JP2008519590A - 組換えニューカッスル病ウィルス - Google Patents

Abstract

本発明の目的は、腫瘍崩壊性NDVの治療活性を高めることである。この問題は、ウィルス感染された腫瘍細胞により発現される場合、治療活性を有する結合タンパク質をコードする組換え核酸を含んで成るニューカッスル病ウィルスにより解決される。結合タンパク質は次のグループに属する：天然のリガンド又は遺伝子的に修飾されたリガンド、天然の受容体の組換え可溶性ドメイン又はその修飾された変型、ペプチド−リガンド、抗体分子及びその誘導体又は抗体様分子、例えばアンキリン反復分子又はその誘導体。

Description

概論：
本発明は、疾病の処理、特に腫瘍崩壊性の腫瘍処理のための組換えRNAウィルス、好ましくはパラミクソウィルス、好ましくはニューカッスル病ウィルス（NDV）に関する。結合タンパク質（抗体、アンキリン反復分子、ペプチド、等）、プロドラッグ転換酵素及び/又はプロテアーゼをコードし、そしてウィルス感染された腫瘍細胞においてそれらの分子の選択的発現を導く組換えウィルスが生成される。それらの結合タンパク質、プロドラッグ転換酵素及び/又はプロテアーゼの活性が、ウィルスの抗腫瘍効果を高める。さらに、本発明は、癌の処理のためのそのような修飾されたウィルスの製造及び使用を記載する。

技術状態の記載：
ニューカッスル病ウィルス：
一般的に腫瘍の処理のための腫瘍崩壊性ウィルスは、Chiocca(2002)に再考されている。ニューカッスル病ウィルスは、40年以上の間、実験用治療剤として使用されており、そしてSinkovics and Horvath (2000)により再考されている。ニューカッスル病ウィルスは一般的に、Alexander(1988)による本に記載されている。NDV株DV701が、グリア芽腫のための抗癌処理として開発されている（Lorence et al., 2003）。NDV株MTH68は、実験用癌処理として使用されており、そして30年以上の間、ヒトに投与されて来た（Csatary など., 2004）。

Stojdlなど. (2003)による文献においては、すべての試験された腫瘍細胞系の80％において、水疱性口内炎ウィルス（VSV）による感染に続いてインターフェロン応答に欠陥が存在することが記載されている。類似する％の腫瘍細胞系は、VSV及びNDVの両者がモノネガビラレス（mononegavirales）目のメンバーであるので、NDVによる感染に対して敏感であることが想定され得る。腫瘍細胞におけるNDVの選択的複製の機構がウィルスに対する細胞性インターフェロン応答における欠陥に基づかれていることを示されている（例えばUS:2003/0044384を参照のこと）。

組換えパラミクソウィルス：
EP-A-0702085号は、ウィルスゲノムの読取枠、偽遺伝子領域又は遺伝子間領域に挿入及び/又は欠失を含んで成る、遺伝子的に操作された感染性の複製する断片化されていない陰性鎖RNAウィルス変異体に関する。
WO99/66045号は、ウィルスゲノムの十分な長さのcDNA分子から得られた、遺伝子的に修飾されたNDVウィルスに関する。

WO00/62735号は、インターフェロン感受性、複製−コンピテントクローンRNAウィルス、例えばNDVの投与を含んで成る、腫瘍処理の方法に関する。
WO01/20989号（PCT/US00/26116号）においては、腫瘍を有する患者の組換え腫瘍崩壊性パラミクソウィルスによる処理方法が記載されている。腫瘍は、複製−コンピテントパラミクソビリダエウィルスの投与により低められる。腫瘍崩壊性質を改良するために、ウィルスゲノムを構築するために使用され得る種々の方法が記載されている。

WO03/005964号は、サイトカインをコードする核酸を含んで成る組換えVSVに関する。
US6,699,479号は、V-タンパク質を低レベルで発現し、そして修正遺伝子座にヌクレオチド置換を含んで成るNDV変異体を記載する。
US2004/0170607号は、通常のヒト病原体ではない５種のウィルスを投与することによるメラノーマの処理に関する。

NDVの遺伝子操作：
NDVは、例えばEP-A-0702085号に記載のようにして逆向き遺伝学技法を用いて遺伝子的に操作され得る。例えば、分泌されたアルカリホスファターゼ（Zhao and Peeters, 2003）、緑色蛍光タンパク質（Engel-Herbert など., 2003）、感染性嚢胞疾患ウィルスのVP2タンパク質（Huang など., 2004）、インフルエンザウィルス赤血球凝集素（Nakaya など., 2001）、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Huang など., 2001）(Krishnamurthyなど., 2000)をコードする追加の核酸を含んで成る組換えNDV構造体を製造することは知られている。それらの組換えNDVのどれも、ヒト疾患の処理への使用のために構成されていない。組換えNDVは、NDVの基本的ウィルスを研究するためにか、又は家禽類のためのワクチン株を開発するために製造された。親ウィルス株として、NDVの長期潜伏期性株が作用した。それらの株は、有意な腫瘍崩壊性質を有さない。

発明の要約：
本発明は、RNAウィルス、例えば高められた腫瘍崩壊活性を有するNDVに関する。より特定には、本発明は、RNAウィルス、特に癌の処理において治療適切性を有する組換え核酸を含んで成るニューカッスル病ウィルスに関し、ここで前記核酸は、ウィルス感染された腫瘍細胞により発現される場合、治療活性を有する、結合タンパク質、プロドラッグ−転換酵素、及び/又はプロテアーゼをコードする。

組換え腫瘍崩壊ウィルス、例えば１又は複数のトランスジーンを含んで成るNDVがより好ましく、ここで前記トランスジーンは、結合タンパク質、プロドラッグ−転換酵素及び/又はプロテアーゼをコードする。異なった特異性の組合せが可能である。
さらに、本発明は、キャプシドタンパク質により複合体化されたウィルスRNAを含んで成る、上記のような組換えウィルスのヌクレオチドキャプシド、又はウィルスRNA、及び/又はその単離された形でのウィルスRNAに対して相補的なRNAに関する。

さらに、本発明は、DNA、例えばウィルスRNAをコードするcDNA、及び/又はウィルスRNAに対して相補的なDNAに関する。さらに、本発明は、腫瘍疾患の予防又は治療に関する。
好ましい態様の特定の記載：

ウィルス：
本発明は一般的に、RNAウィルス、好ましくは陰性鎖RNAウィルス、より好ましくは、腫瘍崩壊性質を有し、そして遺伝子的に構築され得るようなウィルスに関する。そのようなウィルスは、次のものを包含する：
−パラミクソウィルス、好ましくはニューカッスル病ウィルス（NDV）、麻疹ウィルス、おたふくかぜウィルス、センダイ（Sendai）ウィルス；
−オルトミクソウィルス、好ましくはインフルエンザウィルス；
−ラブドウィルス、好ましくは水疱性口内炎ウィルス。

従って、本発明の目的は、少なくとも１つのトランスジーンを有する核酸を含んで成る組換え腫瘍崩壊性RNAウィルスであり、前記トランスジーンの核酸は、ウィルス−感染された腫瘍細胞により発現される場合、治療活性を有する結合タンパク質をコードすることを特徴とする。

もう１つの本発明の目的は、少なくとも１つのトランスジーンを有する核酸を含んで成る組換え腫瘍崩壊性RNAウィルスであり、前記トランスジーンの核酸は、ウィルス−感染された腫瘍細胞により発現される場合、治療活性を有するプロドラッグ転換酵素をコードすることを特徴とする。

さらにもう１つの本発明の目的は、少なくとも１つのトランスジーンを有する核酸を含んで成る組換え腫瘍崩壊性RNAウィルスであり、前記トランスジーンの核酸は、ウィルス−感染された腫瘍細胞により発現される場合、治療活性を有するプロテアーゼをコードすることを特徴とする。
好ましくは、本発明のウィルスは、コードされるトランスジーンの腫瘍選択的発現を導く腫瘍選択的感染を示す。

本発明の組換え腫瘍崩壊ウィルスは、結合タンパク質、プロドラッグ転換酵素及び/又はプロテアーゼをコードするトランスジーンから独立して選択された少なくとも１つのトランスジーン遺伝子を担持することができる。
本発明のウィルスは、陰性鎖RNAウィルス、より好ましくはパラミクソウィルスである。

本発明においては、少なくとも１つのトランスジーンを有する核酸は、本発明の組換えRNAウィルスが基づかれる腫瘍崩壊RNAウィルスに対して異種である遺伝子を含んで成る核酸である。用語“異種”とは、遺伝子のコード領域又はその一部をコードすることができる、完全な遺伝子又はその一部を意味する。

異種遺伝子は、人工配列であることができるか、又は天然源から得られるか、又は天然源及び/又は人工配列から得られた配列から選択された少なくとも２種の配列の組換えにより得られる。“天然源”とは、動物、例えば哺乳類、植物、菌類、及び微生物、例えば細菌、原生動物及びウィルス（本発明の他の腫瘍崩壊RNAウィルスとは異なる）を包含する。トランスジーンはまた、融合タンパク質もコードする。哺乳類は、ヒト及びマウスを包含する。

特に好ましい態様においては、本発明のウィルスは、ニューカッスル病ウィルス（NDV）、最も好ましくはNDV株MTH68である。NDVは、長期潜伏期性、亜病原性又は短期潜伏期性株であり得る。亜病原性又は短期潜伏期性NDV株が特に好ましい。ウィルスは好ましくは、複製コンピテントである。

ウィルスの遺伝子操作：
RNAを遺伝子的に操作するための方法は、上記で言及されたように、良く知られている。さらに、腫瘍崩壊ウィルスの遺伝子操作は、例えばBellなど.（2002）に再考される。ウィルス療法剤としてのRNAウィルスは、Russell（2002）に再考される。それらの記録のいずれかの内容物は、引用により本明細書に組み込まれる。

結合タンパク質：
本発明の主要崩壊組換えRNAウィルスにおいては、少なくとも１つのトランスジーンが結合タンパク質をコードすることができる。
結合タンパク質は、標的細胞において発現される場合、前記細胞及び/又は隣接する細胞の成分に結合することができるタンパク質である。好ましくは、結合タンパク質は、細胞内成分に結合するタンパク質である。

好ましい態様においては、結合タンパク質は、次のグループ、すなわち天然リガンド又は遺伝子的に修飾されたリガンド、天然受容体の組換え可溶性ドメイン又はその修飾された変型、ペプチド−又はポリペプチド−リガンド、抗体分子又はそのフラグメント又は誘導体、又は抗体様分子、及びその誘導体に属する。
高−親和性結合骨格の不完全な再考が、Ladner and Ley（2001）により与えられている。

上記のような結合タンパク質は、ヒト、ネズミ、又は密接に関連する起源のもの又はキメラ性変型のもの、すなわち異なった種、例えばヒト及びマウスからの配列を含んで成る融合タンパク質であり得るタンパク質のものであり得る。
上記に基づかれる組換え結合分子は、単量体、二量体、三量体、四量体又は多量体及び二特異的又は多特異的であり得る。
好ましい結合タンパク質は、治療活性を有する結合タンパク質から選択される。

上記のような天然のリガンドは、成長因子又はペプチドであり得る。遺伝子的に修飾されたリガンドは、天然に存在する成長因子又はペプチドの類似体であり得る。
上記のような天然の受容体の組換え可溶性ドメイン又はその修飾された変型は、細胞表面受容体の組換え的に発現された可溶性細胞外ドメイン及び/又はそのフラグメント、細胞付着分子の組換え的に発現された可溶性細胞外ドメイン及び/又はそのフラグメントである。

上記抗体分子は、いずれか既知の特異性及びイソタイプのモノクローナル免疫グロブリン抗体、そのフラグメント、及び/又はエフェクタータンパク質に融合されたそのフラグメントであり得る。抗体分子は、キメラ性、ヒト融合された又はヒト抗体であり得る。抗体フラグメントは、抗体の少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。抗体フラグメントは、文献（引用により本明細書に組み込まれるAllen（2002）に再考される）に集中的に記載されている。好ましい例は、一本鎖Fvフラグメント、Fabフラグメント、F(ab2’)、ミニ抗体と呼ばれるドメイン欠失された変型、及び他の免疫活性部分、フラグメント、セグメント及び他のより小さいか又はより大きな部分的抗体構造体であり、ここで後者は、本発明の方法内において治療的に有用であるより十分な標的化性質又は免疫学的刺激又は阻害活性を有する。

そのような抗体は、トランスジェニックマウスの使用によるハイブリドーマクローニング実験、又はファージ表示選択、リボソーム表示選択、又はヒト抗体配列を含む抗体ライブラリーのコロニーフィルタースクリーニング、又は関連する方法論から誘導され得る。

上記のような抗体様性質を有する結合タンパク質は、１又は複数のペプチドループが、高い特異性を有する高親和性結合分子が、ファージ表示、リボソーム表示、コロニーフィルタースクリーン又は関連する方法論により、そのような分子のライブラリーからのいずれかの抗原に対して富化され得るような手段で、アミノ酸のレベルに基づいてランダム化される、遺伝子的に修飾されたタンパク質又はそのドメインであり得る。選択されたタンパク質は通常、高い熱及び熱力学的安定性を有し、そして組換え発現システム、例えばE. コリ、酵母、昆虫及び哺乳類発現システムにおいて良く発現される。

抗体様性質を有するそのような結合タンパク質の例は、Binzなど. (2004)に記載されるようなアンキリン反復タンパク質、Skerra（2000）に記載されるようなリポカリン、DE19932688.6に記載されるようなγ−クリスタリン、Hogbom など. (2003)又は Nord など. (2000)に記載されるような修飾されたプロテインA骨格（affibodies）、又はフィブロネクチン骨格又は他のものである。抗体様分子は、一本鎖分子として、又は多鎖分子として構成される、モノマー又は反復性分子であり得、ここで前記抗体様分子は、本発明の方法内において治療的に有用であるために十分な標的化性質、又は免疫学的刺激又は阻害活性を有する。

追加の機能を有する結合分子：
結合タンパク質は、例えば抗体の少なくとも１つの結合ドメイン及び異種ドメインを含んで成る融合タンパク質であり得る。“異種”とは、異種遺伝子において上記で論じられたような意味を有する。

上記に記載される結合タンパク質は、いわゆるイントラボディー（intrabody）として、又は細胞外利用できる結合タンパク質として疾病特異的部位（例えば、腫瘍）にペイロードを供給することができる。供給されたペイロードは、異種ドメイン、例えば毒素、例えばヒトRNアーゼ（De Lorenzo など., 2004）(Zewe など., 1997)、シュードモナス内毒素（Chaudhary など., 1989）(Kreitman and Pastan, 1995) (Batra など., 1992)、ジフテリア毒素（Kreitman など., 1993）(Chaudhary など., 1990) (Batra など., 1991)、又は、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ（Rofflerなど., 1991）(Wang など., 1992) (Bosslet など., 1992)、β−グルコシダーゼ（Rowlinson-Busza, 1992）、カルボキシペプチダーゼ（Antoniw など., 1990）(Bagshawe など., 1988)、治療効能を有するβ−ラクタマーゼ、又はサイトカイン活性、例えばIL-2、IL-12、TNF-α、IFN-β又はGM-CSFを有する免疫刺激性タンパク質（例えば、Allon（2002）により再考を参照のこと）であり得る。

もう１つの例においては、上記に記載される結合タンパク質は、治療的に有用である、それ自体拮抗性又は作用性効力を有する。拮抗性/阻止性結合分子の例は、VEGF阻害抗体Avastin(Ferrara など., 2004)、HER2/neu受容体阻止抗体Herceptin（Noonberg and Benz, 2000）又はEGF−受容体阻止抗体Erbitux（Herbst and Langer, 2002）である。作用性結合タンパク質は、例えばアポプトシスを誘発するか（Georgakisなど., 2005）、又はDNA、RNA又はタンパク質に対して調節活性を有する（例えば、転写を誘発し、タンパク質を安定化する）結合タンパク質であり得る。Adams and Weiner, 2005による再考は、腫瘍崩壊性ウィルス中に組み込まれ得る種々の治療抗体を記載する。

プロドラッグ−転換酵素；
本発明の腫瘍崩壊性組換えRNAウィルスにおいては、少なくとも１つのトランスジーンが、プロドラッグ−転換酵素をコードすることができる。
プロドラッグは、活性化合物に酵素的に転換され得る、治療的活性化合物の誘導体又は前駆体である。プロドラッグ−転換酵素は、プロドラッグを治療的活性薬剤に転換できる酵素である。

従って、本発明の目的は、任意には、医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤及び/又はアジュバントと一緒に、活性成分としての本発明の組換え腫瘍崩壊ウィルス、本発明のウィルスゲノム、本発明のウィルス抗ゲノム、及び/又は本発明のDNA分子を含んで成る医薬組成物であり、前記ウィルス、ウィルスゲノム及び/又はDNA分子はプロドラッグ転換酵素をコードする、少なくとも１つのトランスジーンを含んで成る。

医薬組成物はさらに、ウィルス、ウィルスゲノム、抗ゲノム及び/又はDNA分子によりコードされるプロドラッグ−転換酵素により、治療的活性の化合物に転換され得るプロドラッグを含んで成ることができる。医薬組成物は、増殖性障害の処理及び/又は軽減のために適切である。

プロドラッグは、活性成分としての本発明の組換え腫瘍崩壊性ウィルス、本発明のウィルスゲノム、本発明のウィルス抗ゲノム及び/又は本発明のDNA分子により、単一の組成物において配合され得るか、又は腫瘍崩壊性ウィルス配合とは異なった組成物において配合され得る。

本発明の腫瘍崩壊性組換えRNAウィルスがプロドラッグ転換酵素をコードする場合、本発明の腫瘍崩壊性ウィルスは、プロドラッグ転換酵素を通常発現しないか又は十分には発現しないウィルス感染された標的細胞（特に、腫瘍細胞）におけるプロドラッグ転換酵素の選択的発現を引起す。従って、その必要な対象の処理の間、プロドラッグは標的細胞、特に腫瘍細胞において医薬活性化合物に特に転換されるが、しかし非標的細胞、特に処理される対象の健康な細胞においては、治療的活性化合物に実質的に転換され得ない。従って、治療的活性化合物の所望しない副作用は、治療的活性化合物単独での処理に比較して、低められる。

本発明においては、プロドラッグ転換酵素により転換され得るプロドラッグは、増殖障害の処理及び/又は軽減のために適切な治療激活性化合物の誘導体又は前駆体であり得る。プロドラッグは、当業者により知られている化合物であり得る。誘導体及び/又は前駆体は、当業者により知られている。

プロドラッグは実質的に医薬的不活性及び/又は非毒性であることが好ましい。
本発明のプロドラッグ転換酵素の例は、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、β−ラクタマーゼ、D−アミノ酸オキシダーゼである。さらなる例は、当業者により知られている。
プロドラッグ転換酵素は、非腫瘍細胞において実質的に発現されないことが好ましい。

プロドラッグ転換酵素は、哺乳類、植物、菌類、及び微生物、例えば細菌、原生動物/及びウィルスから選択された生物から得られる。
プロドラッグ転換酵素及びプロドラッグの最も好ましい組合せは、E. コリβ−グルクロニダーゼ、及びβ−グルクロニダーゼにより活性細胞毒性化合物に転換され得るプロドラッグである。例は、癌の処理のための既知化合物であるドキソルビシンに転換され得るHMR1826（ドキソルビシン−グルクロニド）である。

本発明のもう１つの目的は、
（ａ）プロドラッグ転換酵素をコードする少なくとも１つのトランスジーンを含んで成る、本発明の組換え腫瘍崩壊ウィルス、本発明のウィルスゲノム、本発明のウィルス抗ゲノム、及び/又は本発明のDNA分子；及び
（ｂ）上記（ａ）のプロドラッグ転換酵素により医薬的活性化合物に転換され得る、増殖障害の処理のために適切なプロドラッグを、その必要な対象に、医薬的有効量で投与することを含んで成る、増殖障害、特に過増殖性疾患、例えば癌の処理方法である。

前記方法は、成分（ａ）及び（ｂ）の両者を含んで成る単一の医薬組成物の投与を包含するか、又は２種の異なった医薬組成物の投与を包含し、その１つは、成分（ａ）を含み、そして他の１つは（ｂ）を含んだ。

プロテアーゼ：
本発明の腫瘍崩壊性組換えRNAウィルスにおいては、少なくとも１つのトランスジーンが、プロテアーゼをコードすることができる。
従って、本発明の目的は、任意には、医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤及び/又はアジュバントと一緒に、活性成分としての本発明の組換え腫瘍崩壊ウィルス、本発明のウィルスゲノム、本発明のウィルス抗ゲノム、及び/又は本発明のDNA分子を含んで成る医薬組成物であり、ここで前記ウィルス、ウィルスゲノム及び/又はDNA分子がプロテアーゼをコードする、少なくとも１つのトランスジーンを含んで成る。医薬組成物は、増殖障害の処理及び/又は軽減のために適切である。

本発明の腫瘍崩壊性組換えRNAウィルスがプロテアーゼをコードする場合、本発明の腫瘍崩壊性ウィルスは、プロテアーゼを通常発現しないか又は十分には発現しないウィルス感染された標的細胞（特に、腫瘍細胞）におけるプロテアーゼの選択的発現を引起す。従って、その必要な対象の処理の間、プロテアーゼは標的細胞における標的プロペプチドを可逆的に分解することができ、それにより、標的細胞の増殖及び/又は成長を阻害するか、又は標的細胞を殺害するが、しかし非標的細胞、特に処理される対象の健康な細胞における標的分子を実質的に分解しない。この方法によれば、プロテアーゼ処理の所望しない副作用が低められる。

プロテアーゼは配列特異的プロテアーゼであることが好ましい。標的プロペプチドを特異的に分解するプロテアーゼがより好ましい。プロテアーゼは、天然起源のものであり、そしていずれかの種に起因することができるか、又はそれは構築され得る。予定された標的ポリペプチドの特異的分解のために適切なアミノ酸配列は、公的に入手できる配列データベースに基づいて、当業者により決定され得る。US2005-0175581号及びUS2004-0072276号は、予定される基質特異性を有するタンパク質−構築されたプロテアーゼの生成を記載する。それらの２つの資料は、引用により本明細書に包含される。

プロテアーゼの標的分子は、結合タンパク質の標的のための下記のようないずれかの標的分子であり得る。
本発明のもう１つの目的は、プロテアーゼをコードする少なくとも１つのトランスジーンを含んで成る、本発明の組換え腫瘍崩壊ウィルス、本発明のウィルスゲノム、本発明のウィルス抗ゲノム、及び/又は本発明のDNA分子を、その必要な対象に、医薬的有効量で投与することを含んで成る、増殖障害、特に過増殖性疾患、例えば癌の処理方法である。

本発明のトランスジーンは、上記に定義されるようなプロドラッグ転換酵素、上記に定義されるような結合分子及び/又は上記に定義されるようなプロテアーゼの融合タンパク質をコードすることができる。プロドラッグ転換酵素及び結合分子の融合タンパク質、又はプロテアーゼ及び結合分子の融合タンパク質が特に好ましい。

治療用途：
本発明は、結合タンパク質、プロドラッグ転換酵素及び/又はプロテアーゼをコードするトランスジーンが腫瘍崩壊性ウィルス感染された腫瘍細胞において機能的に発現され得ることを、最初に示している。従って、本発明は、任意には、医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤及び/又はアジュバントを共に、上記に示されるようなウィルス、前記ウィルスのヌクレオキャプシド、ウィルスのゲノム、又はウィルスのゲノム及び/又は抗ゲノムをコードするDNA分子を活性成分として含んで成る医薬組成物に関する。

医薬組成物は、溶液、懸濁液、凍結乾燥物として、又はいずれか他の適切な形で提供され得る。活性成分の他に、組成物は、当業界において知られているようなキャリヤー、緩衝液、界面活性剤、及び/又はアジュバントを含んで成る。組成物は、例えば経口的に、局部的に、鼻腔内、肺内投与されるか、又は局部注射により又は静脈内注射により投与され得る。医薬組成物は、阻害の型、患者の状態及び体重、投与の経路、等に依存して、医薬的有効量で投与される。好ましくは、10⁹〜10¹²個のウィルス粒子、10⁸〜10¹¹、10⁷〜10¹⁰又は10⁶〜10⁹個のウィルス粒子が、適用当たり投与される。腫瘍崩壊治療は任意は、他の腫瘍治療、例えば手術、放射線及び/又は化学療法、例えばシクロホスファミド処理及び/又は高温処理と共に組合され得る。

本発明によれば、組換え腫瘍崩壊性パラミクソウィルスは、感染された細胞に存続するか、又は分泌され得る。可溶性結合タンパク質、プロドラッグ転換酵素及び/又はプロテアーゼ、例えば下記に特定されるような抗体、抗体フラグメント、アンキリン反復タンパク質又は他の結合分子を発現することができる。そのようなタンパク質は、RNAウィルス、例えばニューカッスル病ウィルスの腫瘍崩壊性株により発現され得る。

NDVの例として、MTH68株が、患者の実験臨床処理からの有望なデータを有する固有の腫瘍崩壊性質を有するので、本出願において選択された（Sinkovics and Horvath, 2000）。しかしながら、原則として、多塩基性融合タンパク質分解部位を有するほとんどのNDV株は、腫瘍の処理のための腫瘍崩壊剤として使用され得る。逆向き遺伝学技法が、すべての株に適用できる。
上記のような結合タンパク質は、高い治療能力のものであることが示されている。

上記性質の治療結合タンパク質、プロドラッグ転換酵素及び/又はプロテアーゼと、腫瘍崩壊性NDVとの組合せは、２種の治療原理の追加の又はさらに、相乗の効能を有するであろう。腫瘍崩壊自己複製ウィルスは、高い局部濃度で現場発現される作用の好ましい部位に、結合タンパク質薬剤、プロドラッグ転換酵素及び/又はプロテアーゼを標的化する。そのようなタンパク質発現は、非常に選択的であることが予測され、そしてそのそれぞれの作用の態様を有する結合タンパク質、プロドラッグ転換酵素及び/又はプロテアーゼが、NDVの固有の治療腫瘍崩壊活性に付加されるであろう。使用されるウィルスの複製コンピテント性質及び腫瘍細胞における選択的複製に基づいて、発現されたトランスジーン[結合タンパク質、プロドラッグ転換酵素及び/又はプロテアーゼ]の量は、腫瘍の質量に大まかに比例すると思われる。

抗体分子又は抗体様分子、又はそれらの誘導体は、NDV−システムと共に使用される理想的な結合タンパク質である。抗体分子は、集中的研究の対象であり、そして技法は現在、非免疫原性であり、非常に選択的であり、そして高い親和性のものである抗体分子を生成するために利用できる。高濃度での抗体分子の局部発現は、標準の治療に比較して、低められた毒性プロフィールを有するエフェクター分子の非常に有意な作用性又は拮抗性効能又は効果的標的化を導く。

NDVシステムへの抗体様分子の使用は、さらに卓越することが予測される。それらの分子は、通常の抗体に比較して、非常に高い熱安定性を伴って、選択的に高い親和性結合のために企画される。アンキリンに基づく抗体様分子の場合、分子の反復性質が、最適化された標的、結合、阻害又は活性化のために、それぞれの標的に従って、微調整され得る。また、異なった結合特異性が、異なった結合特異性を有するいくつかの単位を、１つのアンキリン−反復分子において連結する可能性を活用して、１つのアンキリン分子内で組合され得る。このモジュール構造は、タンパク質−タンパク質相互作用の阻止において非常に重要であり得る、抗体のために可能であるよりも高いタンパク質表面の多価結合を可能にする。そのモジュール構造はまた、わずか１つの単一ブロッキングアンキリン−反復体−タンパク質によりいくつかのエフェクターを阻止するためにも研究され得る。

アンキリン−反復体−分子は還元条件下でさえ非常に安定しているので、それらの分子は、細胞内のタンパク質（“イントラボディー”）を標的化するために企画され得る。
インビボ標的物同定のためにNDVと共に結合タンパク質コード配列のライブラリーの使用がまた可能である。

結合分子及び/又はプロテアーゼのための可能な標的物は、記載される結合タンパク質及び/又はプロテアーゼにより認識され得、そして一定型の病理学的表現型に関連する、標的細胞又はその標的細胞を取り囲む細胞外マトリックスのすべての構造体であり得る。それらは、構造タンパク質、酵素、成長因子、成長因子受容体、インテグリン、転写因子、等であり得る。

小さな分子により移動できない標的物でさえ（タンパク質−タンパク質相互作用、DN−結合、等）、本発明により取り扱われ得る。
上記のような腫瘍崩壊性NDV及び治療結合タンパク質、プロドラッグ転換酵素及び/又はプロテアーゼの組合せは、炎症性疾患、例えばリウマチ様関節炎及び癌の処理のために考えられる。

癌の処理に関しては、癌の進行に寄与するすべての経路が標的化され得る。それらの経路は、成長シグナルにおける自足、成長−阻害（抗成長）シグナルに対する無感受性、アポプトシスの回避、無限の複製能力、持続された脈管形成、及び組織侵入及び転移である。それらの経路の要約は、Hanahan and Weinberg, 2000に与えられている。腫瘍形成工程に包含され、そして記載されるアプローチにより標的化され得るシグナル化経路は、受容体チロシンキナーゼ（RTK）経路、RB及びp53経路、アポプトシス経路、APC経路、HIF１経路、GLI経路、PI3R経路及びSMAD経路である。それらのシグナル化経路の詳細な説明は、Vogelstein and Kinzler (2004)に与えられる。

記載される結合タンパク質が妨げる他のシグナル化経路は、例えば、タンパク質−タンパク質相互作用が阻止され得る、Ras, Wnt及びHedgehog経路である。

癌細胞における上記経路において有益に介在する結合タンパク質の例は、次のものである：
−自律活性成長因子受容体のブロッキングタンパク質（例えば、EGFR, Met）；
−成長因子のための競争結合体（アンタゴニスト）；
−Rb−リン酸化のためのブロキングタンパク質；
−E2F−依存性転写のためのブロッキングタンパク質；
−p53のための安定剤；
−抗アポプトシスタンパク質のための拮抗性結合体（例えば、Bcl-2）；
−サイクリンのための拮抗性結合体；
−Rasエフェクターのための拮抗性結合体（例えば、GEF）；
−低酸素誘発されたタンパク質のための拮抗性結合体（例えば、HIF1α）；

−二量体化又はDNA−結合又は補因子結合を妨げる転写因子のインヒビター（例えば、Myc/Max）；
−分化のインジューサー；
−smadシグナル化/トランスロケーションのインヒビター；
−細胞付着相互作用のインヒビター（カドヘリン、インテグリン、例えばα5β1、αvβ3）；
−細胞外マトリックスを分解する酵素のインヒビター（例えば、MMP）；
−前脈管形成リガンドのための拮抗性結合体（例えば、可溶性VEGF−R）；
−有糸分裂キナーゼのインヒビター（例えば、PIK−I）；
−前脈管形成受容体に対する拮抗性結合体；
−骨格複合体形成のインヒビター（例えば、KSR/Ras）；
−翻訳開始のインヒビター（eIF4E, EIF2a）。

本発明のプロテアーゼ、プロドラッグ転換酵素、及び/又は前記プロドラッグ転換酵素により本発明のプロドラッグから誘導される治療的活性化合物はまた、癌細胞の上記経路において有益に介在する。

定義：
ニューカッスル病ウィルス：
パラミクソウィルスは、15〜19kbの長さのゲノム（野生型）を有する、負の極性の一本鎖RNAゲノムを含み、そして前記ゲノムは６〜10個の遺伝子を含む。ウィルスエンベロープは、表面糖タンパク質、及び宿主細胞由来の膜部分により形成される。表面糖タンパク質（F及びHN、又はH又はG）は、宿主細胞からのウィルスの侵入及び流出を仲介する。ヌクレオキャプシドは、エンベロープの内部に存在し、そしてRNAゲノム及びヌクレオキャプシドタンパク質（NP）、細胞間ウィルス転写及び複製を担当するリン−（P）及び大きな（L）タンパク質を含む。

マトリックス（M）タンパク質は、ウィルスエンベロープ及びヌクレオキャプシドを結合する。構造タンパク質をコードするそれらの遺伝子の他に、パラミクソビリダエは、上記に言及される遺伝子と共に散在される追加の転写単位であり得る“補助”遺伝子を含むことができる。その補助遺伝子は、P遺伝子転写単位と重複するORFである。パラミクソビリダエの包括的な記載は、Lamb、2001に見出され得る。

NDVは、モノネガビラス（Mononegavirales）目に属するパラミクソピリダエ科におけるアブラウィルス（Avulavirus）属のタンパク質分解メンバーである。ウィルスゲノムは、次の６種の腫瘍タンパク質をコードする一本鎖の負のセンスRNAである：ヌクレオキャプシドタンパク質（NP）、リンタンパク質（P）、マトリックスタンパク質（M）、融合タンパク質（F）、赤血球凝集素タンパク質（HN）及びポリメラーゼタンパク質（L）。Pタンパク質mRNAの修正により、１又は２個の追加のタンパク質V（及びW）が翻訳される。

NDV株は、すべての年齢の鶏の急性致死感染を導く短期潜伏期性株（高い毒性）として、若い鶏においてのみ致死性である亜病原性単離物（中間の毒性）として、及び疾病の軽いか又は不明な形で表される長期潜伏期性株（非毒性）として、鶏についてのそれらの病原性に基づいて分離される。短期潜伏期、亜病原期又は長期潜伏期におけるNDV単離物の分類は、胚を殺害するための最少致死用量による接種の後、９日目の胚形成された卵における鶏胚の平均死亡時間（MDT）により選択される。NDVビルレンスの決定因子の１つは、前駆体Fタンパク質の分解部位を部位であると思われる。
NDVは、Alexander（1988）及びLamb（2001）に、詳細に特徴づけられている。

組換えウィルス：
組換えウィルスは、そのゲノムRNA配列に構築された定義される変更を有するウィルスを意味する。この変更は、１又は複数の挿入、欠失、点突然変異又はそれらの組合せであり得る。

本発明の組換えRNAウィルスは、天然の（修飾されていない）RNAウィルスの完全なゲノム、又はそれに由来する配列を含んで成り、そしてさらに、少なくとも１つの組換え転写カセットを含んで成る。前記少なくとも１つの転写カセットは、ウィルスゲノムの２つの遺伝子（転写単位）間に修飾することができる。この場合、前記少なくとも１つの転写カセットは、転写開始及び停止配列を両端に有する。前記少なくとも１つの転写カセットはまた、ウィルスゲノムの転写単位内に位置することができる。この場合、追加の転写開始及び停止配列は必要とされない。

前記少なくとも１つの転写カセットは、ユニークであり得る制限部位、例えばPacI及び/又はAscIを含んで成る。２種の転写カセットが存在する場合、それらは異なった制限部位を含んで成る。
本発明のRNAウィルスは１又は２個の組合せ転写カセットを含んで成ることが好ましい。
本発明の少なくとも１つの転写カセットにおいては、上記のような結合タンパク質、プロドラッグ転換酵素及び/又はプロテアーゼをコードするトランスジーンが位置する。

ウィルスゲノムの２種の個々の遺伝子（転写単位）間のいずれかの遺伝子間領域は、少なくとも１つの組換え転写カセットを導入するために適切である。１つよりも多くの組換え転写カセットが存在する場合、それらは同じか又は異なった遺伝子間領域に位置することができる。図１は、１つの遺伝子間領域内の２種の組換え転写カセットの例を記載する。少なくとも１つの組換え転写カセットは、特に本発明のRNAウィルスが組換えニューカッスル病ウィルスである場合、ウィルスF遺伝子とHN遺伝子との間に位置することが好ましい。

パラミクソビリダエのゲノムのサイズに関しての既知上限は存在しない。従って、本発明の組換えRNAウィルス中の導入されるトランスジーンの数及びサイズに関する上限は存在しない。トランスジーンは約10kbまでの、より好ましくは約5kbまでの、最も好ましくは約2kbまでのサイズを有することが好ましい。

本発明の組換えRNAウィルスは好ましくは、５個までのトランスジーン、より好ましくは４個までのトランスジーン、さらにより好ましくは３個までのトランスジーン、最も好ましくは１又は２個のトランスジーンを担持する。本発明の組換えウィルスが少なくとも２個のトランスジーンを担持する場合、それらは同一であっても又は異なっても良い。本発明の組換えRNAウィルスは、特定のトランスジーンの１つよりも多くのコピー、特に２，３，４又は４個のコピーを担持することができる。

トランスジーンの発現（mRNAへのウィルスRNAの転写及びmRNAの翻訳を包含する）においては、発現制御配列、例えば転写開始及び停止配列、及び翻訳を制御する配列が使用される。本発明の組換えRNAウィルスが基づかれるRNAウィルスであり得るRNAウィルスの発現制御配列が使用され得る。特に、転写開始及び停止は、RNAウィルスから得られる。発現制御配列、特に翻訳及び/又はタンパク質輸送を制御する配列は、標的細胞から得られる。

パラミクソビリダエの複製構造のために、ゲノム又は抗ゲノムRNAは通常、裸RNAとして出現しない。ゲノム及び抗ゲノムRNAは、核タンパク質と共にアセンブリーされる。従って、本発明のさらなる対象は、本発明の組換え腫瘍崩壊性RNAウィルスのヌクレオキャプシドである。ヌクレオキャプシドは、RNAウィルスのゲノム又は/及び抗ゲノム、及びヌクレオキャプシドタンパク質をコードするRNA分子を含んで成る。ヌクレオキャプシドはまた、ポリメラーゼタンパク質L又はリンタンパク質Pを含んで成ることができる。
本発明の対象はまた、上記に記載されるような本発明のゲノムの抗−ゲノムである。

本発明のさらなる観点は、本発明の組換え腫瘍崩壊性RNAウィルスのゲノム及び/又は抗ゲノムをコードするDNA分子である。そのDNA分子はプラスミドであり得る。本発明のDNA分子は、本発明のRNAウィルスを遺伝子的に構築するために使用され得る。さらに、DNA分子は、本発明のRNAウィルスを生成するために使用され得る。従って、DNA分子は、転写制御配列、例えば原核又は真核転写制御配列に作用可能に連結され得る。

本発明のDNA分子の例は、pflMTH68ネズミIgG EDB(図２)である。
本発明のゲノム、抗ゲノム、ヌクレオキャプシド及び/又はDNA分子は、上記に記載されるような転写カセット内に位置する少なくとも１つのトランスジーンを含んで成る。上記に論じられるように、トランスジーンは、結合タンパク質、プロドラッグ転換酵素及び/又はプロテアーゼをコードすることができる。

本発明のもう１つの観点は、本発明の組換え腫瘍崩壊性ウィルスのゲノム及び/又は抗ゲノムをコードするDNA分子を発現することを含んで成る、組換え腫瘍崩壊性RNAウィルスの生成方法である。

本発明のさらなる観点は、本発明の組換え腫瘍崩壊ウィルス、本発明のウィルスゲノム、本発明のウィルス抗ゲノム、及び/又は本発明のDNA分子を含んで成る細胞である。細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。細胞は、細胞系、特に哺乳類細胞系、より特定にはヒト又はネズミ細胞系であり得る。細胞は、本発明のRNAウィルスを生成するための本発明の方法に使用され得る。DNA分子を転換するための適切なシステム、例えば原核システム、例えばE. コリ又は真核システム、例えばHeLa又はCHOは、当業者により知られている。

さらにもう１つの観点は、十分な組のパラミクソビリダエの遺伝子、又は少なくとも１つの遺伝子又は遺伝子間領域が遺伝子的に修飾されている１組のパラミクソビリダエの遺伝子を含んで成り、そしてさらに、少なくとも上記のような組換え転写カセットを含んで成る、腫瘍崩壊性RNAウィルス、ゲノム又はその抗ゲノム、又はDNA分子である。そのようなウィルス、ゲノム又は抗ゲノム、又はDNA分子は、薬剤の製造、及び/又は癌の処理のために使用され得る。そのようなRNAウィルス、ゲノム、抗ゲノム又はDNA分子は、転写カセット中に組換え配列を導入するために、遺伝子構築技法により、組換えパラミクソビリダエウィルス、特に組換えニューカッスル病ウィルスを構成するために適切である。このためには、少なくとも１つの転写カセットは、制限部位を含むことができる。１以上の転写カセットが存在する場合、その転写カセットのユニーク制限部位は異なることができる。例は、図１のプラスミドpflMTH68_Asc. Pacである。

治療関連性：
癌の処理とは、腫瘍増殖の阻害、好ましくは腫瘍細胞の殺害、又は感染による、時隔での増殖の阻止を意味する。NDVは、腫瘍細胞において選択的に複製する。
本発明のウィルスは、増殖性障害、特に過増殖性障害を処理するために使用され得る。好ましくは、新生物、好ましくは肺、結腸、前立腺、乳癌及び脳癌から成る群から選択された癌は、記載されるウィルスにより処理され得る。

より好ましくは、固形腫瘍が処理され得る。
より好ましくは、遅い増殖速度の腫瘍が処理され得る。遅い増殖速度の腫瘍の例は、前立腺癌又は乳癌である。より好ましくは、脳腫瘍が処理され得る。より好ましくは、グリア芽腫が処理され得る。

組換えRNAウィルスの製造：
本発明の組換えRNAウィルス、特に組換えNDVは、Ramer−Oberdorferなど. (1999)に記載のようにして構成され得る。新規核酸配列の構成は、次の出発プラスミドを用いて、真核細胞内でRNAに翻訳されるcDNAのレベルンに基づかれる：
pCITE P、 pCITE N、 pCITE L、 pX8δT flNDV。
NDVは、ニューカッスル病ウィルスのいずれかの株、より好ましくは、その野生型において腫瘍崩壊性である株であり得る。

プラスミドpX8δTは、EP0702085号（Conzelmann kk）に記載されている。
本発明の組換えRNAウィルス、特に組換えNDVは、T7ポリメラーゼ発現細胞、例えばBHK T7細胞から最初に、又はT7ポリメラーゼによりトランスフェクトされたCHO細胞により一時的に回収され得る。それは、293、CEC32, HT29又はA431のような細胞において増殖され得る。それはまた、胚形成された鶏の卵のアラントイン流体においても増殖され得る。

組換えRNAウィルス、特に組換えNDVは、次の条件下で貯蔵される。組換えRNAウィルス、特にNDVは、５％のD−マンニトール/１％（w/v）L−リシン/pH8.0、又は標準の細胞増殖培地において安定している。−20℃で１ヶ月までの間、−80℃で10年までの間、貯蔵される。

薬剤としての組換えNDVの使用：
本発明の組換えRNAウィルス、特に本発明に従っての精製された組換えNDVは、それが薬理学的効果を示すので、薬剤として使用され得る。
本発明の組換えRNAウィルス、特に本発明のNDVは、癌の予防及び/又は処理、特に肺癌、前立腺癌、脳癌、結腸癌、乳癌の予防及び/又は処理のための薬剤である。

本発明は、医薬的に許容できるキャリヤー及び希釈剤と組合される薬剤として、本発明の組換えRNAウィルス、特に本発明のNDVを含んで成る。そのようなキャリヤー及び希釈剤は、Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania (1980)に記載される。使用されるウィルス力価は、処理の指標に依存して、用量当たり10⁹〜10¹²pfu, 10⁸〜10¹¹pfu, 10⁷〜10¹⁰pfu又は10⁶〜10⁹pfuの範囲である。

従って、本発明のもう１つの目的は、任意には、医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤及び/又はアジュバントと一緒に、本発明の組換え腫瘍崩壊ウィルス、本発明のウィルスゲノム、又は本発明のDNA分子を含んで成る医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、増殖障害、例えば癌の予防又は/及び処理のために使用され得る。
本発明の医薬組成物は、本発明の組換え腫瘍崩壊性RNAウィルス、特に本発明のNDVのエマルジョンを含んで成り、そして吸入、静脈内注入、皮下注射、腹腔内注射又は腫瘍内注射により投与され得る。

本発明のさらなるもう１つの目的は、医薬的有効量の本発明の医薬組成物を、その必要な対象に投与することを含んで成る、増殖阻害、特に癌の予防及び/又は処理方法である。医薬的有効量は、疾病を治癒するか又は抑制する、本発明の腫瘍崩壊性RNAウィルス、特に本発明のNDV、本発明のウィルスゲノム、又は本発明のDNA分子の力価である。
治療効果に関しては、許容できる用量は、異なり、そして例えば構造体、患者、投与の手段、及び癌の型に依存する。

対象（患者）は、哺乳類、より好ましくはヒト患者であることが好ましい。
本発明のさらにもう１つの観点は、本発明の組換えRNAウィルス、特に本発明のNDV、本発明のウィルスゲノム、又は本発明のDNA分子の癌の処理のための薬剤の製造のためへの使用である。
本発明はさらに、次の図及び例により例示される。

例１：抗体の発現を導くトランスジーンを有する組換えNDVの生成：
NDVの腫瘍崩壊株MTH68を用いて、ウィルスRNAを得た。RT−PCRを用いて、cDNAのいくつかのフラグメントを得、そして多段階クローニング方法において、それらを十分なゲノムcDNA中にアセンブリーし、これをベクターpX8δT（Schnellなど., 1994）中にクローン化し、プラスミドpfIMTH6を生成した。このベクターを、T7−ポリメラーゼ発現細胞系から組換えウィルスを得るために、トランスフェクションのために使用することができる。

２種の追加の転写カセットを、ユニークSfiI制限部位中のF−タンパク質及びHN−タンパク質をコードする遺伝子間のNDV MTH68（pf1MTH68）の十分な長さのゲノムプラスミド中にクローン化した。下記の２種のDNA−オリゴヌクレオチドを、アニーリングし、そして続いて、pf1MTH68のSfiI−部位中に連結した：
Sfi fw (5'-aggccttaattaaccgacaacttaagaaaaaatacgggtagaacggcctgag-3’)（配列番号１）、及び
Sfi back (5'-aggccgttctacccgtattttttcttaagttgtcggttaattaaggcctctc-3’) （配列番号2）。

得られるプラスミドpf1MTH68Pacを、PacIにより切断し、そして下記から成るもう１つのdsDNA−オリゴヌクレオチドを、PacI−制限部位中に挿入し、それにより、PacI−認識部位の１つを破壊し、そしてユニークAscI−部位を挿入した：
Asc fw (5'-cgggcgcgccccgacaacttaagaaaaaatacgggtagaacagcagtcttcagtcttaat-3') （配列番号３）及び
Asc back (5'- taagactgaagactgctgttctacccgtattttttcttaagttgtcggggcgcgcccgat-3') （配列番号４）。

得られるプラスミドを、pf1MTH68AscPacと命名した。このプラスミドは、ウィルスF及びHN−遺伝子のための遺伝子間に挿入される２種の追加の転写カセットを有する。両転写カセットは、同一のウィルス転写開始及び停止配列を両端に有する（図１）。カセット１は、ユニークPacI制限部位を含み、カセット２はトランスジーンcDNAの挿入のためのユニークAscI制限部位を含む。

フィブロネクチン（MOR03257）のエキストラドメインB（ED−B）に対する組換え機能阻止治療抗体のH及びL鎖を、それぞれ２種の追加のユニーク制限部位AscI及びPacI中にクローン化した。抗−ED−B抗体のためのネズミIgλL鎖を、AscI部位中に挿入した。抗−ED−B抗体のためのネズミIgG H鎖を、PacI部位中に挿入した。アダプター配列と共に挿入体の長さを、組換えウィルスの完全なゲノムの長さについての６の規則に従うよう、６の倍数である塩基数に調節した。得られるプラスミドを、pf1MTH68ネズミIgG ED−B（図２）と命名した。

組換えNDVを得るための標準の技法（T7−発現BHK細胞のトランスフェクション）を用いて、抗−ED−B IgG抗体の２本の鎖をコードする２種の追加の遺伝子を含むウィルスを生成した。このウィルスを、MTH146と命名した。

例２：組換えニューカッスル病ウィルスによる抗体の発現。MTH146により感染された細胞はその抗原ED−フィブロネクチンを認識する抗体を生成する（ELISA）
材料及び方法：
HT29（ヒト結腸癌）及びCHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を、４×10⁵個の細胞/ウェルで６ウェルプレートに接種した。この後、細胞を、ウィルスMTH146（抗−ED−B抗体のための遺伝子を含む）、又はウィルスMTH115（不適切な、分泌されたトランスジーン（β−グルクロニダーゼ）のための遺伝子を含む）のいずれかにより、0.01のMOIを伴って、三重反復して感染せしめた。

0時、20時、30時、２日、３日、６日の感染後の時点で、細胞上清液のアリコートを採取し、そして抗体力価決定にゆだねた。
抗体力価をELISAにより決定した。プラスチックウェルを、組換え抗原ED−Bにより被覆した。抗体を含むか、又は標準の既知量の組換え抗体を含む組織培養上清液を、ウェルに添加した。洗浄の後、結合された抗体を、ネズミIgGに対して発生されたHRP−カップリングされた第２抗体により検出した。標準濃度として精製された組換え抗体（プラスミド−トランスフェクトされた細胞により発現される）を用いて、ウィルス生成された抗体の濃度を決定した。

結果：
MTH146による感染は、その法的ED-Bに特異的に結合する、細胞上清液への抗体の発現を導く（図３）。不適切な分泌されたトランスジーン（MTH115）を発現するウィルスによる同じ細胞の感染は、細胞上清液によるED-B ELISAにおけるシグナルを導かない。HT29腫瘍細胞においては、上清液における抗体の濃度は、生物学的活性のために十分な濃度である、約８μg/mlの力価（IgGの結合）に達する。CHO細胞においては、抗体力価は、上清液において20μg/ml以上に達する。

例３：ウィルス発現された抗体はその標的物に結合する：免疫蛍光：
材料及び方法：
ネズミF9奇形癌細胞を、６ウェルプレートに接種した。細胞を、MTH146（抗−ED−B抗体）又はMTH115（不適切なトランスジーンβ−グルクロニダーゼ）により感染するか、又は擬似感染した。

感染の２日後、細胞を４％ホルムアルデヒドにより固定した。細胞を洗浄し、そして結合された抗体を、マウスIgGに対して向けられるCy3−カップリングされた第２抗体による洗浄により可視化した。正の対照として、擬似感染された細胞を、固定化の前、5μg/mlの組換えα−ED−B IgGと共に１時間インキュベートした。

結果：
負の対照は、F9細胞の有意な染色を示さない。MTH146により感染された細胞は、組換え抗体による染色とは区別できない染色パターンを示す（図４）。従って、ウィルス感染が組換え抗体のような、その抗原に結合する正しい抗体の生成を導く。ウィルス生成された抗体濃度はまた、5μg/mlの抗体濃度に類似する染色を得るのに十分である。これは、5μg/mlの範囲である、ウィルス発現された抗体の推定される濃度と一致する。

例４：ウィルス発現された抗体はその標的物に結合する：免疫組織化学：
材料及び方法：
マウスにおいて皮下的に異種移植体として増殖されるSK−MELメラノーマの低温保存された組織切片（10μm）を、冷アセトンにおいて10分間、固定し、PBSにより洗浄し、そして抗体により染色した。対照として、トランスフェクトされた安定した293細胞から発現される、精製されたα−ED−B IgG抗体MOR03257（染色のために濃度5μg/ml）が作用した。負の対照を、緩衝液のみと共にインキュベートした（一次抗体は存在しなかった）。

組換えウィルスにより感染された293細胞の上清液を、希釈されていない上清液として染色のために使用した。染色の前、ウィルスをUV光による処理により不活性化した。MTH146感染された細胞は、α−ED−B IgG抗体を生成し、対照の感染された細胞を、トランスジーンとして抗体を生成しなかった組換えウィルスにより感染した。結合された抗体を、プロテインA−ペルオキシダーゼによる検出、及び基質としてジアミノベンジンを用いての染色により可視化した。切片をヘマトキシリンQSにより対比染色した。光調査を、Zeiss axiophotイメージングシステムにより行った。

結果：
低温の切片の非特異的染色は、抗体を伴わないで、又は対照ウィルス感染された293細胞からの組織培養上清液を伴ってインキュベートされる場合、観察され得ない。
トランスフェクトされた安定した293細胞から発現された、精製されたα−ED−B抗体による染色は、ED−Bが存在する腫瘍脈管構造のための特徴的シグナルを示す。MTH146感染された細胞からの上清液とのインキュベーションは、区別できない染色パターンを生成する（図５）。これは、ウィルス発現された抗体が腫瘍組織切片におけるその標的ED−Bを特異的に結合でき、そして感染された細胞の上清液における濃度が5μg/mlの精製された抗体に相当するシグナルを得るために十分であることを示す。

例５：インビボでの組換えNDVの腫瘍−選択的複製：
この例は、GFP発現の腫瘍崩壊ウィルスMTH87の静脈内注入が、マウス異種移植体モデルにおいて腫瘍におけるGFPの発現を導くことを示す。
MiaPaca膵臓癌異種移植体を、ヌードマウスにおいて皮下増殖した。マウスを、１日おきに、１×10⁹pfuのMTH87（トランスジーンとしてGFPは有するNDV）により反覆して（６回）処理した。

最後の処理の後、21日及び34日で、個々の動物を殺害し、そして切片化した。器官の切片（約2mm）を、蛍光顕微鏡下で直接的に分析し、GFP−発現を検出した（図６）。
腫瘍切片の写真は、GFP−発現を示す。そのようなGFP−発現は、次の器官のいずれにおいても見出され得なかった：膵臓、肝臓、肺、心臓、腎臓、腸、副腎。

器官からのNDV（MTHより）の再単離：
複製するウィルスが腫瘍に存在するが、しかし他の器官においては存在しないことを証明するために、器官のスライス（約2mmの厚さ）を、組織培養培地において単層のウィルス感受性HT29細胞の上部でインキュベートした。その後、HT29細胞を、器官/腫瘍に起因するMTH87による感染を示すGFPの発現について評点を付けた。MTH87の再単離は、腫瘍断片から可能であったが、しかし試験された器官のいずれからも不可能であった。個々の腫瘍からの６個の腫瘍切片のうち、少なくとも４個が、ウィルス−再単離に対して陽性であった。負の器官は次のものであった：脾臓、肝臓、肺、心臓、腎臓、腸、副腎（他の器官は、試験に包含されなかった）。

それらの結果は、組換えウィルスMTH87が腫瘍組織において選択的に複製し、そして他の器官においては複製しないことを示す。このウィルス複製は、ウィルスの最後の静脈内投与の後、多くの日で検出できる。

例６：抗体−エフェクター融合タンパク質L19-IL2を発現する腫瘍崩壊性NDVの生成：
融合タンパク質L19-IL2は、抗体標的化されたサイトカインである。抗体フラグメントL19は、主に取り囲む血管において発現され、そしてまた腫瘍支質においても発現されるフィブロネクチン（ED-B）のエキストラドメインBに対して向けられる。

サイトカインインターロイキン−２は、T−細胞の増殖を誘発し、そしてNK−細胞を活性化する。標的化されていない遊離インターロイキン−２（プロロイキン）は、現在、腎細胞癌（RCC）の処理のために低い用量で使用される。プロロイキンの臨床学的使用は、その高い全身性毒性のために制限される。抗体、例えばL19によるIL-2の標的化された供給が、IL-2の非毒性全身性レベルを維持しながら、腫瘍に治療的有効用量を供給するために使用され得ることは示されている。L19-IL2の腫瘍特異的供給及び発現は、腫瘍崩壊ウィルスの腫瘍選択性と、L19抗体フラグメントの追加の腫瘍選択性及びIL-2の強いエフェクター活性を組合す。

材料及び方法：
融合タンパク質L19-IL2を発現する組換えNDVの生成：
プラスミドpf1MTH68Pacは、NDV MTH68の十分なゲノム配列、及びユニークPac1制限部位を有する１つの追加の転写カセットを含む。融合タンパク質L19-IL2をコードするDNA−トランスジーンを、PacI部位中にクローン化する。このトランスジーンは、Kozak配列CCACC、細胞外分泌のためのシグナルペプチド、及び融合タンパク質L19-IL2のためのcDNAから構成される（Carnemollaなど., 2002）。ゲノムの合計の長さは、ウィルスゲノムの長さについて“６の規則”に従うよう、６の倍数であるよう調節される。組換えウィルスは、標準のウィルス開放技法により、L19-IL2のための遺伝子を含む十分な長さのウィルスゲノムプラスミドによりトランスフェクトされたT7−発現細胞から開放される。得られるウィルスを、MTH201と命名する。ウィルスを、組織培養物において、又は鶏の卵のアラントイン流体において培養し、高い力価を生成する。

ネズミF9−奇形癌異種移植実験：
治療研究を、同型F9ネズミ奇形癌モデルにおいて行う。ネズミF9−奇形癌モデルは、主に取り囲む腫瘍血管及びまた、腫瘍支質における高いED-B−フィブロネクチン発現により特徴づけられる急速に成長する同系腫瘍である。

50％マトリゲルにおける２×10⁶個のF9腫瘍細胞を、ヌードマウス株129（クローンSvHsd）中に皮下移植する。腫瘍が約20mm²のサイズに達する場合、マウスを、組換えNDV MTH201（L29-IL2融合タンパク質をコードする）、又は対照ウィルスMTH87（トランスジーンとしてGFPをコードする）により、１，３，５及び７日目で、１×10⁹pfuで静脈内感染する。L19-IL2（CHO-誘導された、ダイマー）及びIL2（PROLEUKINE）を、５日間にわたって、毎日、無菌塩溶液中、静脈内ボーラス注射として投与する。動物研究に使用されるすべての濃度は、1.8〜2.16 Mio. IU/kg/日の範囲である。
12日後、マウスを殺し、そして腫瘍の重量を、カリパスを用いての腫瘍領域（最長の直径及びその垂直位置の生成物）又は腫瘍体積の測定により評価する。

結果：
二重体L19-IL2は、ヒトに使用される低用量法に対応する1430IU/g/日の最低用量でさえ、54.7％の腫瘍重量低下を示すが、但し３−及び６−倍高い用量は、標的化されたIL2の治療効率をわずかに改良する。PROLEUKINEは、その最高の用量で50.5％、腫瘍重量を低める。治療効率は、1430及び4290IU/g/日で観察されない。最良の結果が、NDV MTH201により処理されたマウスグループにおいて得られる。腫瘍重量の低下は、55％以上である。これは、ウィルス−発現されたL19-IL2の組合された作用及びNDVの腫瘍崩壊効果により説明され得る。もう１つの利点は、達成される結果が、融合タンパク質のみに比較して、NDV MTH201の低い投与により得られることである。

例７：VEGFを結合し、そして生物学的に活性であるアンキリン反覆タンパク質を発現する腫瘍崩壊NDVの生成：
VEGF及びその受容体が実験モデルにおいて結腸直腸癌の増殖及び肝臓における結腸癌転移の形成及び増殖のために必須であり（Warrenなど., 1995）、そしてこの原理は現在、転移性結腸直腸を有する患者におけるVEGF−中和化ヒト抗体アバスチンの全身性使用により臨床学的に確認されていることは、示されている（Salgaller, 2003）。

VEGF（又はVPF）は、単一の遺伝子に起因するmRNAの選択的スプライシングにより生成される４種のイソフォーム（成熟モノマーにおける121、165、187、2006個のアミノ酸残基を含む）から成るホモダイマー糖タンパク質である。VEGFのすべての形は、シグナル配列を有するが、より小さな２つの種のみが分泌される。対照的に、より大きな形が、細胞外マトリックスにおいて、ヘパリン−結合されたプロテオグリカンにより結合される。

VEGFは、種々の大きな及び小さな血管内皮細胞に対してミトゲン性であり、組織因子、コラゲナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、及びそれらのインヒビターの生成を誘発し、そしてそれらの細胞においてヘキソース輸送を刺激する。VEGFのための最も重要な受容体は、Fms−様チロシンキナーゼflt1及びKDRである（Waltenberger など., 1994）。VEGFの発現は、インビトロでのいくつかのヒト癌系において、及びヒト胃腸管、卵巣、脳、腎臓、肺及び他のものの手術的に切除された腫瘍において示されている。多くの実験腫瘍モデルにおいて、VEGFの中和が、効果的且つ有意な増殖阻害を導く（Gerber and Ferrara, 2005）。

ここで、本発明者は、組換えNDVによる抗−VEGFアンキリン反覆タンパク質の腫瘍標的化された供給がこの疾病の処理のために好都合であることを示している。これは、結腸直腸癌の実験用無胸腺マウスモデルにおいて示されている。典型的には、肝臓は、結腸直腸癌における転移の最初の及び最も頻繁な部位である。従って、新規試薬の能力がまた、肝臓転移の正常位実験モデルにおいて示されている。

材料及び方法：
VEGFを中和するアンキリン反覆タンパク質を発現する組換えNDVの生成：
タイプN₃Cの抗−VEGFアンキリン反覆分子を、標準方法により選択する（Binzなど., 2004）。企画されたアンキリン反覆タンパク質（dARPIN）をコードする発現カセットを、十分な長さのゲノムNDV−MTH68プラスミド中にクローン化する。

プラスミドpf1MTH68Pacは、NDV MTH68の十分なゲノム配列、及びユニークPac1制限部位を有する１つの追加の転写カセットを含む。VEGFに対するdARPINをコードするDNA−トランスジーンを、PacI部位中にクローン化する。このトランスジーンは、Kozak配列CCACC、細胞外分泌のためのシグナルペプチド、及びアンキリン反復分子のためのcDNAから構成される（Carnemollaなど., 2002）。ゲノムの合計の長さは、ウィルスゲノムの長さについて“６の規則”に従うよう、６の倍数であるよう調節される。組換えウィルスは、標準のウィルス開放技法により、VEGFに対するdARPINのための遺伝子を含む十分な長さのウィルスゲノムプラスミドによりトランスフェクトされたT7−発現細胞から開放される。得られるウィルスを、MTH268と命名する。ウィルスを、組織培養物において、又は鶏の卵のアラントイン流体において培養し、高い力価を生成する。

皮下腫瘍：
LS LiM6細胞の集密的培養物を、10cm²のペトリ皿において増殖し、そして短時間のトリプシン処理（Ca²⁺/Mg²⁺遊離HBSS中、0.05％のトリプシン/0.02％のEDTA）により収穫し、Ca²⁺/Mg²⁺−遊離PBSにより数度、洗浄し、そして血清フリーのDMEMにおいて５×10⁷個の細胞の最終濃度で再懸濁する。単一細胞の存在を、相対比顕微鏡により確かめ、そして細胞生存性を、トリパンブルー排除により決定する。病原フリーのBalb/c NCR-NU無胸腺マウス（Simonson Laboratories, Gilroy, Caから得られた生後３〜４周の雌）を、殺菌されたカゴに収容し、そして５×10⁶個の生存腫瘍細胞により皮下注射する。

動物は、毎日、腫瘍増殖について観察され、そして皮下腫瘍が、３日ごとに、カリパスを通して測定される。腫瘍接種の後、１，３，５及び７日で、５匹の動物グループが、種々の量の抗−VEGF mAB4.6.1（0〜200μg/マウス）、同じイソタイプの対照mAb（200μg/マウス）、抗−VEGFアンキリン反復タンパク質（0〜200μg/マウス）、1×10⁹個のpfu NDV MTH268又は1×10⁹個の対照NDV MTH87により腹腔内注射される。高容量のウィルス処理の前、動物は、１日おきの上昇するウィルス用量1×10⁶pfu, 1×10⁷pfu, 1×10⁸pfu, 5×10⁸pfuにより脱感作される。腫瘍体積を、Kuanなど., 1987に記載のようにして計算する。

肝臓転移：
H7細胞を、皮下注射について上記のようにして、集密性まで増殖し、そして収穫し、そして20×10⁶個の細胞/mlの濃度で血清フリーのDMEMに再懸濁する。無胸腺マウスを、無菌下で調製された吸入によるメトキシフルオランスにより麻酔し、そして脾臓を、左側腹部の切開により体外に出す。100ml中、２×10⁶個の細胞を、１分間にわたって27ゲージの針を通して、脾髄中に注射し、続いて１分後、脾臓切開する。

実験動物は、脾臓門脈注射の１日後に開始し、そしてその後、３〜４日ごとに、腹腔内注射により、VEGF抗体４，６，１、対照抗体（100μg/マウス）、抗−VEGFアンキリン反覆（100μg/ml）を受ける。他方では、マウスを、１，３，５及び７日で、1×10⁹pfuのNDV MTH268又は1×10⁹の対照NDV MTH87により腹腔内処理する。すべての動物を、最初のマウスが傾眠のように見え、そして拡大された腎臓が触診される（28日）場合、殺害する。肝臓を切除し、そして重量を計量し、そして転移を、解剖顕微鏡を用いて計数する。

腫瘍体積を評価するために、個々の肝臓転移の直径を、mmまで測定し、そして個々の腫瘍の体積を、それを球体として仮定することにより計算する。個々の肝臓におけるすべての腫瘍の体積の合計を決定する。２匹の対照動物の肝臓を腫瘍によりほぼ置換し、そして個々の結節は区別され得ない。腫瘍体積を、次の通りに、それらの２つの腎臓において評価する：合計の肝臓体積質量を、20mlのメスシリンダーにおいて水の置換により測定し、そして腫瘍体積を評価し、肝臓の85％を表す。

結果：
皮下腫瘍：
処理された動物の腫瘍サイズをモニターし、そして用量−依存性腫瘍増殖阻害を、すべての試験される試薬について見出す。対照mAbを受けた動物における腫瘍サイズは、８日目で約100mm³、16日目で400mm³及び22日目で900mm³である。mAb4.6.1に関しては、22日目での測定された腫瘍サイズは、10μgのmAbが投与の個々の時点で注射される場合、500mm³であり、そしてそれぞれ200mm³（100μg）、150mm³（50μg）、100mm³（200μg）である。類似する用量依存性が、200μgまでが注射される場合、抗−VEGFアンキリン反覆タンパク質に関して見出され、そして200μgの試薬が適用される場合、100〜500mm³の腫瘍サイズの最良の結果を得る。対照NDV MTH87による無胸腺マウスの処理により、22日目での腫瘍サイズは200mm³以上である。

この抗腫瘍効果は、腫瘍崩壊NDVを引起す抗増殖効果によるものである。無胸腺マウスがNDV MTH268（抗−VEGFアンキリン反覆タンパク質を発現する）により感染される場合、最良の効果が見出される。測定された腫瘍サイズは、100mm³以下である。この効果は、VEGF−中和アンキリン反覆結合タンパク質の腫瘍選択的発現及びその抗脈管形成効果、及び腫瘍細胞に対する腫瘍選択的NDVの独立した抗腫瘍効果の好都合な組合せによるものである。抗−VEGFアンキリン結合タンパク質の腫瘍選択的供給及び発現は、全身性投与されるアンキリン反覆タンパク質の薬理学的制限、例えば急速なクリアランス及び非特異的組織分布を克服する中和タンパク質の一定の及び高いレベルの部位−特異的発現を確保し、そして効果的なVEGF中和化を確保する。この効果は、低められた数の投与で得られ、そして従って、患者人口についての高い便利性が予測される。

肝臓転移：
すべての動物は、肝腫瘍の証拠を示すが、しかし肝臓転移の数、サイズ及び重量においては異なる。対照のmAb処理されたマウスに比較して、劇的な低下が、抗−VEGF処理後に見出される。肝臓当たりの腫瘍の平均数、及び肝臓当たりの評価された平均腫瘍体積は、抗−VEGF mAb4.6.1処理された動物においては、対照抗体処理された動物に比較して、10〜18倍、低い。類似する結果が、抗−VEGFアンキリン反覆タンパク質処理されたマウスに関して見出される。最も劇的な低下は、NDV MTH268により処理された動物において観察される。より少ない回数、投与されても、A4.6.1処理されたマウスに比較して、肝臓における腫瘍の数は低められ、そして腫瘍体積は小さい。

一次腫瘍に関しては、肝臓転移の形成及び増殖の阻害に対するNDV MTH268の有益な効果は、VEGF−中和アンキリン反覆結合タンパク質の腫瘍選択的発現及びその抗脈管形成効果、及び腫瘍細胞に対する腫瘍選択的NDVの独立した抗腫瘍効果の好都合な組合せによるものである。NDVはそれらの残存する腫瘍芽において選択的に増殖し、そしてそれらの腫瘍細胞に対してその抗増殖効果を発揮し、さらに生存する腫瘍細胞の数及び検出できる転移の数を低める。

一次腫瘍の増殖、及び結腸直腸肝臓転移の数、サイズ及び重量に対する高められた治療効能は、VEGF-A、VEGF-CA及びPDGFに対する特異性を含む、多特異的アンキリン反覆結合タンパク質が使用される場合、見出される。

例８：polo−様キナーゼ活性を阻害し、そして腫瘍増殖を阻害する細胞内アンキリン反覆タンパク質を発現する組換えNDVの生成：
Plk-1は、癌治療のための標的物であることが知られている。Plk-1の発現は、新生物組織において高められ、そして広範囲のヒト腫瘍において予後能力を有する（例えば、WO2005/042505号及びそこにおける引用を参照のこと）。

タイプN3Cの抗−ヒトPlk-１アンキリン反覆分子を、標準方法により選択する（Binz など., 2004, Amstutz など., 2005）。Plk-１への結合を、基質として、グルタチオン−プレート上での組換えFST-Plk-1を用いてELISAにおいて測定する。陽性結合体を選択し、そしてその対応する遺伝子を、真核CMV発現プラスミドpcDNA3.1中にクローン化する。プラスミドを、Hela及びMaTu細胞中にトランスフェクトし、そして細胞を、WO2005/04250号に記載のようにして、増殖アッセイにゆだねる。

この方法は、キナーゼ活性を直接的に阻止しないで、機能を阻止する結合dARPINSを同定するために、インビトロキナーゼアッセイに対して好ましい。細胞増殖の最良の阻害活性を有するdARPINを、腫瘍崩壊性組換えNDVのゲノム中への挿入のために選択する。選択されたアンキリン反覆タンパク質の配列は、483bpに対応する、161個のアミノ酸を含んで成る。ヒトPlk-1に対する阻害活性を有する、企画去れるアンキリン反復タンパク質（dARPIN）をコードする発現カセットを、十分な長さのゲノムNDV−MTH68プラスミド中にクローン化する。

プラスミドpf1MTH68Pacは、NDV MTH68の十分なゲノム配列、及びユニークPac1制限部位を有する１つの追加の転写カセットを含む。Plk-1に対するdARPINをコードするDNA−トランスジーンを、PacI部位中にクローン化する。このトランスジーンは、Kozak配列CCACC、及びアンキリン反復分子のためのcDNAから構成される。ゲノムの合計の長さは、ウィルスゲノムの長さについて“６の規則”に従うよう、６の倍数であるよう調節される。組換えウィルスは、標準のウィルス開放技法により、Plk-1に対するdARPINのための遺伝子を含む十分な長さのウィルスゲノムプラスミドによりトランスフェクトされたT7−発現細胞から開放される。得られるウィルスを、MTH261と命名する。ウィルスを、組織培養物において、又は鶏の卵のアラントイン流体において培養し、高い力価を生成する。ウィルスを精製し、そして接線流濾過を用いて濃縮し、そして５％マンニトール/１％L-リシンを含む緩衝液により溶出する。

インビボ腫瘍増殖阻害：
雌のNMRIヌードマウスを、１：１（培地：マトリゲル）に希釈された1.5×10⁶個のMaTu細胞により皮下注射する。腫瘍が20〜25mm³のサイズに達する場合（約３日後）、動物を組換えウィルスにより処理する。動物を、次の連続的用量を伴って、１日おきに、200μlのウィルス懸濁液（５％マンニトール/１％L−リシン緩衝液における）により皮下注射する：1x10⁶ pfu、 1x10⁷ pfu、 1x10⁸ pfu、 5x10⁸ pfu、 1x10⁹ pfu、 1x10⁹ pfu、 1x10⁹ pfu、 1x10⁹ pfu、1x10⁹ pfu。開始での上昇する用量は、ウィルスに対するマウスの脱感作を可能にする。

１つのグループは緩衝液（５％マンニトール/１％L−リシン）のみを受け、１つのグループは非治療的トランスジーン（GFP）を発現する組換えウィルスMTH87を受け、そして１つのグループは、Plk-1に対する阻害活性を有するdARPINを発現する組換え腫瘍崩壊性ウィルスMTH261を受ける。腫瘍増殖を３週間モニターし、そして腫瘍を最後に（21日目）、計量する。対照腫瘍は1.0gの範囲である。MTH87により処理された腫瘍は、有意な重量低下を示す。MTH261により処理された腫瘍は、さらに小さく、そしてMTH87に比較して、有意な重量低下を示す。これは、ウィルス処理のみに比較して、ウィルスによるdARPIN発現の有益性を示す。その結果はまた、細胞内活性トランスジーンが、組換え腫瘍崩壊性ウィルスの腫瘍崩壊性質を改良することを証明する。

例９：HIF1αを結合し、そして生物学的活性であるアンキリン反復タンパク質を発現する腫瘍崩壊NDVの生成：
腫瘍における低酸素は、腫瘍細胞が血管系を形成する内皮細胞よりも早く成長し、腫瘍に酸素及び栄養物の奪取を導く場合、進行する。

固形腫瘍における低酸素領域の確立は、腫瘍成長の進行を促進する。腫瘍細胞における酸素欠失が、遺伝的不安性を導き、続いて選択工程が、低められたアポプトシス能力、及び従来の療法、例えば化学療法及び放射線に対する高められた耐性を有する腫瘍細胞において終結する。結果として、腫瘍における低酸素は、より悪性の表現型に寄与する。

低酸素−誘発性転写因子HIF-１αが、低酸素条件下で腫瘍細胞におけるほとんどの遺伝子の活性化を主に担当することができる。HIF-１α誘発された遺伝子生成物は、脈管形成、グルコース代謝、細胞増殖及び酸素輸送のような皇帝を調節する。HIF-１αによる調節されていない遺伝子の例は、グルコース輸送体１及び３、アデニル酸キナーゼ３、乳酸デヒドロゲナーゼ、VEGF, Flt-1及び他のものである。

ヘテロダイマー転写因子HIF-1αは、HIF-1α及びHIF-1βから構成される。HIF-1αサブユニット及びHIF-1βサブユニットが構成的に発現される。しかし、HIF-1αは、HIF-1βに比較して、通常の酸素条件下ですぐに分解される。通常の酸素環境下で、HIF-1βサブユニットが認識され、そしてE3ユビキチンリガーゼ複合体の一部である、Von-Hippel-Lindauタンパク質（pVHL）によるプロテアソーム分解により特徴づけられる。低酸素条件下で、HIF-1αサブユニットは、pVHLによりもはや認識されず、そしてタンパク質はすぐに、核中に輸送される。

核において、HIF-1サブユニットによる二量体化が生じ、そしてHRE（低酸素応答要素）へのDNA結合が特定の遺伝子誘発を導く。記載される実験においては、固形腫瘍モデルにおける組換えNDVにより発現される抗HIF-1αアンキリン反復タンパク質によるHIF-1α転写因子の細胞内標的化が、NDV処理単独よりも、及び組換え精製された抗HIF-1αアンキリン反復タンパク質単独の適用により卓越していることは示されている。インビボ効能が、ヌードマウスにおける前立腺癌異種移植モデルにおいて立証されている。

材料及び方法：
HIF-1αを結合するアンキリン反復タンパク質を発現する組換えNDVの生成：
タイプN3Cの抗HIF-1αアンキリン反復分子を、標準の方法により選択する（Binzなど., 2004）。選択されたアンキリン反復タンパク質の配列は知られている。HIF-1αに対する阻害活性を有する企画されるアンキリン反復タンパク質（dARPIN）をコードする発現カセットを、十分な長さのゲノムNDV−MTH68プラスミド中にクローン化する。

プラスミドpf1MTH68Pacは、NDV MTH68の十分なゲノム配列、及びユニークPac1制限部位を有する１つの追加の転写カセットを含む。HIF1αに対するdARPINをコードするDNA−トランスジーンを、PacI部位中にクローン化する。このトランスジーンは、Kozak配列CCACC、及びアンキリン反復分子のためのcDNAから構成される。ゲノムの合計の長さは、ウィルスゲノムの長さについて“６の規則”に従うよう、６の倍数であるよう調節される。組換えウィルスは、標準のウィルス開放技法により、HIF1αに対するdARPINのための遺伝子を含む十分な長さのウィルスゲノムプラスミドによりトランスフェクトされたT7−発現細胞から開放される。得られるウィルスを、MTH288と命名する。ウィルスを、組織培養物において、又は鶏の卵のアラントイン流体において培養し、高い力価を生成する。

PC-3異種移植モデル：
PC-3異種移植片を、無胸腺雌又は雄ヌードマウスにおいてインビボ継代する。異種移植片を、動物当たり５×10⁵個のPC-3細胞の皮下（sc）注射により確立する。第３継代の後、腫瘍を2mm³の断片に切断する。ヌードマウスにおける非壊死性腫瘍組織の皮下接種を、無菌のステンレス鋼の針を用いて行う。腫瘍体積が150〜200mm³の平均サイズに達する場合、マウスを種々処理グループに配分する。

グループ配分の後、0日目、マウスを、上昇する用量のMTH288（抗HIF-1α dARPINをコードする）又はMTH87（トランスジーンとしてGFPをコードする対照ウィルス）により１日おきに処理する。高容量のウィルス処理の前、10⁶PFU, 10⁷PFU, 10⁸PFU及び5×10⁸PFUのウィルス用量が、NDVに対する脱感作のために静脈内注射される。脱感作の後、最高用量の10⁹PFUが３度、適用される。対照グループを、精製された抗HIF-1αアンキリン反応タンパク質（200μg/マウス）により静脈内処理する。抗−HIF-1αアンキリン反復タンパク質の適用は、最初のウィルス注射の時点で開始し、そしてまた、ウィルス処理が行われる限り、１日おきに反復される。第３対照グループを、PBSのみにより処理する。最初の処理の後、20日目に、動物を、腫瘍増殖について観察し、そして皮下腫瘍を、カリパスを用いて測定する。

結果：
最初の処理の後、20日目に、PBS注射された動物の腫瘍は、平均1500mm³の体積を示す。抗HIF-1αアンキリン反復タンパク質によってのみ処理された第２対照グループは、わずかな腫瘍増殖の低下を示す。NDV MTH87を受ける動物は、強い腫瘍低下を示す。20日目での最良の腫瘍増殖阻害が、抗HIF-1αアンキリン反復タンパク質を発現するNDV MTH288により注射されたマウスにおいて見られる。MTH288による処理の後の腫瘍増殖の阻害は、他の処理の後よりも有意に良好である。

この結果は、NDVによるHIF-1αに対するアルキリン反復タンパク質の細胞内発現が、NDV処理単独よりも、又は組換え精製されたHIF-1αアンキリン反復タンパク質の適用よりも好都合であることを示す。

細胞侵入性ペプチド（例えば、tatペプチド、オリゴアルゴニンペプチド、AntPペプチド、VP22ペプチド、ペネトラチン、トランスポータン（再考に関しては、Fordなど., 2001を参照のこと））に融合される、分泌された抗HIF-1αアンキリン反復タンパク質のウィルス発現が、治療効果を増強することが予測される。この方法は、NDVにより、それら自体感染されていない抗HIF-1αアンキリン反復融合タンパク質による腫瘍細胞の標的化を可能にする。

２種の別々のdARPINS (HIV-1αに対して細胞内の１つ及びインターロイキン−８に対して分泌された１つ)のためのトランスジーンを同時に発現するウィルスは、２つの補足経路の遮断のために、高められた抗腫瘍活性を有すると思われる（Mizukamiなど., 2005）。

例10：MTH1151は感染された細胞においてβ−グルクロニダーゼの発現を導く：
材料及び方法：
Hela細胞を、６ウェル皿にプレートした。集密性に達した後、細胞を、非常に低いMOI＝0.00001のMTH87及びMTH115により感染せしめた。示される時点で、細胞上清液のアリコートを採取し、そして-20℃で凍結した。感染の72時間後、β−グルクロニダーゼの活性を、MUGアッセイにより、すべての上清液において同時に測定した。

β−グルクロニダーゼ活性の定量化のためのMUGアッセイ：
MU（４−メチルウンベリフェロン)及びMUG（４−メチルウンベリフェリル−β−D−グルクロニド）は、Sigmaからである。MUは、標準曲線を生成するために使用される。ウィルス含有サンプルを、MUG−アッセイの前、ウィルスを不活性化するために30分間、UV照射する。サンプルを、10μMのMUGと共に、25mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.6）において、37℃で60分間インキュベートする。反応を、200mMのグリシン緩衝液（pH10.4）の添加により停止する。蛍光を、蛍光計において、320nmでの励起及び460nmでの放射により測定する。蛍光放射から、ｎモル/ml/時での比活性を計算する。

結果：
MTH115による感染は、ウィルス複製の結果である、β−グルクロニダーゼの発現の時間−依存性上昇を導く（図７）。MTH87は結果的に、細胞を殺し、そして従って、細胞から内因性β−グルクロニダーゼを生成するが、上清液におけるその得られる活性は無視できる。MTH115感染は、トランスジーンの多量生成を明らかに達成する。MTH115によるCPEは、MTH87及びMTH68（wt）のCPEに匹敵し、その結果、ウィルスによるβ−グルクロニダーゼの発現は、ウィルスの複製を弱めも、又はウィルスの細胞病原性を低めもしない。

例11：種々の細胞におけるMTH115によるトランスジーン発現の定量化：
材料及び方法：
細胞を、96ウェルプレートに接種した。細胞の数を、プレートの後、１日で集密性に達するよう選択した：
Hela 15,000個の細胞/ウェル
HT29 30,000個の細胞/ウェル
繊維芽細胞 10,000個の細胞/ウェル
HDMVEC 20.000個の細胞/ウェル

接種の後1日で、細胞を、0.01のMOIでウィルスMTH115により感染した。詳細には、細胞をPBSにより洗浄し、100μlのウィルス−懸濁液により37℃で接種し、ウィルスをアスピレートし、そして200μlの暖かな培地を細胞に添加した。
示される時点で、上清液を細胞から採取し、そしてβ−グルクロニダーゼMUG−アッセイにゆだねた。個々の時点で、三重反復してウェルを分析した。

結果：
結果は、図８に要約されている。正常細胞HDMVEC及び繊維芽細胞においては、トランスジーン発現は検出され得ない。また、細胞障害効果は観察されなかった（示されていない)。ウィルスHela及びHT29に対して敏感である腫瘍細胞においては、その活性が上清液において測定され得るトランスジーンβ−グルクロニダーゼの多量生成が存在する。48時間内にウィルスにより殺害されるHela細胞は、比較的低レベルのトランスジーンを生成する。使用されるウィルス用量で５日後にのみ死亡するHT29細胞は、Hela細胞よりも約10倍、及びバックグラウンドよりも1000倍以上の高いβ−グルクロニダーゼ活性を生成する。

例12：NDV−β−グルクロニダーゼ及びHMR1826は、処理のみに対して耐性である細胞を共同的に殺す：
材料及び方法：
細胞を、24ウェル皿において、１日目にプレートした。２日目、細胞を、0.001のMOIで、NDV−β−グルクロニダーゼ（MTH115）により感染せしめた。３日目、細胞を、1μMのドキソルビシン又は１μMでのドキソルビシン−グルクロニドHMR1826のいずれかにより処理した。８日目、細胞を洗浄し、固定し、そしてGiemsaにより染色し、そしてウェルの写真を取った。

結果：
結果は、図９及び10に要約される。ドキソルビシンは単独で、与えられる濃度で細胞を殺す。同じ濃度でのプロドラッグは、細胞に対して毒性ではない。与えられるMOIでの単独でのウィルスはまた、ウィルス処理に対してかなりの程度の耐性を有する腫瘍細胞が選択されるので、毒性ではない。グルクロニダーゼ発現ウィルス及びプロドラッグの両者の組合せは、いずれかの処理のみにより殺害されない細胞を殺すことができる。対照ウィルス（β−グルクロニダーゼの代わりにGFPを発現する）は、プロドラッグ処理によりいずれの相乗性も示さない。

参照文献：
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図１は、NDVの十分なゲノム、及びユニーク制限部位AscI又はPacIを含んで成る２種の転写カセットをそれぞれ含んで成るプラスミドpflMTH68_Asc_Pacを示す。ヌクレオチド配列は、２種の組換え転写カセットを含んで成る、FとHNとの間の遺伝子間領域を記載する（配列番号５）。 図２は、pflMTH68_Asc_Pacに基づかれ、そして抗−ED-B IgG抗体MOR03257のL鎖及びH鎖をコードする配列を含んで成るプラスミドpf1MTH68ネズミIgG ED-Bを示す（ドイル特許出願DE10 2004 05 0101.7-43の請求項42を参照のこと；配列番号77）。L鎖及びH鎖は、それぞれ、転写カセットの１つに挿入される。

図３は、抗−ED−B IgG抗体MOR03257のための遺伝子を含むNDV MTH146によるCHO又はHT29細胞の感染が細胞上清液への抗体の発現を導くことを示す。感染の24時間後、最大発現レベルの約20％のレベルに達する。感染の約72時間後、抗体の最大発現が達成する。対照として、細胞を、MTH115（β−グルクロニダーゼのための遺伝子を含む）により感染した。それらの細胞においては、IgGは検出されなかった。 図４ａは、MTH146により感染された細胞が、組換え抗体MOR03257による染色とは区別できない染色パターンを示すことを免疫蛍光により示す。 図４ｂは、MTH146により感染された細胞が、組換え抗体MOR03257による染色とは区別できない染色パターンを示すことを免疫蛍光により示す。 図５は、MTH146により感染された細胞からの上清液が、ED-Bが存在する腫瘍脈管構造において、安定してトランスフェクトされた293細胞から発現された、精製されたαED-B抗体MOR03257に比較して、区別できない染色パターンを生成することを免疫組織化学により示す。

図６は、MTH87の静脈内注射がマウス異種移植モデルにおける腫瘍においてGFPの発現を導くことを示す。 図７は、MTH115 感染されたHela細胞におけるβ−グルクロニダーゼの発現を示す。 図８は、MTH115感染された細胞系におけるβ−グルクロニダーゼの発現レベルを示す。 図９は、腫瘍細胞を選択的に殺すことへのHMR1826及びMTH115の相乗効果を示す。 図10は、腫瘍細胞を選択的に殺すことへのHMR1826及びMTH115の相乗効果を示す。

Claims (30)

1. 少なくとも１つのトランスジーンを有する核酸を含んで成る組換え腫瘍崩壊性RNAウィルスであって、前記トランスジーンの核酸が、ウィルス−感染された腫瘍細胞により発現される場合、治療活性を有する結合タンパク質をコードすることを特徴とするウィルス。
2. 陰性鎖RNAウィルスである請求項１記載のウィルス。
3. パラミクソウィルスである請求項１又は２記載のウィルス。
4. ニューカッスル病ウィルス（NDV）である請求項１〜３のいずれか１項記載のウィルス。
5. 長期潜伏期性NDV、例えば亜病原性又は短期潜伏期性NDV、特に亜病原性株MTH68である請求項４記載のウィルス。
6. 前記結合タンパク質が、次のグループ、すなわち天然リガンド又は遺伝子的に修飾されたリガンド、天然受容体の組換え可溶性ドメイン又はその修飾された変型、ペプチド−又はポリペプチド−リガンド、抗体分子又はそのフラグメント又は誘導体、又は抗体様分子、例えばアンキリン−反復タンパク質又はそのフラグメント又は誘導体に属する請求項１〜５のいずれか１項記載のウィルス。
7. 前記結合タンパク質が、哺乳類、例えばヒト、ネズミ、又は密接に関連する起源のもの又はキメラタンパク質のものである請求項１〜６のいずれか１項記載のウィルス。
8. 前記結合タンパク質が、単量体、二量体、三量体、四量体又は多量体タンパク質である請求項１〜７のいずれか１項記載のウィルス。
9. 前記結合タンパク質が、一特異的、二特異的又は多特異的である請求項１〜８のいずれか１項記載のウィルス。
10. 前記結合タンパク質が、少なくとも１つの結合ドメイン及び異種ドメインを含んで成る融合タンパク質である請求項１〜９のいずれか１項記載のウィルス。
11. 前記結合タンパク質が、毒素、例えばヒトRNアーゼ（シュドモナス外毒素、ジフテリア毒素）を含む融合タンパク質、又は酵素様β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、β−ラクタマーゼを含む融合タンパク質、又はサイトカイン活性様IL-2, IL-2, TNF-α、IFN-β又はGM-CSFを有する免疫−刺激タンパク質を含む融合タンパク質である請求項10項記載のウィルス。
12. 前記結合タンパク質が、次の群、すなわち自律性活性成長因子受容体の阻止タンパク質（例えば、EGFR, Met）、成長因子のための競争結合体（アンタゴニスト）、Rb−リン酸化のための阻止タンパク質、E2F−依存性転写のための阻止タンパク質；p53のための安定剤；抗アポプトシスタンパク質のための拮抗性結合体（例えば、Bcl-2）；サイクリンのための拮抗性結合体；Rasエフェクターのための拮抗性結合体（例えば、GEF）；低酸素症誘発されたタンパク質のための拮抗性結合体（例えば、HIF1α）；二量体化又はDNA−結合又は補因子結合を妨げる転写因子のインヒビター（例えば、Myc/Max）；分化のインデューサー；smadシグナル化/トランスロケーションのインヒビター；細胞付着相互作用のインヒビター（カドヘリン、インテグリン、例えばβα5β1、αvβ3）；細胞外マトリックスを分解する酵素のインヒビター（例えば、MMP）；前脈管形成性リガンドのための拮抗性結合体（例えば、可溶性VEGF-R）;前脈管形成性受容体に対する拮抗性結合体；骨格複合体形成のインヒビター（例えば、KSR/Ras）；翻訳開始のインヒビター（例えば、eIF4E, EIF2a）;有糸分裂キナーゼのインヒビター（例えば、PIK-1）から選択される請求項１〜11のいずれか１項記載のウィルス。
13. 請求項１〜12のいずれか１項記載の組換え腫瘍崩壊RNAウィルスのヌクレオキャプシド。
14. 請求項１〜12のいずれか１項記載の組換え腫瘍崩壊RNAウィルスのゲノム。
15. 請求項１〜12のいずれか１項記載の組換え腫瘍崩壊RNAウィルスのゲノム及び/又は抗ゲノムをコードするDNA分子。
16. 転写制御配列に作用可能に連結される請求項15記載のDNA分子。
17. 請求項１〜12のいずれか１項記載の組換え腫瘍崩壊ウィルス、請求項14記載のウィルスゲノム、又は請求項15又は16記載のDNA分子を含んで成る細胞。
18. 任意には、医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤及び/又はアジュバントと一緒に、活性成分としての請求項１〜12のいずれか１項記載の組換え腫瘍崩壊ウィルス、請求項14記載のウィルスゲノム、又は請求項15又は16記載のDNA分子を含んで成る医薬組成物。
19. 癌の予防及び/又は処理のための請求項18記載の医薬組成物。
20. 医薬的有効量の請求項18又は19記載の組成物を、その必要な対象に投与することを含んで成る、癌の予防及び/又は処理のための方法。
21. 前記対象がヒト患者である請求項20記載の方法。
22. 少なくとも１つのトランスジーンを有する核酸を含んで成る組換え腫瘍崩壊性RNAウィルスであって、前記トランスジーンの核酸が、ウィルス−感染された腫瘍細胞により発現される場合、プロドラッグ転換酵素をコードすることを特徴とするウィルス。
23. 少なくとも１つのトランスジーンを有する核酸を含んで成る組換え腫瘍崩壊性RNAウィルスであって、前記トランスジーンの核酸が、ウィルス−感染された腫瘍細胞により発現される場合、プロテアーゼをコードすることを特徴とするウィルス。
24. 任意には、医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤及び/又はアジュバントと一緒に、活性成分としての請求項１〜12のいずれか１項記載の組換え腫瘍崩壊ウィルス、請求項14記載のウィルスゲノム、及び/又は請求項15又は16記載のDNA分子を含んで成る医薬組成物であって、前記ウィルス、ウィルスゲノム及び/又はDNA分子がプロドラッグ転換酵素をコードする、少なくとも１つのトランスジーンを含んで成る医薬組成物。
25. 請求項24記載のウィルス、ウィルスゲノム及び/又はDNA分子によりコードされるプロドラッグ転換酵素により、治療的活性化合物に転換され得るプロドラッグをさらに含んで成る請求項24記載の医薬組成物。
26. 増殖性障害の処理及び/又は軽減のための請求項24又は25記載の医薬組成物。
27. （ａ）プロドラッグ転換酵素をコードする少なくとも１つのトランスジーンを含んで成る、請求項１〜12のいずれか１項記載の組換え腫瘍崩壊ウィルス、請求項14記載のウィルスゲノム、及び/又は請求項15又は16記載のDNA分子；及び
    （ｂ）上記（ａ）のプロドラッグ転換酵素により医薬的活性化合物に転換され得る、増殖障害の処理のために適切なプロドラッグを、その必要な対象に、医薬的有効量で投与することを含んで成る、増殖障害の処理方法。
28. 任意には、医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤及び/又はアジュバントと一緒に、活性成分としての請求項１〜12のいずれか１項記載の組換え腫瘍崩壊ウィルス、請求項14記載のウィルスゲノム、及び/又は請求項15又は16記載のDNA分子を含んで成る医薬組成物であって、前記ウィルス、ウィルスゲノム及び/又はDNA分子がプロテアーゼをコードする、少なくとも１つのトランスジーンを含んで成る医薬組成物。
29. 増殖性障害の処理及び/又は軽減のための請求項28記載の医薬組成物。
30. プロテアーゼをコードする少なくとも１つのトランスジーンを含んで成る、請求項１〜12のいずれか１項記載の組換え腫瘍崩壊ウィルス、請求項14記載のウィルスゲノム、及び/又は請求項15又は16記載のDNA分子を、その必要な対象に、医薬的有効量で投与することを含んで成る、増殖障害の処理方法。

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