鼠株129(SvHsd克隆)内。当肿瘤达到近20mm大小时，用1×10⁹pfu重组NDVMTH201(编码L19-IL2融合蛋白)或对照病毒MTH87(编码转基因GFP)在第1、3、5和7天静脉内感染小鼠。在5天时间内，每天都用无菌盐水溶液静脉内脉冲注射L19-IL2(CHO来源，二聚体)和IL2(PROLEUKINE)。动物研究所用的所用浓度都在1.8-2.16Mio.IU/kg/天的范围之内。

在12天之后，处死小鼠并通过用测径器测定肿瘤面积(最长直径及其垂直线的乘积)评价出肿瘤重量。

结果

二聚体L19-IL2显示出甚至最低剂量的1430IU/g/天(对应于人体所用的低剂量方案)都使得肿瘤重量下降了54.7％，而3倍和6倍更高的剂量的IL2仅仅轻微地提高了靶向IL2的治疗疗效。最高剂量的PROLEUKINE使得肿瘤重量下降了50.5％。在剂量为1430和4290IU/g/天时都没有观察到治疗疗效。在经NDV MTH201治疗过的小鼠组中得到了最佳结果。肿瘤重量的下降超过了55％。病毒表达的L19-IL2和NDV的溶瘤性作用的联合作用可以解释这一点。另一个优点是与单独施用融合蛋白相比较，施用更少的NDV MTH201获得了相同的结果。

实施例7：产生表达与VEGF结合的并且有生物学活性的锚蛋白重复序列蛋白的溶瘤性NDV。

在试验模型中，已经证实VEGF及其受体对于结直肠癌的生长以及结肠癌的肝转移癌的形成和生长都是必需的(Warren et al.，1995)。现在通过给转移性结直肠癌患者全身施用VEGF中和性的人类抗体Avastin已经临床上证实了这一点(Salgaller，2003)。

VEGF(或VPF)是由四个亚型(其成熟单体内含有121、165、189、206个氨基酸残基)组成的同二聚体糖蛋白，所述亚型是通过对源自单个基因的mRNA的不同剪接所形成的。虽然所有形式的VEGF都具有信号序列，但是仅仅较小的两个亚型被分泌。相反地，更大形式的则与细胞外基质内的肝素结合的蛋白聚糖相连接。VEGF是各种大血管和小血管内皮细胞的促有丝分裂剂，诱导了组织因子、胶原酶、纤溶酶原激活剂、及其抑制剂的产生，并刺激这些细胞的己糖转运。最重要的VEGF受体是fms样酪氨酸激酶flt1和KDR(Waltenberger et al.，1994)。体外在一些人类肿瘤细胞系以及手术切除的人类胃肠道、卵巢、脑、肾脏、肺等的肿瘤中都已经证实由VEGF的表达。在多个试验性肿瘤模型中，中和VEGF造成了有效的和显著的生长抑制(Gerber and Ferrara，2005)。

在此我们证实了经重组NDV肿瘤靶向的转运抗VEGF的锚蛋白重复序列蛋白有益于该疾病的治疗。结直肠癌的无胸腺小鼠实验模型表明了这一点。肝脏通常是结直肠癌的首个和最常见的转移部位。因此，在原位肝脏转移癌试验模型中也证实了该新药物的效力。

材料和方法：

产生表达中和VEGF的锚蛋白重复序列蛋白的重组NDV

用标准方法选择出N₃C型抗VEGF锚蛋白重复序列分子(Binz et al.，2004)。所选的锚蛋白重复序列蛋白的序列是已知的。将编码特定的具有抗VEGF抑制活性的锚蛋白重复序列蛋白(dARPIN)的表达盒克隆到全长基因组NDV-MTH68质粒内。

质粒pflMTH68 Pac含有NDV MTH68的全长基因组序列以及加上一个附加的具有唯一PacI限制性位点的转录盒。将编码抗VEGF的dAPRIN的DNA转基因颗粒到PacI位点内。该基因包括Kozak序列CCACC、用于细胞外分泌的信号肽以及锚蛋白重复序列分子的cDNA。基因组的总长度被调整到6的倍数，以遵循病毒基因组长度的“6倍规则”。用标准的病毒拯救技术从用含有抗VEGF的dARPIN基因的全长病毒基因组质粒转染的表达T7的细胞中拯救出重组病毒。所形成的病毒被称作MTH268。在组织培养物中或在鸡卵的尿囊液中培养病毒，以生成高滴度病毒。

皮下肿瘤

LS LiM6细胞的汇合培养物生长于10cm²Petri皿内，用简单的胰蛋白酶化(0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA，无Ca2+/Mg2+的HBSS)收集细胞，在无Ca2+/Mg2+的PBS中洗涤多次，并将其按5×10⁷个细胞的终浓度重悬于无血清的DMEM内。用相差显微镜确认单个细胞的存在，并用台盼兰排除检测法确定出细胞活力。将无病原体的Balb/c NCR-NU无胸腺小鼠(来自Simonson实验室，Gilroy，Ca的3-4周大的雌性小鼠)圈养于已灭菌的笼子内，并皮下注射5×10⁶个活肿瘤细胞。每天观察动物的肿瘤生长，并用测径器每3天一次测定皮下肿瘤。在肿瘤接种1、3、5和7天之后，给各组5只一组的小鼠腹腔内注射不同量的抗VEGFmAB4.6.1(每只鼠0-200μg)、相同同种型的对照mAb(每只鼠200μg)、抗VEGF的锚蛋白重复序列蛋白(每只鼠0-200μg)、1×10⁹pfu NDV MTH268或1×10⁹对照NDV MTH87。在高剂量病毒处理之前，隔日用渐增剂量的病毒(1×10⁶pfu、1×10⁷pfu、1×10⁸pfu、5×10⁸pfu)脱敏动物。如先前所述的计算出肿瘤体积(Kuan et al.，1987)。

肝脏转移癌

将H7细胞生长到融合状态，并如上面所述的收集细胞进行皮下注射，并按20×10⁶细胞/ml的浓度重悬于无血清的DMEM内。用无菌制备的甲氧氟烷吸入麻醉无胸腺小鼠，经左侧切口暴露出脾脏。经27号针头在1分钟内将100ml 2×10⁶个细胞缓慢地注射到脾髓内，1分钟后进行脾切除。在脾-门脉注射1天后开始并在此之后每3到4天给试验动物腹腔内注射VEGF抗体4.6.1、对照抗体(100μg/小鼠)、抗VEGF的锚蛋白重复序列蛋白(100μg/ml)。同样，在第1、3、5和7天经腹腔内施用1×10⁹pfuNDV MTH268或1×10⁹对照NDV MTH87处理小鼠。当出现第一只小鼠死亡并触及到肿大的肝脏(第28天)时，处死所有小鼠。切下肝脏并称重，用解剖显微镜计数出转移癌数目。

为了估计出肿瘤体积，测定每个肝脏转移癌的直径到最接近的毫米数，并假定其为球形测定出每个肿瘤的体积。测定出每个肝脏的所有肿瘤的体积的总和。两个对照动物的肝脏几乎被肿瘤所取代，并且不能区分出单个结节。在这两个肝脏中所估计到的肿瘤体积如下：通过在20ml量筒内取代水测定到总的肝脏体积量，以及肿瘤体积被估计为肝脏的85％。

结果

皮下肿瘤：

监测所处理的动物的肿瘤大小，并且发现所有测试试剂都有剂量依赖性的肿瘤生长抑制。接受对照mAb的动物体内的肿瘤大小在第8天近似为100mm³，第16天为400mm³，第22天为900mm³。对于mAb4.6.1而言，当每次给药注射10μg、100μg、50μg和200μg mAb时，在第22天所测定到的肿瘤大小分别为500mm³、200mm³、150mm³、和100mm³。当最高注射200μg抗VEGF的锚蛋白重复序列蛋白时，发现了相似的剂量依赖性，当施用200μg试剂时，肿瘤大小的最佳结果是100-500mm³。通过用对照NDV MTH87处理无胸腺小鼠时，第22天的肿瘤大小超过了200mm³。该抗肿瘤作用可以归功于溶瘤性NDV引起的抗增殖作用。当用NDV MTH268(表达抗VEGF的锚蛋白重复序列蛋白)感染无胸腺小鼠时，测量到的肿瘤大小小于100mm³。该作用可归功于VEGF中和性锚蛋白重复序列结合蛋白的肿瘤选择性表达及其抗血管生成作用以及独立的NDV对肿瘤细胞肿瘤选择性的抗增殖作用的有益组合。抗VEGF的锚蛋白结合蛋白的肿瘤选择性转运和表达保证了中和性蛋白的稳定的和高水平的顶点表达，其克服了全身施用的锚蛋白重复序列蛋白的药理学局限，例如快速清除和非特异的组织分布，并且确保了有效的VEGF中和作用。减少数目的施用得到了这个作用，因此预计这对于患者人群将是更为便利的。

肝脏转移癌：

所有动物都显示出了肝脏肿瘤的证据，但是其肝脏转移癌的数目、大小和重量都有所不同。与对照mAb处理过的小鼠相比较，在抗VEGF处理之后显著地减少了肿瘤量。抗VEGF mAb4.6.1处理过的动物体内的每个肝脏的平均肿瘤数目和每个肝脏的平均估计肿瘤体积比对照抗体处理过的动物低10倍和18倍。在抗VEGF的锚蛋白重复序列蛋白处理过的小鼠中观察到了相似的结果。在经NDV MTH268处理过的动物中观察到了最显著的降低。尽管施用的次数更少，但是与A4.6.1处理过的小鼠相比较，减少了肝脏内的肿瘤数目以及肿瘤的体积也更小。

与原发肿瘤一样，NDV MTH268抑制肝脏转移癌的形成和生长的有益作用可归功于VEGF中和性锚蛋白重复序列结合蛋白的肿瘤选择性表达及其抗血管生成作用以及独立的NDV对肿瘤细胞肿瘤选择性的抗增殖作用的有益组合。NDV在这些残余的肿瘤芽内选择性地扩增，并对这些肿瘤细胞施加其抗增殖作用，这进一步地减少了存活的肿瘤细胞的数目以及可检测到的转移癌的数目。

当施用含有特异于VEGF-A、VEGF-C和PDGF的多特异性锚蛋白重复序列结合蛋白时，甚至观察到增加了对结直肠癌的原发肿瘤的生长和肝脏转移癌的数目、大小和肿瘤的治疗疗效。

实施例8：产生表达抑制polo样激酶活性并抑制肿瘤生长的细胞内锚蛋白重复序列蛋白的重组NDV

Plk-1已经作为癌症治疗的靶点。在肿瘤组织中，增加了Plk-1的表达，并对大量人类肿瘤都具有预后价值(见例如WO2005042505及其参考文献)。

用标准方法(Binz et al.，2004，Amstutz et al.，2005)选出N3C型的抗人Plk-1锚蛋白重复序列分子。在ELISA方法中，用谷胱甘肽板上的重组GST-Plk-1作为底物测定与Plk-1的结合力。选出阳性的结合剂，并将相应的基因克隆到真核细胞CMV表达质粒pcDNA3.1内。用质粒转染HeLa和MaTu细胞，并如WO2005042505所述的那样，用细胞进行增殖检测。为了能够鉴定出能阻断功能而不直接阻断激酶活性的结合性dARPINS，该方法优选地是体外激酶检测法。选出具有最佳的细胞增殖抑制活性的dARPIN，并将其插入到溶瘤性重组NDV的基因组内。所选出的锚蛋白重复序列蛋白的序列包含161个氨基酸，对应有483bp。将编码预定的具有抗人Plk-1的抑制活性的锚蛋白重复序列蛋白(dARPIN)的表达盒克隆到全长基因组NDV-MTH68质粒内。

质粒pflMTH68 Pac含有NDV MTH68的全长基因组序列以及加上一个附加的具有唯一PacI限制性位点的转录盒。将编码抗Plk-1的dARPIN的DNA转基因克隆到PacI位点内。该转基因包括Kozak序列CCACC和锚蛋白重复序列分子的cDNA。基因组的总长度被调整到6的倍数，以遵循病毒基因组长度的“6倍规则”。用标准的病毒拯救技术从用含有抗Plk-1的dARPIN基因的全长病毒基因组质粒转染的表达T7的细胞中拯救出重组病毒。所形成的病毒被称作MTH261。在组织培养物中或在鸡卵的尿囊液中培养病毒，以生成高滴度病毒。用正切流动过滤法纯化并浓缩病毒，用5％甘露醇/1％L-赖氨酸缓冲液进行洗脱。

体内肿瘤生长抑制

给NMRI裸鼠皮下注射经1∶1稀释(培养基∶基质胶)的1.5×10⁶个MaTu细胞。当肿瘤大小达到20-25mm²(近3天后)时，用重组病毒处理动物。按下面的连续剂量，隔日给动物静脉内注射200μl病毒悬浮液(5％甘露醇/1％L-赖氨酸缓冲液)：1×10⁶pfu、1×10⁷pfu、1×10⁸pfu、5×10⁸pfu、1×10⁹pfu、1×10⁹pfu、1×10⁹pfu、1×10⁹pfu、1×10⁹pfu。在开始时渐增剂量容许小鼠对病毒脱敏。一组仅仅接受缓冲液(5％甘露醇/1％L-赖氨酸)，一组接受表达非治疗性转基因(GFP)的重组病毒MTH87，以及一组接受表达具有抗Plk-1抑制活性的dARPIN的重组溶瘤性病毒MTH261。监测肿瘤生长3周，并在结束时称量肿瘤(第21天)。对照肿瘤时在1.0g范围内。经MTH87处理过的肿瘤显示出显著的肿瘤重量的降低。经MTH261处理过的肿瘤甚至更小，并显示出比MTH87处理过的肿瘤更为显著的肿瘤重量的降低。这证实了病毒表达dARPIN比单用病毒治疗有着更大的益处。该结果也证实细胞内的活性的转基因可以提高重组溶瘤性病毒的溶瘤性能。

实施例9：产生表达与HIF1α结合并具有生物学活性的锚蛋白重复序列蛋白的溶瘤性NDV

如果肿瘤细胞比形成血管系统的内皮细胞生长得更快，造成了肿瘤内的氧气和养分的耗竭，就会出现肿瘤缺氧。

实体瘤内的缺氧区域的出现会促进肿瘤发生的进展。肿瘤细胞的氧缺乏将造成遗传不稳定，随后是选择过程，最终存活的是具有降低的凋亡能力以及增加的对传统治疗例如化疗和放疗的抗性的肿瘤细胞。因此，肿瘤缺氧造成了更为恶性的表型。

缺氧诱导型转录因子HIF1α主要造成了在缺氧条件下激活肿瘤细胞内的大多数基因。HIF1α诱导的基因产物调节了过程例如血管生成、葡萄糖代谢、细胞生长和氧运输。受HIF1α上调的基因的实例是葡萄糖转运子1和3、腺苷酸激酶3、乳酸脱氢酶、VEGF、Flt-1等。

异二聚体的转录因子HIF1α是由HIF1α和HIF1β亚基组成的。HIF1α亚基和HIF1β亚基是组成型表达的。但是，与HIF1β不同的是，HIF1α在正常条件下被快速降解。在正常的氧环境下，HIF1α亚基被Von-Hippel-Lindau蛋白(pVHL)识别并标记进行蛋白酶体降解，所述pVHL是E3泛素连接酶复合物的一部分。在缺氧条件下，HIF1α亚基不再被pVHL识别，蛋白即刻被转运到细胞核内。在细胞核内，发生了与HIF1β亚基的二聚体化，与HRE(缺氧应答元件)的DNA结合造成了特异性的基因诱导。在所述的试验中，证实了在实体瘤模型内重组NDV表达的抗HIF1α锚蛋白重复序列蛋白对HIF1α转录因子的细胞内靶向作用要优于单独的NDV处理以及单独应用重组纯化的抗HIF1α锚蛋白重复序列蛋白。在裸鼠的前列腺癌异种模型中证实了其体内疗效。

材料和方法

产生表达与HIF1α结合的锚蛋白重复序列蛋白的重组NDV

用标准方法(Binz et al.，2004，Amstutz et al.，2005)选出N3C型的抗人HIF1α锚蛋白重复序列分子。所选的锚蛋白重复序列蛋白的序列是已知的。将编码预定的具有抗人HIF1α的抑制活性的锚蛋白重复序列蛋白(dARPIN)的表达盒克隆到全长基因组NDV-MTH68质粒内。

质粒pflMTH68 Pac含有NDV MTH68的全长基因组序列以及加上一个附加的具有唯一PacI限制性位点的转录盒。将编码抗HIF1α的dARPIN的DNA转基因克隆到PacI位点内。该转基因包括Kozak序列CCACC和锚蛋白重复序列分子的cDNA。基因组的总长度被调整到6的倍数，以遵循病毒基因组长度的“6倍规则”。用标准的病毒拯救技术从用含有抗HIF1α的dARPIN基因的全长病毒基因组质粒转染的表达T7的细胞中拯救出重组病毒。所形成的病毒被称作MTH288。在组织培养物中或在鸡卵的尿囊液中培养病毒，以生成高滴度病毒。

PC-3异种移植模型

在无胸腺的雌性或雄性裸鼠体内传代PC-3异种移植物。通过每只动物皮下注射5×10⁵个PC-3细胞建立异种移植物。在第三次传代之后，将肿瘤切成2mm³的切片。用无菌的不诱钢针头对裸鼠进行非坏死性肿瘤组织的皮下接种。当肿瘤体积达到平均大小为150-200mm³时，将小鼠随机分组到不同的治疗组。

在分组后的第0天，隔日用渐增剂量的MTH288(编码抗HIF1αdAPRIN)或MTH87(编码GFP转基因的对照病毒)处理小鼠。在高剂量病毒处理之前，静脉内给予10⁶pfu、10⁷pfu、10⁸pfu、5×10⁸pfu剂量的病毒，以使得小鼠对NDV脱敏。在脱敏之后，施用最高剂量10⁹pfu3次。用纯化的抗HIF1α锚蛋白重复序列蛋白(200μg/小鼠)静脉内处理对照组。在第一次病毒注射时间点开始施用抗HIF1α锚蛋白重复序列蛋白，也隔日重复施用，直到病毒处理结束。单用PBS处理第三个对照组。在第一次处理后的第20天，观察动物的肿瘤生长并用测径器测量皮下肿瘤。

结果

在第一次处理后第20天，注射PBS的动物的肿瘤显示出平均体积为1500mm³。仅仅经抗HIF1α锚蛋白重复序列蛋白处理过的第二个对照组显示出轻微的肿瘤生长减少。接受NDV MTH87的动物显示出强烈的肿瘤减少。在第20天时，在经表达抗HIF1α锚蛋白重复序列蛋白的NDVMTH288所注射的小鼠中看到了最佳的肿瘤生长抑制。经MTH288处理后的肿瘤生长抑制比其它处理之后的抑制明显更好。

这个结果证实了NDV细胞内表达抗HIF1α的锚蛋白重复序列蛋白要优于单独的NDV处理或者应用重组纯化的抗HIF1α锚蛋白重复序列蛋白。

预计病毒表达融合于细胞穿透肽(例如tat肽、寡精氨酸肽、AntP肽、VP22肽、穿透肽、转运子(其综述见Ford et al.，2001))的分泌性抗HIF1α锚蛋白重复序列蛋白增强了治疗作用。这个策略容许抗HIF1α锚蛋白重复序列融合蛋白所靶向的肿瘤细胞是本身没有受NDV感染的肿瘤细胞。

预计同时表达两种不同的dARPINS(一种是抗HIF1α的细胞内dARPINS，一种是抗白介素8的分泌性dARPINS)的转基因的病毒具有增加的抗肿瘤活性，因为阻断了两条相互补充的途径(Mizukami et al.，2005)。

实施例10：MTH151造成受感染的细胞表达β-葡糖醛酸糖苷酶

材料和方法

将HeLa细胞铺板于6孔板内。在达到汇合之后，用非常低的MOI＝0.00001的MTH87和MTH115感染细胞。在所述的时间点上，取出细胞培养液的一部分，并冷冻于-20℃。在感染72个小时之后，用MUG检测法同时检测所有上清液中的β-葡糖醛酸糖苷酶的活性。

用于定量β-葡糖醛酸糖苷酶活性的MUG检测法

MU(4-甲基繖形酮)和MUG(4-甲基繖形酮-β-D-葡糖苷酸)都来自Sigma。用MU生成标准曲线。在MUG检测之前，用紫外线照射含病毒的样品30分钟以灭活病毒。在25mM乙酸钠缓冲液(pH 5.6)内，将样品和10μM MUG在37℃孵育60分钟。加入200mM甘氨酸缓冲液(pH10.4)终止反应。用荧光光度计在激发波长为320nm和发射波长为460nm处测定出荧光强毒。从发射的荧光量中，计算出每小时每ml nmol的特异活性。

结果

MTH115感染造成了β-葡糖醛酸糖苷酶表达的时间依赖性的增加，这是病毒复制造成的结果(图7)。尽管MTH87最终杀死了细胞并因此释放出细胞的内源性β-葡糖醛酸糖苷酶，但是所形成的上清液中的活性是忽略不计的。MTH115感染显然获得了转基因的大量产生。MTH115的CPE与MTH87和MTH68(wt)的CPE相当，使得病毒表达β-葡糖醛酸糖苷酶不会减弱病毒的复制，也不会降低病毒的细胞致病性。

实施例11：定量MTH115在各种细胞内的转基因表达

材料和方法

将细胞种植于96孔板内。选择细胞数目以便在铺板1天后达到汇合：

HeLa 15000细胞/孔

HT29 30000细胞/孔

成纤维细胞10000细胞/孔

HDMVEC 20000细胞/孔

在种植细胞1天后，用MOI为0.01的病毒MTH115感染细胞。用PBS充分地洗涤细胞，在37℃用100μl病毒悬浮液接种细胞，吸出病毒并给细胞加入200μl温培养基。

在所示的时间点，取出上清液并丢弃细胞，进行β-葡糖醛酸糖苷酶MUG检测法。对于每个时间点都分析一式三孔。

结果

图8概括了结果。在正常细胞HDMVEC和成纤维细胞中都没有检测到转基因表达。也没有观察到细胞致病作用。在易感于病毒的肿瘤细胞HeLa和HT29中，都大量生成了转基因β-葡糖醛酸糖苷酶，在上清液中可以检测到其活性。在48小时内被病毒杀死的HeLa细胞产生了相对更低水平的转基因。在所用的病毒剂量下，仅仅在5天后才死亡的HT29细胞甚至产生了更高的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，约为HeLa细胞的10倍并比背景水平高1000倍。

实施例12：NDV-β-葡糖醛酸糖苷酶和HMR1826协同杀死对每种单独的治疗都耐药的细胞

材料和方法

在第1天，将细胞铺板到24孔板内。在第2天，用MOI为0.001的NDV-β-葡糖醛酸糖苷酶(MTH115)感染细胞。在第3天，用1μM阿霉素或者用1μM阿霉素-葡糖苷酸HMR1826处理细胞。在第8天，洗涤、固定以及用Giemsa染色细胞，并给孔拍照。

结果

图9和图10概括了结果。给定浓度的阿霉素单独杀死细胞。相同浓度的前体药物对细胞是无毒的。给定MOI的病毒单独也是无毒的，因为选择了具有一定程度的对病毒治疗的耐受性的肿瘤细胞。表达葡糖醛酸糖苷酶的病毒与前体药物的组合能够杀死每种治疗单独都不能杀死的细胞。对照病毒(表达GFP而不是β-葡糖醛酸糖苷酶的病毒)没有显示出与前体药物治疗的任何协同性。

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                              序列表

<110>拜尔舍林医药股份公司

<120>重组新城疫病毒

<130>53277A

<150>EP04090432.8

<151>2004-11-11

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>52

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Sfi fw，DNA-Oligonucleotide

<400>1

aggccttaat taaccgacaa cttaagaaaa aatacgggta gaacggcctg ag              52

<210>2

<211>52

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Sfi back.DNA-Oligonucleotide

<400>2

aggccgttct acccgtattt tttcttaagt tgtcggttaa ttaaggcctc tc              52

<210>3

<211>60

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Asc fw，DNA-Oligonucleotide

<400>3

cgggcgcgcc ccgacaactt aagaaaaaat acgggtagaa cagcagtctt cagtcttaat      60

<210>4

<211>60

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Asc back.DNA-Oligonucleotide

<400>4

taagactgaa gactgctgtt ctacccgtat tttttcttaa gttgtcgggg cgcgcccgat      60

<210>5

<211>318

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Intergenic region between F and HN of plasmid pflMTH68_Asc_Pac，

     DNA-Oligonucleotide

<400>5

atgcagatga gaggcagagg tatccccaat agcaatctgt gtgtcaattc tggcagcctg     60

ttaatcagaa gaattaagaa aaaactaccg gatgtaggtg aacaaaaggg aatatacggg    120

tagaacggcc tgagaggcct taatcgggcg cgccccgaca acttaagaaa aaatacgggt    180

agaacagcag tcttcagtct taattaaccg acaacttaag aaaaaatacg ggtagaacgg    240

cctgagaggc cacccctcaa tcgggagcca ggccccacta cgtccgctct accgcaacac    300

caacagcagt cttcagtc                                                  318

Claims (30)

1.一种重组溶瘤性RNA病毒，其包含具有至少一个转基因的核酸，其中该转基因的核酸编码结合蛋白，当所述结合蛋白被受所述病毒感染的肿瘤细胞表达时，其具有治疗活性。

2.权利要求1的病毒，其是负链RNA病毒。

3.权利要求1或2的病毒，其是副粘病毒。

4.权利要求1到3中任一项的病毒，其是新城疫病毒(NDV)。

5.权利要求4的病毒，其是非轻型毒性NDV，如中等毒力NDV或强毒NDV，特别是中等毒力株MTH68。

6.权利要求1到5中任一项的病毒，其中结合蛋白属于下面的组：天然配体或遗传学修饰的配体、天然受体的重组可溶性结构域或其修饰形式、肽配体或多肽配体、抗体分子或其片段或衍生物或抗体样分子如锚蛋白重复序列蛋白或其片段或衍生物。

7.权利要求1到6中任一项的病毒，其中结合蛋白来源于哺乳动物，例如来源于人、鼠或密切相关的来源，或是嵌合蛋白质。

8.前述权利要求中任一项的病毒，其中结合蛋白是单体的、二聚体的、三聚体的、四聚体的或多聚体的蛋白。

9.前述权利要求中任一项的病毒，其中结合蛋白是单特异性的、双特异性的或多特异性的。

10.前述权利要求中任一项的病毒，其中结合蛋白是包含至少一个结合结构域和异源结构域的融合蛋白。

11.权利要求13的病毒，其中结合蛋白是与毒素例如人RNAse(假单胞外毒素、白喉毒素)形成的融合蛋白、或与酶例如β-葡糖苷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、羧肽酶、β-内酰胺酶形成的融合蛋白或者与具有细胞因子活性的免疫刺激蛋白例如IL-2、IL-12、TNF-α、IFN-β或GM-CSF形成的融合蛋白。

12.前述权利要求中任一项的病毒，其中所述结合蛋白选自下面的组：自主活性的生长因子受体(例如EGFR、Met)的阻断蛋白、生长因子的竞争结合剂(拮抗剂)、Rb磷酸化的阻断蛋白、E2F依赖性转录的阻断蛋白、p53的稳定剂、抗凋亡蛋白(例如Bcl-2)的拮抗型结合剂、细胞周期素的拮抗型结合剂、Ras效应物(例如GEF)的拮抗型结合剂、缺氧诱导型蛋白(例如HIF1α)的拮抗型结合剂、干扰二聚体化或DNA结合或辅助因子结合(例如Myc/Max)的转录因子的抑制剂、分化诱导剂、smad信号传导/转移的抑制剂、细胞粘附相互作用(例如钙粘素、整联蛋白例如βα5β1、αvβ3)的抑制剂、降解细胞外基质(例如MMP)的酶的抑制剂、促血管生成配体的拮抗型结合剂(例如可溶性VEGF-R)、促血管生成受体的拮抗型结合剂、支架复合物形成(例如KSR/Ras)的抑制剂、翻译起始(例如eIF4E、EIF2α)的抑制剂、有丝分裂激酶(例如Plk-1)的抑制剂。

13.权利要求1到12中任一项的重组溶瘤性RNA病毒的核衣壳。

14.权利要求1到12中任一项的重组溶瘤性RNA病毒的基因组。

15.一种DNA分子，其编码权利要求1到12中任一项的重组溶瘤性RNA病毒的基因组和/或反基因组。

16.权利要求15的DNA分子，其与转录调节序列可操纵地连接。

17.一种细胞，其包含权利要求1到12中任一项的重组溶瘤性RNA病毒、权利要求14的病毒基因组或权利要求15或16的DNA分子。

18.一种药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求1到12中任一项的重组溶瘤性RNA病毒、权利要求14的病毒基因组或权利要求15或16的DNA分子，以及任选地包含药学可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。

19.权利要求18的药物组合物，其用于预防和/或治疗癌症。

20.一种用于预防和/或治疗癌症的方法，包括给所需治疗的对象施用药学有效量的权利要求18或19的组合物。

21.权利要求20的方法，其中对象是人类患者。

22.一种重组溶瘤性RNA病毒，其包含具有至少一个转基因的核酸，其中该转基因的核酸编码前体药物转换酶，当所述前体药物转换酶被感染病毒的肿瘤细胞表达时，其具有治疗活性。

23.一种重组溶瘤性RNA病毒，其包含具有至少一个转基因的核酸，其中该转基因的核酸编码蛋白酶，当所述蛋白酶被感染病毒的肿瘤细胞表达时，其具有治疗活性。

24.一种药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求1到12中任一项的重组溶瘤性病毒、权利要求14的病毒基因组和/或权利要求15或16的DNA分子，以及任选地包含药学可接受的载体、稀释剂和/或佐剂，其中所述病毒、病毒基因组和/或DNA分子包含至少一个编码前体药物转换酶的转基因。

25.权利要求24的药物组合物，还包含一种可以被权利要求24所述的病毒、病毒基因组和/或DNA分子编码的前体药物转换酶转化成治疗活性化合物的前体药物。

26.权利要求24或25的药物组合物，其用于治疗和/或缓解增殖性疾病。

27.一种用于治疗增殖性疾病的方法，包括给所需治疗的对象施用药学有效量的

(a)包含至少一个编码前体药物转换酶的转基因的权利要求1到12中任一项的重组溶瘤性病毒、权利要求14的病毒基因组、和/或权利要求15或16的DNA分子；和

(b)适用于治疗增殖性疾病的前体药物，其中前体药物可以被(a)的前体药物转换酶转化成药学活性化合物。

28.一种药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求1到12中任一项的重组溶瘤性病毒、权利要求14的病毒基因组和/或权利要求15或16的DNA分子，以及任选地包含药学可接受的载体、稀释剂和/或佐剂，其中所述病毒、病毒基因组和/或DNA分子包含至少一个编码蛋白酶的转基因。

29.权利要求28的药物组合物，其用于治疗和/或缓解增殖性疾病。

30.一种用于治疗增殖性疾病的方法，包括给所需治疗的对象施用药学有效量的包含至少一个编码蛋白酶的转基因的权利要求1到12中任一项的重组溶瘤性病毒、权利要求14的病毒基因组、和/或权利要求15或16的DNA分子。

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