CN102776156A - 基因Ⅵb亚型新城疫病毒致弱株ⅥbI4及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因Ⅵb亚型鸽源新城疫病毒致弱株ⅥbI4及其构建方法。所述基因Ⅵb亚型鸽源新城疫病毒致弱株ⅥbI4，它的保藏号CGMCCNo：6149。本发明涉及应用反向遗传技术，利用含有鸽源新城疫病毒JS/07/04/Pi基因组全长的转录载体pTVT/071204，对其F基因进行致弱突变后获得转录载体ApTVT/071204，再将新城疫病毒rNDV/I4的NP、P和L基因片段替换ApTVT/071204上的对应部分，得到重组质粒ApTVT/ⅥbI4，该质粒与辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞后成功拯救出重组病毒ⅥbI4。该病毒在鸡胚上具有较高的繁殖滴度，适合于疫苗的大规模生产，可用于制造疫苗。

Description

基因Ⅵb亚型新城疫病毒致弱株ⅥbI4及其构建方法

技术领域

本发明涉及应用反向遗传技术，产生一种基因Ⅵb亚型新城疫病毒致弱株ⅥbI4，用于制造疫苗。

背景技术

反向遗传操作技术(Reverse genetics manipulation technique)是指在体外通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，将病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA分子水平上对其进行各种体外人工操作，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒的一项研究技术[Leyrer S,Neubert WJ,SedlmeierR.Rapidand efficient recovery of Sendai virus from cDNA:factors influencing recombinantvirus rescue.J Virol Methods 1998,75(1):47-58.]，也叫全长感染性cDNA克隆技术，又常被称为“病毒拯救”。由于最终“拯救”出的RNA病毒来源于cDNA克隆，因此，可通过中间过程中人为加入的DNA环节，在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工操作，如进行基因突变、基因插入、基因敲除（缺失）、等改造，解决了对RNA病毒基因组难以操作这一难题，极大地方便了人们进行病毒各基因的功能、致病机理和病毒病防制策略的研究，同时为新型疫苗的研制和开发提供了新的思路[Engel-Herbert I,Werner O,Teifke JP，et al.Characterizationof a recombinant Newcastle disease virus expressing the green fluorescent protein.JVirol Methods.2003,108(1):19-28.]。

鸽新城疫(Newcastle Disease)是由鸽Ⅰ型副黏病毒（pigeon paramyxovirus 1，PPMV-1）引起鸽的一种高度接触性，高发病率和高死亡率都很高的急性传染病，其症状同鸡新城疫相似。PPMV-1属于禽副黏病毒科、腮腺炎病毒属，通常被认为是鸡新城疫病毒（NDV）的变异株，基因组为单股负链RNA，长度为15kb，基因组序列为3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，分别编码6种蛋白：核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）和大分子蛋白（L）。此外，P基因转录过程中，在484位会插入一或两个额外的非模板鸟嘌呤核苷酸（G碱基），发生RNA编辑现象而产生V和W蛋白，它们和P蛋白含有相同的N端，但是具有不同的C端[15]。其中F和HN两种糖蛋白位于病毒囊膜表面，是分子生物学研究的首选基因。[Steward M,Vipond I B,Millar,et al.RNA editing in Newcastle disease virus.Journal of General Virology，1993,74:2539-2547.]。

Dorina Ujvari等[Ujvari D,Wehmann E,Kaleta EF,et al.Phylogenetic analysisreveals extensive evolution of avian paramyxovirus type 1 strains of pigeons(Columba livia)and suggests multiple species transmission.2003,96(1-2):63-73.]在1978~2002年对16个国家的鸽源新城疫分离株进行序列比对发现，绝大多数属于Ⅵb亚型。有研究表明Ⅵb亚型NDV大多数是从鸽群中分离得到[Kim LM,KingDJ,Guzman H,et al.Biological and phylogenetic characterization of pigeonparamyxovirus serotypes 1 circulating in wild North American pigeons and doves.2008,46(10):3303-3310.]，由此可见，Ⅵb亚型NDV对鸽子具有较强的宿主特异性。近几年来，我国养鸽业发展迅速，该病在国内亦呈上升趋势，甚至一些养鸽场呈暴发流行，给养鸽业带来较大的经济损失，并且常常引起鸡新城疫的流行。近年来，基因Ⅱ型疫苗株LaSota已在鸽场得到了广泛使用，但免疫鸽群中仍可发生Ⅵb亚型NDV的感染与流行，表明当前疫苗株并不能有效预防Ⅵb亚型NDV的感染。

该类病毒的F蛋白含有典型的强毒裂解位点，有些对鸽致病力较强而对鸡却属于弱或中等毒力。Ⅵb亚型NDV感染鸽后，体内带毒时间较长，排毒明显高于其他基因型，吴双等[吴双王伟伟,曹军平,等.不同基因型新城疫病毒对美国白羽王鸽的致病性研究.中国预防兽医学报2010,32:424.]对白羽王鸽的致病性试验中，发现相对于JS-5-05-Go（Ⅶd亚型），WX-10-07-Pi（Ⅵb亚型）感染组鸽的泄殖腔棉拭子在感染后第5d至15d内均可检测到排毒，而且排毒率明显高于JS-5-05-Go感染组。加上鸽的活动范围较广，使得该类病毒在鸽群中传播迅速，家鸽和野鸽与家禽的偶然接触也增加了其他家禽感染的风险。鸽源NDV通过鸡或鸡胚传代后毒力增强的现象也多次被报道[Dortmans JC,Rottier PJ,Koch G，et al.Passaging of a Newcastle disease virus pigeon variant in chickens results inselection of viruses with mutations in the polymerase complex enhancing virusreplication and virulence.2011,92(2):336-345.]。因此，鸽源NDV一旦突破了这种宿主特异性而传染给其他家禽，将会给养禽业带来巨大的威胁。鸽源NDV被认为是鸡源NDV的变异株，其在抗原性上与鸡源疫苗毒株存在明显的差异[Dortmans JC,Koch G，Rottier PJ,et al.A comparative infection study of pigeon andavian paramyxovirus type1viruses in pigeons:evaluation of clinical signs,virusshedding and seroconversion.2011,40(2):125-130]。研究证实，使用与流行株基因型一致的疫苗株能有效降低免疫禽群中NDV强毒的携带量及感染率（Hu S,MaH,Wu Y，et al.A vaccine candidate of attenuated genotype VII Newcastle diseasevirus generated by reverse genetics.Vaccine2009,27(6):904-910.）。鸽新城疫的预防应该使用专门的鸽源新城疫疫苗。

一个好的疫苗候选毒株需同时具有毒力弱、繁殖滴度高和遗传稳定性好的特点，而目前国内外分离到的PPMV-1普遍存在强毒裂解位点、效价低和容易发生变异等缺点。大部分PPMV-1F蛋白裂解位点序列为强毒特征，在CEF上可以形成空斑，但对鸡的致病力较弱，推测这种毒力的差异可能由于病毒的复制能力的差异而引起。Dortmans,J.C等将PPMV-1弱毒株AV324与强毒株Herts的NP、P、M和L基因互换，利用反向遗传技术拯救出重组病毒，测定重组毒的ICPI、空斑试验，生物学特性试验结果表明NP、P、L蛋白对病毒的复制能力和毒力有直接影响[Dortmans JC,Rottier PJ,Koch G，et al.The viral replication complex isassociated with the virulence of Newcastle disease virus.2010,84(19):10113-10120.]。

2007年王伟伟等在发病的鸽群中，成功分离到了基因Ⅵb亚型鸽源新城疫JS/07/04/Pi株，并进行了全基因组测序，登录号为FJ766526（王伟伟.江苏省新城疫病毒分子流行病学研究及鸽源分离株基因组序列的分析.扬州大学硕士论文.扬州,扬州大学,2009.）。2012年，朱艳梅等构建出了JS/07/04/Pi株的全长表达克隆[朱艳梅,胡增垒,宋庆庆,等.鸽源新城疫病毒JS/07/04/Pi株感染性分子克隆的构建及病毒拯救.病毒学报.2012,28（1）,67-72.]。2005年姚春峰等从发病鹅群中分离到基因VII型NDV毒株JS-5-05-Go，其尿囊液的HA价为8log2明显高于JS/07/04/Pi株（姚春峰.我国部分地区新城疫病毒的部分生物学特性鉴定及分子流行病学研究.扬州大学硕士学位论文.扬州,2007,6.），2011年胡增磊等构建出该毒株的全长表达克隆pNDV/I4，并成功将其致弱，致弱后的NDV/AI4，效价高达10log2[Hu Z,Hu S,Meng C,et al.Generation of a genotype VII Newcastle diseasevirus vaccine candidate with high yield in embryonated chicken eggs.Avian Dis2011,55(3):391-397.]。

发明内容

本发明的第一个目的在于发明一种基因Ⅵb亚型鸽源新城疫病毒致弱株，从而解决当前所用疫苗株与鸽新城疫流行株基因型不一致的问题。

本发明基因Ⅵb亚型新城疫病毒致弱株ⅥbI4，于2012年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，其保藏号CGMCC No：6149。

本发明的第二个目的在于提供一种基因Ⅵb亚型鸽源新城疫病毒致弱株ⅥbI4的构建方法：

本发明利用已建立的鸽源新城疫病毒的反向遗传操作平台，将JS/07/04/Pi株的F裂解位点突变致弱后，将繁殖性能较高的新城疫病毒rNDV/I4的NP、P和L基因片段替换转录载体ApTVT/071204上的对应部分构建出重组质粒ApTVT/ⅥbI4，该重组质粒与辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞后，获得了具有较高繁殖性能的基因Ⅵb亚型鸽源新城疫致弱株ⅥbI4，适合于疫苗的大规模生产。

另外，该致弱毒株为基因Ⅵb亚型与当前我国鸽新城疫流行株的基因型相一致，因此，同常规疫苗（基因I和II型）相比，致弱株ⅥbI4在控制当前鸽新城疫的发病和流行方面显示出了广阔的应用前景。

本发明包括以下具体步骤：

1）新城疫病毒JS/07/04/Pi株的F蛋白致弱突变

构建阳性质粒APF：分别从JS/07/04/Pi株基因组的4107nt~4903nt，4871nt~5676nt位置通过Overlap PCR克隆出部分F基因片段，在质粒pCR2.1载体中相连，获得阳性质粒APF；

分别将APF与P34用AflⅡ和Bsu36Ⅰ进行双酶切后，回收目的片段，连接构建成AP34；将质粒AP34与P58用BstBⅠ和XbaⅠ双酶切，回收目的片段后连接成中间质粒AP38，最后将AP38用AgeⅠ和MluⅠ双酶切后替换到pTVT/071204的对应序列，构建出重组质粒ApTVT/071204，具体的构建模式见图1。

两对突变引物分别是：

APF1 5'GTGATGTACTCGGACCTTCTGTGCTTGT3'（SEQ ID No.1）

APF2 5'ATAAGGCGCCCTTGCCTCCCTCCTCCTGATGTGGACA3'（SEQID No.2）

APF3 5'ACATCAGGAGGAGGGAGGCAAGGGCGCCTTAT3'（SEQ IDNo.3）

APF4 5'TCAGTCTTTGAATACATGCAGGCTGATG3'（SEQ ID No.4）

2）重组病毒ⅥbI4株的拯救

由于rNDVI4和JS/07/04/Pi病毒基因组的2880bp和9520bp位置均有相同的单酶切位点AgeⅠ和FspAⅠ，所以将pNDV/I4和ApTVT/071204用AgeⅠ和FspAⅠ双酶切后，回收ApTVT/071204小片断、pNDV/I4大片段，连接成重组质粒ApTVT/ⅥbI4。具体的构建模式见图2。

将质粒ApTVT/ⅥbI4与pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒共转染BSR-T7/5细胞，转染18h后加入终浓度为10%的SPF鸡胚尿囊液，转染60h后将转染样品接种9~11日龄SPF鸡胚，即获得基因Ⅵb亚型新城疫病毒致弱株ⅥbI4。

上述基因Ⅵb亚型新城疫病毒致弱毒株ⅥbI4的构建方法，其特征在于步骤1）中通过APF1+APF2和APF3+APF4两对突变引物分别扩增APFa和APFb两个片段，凝胶电泳回收APFa和APFb，用引物APF1和APF4将以上两个扩增片段通过Overlap PCR方法相连，得到裂解位点产生突变的扩增片段APF，将其替换中间质粒P34的对应部分得到质粒AP34，该质粒AP34和P58相连得到AP38，利用AP38中含有的Age I和MluⅠ，替换转录载体pTVT/071204上的对应部分从而获得了突变后的质粒ApTVT/071204。

附图说明

图1重组质粒ApTVT/071204构建模式图。

图2重组质粒ApTVT/ⅥbI4构建模式图。

图3重组质粒ApTVT/ⅥbI4的AflⅡ和XhoⅠ酶切鉴定。其中1.ApTVT/ⅥbI4digested with AflⅡ；2.ApTVT/ⅥbI4digested with XhoⅠ；M.DNAMarker。

图4F蛋白裂解位点突变模式图（方框中为突变序列）。

图5致弱株ⅥbI4的RT-PCR鉴定。

图6致弱株ⅥbI4灭活苗免疫鸽后诱导抗体的产生情况（以鸽源毒株070422作为检测抗原）。

具体实施方式

本发明构建的基因Ⅵb亚型鸽源新城疫病毒致弱毒株ⅥbI4于2012年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：中国科学院微生物研究所，其保藏号CGMCC No：6149，其长度为：15192bp。

构建步骤一：鸽新城疫病毒致弱全长表达克隆构建

生物材料准备：

新城疫病毒JS/07/04/Pi株的全长表达克隆pTVT/071204，及其中间质粒P34、P58[朱艳梅,胡增垒,宋庆庆,等.鸽源新城疫病毒JS/07/04/Pi株感染性分子克隆的构建及病毒拯救.病毒学报.2012,28（1）,67-72.]由扬州大学农业部畜禽传染病实验室构建、保存。申请人承诺自申请日起向公众发放二十年。

pCR2.1载体：购自Invitrogen公司。

1、F裂解位点的突变

设计2对引物用于突变扩增JS/07/04/Pi株基因组F基因4107nt~5676nt约1569bp大小的片段。

两对突变引物分别是：

APF1 5'GTGATGTACTCGGACCTTCTGTGCTTGT3'

APF2 5'TCCTCCTGATGTGGACA3'和

APF3 5'ACATCAGGAGGA

3'

APF4 5'TCAGTCTTTGAATACATGCAGGCTGATG3'

突变碱基由斜体标注，重叠部分有下划线标注。以上引物由上海生物工程有限公司合成。

PCR反应：以转录载体pTVT/071204为模板配制如下PCR反应体系：

PCR反应循环参数：94℃预变性2min；94℃20s，56℃30s，72℃延伸，延伸时间为1min/kb，20循环后72℃延伸10min，4℃保存。

用引物APF1和APF2扩增病毒基因组的4107nt~4903nt区域，用引物APF3和APF4扩增基因组的4871nt~5676nt区域。

Overlap PCR反应体系及条件：

PCR反应循环参数：94℃预变性4min；50℃退火1min，72℃延伸5min，之后再94℃20s，56℃30s，72℃延伸2min30s，20循环后72℃延伸10min，4℃保存。

用引物APF1和APF4将以上两个扩增片段通过Overlap PCR方法相连（Overlap部分在上述引物中以下划线标注），得到裂解位点发生4个氨基酸突变的F基因片段，突变模式见图4。

2、全长致弱质粒的构建

PCR产物经回收纯化后与pCR2.1载体相连，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，质粒提取后送南京金斯瑞生物有限公司进行测序验证，阳性质粒命名为APF，分别将APF与P34用AflⅡ和Bsu36Ⅰ进行双酶切后，回收目的片段，连接构建成AP34；将质粒AP34与P58用BstBⅠ和XbaⅠ双酶切，回收目的片段后连接成中间质粒AP38。

最后将目的片段AP38经AgeⅠ和MluⅠ酶切后替换转录载体pTVT/071204上的对应序列。重组质粒用PCR方法鉴定，阳性克隆命名为ApTVT/071204。（见图1）。

步骤二：重组病毒ⅥbI4株的拯救

生物材料准备

pNDV/I4：[Hu Z,Hu S,Meng C,et al.Generation of a genotype VII Newcastledisease virus vaccine candidate with high yield in embryonated chicken eggs.AvianDis2011,55(3):391-397.]由扬州大学农业部畜禽传染病实验室构建、保存。

pCI-NP、pCI-P、pCI-L真核表达质粒：（胡顺林.鹅源新城疫病毒反向遗传技术平台的建立及其应用.扬州:扬州大学;2007）由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室构建、保存。

BSR-T7/5细胞：[Romer-Oberdorfer,A.,et al.,Generation of recombinantlentogenic Newcastle disease virus from cDNA.J Gen Virol,1999.80(11):2987-2995.]由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高研究员惠赠。

基因Ⅱ型疫苗株Lasota由扬州大学农业部畜禽传染病实验室保存。

Ⅵb亚型070422株由扬州大学农业部畜禽传染病实验室于2007年发病鸽中分离并保存。

以上生物材料申请承诺自申请日起向公众提供20年。

1、NP、P、L基因的替换

将pNDV/I4和ApTVT/071204用AgeⅠ和FspAⅠ双酶切后，回收ApTVT/071204小片断、pNDV/I4大片段，连接成重组质粒ApTVT/ⅥbI4。见图2.

2、重组质粒ApTVT/ⅥbI4的酶切鉴定

质粒ApTVT/ⅥbI4经AflⅡ酶切电泳后将出现2.2kb、6.3kb、9.4kb大小的条带，而经XhoⅠ酶切后出现1.7kb、1.8kb、6.3kb和8.4kb大小的条带，由于1.7kb和1.8kb相差太小，电泳仅呈现一条带。（见图3）。

3、重组病毒ⅥbI4株的拯救

将5×10⁵BSR-T7/5细胞接种于35mm dish中，用含1mg/mL G418和10%小牛血清的DMEM培养过夜，约60%~80%铺满时用于转染。将pCI-NP、pCI-P和pCI-L3个真核表达质粒与含有NDV基因组cDNA全长的转录载体(ApTVT/ⅥbI4)共转染BSR-T7/5细胞，18-24h后加入10%SPF胚尿囊液，60h后将转染样品用封口膜（parafilm）封好，转移到-70℃低温冰箱反复冻融2次，然后将转染细胞轻轻刮下，与细胞上清充分混合后接种9~11日龄SPF鸡胚，每个样品接种3枚，0.4mL/枚，37℃孵育。定时照胚，弃去24h内死亡胚。取出24h后死亡胚置于4℃充分冷却，待鸡胚血管收缩后收集尿囊液。

收集的尿囊液均按OIE标准所测HA效价为9log2，与母本Ⅵb亚型毒株JS/07/04/Pi相比上升了2个滴度。

4、新城疫病毒致弱毒株ⅥbI4的RT-PCR鉴定

将HA和HI检测均为阳性的尿囊液在SPF鸡胚上传两代后，收集尿囊液，抽提RNA用于RT-PCR反应，利用引物APF1和APF4扩增F基因长度约为1500bp左右大小的片段，回收目的片段进行测序鉴定，扩增片段的测序结果显示F基因的裂解位点已突变成功（图5）。

用于扩增新城疫病毒致弱毒株ⅥbI4中F基因的引物序列为：

APF1 5'GTGATGTACTCGGACCTTCTGTGCTTGT3'

APF4 5'TCAGTCTTTGAATACATGCAGGCTGATG3'

步骤三、致弱毒株的生物学特性鉴定

1、MDT与ICPI的测定

用灭菌生理盐水分别连续10倍（10^-3、10^-4……10^-7）递增稀释致弱病毒ⅥbI4，每个稀释度接种5只9～11日龄SPF鸡胚，37℃孵育5d，按OIE标准方法计算病毒的MDT；致弱病毒的尿囊液以灭菌生理盐水10倍稀释后经脑内接种10只1日龄的SPF鸡，按OIE标准方法计算病毒的ICPI。

病毒5个稀释度的接种鸡胚在120h内没有发生死亡，说明该毒株的MDT值大于120h；尿囊液经脑内接种1日龄SPF鸡后，ICPI的测定值仅为0.15，表明获救病毒的毒力完全符合弱毒株的标准。

2、致弱毒株的免疫原性试验

将30只40日龄非免疫肉鸽分为3组，每组10只。第1组和第2组按0.5ml/只的量，经肌肉注射基因Ⅱ型Lasota（IV系苗，市售）和本发明致弱疫苗株ⅥbI4制成的油苗，第3组免疫相同剂量PBS做皮下注射。免疫后分别于第1周、第2周、第3周、第4周采血分离血清，分别用基因Ⅵb亚型病毒JS-07-22-Pi（由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离保存，基因组序列登录号：FJ766526）和基因Ⅱ型LaSota为4单位抗原，测定6组鸽在第1-4周内的抗体水平。结果：灭活苗组ⅥbI4同LaSota免疫组于第4周免疫鸽抗体水平均可达到6log2以上，同时PBS免疫组一直为0并且用Ⅵb亚型毒株做抗原时。ⅥbI4灭活苗组的抗体水平比LaSota组高2个滴度，表明ⅥbI4灭活苗在预防鸽新城疫方面明为优于LaSota（图6）。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  扬州大学

 

<120>  基因Ⅵb亚型新城疫病毒致弱株ⅥbI4及其构建方法

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gtgatgtact cggaccttct gtgcttgt                                        28

 

 

<210>  2

<211>  37

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ataaggcgcc cttgcctccc tcctcctgat gtggaca                              37

 

 

<210>  3

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

acatcaggag gagggaggca agggcgcctt at                                   32

 

 

<210>  4

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

tcagtctttg aatacatgca ggctgatg                                        28

 

 

Claims (4)

1.基因Ⅵb亚型鸽源新城疫病毒致弱株ⅥbI4，它的保藏号CGMCC No：6149 。

2.权利要求1所述基因Ⅵb亚型新城疫病毒致弱株ⅥbI4株的构建方法，其特征在于：对含有鸽源新城疫病毒JS/07/04/Pi基因组全长的转录载体pTVT/071204中的 F基因进行致弱突变后，得到F基因致弱后的转录载体ApTVT/071204，再利用基因重组的方法将新城疫病毒rNDV/I4的NP、P和L基因片段替换ApTVT/071204基因组的对应部分，得到重组质粒ApTVT/ⅥbI4，该质粒与辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞后获得重组病毒ⅥbI4。

3.根据权利要求2所述基因Ⅵb型新城疫病毒致弱株ⅥbI4的构建方法，其特征在于包括以下具体步骤：

1）新城疫病毒JS/07/04/Pi株的F蛋白致弱突变

构建阳性质粒APF：分别从JS/07/04/Pi株基因组的4107 nt ~4903 nt，4871 nt ~5676 nt位置通过Overlap PCR克隆出部分F基因片段，在质粒pCR2.1 载体中相连，获得阳性质粒APF；

分别将APF与P34用AflⅡ和Bsu36Ⅰ进行双酶切后，回收目的片段，连接构建成AP34；将质粒AP34与P58用BstBⅠ和XbaⅠ双酶切，回收目的片段后连接成中间质粒AP38，最后将AP38用AgeⅠ和MluⅠ双酶切后替换pTVT/071204的对应序列，构建出重组质粒ApTVT/071204，

两对突变引物分别是：

APF1  5'  GTGATGTACTCGGACCTTCTGTGCTTGT  3'

APF2  5' ATAAGGCGCCCTTGCCTCCCTCCTCCTGATGTGGACA  3'

APF3  5'  ACATCAGGAGGAGGGAGGCAAGGGCGCCTTAT  3'

APF4  5'  TCAGTCTTTGAATACATGCAGGCTGATG  3'

2）重组病毒ⅥbI4株的拯救

由于rNDV/I4和JS/07/04/Pi病毒基因组的2880bp和9520bp位置均有相同的单酶切位点AgeⅠ和FspAⅠ，因此，将含有rNDV/I4基因组的转录载体pNDV/I4和ApTVT/071204以AgeⅠ和FspAⅠ同时进行双酶切后，回收ApTVT/071204小片断、pNDV/I4大片段，连接成重组质粒ApTVT/ⅥbI4；

将质粒ApTVT/ⅥbI4与pCI-NP、pCI-P和pCI-L 三个真核表达质粒共转染BSR-T7/5 细胞，转染18h后加入终浓度为10%的SPF鸡胚尿囊液，转染60h后将转染样品接种9~11日龄SPF鸡胚，即获得基因Ⅵb亚型新城疫病毒致弱株ⅥbI4。

4.根据权利要求3所述基因Ⅵb亚型新城疫病毒致弱毒株ⅥbI4株的构建方法，其特征在于步骤1）中通过APF1+APF2和APF3+APF4两对突变引物分别扩增APFa和APFb两个片段，凝胶电泳回收APFa和APFb，用引物APF1和APF4将以上两个扩增片段通过Overlap PCR方法相连，得到裂解位点产生突变的扩增片段APF，将其连接到中间质粒中得到AP38，利用AP38中含有的Age I和MluⅠ，替换转录载体pTVT/071204上的对应部分从而获得了突变后的质粒ApTVT/071204。

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