CN116004552B - 一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF及其应用与疫苗 - Google Patents

一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF及其应用与疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明“一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX‑mF及其应用与疫苗”属于兽用生物制品领域。所述一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX‑mF的保藏编号为CGMCC NO.45221。本发明还请求保护保藏编号为CGMCC NO.45221的一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX‑mF在制备鸽副粘病毒Ⅰ型疫苗方面的用途以及基于该弱毒疫苗株rGX‑mF的疫苗。本发明提供的弱毒疫苗株rGX‑mF制备的疫苗免疫鸽的抗体滴度平均值最高可达8.8log2，免疫抗体保护期至少可达12个月。

Description

一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF及其应用与疫苗
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF及其应用与疫苗。
背景技术
鸽Ⅰ型副黏病毒（Pigeon paramyxovirus type I,PPMV-I），又称鸽新城疫，鸽瘟，其临床症状与鸡新城疫相似，常见肠炎、下痢和神经症状，尤以嗜神经速发型多见。各年龄段鸽均易感染，发病率可达80%，死亡率可达50%以上。ND在世界范围内呈地方流行，因此世界各国对该疫病的发生和流行均高度重视。
新城疫在世界范围内曾有过四次大流行。其中第三次大流行是由鸽子引起的，始于上世纪七十年代晚期。经过前两次大流行，新城疫对世界绝大多数国家的养禽业造成了巨大的经济损失。虽然世界各国充分认识到新城疫的危害程度，促进了新城疫疫苗的研发和开发，免疫预防策略得到高度重视，但是赛鸽、观赏鸽和肉鸽等作为新城疫强毒的潜在来源则被忽视。正因为如此，鸽子作为媒介在短时间里把NDV传播到世界各国，造成了第三次大流行，此次流行主要归咎于赛鸽。到目前为止，除了主要的NDV基因Ⅶ型流行株外，其他基因型的毒株依然存在。
新城疫作为一种长期严重危害养禽业的重大疫病。选择科学、合理的防控策略，对有效控制本病具有重要意义。目前常规的新城疫疫苗主要是弱毒疫苗和灭活疫苗，包括I系疫苗（Mukteswar株）、II系疫苗（Hitchner B1）、III系疫苗（F株）、IV系疫苗（LaSota株与Clone30株）和V4疫苗株，由于市场上的这些新城疫疫苗主要为防控鸡新城疫而开发，虽然在实际应用中这些疫苗能为鸽提供一定的免疫保护，但是效果不佳，经常出现免疫过的鸽场散发鸽新城疫的现象。其主要原因是由于疫苗毒株与流行毒株之前存在抗原差异。PPMV-I为基因Ⅵ型，在系统进化树上形成了一个独立的分支，而疫苗株主要属于基因I、II和III等基因型，其与基因Ⅵ型的鸽新城疫病毒遗传关系较远，存在明显的抗原差异性；另外，交叉血凝抑制试验和交叉中和实验表明PPMV-I与常用的疫苗LaSota株和强毒株之间存在显著的抗原差异，表明了基因Ⅵ型的鸽新城疫病毒抗原发生了变异。用于疫苗免疫的毒株与流行毒株基因型越接近，保护效果越好，群体带毒和排毒量越低。
中国发明专利申请CN113736800A提供了一株基于对LaSota株的F蛋白和HN蛋白的基因所在基因组序列进行替换或突变修饰的、保藏编号为：CGMCCNo .21900的鸽源新城疫病毒重组弱毒疫苗株rLa-VI-QH17，虽然该疫苗株具有高生长滴度和低致病力，其产生的HI抗体滴度平均值为8.5log2，但其产生的免疫抗体保护期仅3个多月，对于需要发挥长效免疫保护的养禽业而言是远远不够的。同时保护期过短还会带来需要定期接种、多次接种等一系列问题，造成家禽应激反应以及增加养禽业的接种成本。
发明内容
针对本领域现有技术存在的上述问题和不足，本发明的目的在于提供一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株，其在具备高生长滴度和低致病力的同时还能维持较长时间的免疫抗体保护期，从而解决现有技术中缺乏鸽新城疫疫苗产品的问题。
本发明的技术方案如下：
一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF，其保藏编号为CGMCC NO. 45221。
保藏编号为CGMCC NO. 45221的一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF在制备鸽副粘病毒Ⅰ型疫苗方面的用途。
将鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF富集扩繁得到的病毒液灭活制得。
所述富集扩繁指，将鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF接种鸡胚并孵育；
优选地，所述灭活指，在病毒液中加入体积浓度0.1％的甲醛溶液于160转、37℃灭活16h。
所述孵育指37℃孵育120h。
所述鸡胚指9～11日龄SPF鸡胚，接种量为每个鸡胚接种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF稀释液0.1ml。
所述鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF稀释液指：用灭菌生理盐水将鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF稀释10000倍所得的稀释液；
优选地，所述疫苗为油佐剂灭活疫苗。
一种鸽副粘病毒Ⅰ型疫苗，包括抗原免疫活性成分，所述抗原免疫活性成分来自保藏编号为CGMCC NO. 45221的一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF。
所述的一种鸽副粘病毒Ⅰ型疫苗还包括：疫苗佐剂。
所述疫苗佐剂为油佐剂。
作为优选，所述的鸽源新城疫病毒重组弱毒疫苗株，为鸽副粘病毒Ⅰ型致弱毒株rGX-mF，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2022年7月1日，保藏编号为：CGMCC NO. 45221。
本发明的再一个目的是提供所述的鸽副粘病毒Ⅰ型重组疫苗株在制备疫苗中的应用；
所述的疫苗为灭活疫苗，是通过甲醛对弱毒疫苗株进行灭活。
本发明提供的鸽副粘病毒Ⅰ型重组疫苗株是利用分子生物学手段重组构建的一系列重组候选毒株接种鸡胚传代多次筛选得到的优良弱毒疫苗株。该重组疫苗株在鸡胚中具有高生长滴度和低致病力的生物学特性，遗传稳定，对鸽副粘病毒Ⅰ型具有良好的免疫保护效果，并能有效抑制排毒，最关键的是，基于本发明提供的鸽副粘病毒Ⅰ型重组疫苗株制备得到的鸽副粘病毒Ⅰ型疫苗免疫后的保护期长达12个月，比现有技术整整提高3倍。本发明的鸽副粘病毒Ⅰ型重组疫苗株能够用于防控目前流行的鸽副粘病毒Ⅰ型，对保障鸽养殖业的健康发展具有重要的意义。
本发明鸽副粘病毒Ⅰ型致弱毒株rGX-mF保藏信息如下：
保藏名称：rGX-mF
保藏号：CGMCC No.45221
分类命名：鸽副粘病毒Ⅰ型致弱毒株
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号
保藏日期：2022年7月1日。
附图说明
图1是本发明实验例2提供的rGX-mF与LaSota灭活疫苗免疫产生抗体滴度的差异对比，图中的标记含义如下：rGX-mF代表本发明rGX-mF疫苗株免疫组，LaSota代表LaSota灭活疫苗免疫组。
图2是本发明实验例2提供的疫苗株的攻毒保护性试验结果图；图中的标记含义如下：control代表PBS对照组，LaSota代表LaSota灭活疫苗免疫组，rGX-mF代表本发明rGX-mF疫苗株免疫组。
图3是本发明实验例2提供的rGX-mF灭活疫苗抗体水平持续期；图中的标记含义如下：control代表PBS对照组，rGX-mF代表本发明rGX-mF疫苗株免疫组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的详细内容做进一步具体描述，但并不以此限制本发明的保护范围。
生物材料的来源
本发明实验例1使用的鸡胚、雏鸡，实验例2使用的鸽均可商购获得。
第1组实施例、本发明的弱毒疫苗株rGX-mF
本组实施例提供一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF，其保藏编号为CGMCCNO. 45221。
任何单位、组织、个人未经申请人许可使用、培养、富集、扩繁、复制、接种、销售、许诺销售、生产保藏编号为CGMCC NO. 45221的鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF的行为均落入本发明的保护范围。
第2组实施例、本发明的弱毒疫苗株rGX-mF的新用途
本组实施例提供保藏编号为CGMCC NO. 45221的一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF在制备鸽副粘病毒Ⅰ型疫苗方面的用途。
本领域技术人员可根据本发明的教导，采取《生物技术制药》等工具书中记载的疫苗领域常规技术手段，将保藏编号为CGMCC NO. 45221的一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF，制成可用的疫苗制剂。
在一些实施例中，将鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF富集扩繁得到的病毒液灭活制得。
在另一些实施例中，所述富集扩繁指，将鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF接种鸡胚并孵育；
优选地，所述灭活指，在病毒液中加入体积浓度0.1％的甲醛溶液于160转、37℃灭活16h。
在具体的实施例中，所述孵育指37℃孵育120h。
在一些实施例中，所述鸡胚指9～11日龄SPF鸡胚，接种量为每个鸡胚接种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF稀释液0.1ml。
在更具体的实施例中，所述鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF稀释液指：用灭菌生理盐水将鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF稀释10000倍所得的稀释液；
优选地，所述疫苗为油佐剂灭活疫苗。
第3组实施例、本发明的疫苗
本组实施例提供一种鸽副粘病毒Ⅰ型疫苗。本组实施例都具备如下共同特征：所述鸽副粘病毒Ⅰ型疫苗包括抗原免疫活性成分，所述抗原免疫活性成分来自保藏编号为CGMCCNO. 45221的一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF。
在进一步的实施例中，所述的一种鸽副粘病毒Ⅰ型疫苗还包括：疫苗佐剂。
在一些实施例中，所述疫苗佐剂为油佐剂。
所述疫苗佐剂还可采用其它药学上可接受的辅料，例如，溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
本发明最具体的实施例通过分子生物学技术手段构建获得一株鸽Ⅰ型副黏病毒重组弱毒疫苗株，并经相关实验验证该疫苗株具有较高的生长滴度和较低的致病力，同时能获得长达12个月的免疫抗体保护期，申请人将该疫苗株命名为rGX-mF，并送保藏，其保藏编号为CGMCC NO. 45221。
本发明的再一个目的是提供所述的鸽Ⅰ型副黏病毒重组弱毒疫苗株rGX-mF的应用。
上述表达LaSota病毒F蛋白基因重组弱毒疫苗株rGX-mF的生物制品属于本发明的保护范围。
本发明的疫苗株rGX-mF能够使病毒毒力降低，毒株的安全性更好。
本发明设计的鸽Ⅰ型副黏病毒重组疫苗株rGX-mF在鸡胚上表现出了优异的生长特性，同时，具有更好的免疫原性。
所述的疫苗为灭活疫苗，是通过甲醛对弱毒株进行灭活。
免疫保护实验结果表明，重组疫苗株rGX-mF制备的灭活疫苗对鸽只安全且无副反应；免疫30-60日龄雏鸽，28天后可诱导高水平的保护性抗体。免疫28天后用鸽新城疫病毒GX强毒株进行攻毒，免疫rGX-mF鸽只未出现任何发病症状或者死亡，免疫保护率达到100％。免疫攻毒后第3、5、7、10天，免疫rGX-mF组鸽只的口咽及泄殖腔拭子均未检测出排毒，而免疫LaSota组与攻毒对照组则出现不同程度的发病率、死亡率以及拭子病毒排毒检出率。
下面结合具体实验例对本发明做进一步的说明。
下述实验例中所记载的具体实验方法，若未特别指明，均为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。
实验例1、本发明的疫苗株rGX-mF的获取
本发明在毒株GX株的基础上进行多种方式的分子生物学手段改造获得rGX-mF候选株，该毒株可以在9～11日龄SPF鸡胚中稳定连续传代。测定其与亲本毒GX和rGX的EID50、MDT和ICPI，比较病毒的毒力变化情况。表1的试验数据表明，rGX-mF疫苗候选株毒力明显降低，在鸡胚中具有更高生长滴度以及对1日龄雏鸡有更低致病力的生物学特性。因此，本发明构建的rGX-mF疫苗候选株可作为优选疫苗株用于疫苗生产。
表1. 拯救病毒与亲本毒株的生物学特性表
将该疫苗候选株命名为rGX-mF，并送保藏，其保藏信息如下：
保藏名称：rGX-mF
保藏号：CGMCC No.45221
分类命名：鸽副粘病毒Ⅰ型致弱毒株
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号
保藏日期：2022年7月1日。
实验例2、rGX-mF疫苗株对非免疫鸽安全性试验和免疫效果试验
1、灭活疫苗的制备
rGX-mF疫苗株用灭菌生理盐水稀释10 000倍，接种10日龄SPF鸡胚，每胚接0.1mL，置37℃继续孵育。将接种后24h内死胚弃去，24h～120h死胚及时放4℃，收混合样，测定制苗毒的HA效价为210，病毒滴度为109.3EID 50/0.1mL。将测定好效价的新城疫病毒液（死胚和活胚阳性的毒液）导入灭活瓶内，加入终浓度为0.1％的甲醛溶液使其充分混合，置摇床160转，37℃灭活16h。灭活后的病毒原液按常规方法制备油佐剂灭活疫苗。用同样的方法制备LaSota灭活疫苗。
2、灭活疫苗的安全性试验
为测定本发明实施例2拯救的rGX-mF疫苗株对非免疫鸽的安全性，将制备的rGX-mF灭活疫苗免疫30-60日龄非免疫鸽10只，每只肌肉注射疫苗0.2mL，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸽采食、饮水及临床情况。结果显示，鸽免疫后疫苗吸收效果良好，免疫鸽没有出现任何局部和全身的不良反应，鸽的状态完全正常。
3、灭活疫苗的免疫保护性试验
为测定本发明实施例2拯救的rGX-mF疫苗株对非免疫鸽的免疫保护效果，将饲养于隔离器内的非免疫鸽随机分成三组，每组10只，一组为实施例3步骤1所制备的rGX-mF灭活疫苗免疫组，一组为实施例3步骤1所制备的LaSota灭活疫苗免疫组，一组为对照组。免疫组每只鸽子肌肉注射疫苗0.2mL，对照组注射相同剂量的PBS。分别于免疫后28天翅静脉采血分离血清，测定抗体。采血后，用临床分离的基因VI型野毒株强毒GX株攻毒，每只鸽以106.0EID50剂量经胸部肌肉注射途径进行攻毒，隔离器饲养，观察14天，每天记录鸽的发病和死亡情况，攻毒后第3、5、7天，采集鸽子的口咽拭子和泄殖腔拭子接种鸡胚进行病毒分离，检测排毒情况。
结果显示，两组免疫组免疫28天后均可产生一定效价的抗体，rGX-mF灭活疫苗免疫组的抗体效价明显高于LaSota灭活疫苗免疫组，并且差异显著（图1）。
免疫28天攻毒后，rGX-mF灭活疫苗免疫组所有鸽子未出现任何发病或死亡，免疫保护率达到100％；LaSota灭活疫苗免疫组有2只鸽子表现出歪脖、垂翅、拉绿便等新城疫感染症状，有1只鸽子死亡；PBS组所有鸽子均发病，有8只鸽子死亡（表2和图2）。
表2. 疫苗株的攻毒保护性试验结果表
排毒情况显示，免疫rGX-mF灭活疫苗组的鸽子在攻毒后第3、5、7天均未出现排毒现象，而免疫LaSota灭活疫苗组的鸽子排毒率为3/10-7/10，空白攻毒对照组排毒率为7/9-10/10 (表3)。
表3. 攻毒后各组试验鸽排毒检测结果表
注：a攻毒后第5天死亡1只鸽子，第七天总共采集9只鸽子样本。
4、灭活疫苗的免疫持续期
为测定本发明实验例2拯救的rGX-mF疫苗株在非免疫鸽体内产生的抗体消长规律，将饲养于隔离器内的非免疫鸽随机分成两组，免疫组10只和对照组10只。将实施例3步骤1所制备的rGX-mF灭活疫苗免疫鸽子。免疫组的每只鸽子肌肉注射疫苗0.2mL，对照组的每只鸽子肌肉注射0.2mL PBS；两组鸽子分别于免疫后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、16、20、24、28、32、36、40、44、48和52周对鸽子进行翅静脉采血分离血清，测定抗体。结果显示，免疫组在免疫后至52周监测期结束均可产生一定效价的抗体，对照组无抗体（图3）。rGX-mF灭活疫苗免疫组在免疫后第7、8周免疫鸽的抗体水平达到最高，HI抗体滴度平均值为8.8log2，且其在免疫后第52周还可以产生较高的抗体水平，HI抗体滴度平均值为5.6log2。随后，用临床分离的基因VI型野毒株强毒GX株攻毒，每只鸽以106.0EID50剂量经胸部肌肉注射途径进行攻毒，隔离器饲养，观察14天，每天记录鸽的发病和死亡情况，攻毒后第5天，采集鸽子的口咽拭子和泄殖腔拭子接种鸡胚进行病毒分离，检测排毒情况。结果显示，免疫52周后攻毒，rGX-mF灭活疫苗免疫组所有鸽子未出现任何发病或死亡，免疫保护率达到100％，对照组有6只鸽子死亡(表4)。排毒情况显示，免疫rGX-mF灭活疫苗组的鸽子在攻毒后第5天排毒率为1/10，空白攻毒对照组排毒率为10/10 (表5)。说明其免疫抗体保护期至少可达12个月。
表4. 疫苗株的攻毒保护性试验结果表
表5. 攻毒后各组试验鸽排毒检测结果表
综上所述，本发明所制备的鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒灭活疫苗，对免疫鸽具有良好的安全性和保护效果，具有广阔的应用前景。
上述内容仅为本发明创造的优选实施例，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是未脱离本发明技术方案的内容，依本发明创造权利要求及发明创造说明内容对以上实施例所做出的简单变化、等效变化与修饰，均仍属于本发明技术方案涵盖的范围。

Claims (10)

1.一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF，其特征在于，保藏编号为CGMCC NO.45221。
2. 保藏编号为CGMCC NO. 45221的一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF在制备鸽副粘病毒Ⅰ型疫苗方面的用途。
3. 根据权利要求2所述的保藏编号为CGMCC NO. 45221的一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF在制备鸽副粘病毒Ⅰ型疫苗方面的用途，其特征在于，将鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF富集扩繁得到的病毒液灭活制得。
4. 根据权利要求2或3所述的保藏编号为CGMCC NO. 45221的一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF在制备鸽副粘病毒Ⅰ型疫苗方面的用途，其特征在于，所述富集扩繁指，将鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF接种鸡胚并孵育；
和/或，所述灭活指，在病毒液中加入体积浓度0.1％的甲醛溶液于160转、37℃灭活16h。
5. 根据权利要求4所述的保藏编号为CGMCC NO. 45221的一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF在制备鸽副粘病毒Ⅰ型疫苗方面的用途，其特征在于，所述孵育指37℃孵育120h。
6. 根据权利要求4所述的保藏编号为CGMCC NO. 45221的一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF在制备鸽副粘病毒Ⅰ型疫苗方面的用途，其特征在于，所述鸡胚指9～11日龄SPF鸡胚，接种量为每个鸡胚接种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF稀释液0.1ml。
7. 根据权利要求6所述的保藏编号为CGMCC NO. 45221的一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF在制备鸽副粘病毒Ⅰ型疫苗方面的用途，其特征在于，所述鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF稀释液指：用灭菌生理盐水将鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF稀释10000倍所得的稀释液；
和/或，所述疫苗为油佐剂灭活疫苗。
8. 一种鸽副粘病毒Ⅰ型疫苗，其特征在于，包括：灭活的保藏编号为CGMCC NO. 45221的一种鸽副粘病毒Ⅰ型重组弱毒疫苗株rGX-mF。
9.根据权利要求8所述的一种鸽副粘病毒Ⅰ型疫苗，其特征在于，还包括：疫苗佐剂。
10.根据权利要求9所述的一种鸽副粘病毒Ⅰ型疫苗，其特征在于，所述疫苗佐剂为油佐剂。
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