CN103333916A

CN103333916A - 适应鸡新城疫病毒增殖的bhk细胞系的建立方法及其应用

Info

Publication number: CN103333916A
Application number: CN201310120764XA
Authority: CN
Inventors: 李明义; 陈欢; 刘阳; 冯晶晶; 单学强; 张伦; 郭春丽; 李佳琪
Original assignee: SHANDONG SINDER TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANDONG SINDER TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-04-02
Filing date: 2013-04-02
Publication date: 2013-10-02

Abstract

本发明公开了一种适应鸡新城疫病毒增殖的BHK细胞系的建立方法以及在鸡新城疫病毒的增殖中的应用。本发明通过改进新城疫病毒培养方式、优化培养参数、筛选传代细胞，建立传代细胞疫苗生产工艺，生产工艺流程将大大简化，生产过程更加可控。

Description

适应鸡新城疫病毒增殖的BHK细胞系的建立方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及适应鸡新城疫病毒增殖的BHK-α-2，3细胞系的建立方法及其应用。

背景技术

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)为副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒属(Paramyx-ovirus)成员，是有囊膜的负链RNA病毒。由NDV引起的新城疫(Newcastledisease，ND)是一种严重危害养禽业的高度接触性传染病，死亡率为90％以上，被国际兽疫局认定为两种A类禽病之一(另一种为禽流感)。

近年来，随着世界各国养殖业的发展，种禽频繁调动及疫苗的广泛使用，使得N D V的宿主范围不断扩大，抗原性和病毒毒力发生了变化，这给N D的诊断及N D V的实验室研究带来诸多困难.分离和增殖N D V常用的方法是鸡胚接种法，此方法简便易行，但由于鸡胚本身可能携带有一些垂直传播疾病的病原，对疾病诊断及实验室研究造成干扰.使用异源传代细胞制备ND疫苗可避免鸡胚传播其他疫病的风险，最大程度的减少了批间质量差异，使产品真正达到了使用安全，质量均一、稳定，关于NDV在各种细胞中的增殖研究国内外均有报道。研究表明，NDV可在鸡胚尿囊液中复制并产生感染性的病毒粒子，NDV强毒株可在多种体外培养细胞中复制，但是弱毒株只能在含有胰蛋白酶的细胞中进行复制。决定N D毒株毒力强弱的关键是融合(F)蛋白裂解位点的氨基酸组成和序列差异，F蛋白直接参与N D V的致病过程，鉴定F基因对N D V毒株毒力判定具有重要意义.

目前已有报道利用VERO细胞和MDCK细胞生产制备人用流感疫苗。因此，具备悬浮培养特性的BHK等一些细胞已成为新城疫病毒增殖不可缺少的一种宿主系统。部分毒株虽具备在BHK等哺乳动物细胞的复制增殖能力，但由于受体丰度较低，造成病毒滴度低，形成蚀斑能力弱，给进一步深入研究乃至疫苗和抗病毒药物研制造成极大困难。提高BHK工程细胞系表面受体丰度，有可能改进新城疫病毒分离株的生长滴度及蚀斑形成能力。筛选稳定表达鸡ST3Gal I基因的BHK细胞株，为进一步研究新城疫病毒受体结合特性以及大规模细胞培养生产疫苗奠定基础。

目前在我国用于预防新城疫病毒的疫苗全部为利用鸡胚生产的灭活疫苗，虽然在国内防控新城疫期间发挥了重要作用，但是，在禽流感疫苗销量较大的生产企业中，每天生产约需30万枚鸡胚，如此大的鸡胚需求量，势必无法保证鸡胚来源、品种一致，以及母源抗体水平、新鲜度一致，继而对鸡胚的孵化率及其所繁殖病毒的效价造成很大影响，由于这些自然因素，很难保证制备疫苗所用抗原的一致性，其结果就是疫苗批间的均一性大打折扣。而且鸡胚中含有大量的杂蛋白，使用过程中存在一定的安全隐患。另外，高压灭菌处理鸡胚废弃物，一是成本增加，二是由于量大，往往高压灭菌并不彻底，因此对环境也存在一定的安全隐患。所以，利用鸡胚培养很难保证每批产品质量均能达到一致，稳定，且安全。鸡胚源疫苗存在着质量难以控制、生产周期长、易引起过敏等问题，因此急需开发新的流感疫苗生产介质。

发明内容

本发明其主要目的是提供一种适应鸡新城疫病毒增殖的BHK细胞系的建立方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)PCR扩增ST3GALI片段：

以如下引物：

ST3GAL-F：5′-ATTTGCGGCCGCGCCGCCACCATGGTCACCGTCAGGAAAAGGAAC-3′；ST3GAL-R：5′-CGTCTAGAGGTCATCTGCCCTTGAAAAAT3′。

以pESG-T-ST3GAL I质粒为模板，PCR扩增ST3GAL I基因序列，收集1000-1050bp的扩增引物；

(2)重组质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3Gal I的构建

将扩增序列连接到pMD18-T载体上得重组质粒pMD-ST3Gal I，使用Not I、Xba I分别双酶切pMD-ST3Ga I和pcDNA3.1-EGFP，酶切产物在T4DNA ligase的作用下连接，得重组表达质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3Gal I；

(3)BHK-21细胞的转染

BHK细胞在转染前一天接种，培养18～24h至70-90％细胞汇合，使用转染试剂将重组质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3Gal I转染BHK细胞；

(4)抗性细胞克隆的筛选

待转染20-28h后，换用含有G418(700-900ug/mL)的DMEM培养液进行筛选，2周后G418改为300-500ug/mL维持剂量筛选，挑选抗性细胞集落，按有限稀释法进行单细胞克隆，得到适应鸡新城疫病毒增殖的BHK细胞系。

本发明另一方面还涉及鸡新城疫病毒的增殖方法，包括上述适应鸡新城疫病毒增殖的BHK细胞系的步骤，其特征在于包括新城疫病毒Lasota株感染BHK细胞系的步骤。

本发明通过改进培养方式、优化培养参数、筛选传代细胞，建立传代细胞疫苗生产工艺，生产工艺流程将大大简化，生产过程更加可控。

附图说明

图1：pSG5-ST3GAL I质粒结构示意图；

图2：重组质粒pcDNA3.1-EGFPP-ST3Gal I的PCR产物鉴定结果；

图3；重组质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3Gal I双酶切产物(Not I和Xba I)；M：DL2000DNA分子质量标准；

图4：pcDNA3.1-EGFP-ST3Gal I结构示意图；

图5：抗性细胞克隆的荧光显微镜观察结果，BHKα-2，3(左)与正常BHK细胞(右)；

图6：抗性细胞克隆的RT-PCR鉴定结果：1和2为ST3Gal I基因在BHK细胞中表达；M：DL2000DNA分子质量标准

图7：流式细胞仪检测BHK-α-2，3细胞和BHK细胞对α-2，3连接型特异性凝集素的反应性。MAA与2，3连接型反应；SNA与2，6连接型反应：A：BHK细胞与MAA结合；B：BHK-α-2，3细胞与MAA结合；C：BHK细胞与SNA结合；D：BHK-α-2，3细胞与SNA结合；

具体实施方式

1材料和方法

1.1细胞、菌株和质粒

pcDNA3.1-EGFP载体购自长沙赢润生物技术有限公司；pSG5-ST3GAL I质粒来源于商购，其结构如图4所示。

1.2主要工具酶及试剂

Trizol Reagent购自Invitrogen公司；限制性内切酶Not I、Xba I、Pyrobest DNA Polymerase、T4DNA连接酶均购自Sigma公司；AMV反转录试剂盒、DNA胶回收纯化试剂盒、质粒DNA提取试剂盒、DNA Marker、低分子量标准蛋白Marker均购自大连宝生物公司；质粒大量提取试剂盒购自Qiagen公司；G418、DMEM培养基、转染试剂Lipofectamine2000Regeant购自Invitrogen公司；胎牛血清购自GIBCO公司。DIG Glyan Differentiation Kit、Anti-digoxigenin-rhodamine均购自Roche公司。

1.3引物的设计与合成

利用Oligo6.0软件设计以下引物：ST3GAL-F：5′-ATTTGCGGCCGCGCCGCCACCATGGTCACCGTCAGGAAAAGGAAC-3′；ST3GAL-R：5′-CGTCTAGAGGTCATCTGCCCTTGAAAAAT3′。

以pESG-T-ST3GAL I质粒为模板，PCR扩增ST3GAL I基因序列。PCR条件：95℃3min，95℃30s，55℃30s，72℃1min，共30个循环，72℃10min，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4重组质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3Gal I的构建

PCR产物经过8g/L琼脂糖凝胶电泳分析，将目的条带(片段长度为1000-1050bp)用凝胶回收试剂盒回收，连接到pMD18-T载体上，将重组质粒命名为pMD-ST3Gal I，使用Not I、Xba I分别双酶切pMD-ST3Ga I和pcDNA3.1-EGFP，酶切产物用用8g/L琼脂糖凝胶进行电泳，将ST3Gal I1029bp目的条带分别用凝胶回收试剂盒回收后，在T4DNA ligase的作用下16℃过夜。将构建好的重组表达质粒经PCR、酶切和测序鉴定，命名为pcDNA3.1-EGFP-ST3Gal I，其结构示意图如图3所示。

1.5BHK-21细胞的转染

按照Qiagen质粒中提试剂盒操作说明制备转染用质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3Ga I，鉴定正确、测定浓度后用于转染。BHK细胞在转染前一天接种于6孔板中(4×10⁵细胞/孔)，每孔含1mL培液(无抗生素)，培养18～24h至80％细胞汇合。重组质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3Gal I及pcDNA3.1-EGFP空载体分别转染BHK细胞，按LipofectatimeTM2000说明书操作。

1.6抗性细胞克隆的筛选

待转染24h后，换用含有G418(800ug/mL)的DMEM培养液进行筛选，2周后G418改为400ug/mL维持剂量筛选，挑选抗性细胞集落，按有限稀释法进行单细胞克隆得到BHK-α-2，3细胞株。

提取细胞细胞株总RNA进行RT-PCR鉴定，获得一条约1029bp的特异性片段，与预期结果相符，连续传5代、10代后仍能检测到1029bp的特异性片段，表明ST3Gal I基因已经整合到BHK细胞系的基因组上。

抗性细胞克隆的荧光观察：荧光显微镜下可见清晰的绿色荧光，如图1所示，证明eGFP表达，也间接证明目的基因ST3GAL1的表达成功。BHKα-2，3与正常BHK细胞未见明显的形态差异(图1)。持续传代过程中我们使用无G418培养液培养仍可见绿色荧光的表达，同时在后续的RT-PCR鉴定过程中我们也使用的是无G418培养液培养的细胞株，说明目的基因已整合进BHK细胞基因组中并可持续表达。

1.7流式细胞仪检测α-2，3、α-2，6在人工构建BHK-α-2，3细胞中的表达

BHK与第五代冻存复苏的BHK-α-2，3分别铺于T75瓶各两瓶。待细胞密度约为90％时，胰酶消化，分别收集细胞沉淀。用含10mM Glycine的PBS洗两次，再用Buffer1洗一次。用配置好的封闭液Blocking Solution均匀重悬细胞沉淀，在冰上封闭1小时。之后按上述方法重复洗涤，再分别用MAA、SNA及空白对照同样处理BHK与BHK-α-2，3，即1uL一抗于30uL Buffer1中均匀重悬细胞沉淀，冰上孵育1小时。重复洗涤，再用1uL罗丹明标记地高辛二抗于30uL Buffer1中均匀重悬细胞沉淀，冰上孵育1小时，最后PBS洗涤三次后可用于流式检测，结果如图2所示。

使用地高辛标记的两种凝集素作为一抗检测α-2，3及α-2，6连接型受体在BHK和BHK-α-2，3细胞上的表达量：黑接骨木果凝集素(SNA)特异性识别2，6连接型唾液酸，高丽槐黄柏甙凝集素(MAA)特异性识别2，3连接型唾液酸。罗丹明标记抗地高辛抗体为二抗。结果显示，BHK-α-2，3细胞中α-2，3连接型受体含量显著高于BHK细胞，说明ST3GAL I基因在BHK细胞中的稳定表达显著提高了α-2，3连接型受体的丰度。而2，6连接型受体含量在两种细胞中并没有显示出明显差异。

1.8新城疫病毒Lasota株在BHK-α-2，3细胞内的增殖情况

经复壮的NDV弱毒株Lasota不稀释，向长成单层的第十代BHK接毒盲传5代，接毒量为1.0mL，置5％、37℃CO₂温箱孵育1h。置5％、37℃CO₂温箱，逐日观察细胞病变(CPE).待80％细胞出现圆缩、脱落时收毒。待细胞单层被完全破坏后反复冻融3次收集上清液后，用常规微量红细胞凝集试验检测病毒的HA滴度。

病毒细胞培养物离心后，取上清液进行半数细胞感染量(TCID₅₀)的测定，将上清液进行10倍梯度稀释，取10^-6，10^-7，10^-8，10^-9和10^-10稀释度样品接种长成致密单层的BHK-α-2，3细胞，接种量为0.1mL/孔，每个稀释度接种5孔细胞。观察细胞病变，如120小时内出现细胞病变则判定为阳性，如未出现细胞病变则判定为阴性，以Reed-Muench法计算TCID₅₀。

经鸡胚复壮的NDV弱毒株以不同稀释度接种细胞，均能在B H K-21中增殖，产生典型的CPE，即发生细胞融合和形成合胞体.CPE最初表现为细胞变圆，回缩，形成较小的合胞体，细胞之间的空隙变大；后期发生细胞融合和形成多核巨细胞，最终细胞瓦解，脱离瓶壁，漂浮于细胞培养液中.用常规微量红细胞凝集试验检测病毒的HA滴度是2⁸，并且盲传5代保持不变，56℃处理1小时HA效价无明显变化。

新城疫病毒Lasota株感染BHK-α-2，3细胞TCID₅₀

计算该毒株的细胞增殖效价是10⁸³⁶TCID₅₀/mL

城疫病毒Lasota株具弱毒特性，鸡胚平均致死时间为103～105h，脑内致病指数为0.00。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims

1.一种适应鸡新城疫病毒增殖的BHK细胞系的建立方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)PCR扩增ST3GAL I片段：

以如下引物：

ST3GAL-F：5′-ATTTGCGGCCGCGCCGCCACCATGGTCACCGTCAGGAAAAGGAAC-3′；ST3GAL-R：5′-CGTCTAGAGGTCATCTGCCCTTGAAAAAT-3′。

(2)重组质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3Gal I的构建

(3)BHK细胞的转染

(4)抗性细胞克隆的筛选

2.鸡新城疫病毒的增殖方法，包括如权利要求1所述的适应鸡新城疫病毒增殖的BHK细胞系的步骤，其特征在于包括新城疫病毒Lasota株感染BHK细胞系的步骤。