CN101205544B - 肿瘤靶向性重组新城疫病毒及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肿瘤靶向性的重组新城疫病毒及其构建方法，通过在新城疫病毒Italien株病毒基因组的HN基因开放读码框的3’通过G₄S linker与肿瘤scFv序列连接，使两种蛋白能够融合表达；同时将HN基因中负责编码唾液酸受体的相关序列进行突变，使病毒丧失对唾液酸的识别与结合能力，最终使重组病毒只能与表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞结合并且在其中复制最终导致其死亡。本发明的有益效果是：得到了一种能够靶向性的与表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞结合并在其中复制，最终杀伤肿瘤细胞而对正常的人体组织细胞没有毒力的重组溶瘤新城疫病毒。为相关肿瘤的治疗研究提供一种可能的方案。

Description

肿瘤靶向性重组新城疫病毒及其构建方法 

技术领域

本发明涉及基因工程、生物技术及医药领域，特别是构建一种能通过与肿瘤细胞表面相关抗原识别与结合，特异性感染并且杀伤肿瘤细胞的重组新城疫病毒及其构建方法。 

背景技术

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是一种引起家禽呼吸道感染等症状的负链RNA病毒。由于NDV对人类无致病原性，而且具有在肿瘤细胞选择性复制的特点，因而近年来用于肿瘤的治疗。 

NDV为不分节、负链RNA副粘病毒，直径为100～400nm，近似球形，核衣壳被一个来源于细胞质膜的双层脂质膜包被。RNA基因组全长约15186个核苷酸，包含6个基因，分别编码核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，NP)、磷蛋白(phosphoprotein，P)、基质蛋白(matrix protein，M)、融合蛋白(fusion protein，F)、血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase，HN)和RNA依赖的RNA聚合酶(large polymerase，L)。其中HN和F蛋白表达在病毒的包膜上，HN蛋白通过和宿主细胞表面含唾液酸的糖蛋白受体结合，继而HN和F蛋白相互作用，激活F蛋白的融膜作用，最终NDV膜和靶细胞膜相互融合，从而病毒进入胞浆复制。 

NDV在肿瘤细胞选择性复制的机制和肿瘤细胞的干扰素信号通路缺陷有关。根据在人肿瘤细胞内复制的特点，NDV分为非溶瘤株(如：NDV-Ulster和NDV-LaSoda等)和溶瘤株(如：NDV-Italien和NDV-PV701等)。非溶瘤株NDV一般在肿瘤细胞只能进行单周期复制，新生病毒颗粒没有再感染能力；而溶瘤株则能进行多次循环复制，新生病毒可继续感染邻近细胞，因而具有较强的杀伤力。

目前NDV治疗肿瘤的研究集中在两个方面：1)由于NDV具有诱导T细胞共刺激活性、诱导细胞因子和局部趋化因子，增强肿瘤特异性抗原表达，从而刺激机体产生特异性抗肿瘤的作用，因此临床上用NDV感染患者自体肿瘤细胞制成瘤苗(NDV-modified autologoustumor vaccine，ATV-NDV)对患者进行术后主动免疫治疗。由Schirrmacher实验室在德国进行的ATV-NDV治疗头颈鳞癌已完成II期临床，显示了良好的疗效。2)NDV在肿瘤病毒治疗和基因治疗方面的应用。基于溶瘤株NDV具有直接杀伤癌细胞和诱导癌细胞凋亡的特点，减毒NDV溶瘤株如，NDV-PV701和MTH-68/H被用来直接静脉注入患者体内进行肿瘤的病毒治疗。 

由于RNA病毒其复制过程中不形成DNA中间体，对RNA病毒基因组直接用DNA的分子生物学技术操作存在困难。上世纪九十年代末反向遗传学技术的出现为这一领域开辟了新途径。该技术是将病毒RNA逆转录成cDNA，由含病毒基因组cDNA的质粒获取病毒的方法。 

尽管NDV选择性在人肿瘤细胞复制，但由于NDV-HN的受体是含唾液酸的糖蛋白，一种广泛存在于细胞膜上的分子，因此NDV具有广谱的细胞亲嗜性。这个不利的因素造成当静脉注射NDV时，NDV和正常细胞吸附，无疑减少了NDV最终结合靶肿瘤细胞的剂量。另一方面，我们发现NDV和小鼠或人红细胞结合，导致严重的凝血和溶血。 

发明内容

为了克服目前NDV对肿瘤细胞缺乏靶向性结合的不足，本发明通过反向遗传操作的方法，提供一种肿瘤靶向性重组新城疫病毒及其构建方法，通过定点突变技术以消除NDV上HN的天然唾液酸识别位点，同时将具有肿瘤靶向性的抗肿瘤抗原scFv融合到HN的羧基端，以获得肿瘤靶向性的重组NDV。 

本发明所采用的技术方案是：具有肿瘤靶向性的重组新城疫病毒，所述的重组新城疫病毒Italien株的病毒基因组，其cDNA是序列表<400>1的序列。

肿瘤靶向性的重组新城疫病毒构建方法，包括下述步骤：(1)分段RT-PCR扩增新城疫病毒Italien株的病毒基因组以获得6个cDNA亚片段(NPP、PF、FHN、HNL、La、Lb)，然后连接为3个大片段(NPP、PF+FHN、HNL+La+Lb)，最后连入pBR322载体，得到包含新城疫病毒Italien株全长基因组cDNA的质粒pBR-rNDV；辅助表达质粒的构建：用相应的引物，PCR分别扩增NP和P基因，酶切后克隆到真核表达载体pCIneo中，获得质粒pCI-NP和pCI-P，L基因则通过用Sac II/Sal I双酶切含L基因的亚基因cDNA片段，然后克隆至pCIneo中，获得质粒pCI-L；体外复活病毒：将pBR-rNDV、pCI-NP、pCI-P和pCI-L共同转染能够稳定表达T7RNA聚合酶的BSR T7/5细胞，获得复活的重组病毒rNDV；(2)构建HN基因与肝癌HAb18scFv融合表达质粒pcDNA-HNmu/scFv质粒：在病毒基因组中HN的开放读码框3’端通过G₄Slinker连接能够特异性识别肿瘤抗原的靶向性抗体scFv序列；定点突变HN基因三个关键氨基酸I175E、R516S和P93G；(3)构建包括F末端、F和HN之间的连接序列、EGFP序列以及HN前端序列的质粒pUC18/F-EGFP-HN；(4)用HNmu-scFv和F-EGFP-HN片段分别通过酶切替换pBR-rNDV中的HN基因片段和F-HN基因之间相对应的片段。 

治疗基因可以插入质粒pBR-rNDV中的NP基因开放读码框前、NP和P之间、P和M之间、M和F之间、F和HN之间、HN和L之间以及L之后。 

本发明对NDV-Italien株的cDNA全长基因进行了测序，用反向遗传学技术构建了重组毒株，其中包括肝癌单链抗体(scFv)融合在溶瘤株NDV-Italien HN的C末端，HN基因三个关键氨基酸I175、R516和P93的定点突变，以消除天然唾液酸受体结合位点，而保留神经氨酸酶(neuramidinase，NA)和促膜融合活性，F和HN序列之间EGFP基因的插入。对NDV的基因组进行靶向性改造，使其具有肿瘤细胞特异的亲嗜性，最终获得了具有特异性靶向肝癌的重组溶瘤NDV载体，进而用于肿瘤的靶向性基因治疗和病毒治疗。本发明的有益效果是：得到了一种能够靶向性的与表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞结合并在其中复制，最终杀伤肿瘤细胞而对正常的人体组织细胞没有毒力的重组溶瘤新城疫病毒。为相关肿瘤的治疗研究提供一种可能的方案。 

NDV作为肿瘤基因治疗的新型病毒载体具有以下优点：1)NDV对人类无致病原性；病毒复制在胞浆进行，其基因组不和宿主细胞染色质发生整合，因而不具有激活癌基因的潜在危险，因此是一种安全的病毒载体。2)NDV在多种人肿瘤细胞株(如：肝癌、神经胶质瘤、头颈癌等)天然地选择性复制。3)NDV和肿瘤细胞结合后，具有激活肿瘤特异性CTL、上调HLA和粘附分子、刺激单核细胞释放IFN-α和TRAIL，从而全面提高机体抗肿瘤免疫反应的能力；而其溶瘤株裂解肿瘤细胞后，导致肿瘤特异性抗原释放，则再次激活机体抗肿瘤的先天性和适应性免疫应答。4)NDV具有诱导细胞凋亡的作用。5)反向遗传学技术使外源基因可以成功插入NDV基因组，而不影响病毒的复制，使NDV具有一定的包装能力。 

附图说明

图1为NDV Italien株全长cDNA的构建方法示意图。 

图2为pcDNA-HN/scFv质粒图谱。 

图3为pcDNA-HN/scFv质粒转染COS-7细胞瞬时表达免疫荧光检测结果图。 

图4为pcDNA-HN/scFv和pcDNA-F质粒共转染COS-7细胞导致细胞融合示意图。 

图5为病毒基因组亚片段RT-PCR产物电泳结果图。 

图6为EGFP插入到NDV基因组的F和HN之间电泳结果图。道1：Marker DL2000；道2：Sac I和Hind III双酶切，目的片段1.3kb为F-EGFP-HN；道3：Stu I和PshA I双酶切，目的片段750bp为EGFP基因；道4-5：质粒pUC18/F-EGFP-HN。 

具体实施方式

1材料 

1.1病毒和细胞株 

强毒株NDV Italien(参考文献参见《In vivo efficacy ofsystemic tumor targeting of a viral RNA vector with oncolyticproperties using a bispecific adapter protein》Int J Oncol.2006Dec；29(6)：1359-69.)由Schirrmacher教授馈赠；表达T7RNA聚合酶的BSR T7/5细胞由德国慕尼黑市Pettenkofer研究所K.Conzelmann教授馈赠。 

1.2菌种与质粒 

E.coli JM109购自北京鼎国生物技术有限责任公司；pTA2Vector购自Toyobo公司；pBR322载体购自TaKaRa公司。 

1.3主要试剂 

Trizol LS Reagent和Lipofectamine TM2000购自Invitrogen公司；IPTG、X-gal、氨苄青霉素、G418购自Genview公司；ReverTra Ace反转录酶购自Toyobo公司；限制性内切酶，Ex taq HS酶，T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；质粒抽提试剂盒(Plasmid Minipreps kit)和DNA凝胶纯化试剂盒为U-gene公司产品。 

2方法 

2.1引物的设计：首先通过GenBank获得目前序列已知的NDV毒株的全基因组序列特别是同一基因型的Herts/33株全基因序列和公开的NDV部分序列，通过计算机比对上述NDV不同毒株基因序列和Italien株HN、F序列，确定病毒基因组中相对保守的序列，设计和合成引物(表1)。 

表1引物序列 

注：在NPP1的5’添加了T7RNA聚合酶启动子结合序列，在NPP2的5’添加了Spe I，Swa I和Xba I的酶切序列。 

在PF2的5’添加了Spe I的酶切序列。 

在HNL2的5’添加了 和Swa I酶切位点。 

在Lb2的5’添加了HDV的自身催化核酶序列和Swa I酶切位点。 

2.2病毒的扩增和收集：将病毒接种9日龄SPF鸡胚尿囊腔，72小时后收获尿囊液，所获得的尿囊液以20％蔗糖溶液为介质经差速离心法收集病毒沉淀，病毒沉淀用TNE缓冲液重悬后保存于-70℃。 

2.3病毒基因组cDNA的分段扩增：采用Trizol LS提取病毒基因组RNA，并且通过分段RT-PCR扩增的方法获得cDNA亚片段6个，分别是NPP、PF、FHN、HNL、La和Lb，最终将这6个亚片段连接为3个大片段，如图1所示Part1、Part2、Part3。扩增NPP段以NPP1为引物进行反转录，采用高保真DNA聚合酶以NPP引物对进行PCR扩增；PF、FHN、HNL、La和Lb片段则分别以PF1、FHN1、HNL1、La1和Lb1为引物进行反转录，采用与NPP段相似的方法，分别以PF、FHN、HNL、La和Lb引物对进行扩增，所有扩增得到的产物(如图5所示)均通过凝胶回收以及在两端添加“A”后连入T载体，所有片段均经过多样本测序及序列比对以确认正确性。 

2.4亚片段的连接：连接方法如图1所示，NPP片段通过分别位于其两端的T载体上的酶切位点BamHI和SalI连入pBR322载体，所得到的载体为pBR-NPP；PF和FHN片段通过位于FHN两端的单一酶切位点 Af1 II和Spe I连接成大片段，所得到质粒为pT-HN；HNL和La片段先通过位于La两侧的单一酶切位点Nhe I和BsrG I连接成片段HNLa，该片段再通过Lb片段两侧的BsrG I和Xba I连接成大片段，所得到质粒为pT-HNLab；pT-HN片段再通过位于其两侧的单一酶切位点Apa I和Spe I连入pBR-NPP的相应酶切位点之间，所得质粒为pBR-NPHN；最后将大片段pT-HNLab通过其两侧的单一酶切位点Spe I和Xba I连入pBR-NPHN，得到最终的包含NDV Italien株全长基因组cDNA的质粒pBR-rNDV。 

2.5辅助表达质粒的构建：用相应的引物，PCR分别扩增NP和P基因，酶切后克隆到真核表达载体pCIneo(Promega)中，获得质粒pCI-NP和pCI-P。L基因则通过用Sac II/Sal I双酶切含L基因的亚基因cDNA片段，然后克隆至pCIneo中，获得质粒pCI-L。引物为： 

NP基因5’-TAT AGC TAG CAG GCC GAA GCT CAA ACT CGA GAG-3’； 

      5’-TAA TAG ATC TGT CCT GTG GAG GCA GAC TGG GT-3’ 

P基因5’-GTA TGC TAG CTA GGG TGA AGA TGG CCA CCT TT-3’； 

     5’-GAC TAG ATC TGT TGT AGG TTG TGA TGG CGG TC-3’ 

L基因5’-CGG CTC TAG AGG ATA GCA CGG GTA GGA CAT-3’； 

     5’-TAT ACG CCG GCG ATA TGT GAT TGC CTT TAA GAG T-3’ 

2.6体外复活病毒：将pBR-rNDV、NP、P和L基因表达质粒共同转染能够稳定表达T7RNA聚合酶的BSR T7/5细胞，获得复活的重组病毒rNDV。 

2.7HN基因与肝癌scFv融合表达质粒的构建：首先采用引物HN1/2(HN1：5’CAT AAA GCT TAC CAC CAT GGA CCG TGC AGT TGG CAGAG 3’；HN2：5’TAT AGG ATC CAC CGC CAC CAA CCC CAT CTT CCT TGAG 3’)通过高保真RT-PCR获得NDV Italien株HN基因序列，在引物HN1的5’添加Hind III酶切位点，HN2的5’添加了G₄S linker部分序列及BamH I酶切位点(下划线部分)；所获得的产物通过Hind III和BamHI连入pcDNA3.1(+)，所得质粒为pcDNA-HN；采用引物scFv1/2(scFv1： 5’AAT TAG ATC TGA AGT GAA GCT TGA GGA G 3’；scFv2：5’CAGTGA ATT CTC ATT AAT GAT GAT GAT G 3’)通过高保真PCR的方法以质粒pCAN-scFv(第四军医大学细胞工程研究中心构建)中扩增HAb18scFv序列，其中在scFv1引物的5’添加有Bgl II的酶切位点(下划线部分)；通过scFv片段的BglI I和EcoR I酶切位点连入pcDNA-HN中，所得到的质粒即pcDNA-HN/scFv(如图2所示)。将pcDNA-HN/scFv转染COS-7细胞进行瞬时表达，结果表明HN蛋白和scFv均能表达对应产物(如图3A和B所示)，其中HN基因表达产物能与F基因表达产物共同作用导致细胞融合(如图4所示)；scFv表达产物能与相应抗原HAb18G/CD147结合，表明HN基因和scFv基因表达产物都具有相应功能。用Quick-change system(Stratagene公司)定点突变技术单点突变及两两组合突变pcDNA-HN/scFv中HN的I175E、R516S和P93G，以改变HN基因中负责编码与唾液酸受体结合关键氨基酸的碱基序列，使所得到的质粒pcDNA-HNmu/scFv丧失与唾液酸受体结合的能力，而只能通过scFv基因产物与细胞表面HAb18G/CD147分子结合。 

2.8靶向重组NDV的构建：pcDNA-HNmu/scFv质粒中HNmu-scFv片段通过酶切替换pBR-rNDV中HN基因片段，方法为：将pcDNA-HNmu/scFv分别用Nhe I/Spe I和Spe I/Not I两组共三种限制性核酸内切酶酶切，将HNmu-scFv片段分为了两个部分，其中Nhe I/Spe I酶切结果中1.5kb长片段连入替换PF-T载体中对应位置，所得质粒称为rPF-T；Spe I/Not I酶切得到的773bp大小片段连入HNLab-T质粒中，连接前需要通过PCR突变的方法，将HN开放读码框的最后16个碱基(GGAAGA TGG GGT TTA A)突变成包含Not I酶切位点的序列(GCG GCC GCG GTTTAA G)；最终重组所得的质粒称为HNmuLab/scFv-T，重组所得的质粒全长符合六碱基原则，按照前述体外复活病毒的方法组装成包含重组后的NDV Italien株全长基因组cDNA序列的质粒pBR-rNDV/scFv。将重组的病毒分别感染HAb18G/CD147表达阳性和阴性的细胞，观察重组病毒的靶向性，即只通过HAb18 scFv与HAb18G/CD147分子结合而导 

致细胞感染，不通过HN与唾液酸受体结合的途径。 

2.9靶向重组NDV中EGFP基因的插入：采用引物 

5’-TTA AGA GCT CGA CGA GAG GCG GAG GTA T-3’； 

5’-TAGCAAGCTTTAGCAACGCCAACGGAG-3’， 

通过RT-PCR扩增出包括F末端序列、HN前端序列以及F和HN之间的连接序列，Sac I/Hind III连接到pUC18载体上进行测序。然后通过PCR从pEGFP-N1中扩增出EGFP基因，并在引物设计时，在上下游引物的5’端带上F和HN之间的连接序列上的酶切位点Stu I和PshA I，在下游引物的5’端带上NDV的开始连接序列、末端连接序列，以使EGFP能正确地连接到F和HN之间的非编码区并进行表达，获得质粒pUC18/F-EGFP-HN。扩增EGFP所用的引物为：5’-ATA TAG GCC TAT GGTGAG CAA GGG CGA GGA G-3’；5’-TAA GAC TTC GGT CTT CTA CCC GTGCTT TTC TTT AAT TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3’。对EGFP的连接产物进行PCR以及酶切鉴定后进行测序以确保其连接的正确性(如图6所示)。最后通过F末端序列及HN前端序列两个单一酶切位点将包含有EGFP的片段连接到重组NDV全长基因组中，这样就构建成一个能够表达EGFP的重组NDV。 

根据NDV基因组的结构特点，外源性目的基因可以任意插入病毒的NP基因开放读码框前、NP和P之间、P和M之间、M和F之间、HN和L之间以及L之后，因此，治疗基因(如p53、IL-12等)可参考上述方法构建在本发明构建的靶向NDV基因组两端以及各基因的连接序列中。 

序列表 

<110>中国人民解放军第四军医大学 

<120>肿瘤靶向性重组新城疫病毒及其构建方法 

<160>1 

<210>1 

<211>16650 

<212>cDNA 

<213>新城疫病毒Italien株(Newcastle disease virus) 

<220> 

<221>CDS 

<222>(6369)..(7088) 

<223>EGFP 

<220> 

<221>CDS 

<222>(7122)..(9590) 

<223>HN/scFv 

<400>1 

Claims (2)

1.具有肿瘤靶向性的重组新城疫病毒，其特征在于：所述的重组新城疫病毒Italien株的病毒基因组，其cDNA是序列表<400>1的序列。

2.如权利要求1所述的肿瘤靶向性的重组新城疫病毒构建方法，其特征在于：包括下述步骤：(1)分段RT-PCR扩增新城疫病毒Italien株的病毒基因组以获得6个cDNA亚片段NPP、PF、FHN、HNL、La、Lb，然后连接为3个大片段NPP、PF+FHN、HNL+La+Lb，最后连入pBR322载体，得到包含新城疫病毒Italien株全长基因组cDNA的质粒pBR-rNDV；辅助表达质粒的构建：用相应的引物，PCR分别扩增NP和P基因，酶切后克隆到真核表达载体pCIneo中，获得质粒pCI-NP和pCI-P，L基因则通过用Sac II/Sal I双酶切含L基因的亚基因cDNA片段，然后克隆至pCIneo中，获得质粒pCI-L；体外复活病毒：将pBR-rNDV、pCI-NP、pCI-P和pCI-L共同转染能够稳定表达T7RNA聚合酶的BSR T7/5细胞，获得复活的重组病毒rNDV；(2)构建HN基因与肝癌HAb18 scFv融合表达质粒pcDNA-HNmu/scFv质粒：在病毒基因组中HN的开放读码框3’端通过G₄S linker连接能够特异性识别肿瘤抗原的靶向性抗体scFv序列，定点突变HN基因三个关键氨基酸I175E、R516S和P93G；(3)构建包括F末端、F和HN之间的连接序列、EGFP序列以及HN前端序列的质粒pUC18/F-EGFP-HN；(4)用HNmu-scFv和F-EGFP-HN片段分别通过酶切替换pBR-rNDV中的HN基因片段和F-HN基因之间相对应的片段。

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