CN115725657A - 一种节段化的水泡性口炎病毒载体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种节段化的水泡性口炎病毒载体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种水泡性口炎病毒载体，包括sgVSV(△L/L)和sgVSV(△G/G)。本发明所述水泡性口炎病毒载体可以装载并表达外源基因,且相对于野生型毒株毒性更低，相对于已有的srcVSV载体重组突变的可能性更小，外源基因装载容量更大。本发明所述的sgVSV可通过常规的VSV反向遗传技术进行拯救，可以是各节段病毒共拯救，也可以是分别拯救后共传代的制备方法获得。本发明还获得携带新型冠状病毒RBD基因的水泡性口炎病毒s gVSV(△G/GδRBD)。所述sgVSV载体可用于疫苗研制以及传递基因药物。
Description
技术领域
本发明属于生物药物领域，具体涉及一种节段化的水泡性口炎病毒载体及其制备方法和应用。
背景技术
水泡性口炎病毒(vesicular stomatisi virus，VSV)属于弹状病毒科，为不分节段的负链RNA病毒，其具有人群血清阳性率低，基因组结构简单，易于遗传操作等优点。野生型的VSV是一种有包膜病毒，其病毒体结构呈弹状或杆状，拥有一条单链负义RNA基因组(-ssRNA)，并且其复制依赖病毒的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)。含有5种结构蛋白：核蛋白(N)，磷酸化蛋白质(P)，RNA聚合酶(L)，基质蛋白(M)以及糖蛋白(G)。
以VSV为载体开发的疫苗能诱导高滴度中和抗体而且容易规模化生产，是突发烈性传染病疫苗开发及储备的优选策略。同时VSV具有溶瘤特性，是溶瘤病毒开发的热点。另外，VSV可用于烈性病毒的假病毒构建，用于神经细胞示踪研究等，是良好的分子生物学研究工具。
但VSV具有潜在神经毒性，无论是用于疫苗、肿瘤治疗，还是分子生物学研究，其安全性不容忽视。例如，VSV作为疫苗载体时一般使用复制型，因为VSV感染通常不会引起人类疾病，但对于免疫缺陷者或者孕妇等人群依然存在安全风险。特别是有研究指出，VSV载体的埃博拉疫苗存在嗜神经性导致新生小鼠眼睛和脑部损伤。
VSV的致病性之一是其糖蛋白(glycoprotein，G)，将G蛋白编码基因替换为外源基因或者将G蛋白的胞质区段截除可以实现减毒，N蛋白编码基因异位可以降低病毒的复制水平和毒性。然而，这两种策略都无法有效降低VSV的神经毒性。Muik将VSV复制和转录的必须基因分别置于两个缺陷病毒，构建半自主复制的VSV(semireplication-competent VSV，srcVSV)系统，其中VSV△G(G编码基因删除)/VSV△L(L编码基因删除)的组合在动物实验中显示良好的溶瘤特性而且未检测到任何神经毒性。然而，该研究的互补病毒之间除了各自缺失的基因，其余基因均存在两个拷贝，即存在同源序列。尽管体内外传代均未观察到基因重组导致的自主复制型病毒产生，随着传代次数的增加重组的风险依然存在。此外，由于同源基因冗余，srcVSV系统的外源基因装载容量也将受到限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种节段化的水泡性口炎病毒载体及其制备方法和应用，所述水泡性口炎病毒载体由不同的节段包装成对应的病毒颗粒，可避免病毒之间发生同源重组导致毒力恢复，并具有可针对现有的srcVSV系统提供更大的外源基因装载容量。
本发明的第一方面，是提供了一种水泡性口炎病毒载体，其为由依序含VSV病毒的N、P、M、G四个不重叠基因的sgVSV(△L)节段以及含VSV病毒的L基因的sgVSV(L)节段通过病毒拯救获得的sgVSV(△L/L)；或由含VSV病毒的N、P、M、L四个不重叠基因的sgVSV(△G)节段以及含VSV病毒的G基因的sgVSV(G)节段通过病毒拯救获得的sgVSV(△G/G)。
在其中一些实施例中，每个所述的节段的3’端和5’端具有非编码序列，优选地，所述3’端非编码序列的反义DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述5’端非编码序列的反义DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
在其中一些实施例中，sgVSV(△L)节段的基因组反义DNA序列如SEQ ID NO.3所示，和/或sgVSV(L)节段的基因组反义DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
在其中一些实施例中，sgVSV(△G)节段的基因组反义DNA序列如SEQ ID NO.5所示，和/或sgVSV(G)节段的基因组反义DNA序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第二方面，是提供了上述水泡性口炎病毒载体的制备方法，包括以下步骤：S1.构建所述sgVSV(△L)的反义基因组转录质粒，和sgVSV(L)的反义基因组转录质粒；
S2.通过sgVSV(L)的反义基因组转录质粒和sgVSV(△L)的反义基因组转录质粒共拯救，获得节段化水泡性口炎病毒sgVSV(△L/L)；或包括以下步骤：
S1.构建所述sgVSV(△G)的反义基因组转录质粒，和所述sgVSV(G)的反义基因组转录质粒；
S2.通过将sgVSV(△G)的反义基因组转录质粒与所述sgVSV(G)的反义基因组转录质粒分别单独拯救后共传代，获得节段化水泡性口炎病毒sgVSV(△G/G)。
本发明的第三方面，是提供了所述水泡性口炎病毒载体在制备疫苗或基因药物中的应用。
在其中一些实施例中，所述疫苗为防治新型冠状病毒的疫苗。
在其中一些实施例中，所述基因药物可以是治疗肿瘤的siRNA,抗体，肿瘤杀伤蛋白，抑癌蛋白等，或是增强病毒载体自身复制能力的蛋白。
本发明的第四方面，是提供了一种具有上所述水泡性口炎病毒载体的疫苗，其中，在所述sgVSV(△L)节段或sgVSV(L)节段插入有表达目的蛋白的编码基因；或在sgVSV(△G)节段中或sgVSV(G)节段插入有表达目的蛋白的编码基。
即其为由依序含VSV病毒的N、P、M、G四个不重叠基因的sgVSV(△L)节段以及含VSV病毒的L基因的sgVSV(L)节段通过病毒拯救获得的sgVSV(△L/L)；且在所述sgVSV(△L)节段或sgVSV(L)节段插入有表达目的蛋白的编码基因；
或由含VSV病毒的N、P、M、L四个不重叠基因的sgVSV(△G)节段以及含VSV病毒的G基因的sgVSV(G)节段通过病毒拯救获得的sgVSV(△G/G)；且在sgVSV(△G)节段中或sgVSV(G)节段插入有表达目的蛋白的编码基因。
所述需要表达的目的蛋白，其可以类似与GFP和mCherry荧光报告基因那样插入到相应节段，通过病毒拯救获得的目的基因疫苗，其装载有表达目的抗原(蛋白)的表达编码基因，可以在人体或者动物体内表达，诱导免疫保护。同样，也可以是装载有治疗作用的siRNA。
上述具有上所述水泡性口炎病毒载体的疫苗，其制备方法包括以下步骤：
S1.构建所述sgVSV(△L)的反义基因组转录质粒，和sgVSV(L)的反义基因组转录质粒，在sgVSV(△L)的反义基因组转录质粒或者sgVSV(L)的反义基因组转录质粒中插入有表达目的蛋白的编码基因；
S2.通过sgVSV(L)的反义基因组转录质粒和sgVSV(△L)的反义基因组转录质粒共拯救，获得节段化水泡性口炎病毒sgVSV(△L/L)；
或包括以下步骤：
S1.构建所述sgVSV(△G)的反义基因组转录质粒，和所述sgVSV(G)的反义基因组转录质粒，且在sgVSV(△G)节段中或sgVSV(G)节段插入有表达目的蛋白的编码基因；
S2.通过将sgVSV(△G)的反义基因组转录质粒与所述sgVSV(G)的反义基因组转录质粒分别单独拯救后共传代，获得具有节段化水泡性口炎病毒载体的疫苗。
本发明的第五方面，是提供了一种针对新冠病毒的水泡性口炎病毒，其为将SARS-CoV-2的德尔塔株的刺突蛋白受体结合结构域编码基因插入所述sgVSV(△G)节段中的G基因下游，通过拯救获得sgVSV(GδRBD)后与sgVSV(△G)共传代获得的sgVSV(△G/GδRBD)。
本发明的第六方面，是提供了针对新冠病毒的水泡性口炎病毒的制备方法，包括以下步骤：
S1.sgVSV(GδRBD)的反义基因组转录质粒构建：获得SEQ ID NO.18所示序列构成的框架，
S2.获得SEQ ID NO.19所示序列的δRBD基因片段，
S3.δRBD基因片段与框架连接获得psgVSV(GδRBD)质粒,
S4.将所述psgVSV(GδRBD)质粒单独拯救后再与所述sgVSV(△G)共传代，获得sgVSV(△G/GδRBD)。
本发明通过采取了基因组拆分策略对VSV进行减毒，提供一种节段化VSV(segmented VSV，sgVSV)载体，包括sgVSV(△L/L)和sgVSV(△G/G)，所述水泡性口炎病毒载体相对于已有的srcVSV载体，可更好地避免了病毒之间发生同源重组导致毒力恢复，而且同时由于不存在同源基因冗余，sgVSV载体可提供更大的外源基因装载容量。本发明所述的sgVSV可通过常规的VSV反向遗传技术进行拯救，可以是各节段病毒共拯救，也可以是分别拯救后共传代获得。此外，本发明还获得携带新型冠状病毒德尔塔株刺突蛋白受体结合结构域编码基因的节段化水泡性口炎病毒：sgVSV(△G/GδRBD)，通过实验发现，所述sgVSV载体可以装载并表达外源基因(例如SARS-CoV-2的RBD)。所述sgVSV载体可用于疫苗研制以及传递基因药物所用。
附图说明
图1 sgVSV(△Lgfp/Lmch)和sgVSV(△Ggfp/Gmch)的基因组结构示意图。
图2 srcVSV(△Ggfp/△Lmch)的基因组结构示意图。
图3 sgVSV(△Lgfp/Lmch)、sgVSV(△Ggfp/Gmch)以及srcVSV(△Ggfp/△Lmch)感染的Vero细胞的荧光照片，其中，标尺＝100μm，Mock：空白对照组。
图4 sgVSV(△Lgfp/Lmch)、sgVSV(△Ggfp/Gmch)以及srcVSV(△Ggfp/△Lmch)的RT-PCR鉴定产物电泳图，其中，RT+：以经逆转录处理的RNA为模板组；RT-：以未经逆转录处理的RNA为模板组，用于排除残留DNA污染。
图5 sgVSV(△Lgfp/Lmch)、sgVSV(△Ggfp/Gmch)以及srcVSV(△Ggfp/△Lmch)感染Vero细胞后的噬斑荧光照片和结晶紫染色图。
图6 sgVSV(△Lgfp/Lmch)、sgVSV(△Ggfp/Gmch)、srcVSV(△Ggfp/△Lmch)以及野生型毒株VSVgfp的生长曲线。GCN：基因拷贝数。
图7 sgVSV(△Lgfp/Lmch)、sgVSV(△Ggfp/Gmch)、srcVSV(△Ggfp/△Lmch)以及野生型毒株VSVgfp的透射电镜照片，其中，标尺＝100nm。
图8 sgVSV(△Lgfp/Lmch)、sgVSV(△Ggfp/Gmch)、srcVSV(△Ggfp/△Lmch)以及野生型毒株VSVgfp感染A549细胞的噬斑结晶紫染色图和噬斑大小统计结果。
图9 sgVSV(△Lgfp/Lmch)、sgVSV(△Ggfp/Gmch)、srcVSV(△Ggfp/△Lmch)以及野生型毒株VSVgfp感染一日龄C57BL/6小鼠后的生存曲线。
图10 sgVSV(△Lgfp/Lmch)、sgVSV(△Ggfp/Gmch)、srcVSV(△Ggfp/△Lmch)以及野生型毒株VSVgfp感染一日龄C57BL/6小鼠后的体重变化曲线。
图11 sgVSV(△Lgluc/Lmch)、sgVSV(△Gfluc/Ggluc)及srcVSV(△Gfluc/△Lgluc)对IFN-α/βR缺陷小鼠的感染性分析结果。
图12 sgVSV(△Lgfp/Lmch)、sgVSV(△Ggfp/Gmch)、srcVSV(△Ggfp/△Lmch)以及野生型毒株VSVgf的体外肿瘤细胞(A549、U251、LLC及GL261)杀伤效果，其中，hpi：感染后的时间，以小时为单位。
图13 sgVSV(△G/GδRBD)的基因组结构示意图；δRBD：新型冠状病毒刺突蛋白的受体结合结构域。
图14 sgVSV(△G/GδRBD)感染Vero细胞后培养上清中δRBD的Western Blot检测结果，PC：阳性对照；1、2、3：上样重复。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明采取了基因组拆分策略对VSV进行减毒，提供一种节段化VSV(segmentedVSV，sgVSV)载体，不同的节段包装成对应的病毒颗粒。由于不同节段的病毒颗粒各自携带的基因无法支持自身的完整的生命周期，无法在感染宿主细胞后独立产生侵染性子代病毒，只有所有节段的病毒颗粒共同感染一个宿主细胞时才能产生侵染性子代病毒。各节段的病毒颗粒之间功能互补但不存在同源编码基因，可更好地避免了病毒之间发生同源重组导致毒力恢复，包括避免病毒拯救时所用的病毒反义基因组转录质粒之间由于存在同源序列发生潜在的DNA水平同源重组，以及病毒基因组之间因存在同源序列可能会发生的RNA水平同源重组。同时由于不存在同源基因冗余，sgVSV载体可提供更大的外源基因装载容量。sgVSV可通过常规的VSV反向遗传技术进行拯救，可以是各节段病毒共拯救，也可以是分别拯救后共传代获得。
本发明首先构建各节段的反义基因组转录质粒，其采用T7启动子和T7终止子进行反义基因组RNA的转录起始和终止，T7终止子上游插入自剪切型核酶使得被转录出来的反义基因组RNA携带精确的3’末端。以及构建辅助蛋白表达质粒，包括VSV-N、VSV-P、VSV-L、VSV-M、VSV-G的表达质粒，其可采用T7启动子和T7终止子进行表达，通过在基因编码框上游插入IRES(核糖体进入位点)序列增强蛋白翻译效率，在基因编码框下游插入多聚腺苷酸序列增强RNA的稳定性。
完成反义基因组转录质粒和辅助蛋白表达质粒构建后，可通过常规方法进行病毒拯救，如果是共拯救，则各节段的反义基因组转录质粒以及辅助蛋白表达质粒共同转染包装用细胞株(如稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK-21细胞株)，如果是单独拯救，则各节段的反义基因组转录质粒分别与辅助蛋白表达质粒共同转染包装用细胞株，然后将所得病毒共培养获得sgVSV。
通过基因组拆分将原本不分节段的VSV节段化，其完成生命周期必须的基因被分配至两个或以上病毒中，不同节段的病毒在功能上相互牵制，侵染范围被限制达到减毒目的。基因组拆分的优势是得到的病毒之间不存在同源基因，可降低病毒之间发生同源重组导致毒力恢复的风险。同时该策略去除了同源基因冗余，可为外源基因提供更大的装载容量。当前已有的半复制系统尽管也是功能互补形式，但两个病毒均通过单个不同基因的删除获得，之间存留了同源基因。
实施例一：携带双荧光报告基因的sgVSV设计及拯救
1.sgVSV的设计
VSV包含N、P、M、G、L五个不重叠基因，基因组3’端的非编码先导序列(Leader)，基因组5’端的非编码拖尾序列(Trailer)以及编码基因之间保守的转录起始(GAUNNCUGUU)(GS)和终止信号(UUUUUUCAUA)(GE)，按3’Leader-N-P-M-G-L-Trailer 5’的顺序排布。本实施例采取两种不同的拆分策略以验证节段化的可行性。一是在G基因和L基因之间将VSV拆分成无L基因的sgVSV(△L)和只有L基因的sgVSV(L)两个节段；二是将G基因拆分出来构建无G基因的sgVSV(△G)和只有G基因的sgVSV(G)两个节段(图1)。节段化后，每个节段的末端均包含“3’Leader-N基因转录起始序列5’”(对应的反义DNA序列为SEQ ID NO.1)、“3’L基因转录终止-Trailer 5’序列”(对应的反义DNA序列为SEQ ID NO.2)。为了方便病毒表征，两个节段分别添加绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(mCherry)报告基因便于区分，最终获得sgVSV(△Lgfp/Lmch)【sgVSV(△Lgfp)的基因组反义DNA序列：SEQ ID NO.3；sgVSV(Lmch)的基因组反义DNA序列：SEQ ID NO.4】和sgVSV(△Ggfp/Gmch)【sgVSV(△Ggfp)的基因组反义DNA序列：SEQ ID NO.5；sgVSV(Gmch)的基因组反义DNA序列：SEQ ID NO.6】两种不同的sgVSV。作为对照，本实施例设计了携带GFP报告基因的野生型VSV载体，VSVgfp；同时设计了携带GFP和mCherry双荧光报告基因的半自主复制型VSV载体，srcVSV(△Lgfp/△Lmch)(图2)。
2.质粒构建
2.1 sgVSV(△Lgfp)的反义基因组转录质粒构建
(1)质粒框架及片段制备：使用oL23和oL24引物PCR扩增获得包含Leader-N-P-M以及L-Trailer序列的质粒框架(SEQ ID NO.7)，长度为6276bp；使用oL27和oL28引物PCR扩增获得GFP基因片段(SEQ ID NO.8)，长度为757bp；使用oL25和oL26引物PCR扩增获得G基因(SEQ ID NO.9)，长度为1675bp。基因片段之间以及片段和框架之间均有20bp同源臂用于重组连接。所用引物序列信息如下：
oL23:AAAATCATGAGGAGACTCC(SEQ ID NO.20)
oL24:agtgtcaaggAAACAGATCGATCTCTGTTAG(SEQ ID NO.21)
oL25:CGATCTGTTTccttgacactatgaagtgccttttgtacttag(SEQ ID NO.22)
oL26:gattgctgttagtttttttcataaaaattaaaaactcaaatataattg(SEQ ID NO.23)
oL27:gaaaaaaactaacagcaatcATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC(SEQ ID NO.24)
oL28:TGGAGTCTCCTCATGATTTTCTATTTGTATAGTTCATCCATGCC(SEQ ID NO.25)
(2)同源重组连接：框架与片段连接获得psgVSV(△Lgfp)质粒。根据克隆试剂盒说明书，配制同源重组体系，并在37℃中反应30min。重组体系为10μL，框架、GFP基因片段、G基因片段各0.03pmol。连接物转化大肠杆菌感受态细胞，后续挑取单菌落进行PCR鉴定和质粒提取。
(3)酶切鉴定：使用ApaⅠ、XbaⅠ限制性内切酶对质粒进行酶切鉴定，对酶切符合预期的克隆进行测序确认。
2.2 sgVSV(Lmch)的反义基因组转录质粒构建
(1)质粒框架及片段制备：使用oL29和oL30引物PCR扩增包含Leader、L基因、Trailer等序列的框架，约9700bp(SEQ ID NO.10)。使用引物oL31和oL32扩增mCherry基因片段(SEQ ID NO.11)，扩增产物长度为751bp。PCR产物使用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并回收相应条带大小的产物。
PCR所用引物序列信息如下：
oL29:CATTCGGCATGCCTGCAGG(SEQ ID NO.26)
oL30:TTTGATTACTGTTAAAGTTTCTCC(SEQ ID NO.27)
oL31:AAACTTTAACAGTAATCAAAatggtgagcaagggcgagg(SEQ ID NO.28)
oL32:ACCTGCAGGCATGCCGAATGttacttgtacagctcgtcc(SEQ ID NO.29)
(2)同源重组连接：框架与片段连接获得psgVSV(Lmch)质粒。根据重组克隆试剂盒说明书，配制同源重组体系，并在37℃中反应30min。框架、mCherry基因片段各0.03pmol。连接物转化大肠杆菌感受态细胞，后续挑取单菌落进行PCR鉴定和质粒提取。
(3)酶切鉴定：使用限制性内切酶BamHⅠ，SacⅠ对质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定正确的质粒进行测序。
2.3 sgVSV(Gmch)的反义基因组转录质粒构建
(1)框架制备：XhoI和AflII双酶切pL88(G-Gluc)质粒，回收长度4892bp的框架(SEQ ID NO.12)。该框架携带“T7启动子-Leader-G基因”片段，“Trailer-HDVRz-T7终止子”片段。
(2)插入片段制备：使用oL381和oL396引物PCR扩增mCherry(mCh)基因片段(SEQID NO.13)，长度763bp。
(3)重组连接：mCh基因片段与框架连接获得psgVSV(Gmch)质粒。按照重组连接试剂盒说明书配制同源重组反应体系，在37℃中孵育30min。连接物转化大肠杆菌感受态细胞，后续挑取单菌落进行PCR鉴定、质粒提取及测序分析。PCR所用引物信息如下：
oL381：GTTTACGCGTTATCCCTCGAGAAATGGTTTCTAAGGGTGAAG(SEQ ID NO.30)
oL396：TGGAGTCTCCTCATGATTTTTTATTTGTATAATTCATCCATACCTC(SEQ ID NO.31).
2.4 srcVSV(△Lmch)的反义基因组转录质粒构建
该质粒用于拯救L基因删除的srcVSV(△Lmch)然后与可商业获取的scrVSV(△Ggfp)共传代获得目前已报道的半自主复制型VSV载体，即srcVSV(△Ggfp/△Lmch)。
(1)框架制备：NheI和HindIII双酶切pL52(△L-RBD)质粒，切胶回收7830bp的框架(SEQ ID NO.14)。
(2)插入片段制备：用oL391和oL392引物扩增mCherry(mCh)基因片段(SEQ IDNO.15)，长度784bp。
(3)重组连接：mCh基因片段与框架连接获得psrcVSV(△Lmch)质粒。按照重组连接试剂盒说明书配制同源重组反应体系，在37℃中孵育30min。连接物转化大肠杆菌感受态细胞，后续挑取单菌落进行PCR鉴定、质粒提取及测序分析。PCR所用引物信息如下：
oL391：(SEQ ID NO.32)
cgacttggaaagtaaGCTAGCTATGAAAAAAACTAACAGCAATCCTCGAGAAATGGTTTCTAAGGGTGAAG
oL392：TCTCCTCATGATTTTAAGCTTTTATTTGTATAATTCATCCATACC(SEQ ID NO.33)。
2.5 VSVgfp的反义基因组转录质粒构建
以本实验室保存的pVSV△G-GFP质粒(携带G基因缺失的VSV全长cDNA)为基础，在M、GFP基因之间插入G基因。插入的G基因使用原GFP基因的转录起始信号，G基因编码框后添加转录终止信号用于自身的转录终止以及一个转录起始信号用于GFP基因的转录。
(1)框架制备：XhoI单酶切pVSV△G-GFP质粒，回收长度13468bp的框架(SEQ IDNO.16)。(2)插入片段制备：使用oL95和oL96引物PCR扩增G基因片段(SEQ ID NO.17)，长度1609bp。
(3)重组连接：G基因片段与框架连接获得pVSV-GFP质粒。按照重组连接试剂盒说明书配制同源重组反应体系，在37℃中孵育30min。随后转化大肠杆菌感受态细胞，涂平板，挑取单菌落进行PCR鉴定，获得阳性克隆后继续进行测序分析。PCR所用引物序列为：
oL95：GTTTACGCGTTATCCCTCGAGAAatgaagtgccttttgtacttag(SEQ ID NO.34)
oL96：(SEQ ID NO.35)
CTCCTTTACTCATTTCTCGAGGATTGCTGTTAGTTTTTTTCATAGCTAGCttactttccaagtcggttcatc。
3.sgVSV(△Lgfp/Lmch)拯救
采取sgVSV(Lmch)和sgVSV(△Lgfp)共拯救策略。按“病毒反义基因组转录质粒:N蛋白表达质粒:P蛋白表达质粒:L蛋白表达质粒＝5:3:5:1”的质量比将质粒混合，总量为12μg，其中病毒反义基因组转录质粒包含psgVSV(Lmch)和psgVSV(△Lgfp)，二者质量比为1:1。采用Lipo3000转染试剂盒(Thermo Fisher Scientific，货号：L3000015)进行转染，按说明书的比例配制转染复合物，滴加至预先铺板的稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK21-T7细胞培养体系中。24-48h后转接上清至预先铺板的BHK21-T7细胞或者Vero细胞培养体系中进行盲传，如果细胞出现病变并有报告基因的表达，收集培养上清冻存备用。结果显示sgVSV(Lmch)和sgVSV(△Lgfp)共拯救成功，获得携带双报告基因的节段化水泡性口炎病毒sgVSV(△Lgfp/Lmch)，其感染的Vero细胞表达GFP和mCherry双荧光蛋白(图3)，RT-PCR(图4)和测序分析结果符合预期。
4.sgVSV(△Ggfp/Gmch)的拯救
由于sgVSV(△Ggfp)可商业获取，sgVSV(△Ggfp/Gmch)可通过单独拯救sgVSV(Gmch)然后与sgVSV(△Ggfp)共传代获得。sgVSV(Gmch)的拯救方法与上述sgVSV(Lmch)和sgVSV(△Lgfp)的共拯救操作类似，按“病毒反义基因组转录质粒:M蛋白表达质粒：N蛋白表达质粒:P蛋白表达质粒:L蛋白表达质粒＝2.5:2.5:3:5:1”的质量比将质粒混合，总量为12μg。采用Lipo3000转染试剂盒进行转染，按说明书的比例配制转染复合物，滴加至预先铺板的稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK21-T7细胞培养体系中。24-48h后转接上清至预先铺板的BHK21-T7细胞或者Vero细胞培养体系中，同时加入sgVSV(△Ggfp)进行盲传，如果细胞出现病变并有报告基因的表达而且能持续传代，收集培养上清冻存备用。结果显示转染24-48h即可观察到明显的细胞融合现象并有mCherry蛋白表达，培养上清加入sgVSV(△Ggfp)后可持续传代，被感染的细胞表达GFP和mCherry双荧光蛋白(图3)，共培养上清进行RT-PCR分析可检测到两种病毒而且测序鉴定结果符合预期(图4)，说明sgVSV(△Ggfp/Gmch)制备成功。
5.srcVSV(△Lgfp/△Lmch)的拯救
由于srcVSV(△Ggfp)可商业获取，sgVSV(△Ggfp/Gmch)可通过单独拯救sgVSV(Gmch)然后与srcVSV(△Ggfp)共传代获得。srcVSV(△Ggfp)的拯救方法与上述sgVSV(Lmch)和sgVSV(△Lgfp)的共拯救操作类似，按“病毒反义基因组转录质粒:N蛋白表达质粒:P蛋白表达质粒:L蛋白表达质粒＝5:3:5:1”的质量比将质粒混合，总量为12μg。采用Lipo3000转染试剂盒进行转染，按说明书的比例配制转染复合物，滴加至预先铺板的稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK21-T7细胞培养体系中。24-48h后转接上清至预先铺板的BHK21-T7细胞或者Vero细胞培养体系中，同时加入srcVSV(△Ggfp)进行盲传，如果细胞出现病变并有报告基因的表达而且能持续传代，收集培养上清冻存备用。结果显示转染24h即可观察到明显的细胞融合现象并有mCherry蛋白表达，培养上清加入srcVSV(△Ggfp)后可持续传代，被感染的细胞表达GFP和mCherry双荧光蛋白(图3)，共培养上清进行RT-PCR分析可检测到两种病毒而且测序鉴定结果符合预期(图4)，说明srcVSV(△Lgfp/△Lmch)制备成功。
6.VSVgfp的拯救
按“病毒反义基因组转录质粒:N蛋白表达质粒:P蛋白表达质粒:L蛋白表达质粒＝5:3:5:1”的质量比将质粒混合，总量为12μg。采用Lipo3000转染试剂盒进行转染，按说明书的比例配制转染复合物，滴加至预先铺板的稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK21-T7细胞培养体系中。48h后转接上清至预先铺板的BHK21-T7细胞或者Vero细胞培养体系中，24h后如果细胞出现病变并有报告基因的表达而且能持续传代，收集培养上清冻存备用。结果显示转染48h后取上清传代24h后即可观察到明显的细胞毒性效应，培养上清可持续传代，结合RT-PCR及测序分析证实VSVgfp拯救成功。
实施例二：sgVSV的体外表征
将病毒培养上清按10倍梯度稀释，等量接种至6孔板中的Vero细胞，于二氧化碳培养箱37℃孵育2h后弃上清，加入2mL含0.6％琼脂糖的完全培养基，48h后进行荧光显微镜观察以及结晶紫染色，统计噬斑数。结果显示sgVSV(△Lgfp/Lmch)和sgVSV(△Ggfp/Gmch)均有良好的噬斑形成能力，GFP和mCherry双荧光重合(图5)，说明两个节段功能上互补。sgVSV(△Lgfp/Lmch)的滴度可达107PFU/mL数量级，野生型毒株(VSVgfp)的滴度一般为109PFU/mL数量级。而sgVSV(△Ggfp/Gmch)的滴度在106PFU/mL左右，与srcVSV(△Ggfp/△Lmch)的滴度接近。等感染复数接种Vero细胞进行生长曲线绘制，以G基因为绝对定量PCR靶点，结果显示sgVSV(△Lgfp/Lmch)复制速率和扩增能力与野生型毒株(VSVgfp)接近(图6)。透射电镜观察结果显示sgVSV(△Lgfp/Lmch)的病毒粒子仍为典型的弹状结构，但长度明显小于野生型毒株，平均约90nm(接近VSVgfp粒子长度的1/2)(图7)。而sgVSV(△Ggfp/Gmch)则存在大小有明显差异的两种病毒颗粒，一种与野生型毒株VSVgfp大小相仿(图7)；另一种则长度小于100nm，子弹头状(图7)。由于水泡性口炎病毒的基因组大小直接与病毒颗粒大小关联，sgVSV由于包含长度接近或者不同的基因组节段，对应的病毒颗粒大小也会存在差异，实验结果符合理论预期。实施例三：sgVSV的细胞毒性及体内毒性分析
将sgVSV(△Lgfp/Lmch)、sgVSV(△Ggfp/Gmch)、srcVSV(△Ggfp/△Lmch)以及野生型毒株VSVgfp等感染复数接种至6孔板的单层A549细胞，于二氧化碳培养箱，37℃培养2h后弃上清，加入2mL含0.6％琼脂糖的完全培养基，72h后进行结晶紫染色，统计噬斑大小。结果显示sgVSV(△Lgfp/Lmch)、sgVSV(△Ggfp/Gmch)以及srcVSV(△Ggfp/△Lmch)在A549细胞中均有良好的噬斑形成能力，但噬斑面积都远小于VSVgfp(图8)，说明节段化后的VSV对干扰素敏感度增加，毒力减弱。sgVSV(△Lgfp/Lmch)和srcVSV(△Ggfp/△Lmch)的噬斑面积大小相当，无显著性差异，而sgVSV(△Ggfp/Gmch)噬斑面积最小(图8)。将这四种病毒经腹腔注射感染一日龄C57BL/6小鼠均能导致其死亡，但死亡时间存在显著差异，体重变化趋势与生存曲线一致(图9、10)，VSVgfp的毒性最强，sgVSV(△Lgfp/Lmch)与srcVSV(△Ggfp/△Lmch)相当，sgVSV(△Ggfp/Gmch)则最弱，与体外细胞毒性检测结果吻合。为了进一步明确sgVSV在体内的感染特性，本实施例设计构建了携带荧光素酶报告基因的重组病毒便于通过活体成像示踪病毒感染范围。将sgVSV(△Lgfp/Lmch)中sgVSV(△Lgfp)的gfp报告基因替换为高斯荧光素酶(gluc)基因，获得sgVSV(△Lgluc/Lmch)；将sgVSV(△Ggfp/Gmch)中sgVSV(△Ggfp)的gfp报告基因替换为萤火虫荧光素酶(fluc)基因，sgVSV(Gmch)的mch报告基因替换为高斯荧光素酶(gluc)基因，获得sgVSV(△Gfluc/Ggluc)，同样对srcVSV(△Ggfp/△Lmch)进行相应的报告基因替换，获得srcVSV(△Gfluc/△Lgluc)。将装载荧光素酶报告基因的病毒分别滴鼻感染I型干扰素受体缺陷的C57BL/6小鼠，48h进行活体成像分析。结果显示sgVSV(△Gfluc/Ggluc和sgVSV(△Lgluc/Lmch)均能通过滴鼻接种感染小鼠并表达外源基因(图11)。
实施例四：肿瘤细胞杀伤测试
本实施例使用四种肿瘤细胞系进行杀伤测试，分别是人肺癌细胞系A549，人胶质瘤细胞系U251，小鼠肺癌细胞系LLC，小鼠胶质瘤细胞系GL261。将癌细胞按5000细胞/孔提前一天接种至96孔板，然后按感染复数0.01分别接种sgVSV(△Lgfp/Lmch)、sgVSV(△Ggfp/Gmch)、srcVSV(△Ggfp/△Lmch)以及野生型毒株VSVgfp，48h后采用CCK-8法进行细胞活性检测。结果显示，与对照组相比sgVSV(△Lgluc/Lmch)和sgVSV(△Gfluc/Ggluc)感染组的细胞活性大大降低(图12)，说明二者均能有效感染并杀伤肿瘤细胞。
实施例五：sgVSV(△G/G)的外源抗原装载测试
基于sgVSV(△G/G)，在sgVSV(G)上进行抗原装载测试，将新型冠状病毒(SARS-CoV-2)德尔塔株的RBD(刺突蛋白的受体结合结构域)编码基因(δRBD)插入G基因下游获得sgVSV(GδRBD)。δRBD的C端包含通过GSGSG连接肽连接的三聚化模序(Trimerizationfoldon：GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)。通过拯救获得sgVSV(GδRBD)后与sgVSV(△G)共传代获得sgVSV(△G/GδRBD)(图13)。
1.sgVSV(GδRBD)的反义基因组转录质粒构建：
(1)框架制备：使用oL23和oL395引物扩增包含“Leader-G”，“Trailer”片段质粒框架(SEQ ID NO.18)。
(2)插入片段制备：使用G3-delta_RBD-F和G3-delta_RBD-R引物扩增δRBD基因片段(SEQ ID NO.19)，851bp。
(3)重组连接：δRBD基因片段与框架连接获得psgVSV(GδRBD)质粒。按照重组连接试剂盒说明书配制同源重组反应体系，在37℃中孵育30min。随后转化大肠杆菌感受态细胞，涂平板，挑取单菌落进行PCR鉴定，获得阳性克隆后继续进行测序分析。PCR所用引物序列为：
G3-delta_RBD-F：CGCGTTATCCCTCGAGAAATGTTCGTGTTCCTCGTGC(SEQ ID NO.36)
G3-delta_RBD-R：TGGAGTCTCCTCATGATTTTttacaagaaggtgctcagcag(SEQ IDNO.37)
oL395：TCGAGGGATAACGCGTAAAC(SEQ ID NO.38)
oL23：AAAATCATGAGGAGACTCC(SEQ ID NO.39)。
(4)病毒拯救：操作方法与实施例一中sgVSV(Gmch)的拯救相同。获得病毒上清后与sgVSV(△G)(可商业化获取)共传代成功获得sgVSV(△G/GδRBD)。
(5)δRBD的表达检测：将sgVSV(△G/GδRBD)接种至提前铺板的Vero细胞，24h后收集上清和细胞使用新型冠状病毒RBD的抗体进行Western Blot检测。培养上清和细胞中均能检测到δRBD的表达(图14)，说明sgVSV载体可以装载并表达外源基因，可用于疫苗研发。
以上实施例的目的，是对本发明的技术方案进行示例性的再现与推导，并以此完整的描述本发明的技术方案、目的及效果，其目的是使公众对本发明的公开内容的理解更加透彻、全面，并不以此限定本发明的保护范围。
以上实施例也并非是基于本发明的穷尽性列举，在此之外，还可以存在多个未列出的其他实施方式。在不违反本发明构思的基础上所作的任何替换与改进，均属本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种水泡性口炎病毒载体，其特征在于，其为由依序含VSV病毒的N、P、M、G四个不重叠基因的sgVSV(△L)节段以及含VSV病毒的L基因的sgVSV(L)节段通过病毒拯救获得的sgVSV(△L/L)；或由含VSV病毒的N、P、M、L四个不重叠基因的sgVSV(△G)节段以及含VSV病毒的G基因的sgVSV(G)节段通过病毒拯救获得的sgVSV(△G/G)。
2.根据权利要求1所述的水泡性口炎病毒载体，其特征在于，每个所述的节段的3’端和5’端均具有非编码序列，优选地，所述3’端非编码序列的反义DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述5’端非编码序列的反义DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的水泡性口炎病毒载体，其特征在于，所述sgVSV(△L)节段的基因组反义DNA序列如SEQ ID NO.3所示，和/或sgVSV(L)节段的基因组反义DNA序列如SEQ IDNO.4所示。
4.根据权利要求1所述的水泡性口炎病毒载体，其特征在于，所述sgVSV(△G)节段的基因组反义DNA序列如SEQ ID NO.5所示，和/或sgVSV(G)节段的基因组反义DNA序列如SEQ IDNO.6所示。
5.权利要求1-4任一项所述水泡性口炎病毒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.构建所述sgVSV(△L)的反义基因组转录质粒，和sgVSV(L)的反义基因组转录质粒；
S2.通过sgVSV(L)的反义基因组转录质粒和sgVSV(△L)的反义基因组转录质粒共拯救，获得节段化水泡性口炎病毒sgVSV(△L/L)；
或包括以下步骤：
S1.构建所述sgVSV(△G)的反义基因组转录质粒，和所述sgVSV(G)的反义基因组转录质粒；
S2.通过将sgVSV(△G)的反义基因组转录质粒与所述sgVSV(G)的反义基因组转录质粒分别单独拯救后共传代，获得节段化水泡性口炎病毒sgVSV(△G/G)。
6.权利要求1-4任一项所述水泡性口炎病毒载体在制备疫苗或基因药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述疫苗为防治新型冠状病毒的疫苗；
或所述基因药物是治疗肿瘤的siRNA,抗体，肿瘤杀伤蛋白，抑癌蛋白或是增强病毒载体自身复制能力的蛋白。
8.一种具有权利要求1-4任一项所述水泡性口炎病毒载体的疫苗，其中，在所述sgVSV(△L)节段或sgVSV(L)节段插入有目的表达编码基因；或在sgVSV(△G)节段中或sgVSV(G)节段插入有目的表达编码基因。
9.一种针对新冠病毒的水泡性口炎病毒，其特征在于，其为将SARS-CoV-2的德尔塔株的刺突蛋白受体结合结构域编码基因插入所述sgVSV(G)节段中的G基因下游，通过拯救获得sgVSV(GδRBD)后与sgVSV(△G)共传代获得的sgVSV(△G/GδRBD)。
10.权利要求9所述的针对新冠病毒的水泡性口炎病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.sgVSV(GδRBD)的反义基因组转录质粒构建：获得SEQ ID NO.18所示序列构成的框架，
S2.获得SEQ ID NO.19所示序列的δRBD基因片段，
S3.δRBD基因片段与框架连接获得sgVSV(GδRBD)的反义基因组转录质粒psgVSV(GδRBD),
S4.将所述psgVSV(GδRBD)单独拯救后再与所述sgVSV(△G)共传代，获得sgVSV(△G/GδRBD)。
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