CN105936893A

CN105936893A - 鸽1型副粘病毒毒株af-1及其应用

Info

Publication number: CN105936893A
Application number: CN201610361716.3A
Authority: CN
Inventors: 陈博
Original assignee: Wuhan Batis Biological Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Batis Biological Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2016-07-14
Filing date: 2016-07-14
Publication date: 2016-09-14

Abstract

本发明公开了一种鸽1型副粘病毒毒株AF‑1及其应用。该毒株为鸽1型副粘病毒AF‑1，其保藏号为：CCTCC NO：V 201613。利用鸽1型副粘病毒毒株AF‑1制备灭活疫苗的方法，首先培养鸽1型副粘病毒毒株AF‑1，得到AF‑1株病毒液，向AF‑1株病毒液中加入β‑丙内酯；灭活得到混合液；再加入吐温‑80得到水相溶液；向白油中加入硬脂酸铝，边加边搅拌直到完全透明为止，再加入吐温‑80得到油相溶液；向油相溶液中缓缓加入水相溶液置于乳化罐内进行乳化；得到灭活疫苗。本发明的灭活疫苗帮助鸽子有效抵抗鸽副黏病毒I型病毒引起的感染，极大的减少损失并促进鸽业的发展。该疫苗安全、有效，能应用于生产实践。

Description

鸽1型副粘病毒毒株AF-1及其应用

技术领域

本发明涉及鸽1型副粘病毒，具体地指一种鸽1型副粘病毒毒株AF-1及其应用。

背景技术

鸽瘟，又称鸽新城疫或巴拉米哥病毒病，由鸽1型副粘病毒(Pigeon Paramyxovirus 1；PPMV-1)引起。该病流行广泛，主要导致鸽下痢、神经症状及死亡等，给全球养鸽业健康发展造成极大的障碍。不同品种、不同龄期的鸽子均易感。一般来说，鸽的发病率可高达80～90％。根据具体免疫状况以及饲养条件，其死亡率大致为30～80％。

由于鸽子不直接影响大多数人的日常生活，并且养殖量相对较小。所以几十年来并没有引起相关行业认识及国家的重视，目前缺乏针对鸽新城疫的专用疫苗用于预防控制。长期以来，鸽子养殖户大量使用鸡源的新城疫疫苗进行免疫。虽然鸽1型副粘病毒与鸡新城疫病毒同属副粘病毒，但由于其基因型存在差异，保护效果差强人意。随着中国赛鸽运动的快速发展，每年因赛鸽感染鸽新城疫而造成了无法挽回的巨大经济损失。

因此，迫切需要开发一种针对性的鸽新城疫疫苗。大的减少损失并促进鸽业的发展。

发明内容

本发明的目的是提供了一种鸽1型副粘病毒毒株AF-1及其应用。本发明利用鸽1型副粘病毒毒株AF-1制备针对鸽瘟的效价稳定的灭活疫苗；该灭活疫苗帮助鸽子有效抵抗鸽副黏病毒I型病毒引起的感染，极大的减少损失并促进鸽业的发展。

为实现上述目的，本发明提供的一种鸽1型副粘病毒毒株AF-1，毒株为鸽1型副粘病毒AF-1，其保藏号为：CCTCC NO：V 201613。

上述毒株是2014年11月从安徽阜阳某鸽场的病死鸽中分离得到，经反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，连接基因测序鉴定该病毒确为鸽1型副粘病毒(Pigeon Paramyxovirus-1，PPMV-1)。申请人将该病毒株命名为鸽1型副粘病毒AF-1株(PPMV-1AF-1株)。并将该病毒于2016年3月10日保藏于中国武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为：CCTCC NO：V 201613。

进一步地，所述毒株AF-1的形态学特征为：在电子显微镜下，PPMV-1病毒颗粒呈多形性，直径约为100～250nm，有不同长度的细丝；有囊膜，在囊膜的外层有呈放射状排列的突起物或称纤突；具有能刺激宿主产生抑制红细胞凝集素和病毒中和抗体的抗原成分病毒粒子以圆形为主，常因囊膜破损而呈现多形性；粒子内部含义直径为16～20μm的卷曲状的核衣壳，其表面覆盖有6～10nm长的纤突。

本发明还提供了一种上述鸽1型副粘病毒毒株AF-1在制备防治鸽副黏病毒I型病毒引起地鸽瘟的疫苗中应用。

本发明还提供了一种利用鸽1型副粘病毒毒株AF-1制备灭活疫苗的方法，包括以下步骤：

1)培养鸽1型副粘病毒毒株AF-1，得到AF-1株病毒液，其中，病毒液中，AF-1株病毒含量为10^7.0EID₅₀/0.1mL；

2)向步骤1)中得到的AF-1株病毒液中加入β-丙内酯；边加边混合，直至混合均匀，灭活得到混合液；

3)取注射用白油94份，加硬脂酸铝2份，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-80 6份，混合后，高压灭菌备用。；

4)按体积比96∶4混合液中加入吐温-80，充分混匀，直到完全溶解，得到水相溶液；

5)按体积比1∶2取水相溶液和油相溶液，然后向油相溶液中缓缓加入水相溶液置于乳化罐内进行乳化；得到灭活疫苗。

进一步地，所述步骤1)中，毒株AF-1培养过程中，是将鸽1型副粘病毒毒株AF-1置于SPF鸡胚进行培养。

再进一步地，所述步骤2)中，AF-1株病毒液与β-丙内酯体积比为2000∶1，再进一步地，所述步骤2)中，灭活温度为4℃，时间为8h。

本发明的有益效果在于：

1)本发明的毒株是从目前的流行毒株中筛选而出，具有免疫原性好、增殖滴度高的特点。通过最佳接种量、最优培养温度、最适收毒时间等条件的优化，可生产出效价稳定的鸽1型副黏病毒。本发明还对该灭活疫苗的生产工艺、安全性、免疫保护效果、免疫程序和保存期等研究做了评价，结果表明该疫苗安全、有效，能应用于生产实践。

2)本发明利用AF-1株制备的灭活疫苗经皮下注射能够在鸽体内产生非常高的抗体水平，并且帮助鸽子有效抵抗鸽副黏病毒I型病毒引起的感染，保护效率高达90％以上。经免疫的鸽子，未发现明显的不适反应，因此具有良好的安全性。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1病毒的分离与鉴定

从安徽某养鸽场采集病死鸽内脏组织经过RNA提取后经RT-PCR方法检测后确定为鸽副黏病毒1型，将该病毒株命名为鸽副黏病毒PPMV-1AF-1株。具体操作步骤如下：

1、鸡胚增殖

将病料处理液加入双抗(最终浓度为10000U/ml)，于33～35℃孵育30分钟后，经绒毛尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，每份病料接种4鸡胚枚，每胚0.2ml。接种的鸡胚置33～35℃孵育96小时，湿度保持为60～65％，定时照蛋。24小时内死亡的鸡胚弃去。取24～96小时死亡和存活的鸡胚置2～8℃冷却过夜或-20℃以下冷却1～2小时，无菌收集尿囊液，12000转/分钟离心10分钟，以去除红细胞和大的杂质，取上清进行红细胞凝集(HA)试验。对于第一代尿囊液为阴性的取上清按以上方法继续接种SPF胚盲传三代，如仍为阴性则弃之，阳性置-70℃以下保存备用。

2、红细胞凝集(HA)试验向微量血凝板中加入25μl PBS，共做3组平行重复。吸取25μl尿囊液并加入到第一列各孔，然后从左到右进行2倍系列稀释至第11列各孔，从第11列各孔吸取25μl混合液，弃去。第12列各孔不加抗原，作为对照孔。然后向每孔中加入25μl 1％红细胞悬液。将板震荡1分钟，然后室温静置25～30分钟，判定结果。

3、病毒RNA的提取，cDNA的合成以及基因的扩增

3.1、病毒RNA的提取

将已研磨好的病料6000rpm离心5min，取上清200μL，加入1.5ml的EP管中，每管加入1ml RNAiso Reagent，用移液器吹打均匀后室温静置10min；每管加入200μL的三氯甲烷，涡旋仪混匀，置冰浴10min后，4℃，12000rpm，离心10min。取600μL上清转移至新的离心管中，并加入等体积的异丙醇，涡旋仪混匀后室温静置10min。4℃，12000rpm，离心10min。弃上清(除净异丙醇)，沿离心管壁缓缓加入1ml无水乙醇，反复颠倒混匀，7800rpm，5min。将除去乙醇的基因组RNA沉淀在室温下干燥5-10min，缓慢加入适量的DEPC水(20-50μL)溶解基因组RNA。

3.2、I型副粘病毒cDNA的合成

反转录用的引物序列Uni12(单链)：5’-AGCAAAAGCAGG-3’；鸽副黏病毒cDNA合成：

在20μL反转录体系中进行，依次加入以下组分：

将上述试剂或酶混匀后置PCR仪上，于42℃下反应60min，95℃下反应5min进行反转录，反应产物直接用于PCR或于4℃下保存备用。

3.3、I型副粘病毒的PCR鉴定

根据鸽副黏病毒1型F基因设计引物，引物序列：

上游引物：5’-ccatgggctccaaaccttct-3’；

下游引物：5’-ggtcatgtt cttgtagtgg-3’。

采用20μL体系进行DNA扩增，反应体系及程序如下：

PCR酶	0.2μL
		PCR酶Buffer	2μL
dNTP	2μL
		上游引物	1μL
下游引物	1μL
		DNA模板	2μL
DEPC水	11.8μL

PCR反应参数：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃3min，30个循环；72℃延伸10min。F基因的扩增结果分别见图1，将PCR产物纯化后连接pMD18-T载体(购自宝生物工程大连有限公司，其载体图谱见宝生物工程大连有限公司的pMD18-T载体说明书)。

4、病毒的保藏

发明人对该毒株(AF-1株)进行了生物保藏。保藏单位为：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为：CCTCC NO：V 201613。

实施例2灭活疫苗1的制备

1、病毒含量测定

将病毒液用灭菌的生理盐水作10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-83个稀释度尿囊腔内接种10日龄的SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，0.1ml/胚，记录24～120小时鸡胚感染情况，计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量应≥10^7.0EID₅₀。经测定，收获尿囊液混合后EID₅₀见下表：

表1 Reed-Muench法计算EID₅₀结果

计算方法如下：

lgEID₅₀＝高于50％感染的病毒最高稀释度的对数+距离比例×稀释度之间的差。

距离比例＝0.78

lgEID₅₀＝-7+(-1×0.78)＝-7.78

则EID₅₀＝10^-7.78/0.1ml

2、病毒灭活

将上述胚液以4层纱布及一层细铜纱网滤过，混合于一个大玻璃瓶内。然后按0.05％加入β-丙内酯，随加随摇，使其充分混合。然后在4℃灭活(以瓶内温度达到4℃开始计时)8小时。

3、灭活检验

取10日龄SPF鸡胚5个，0.2m1/胚，接种后每日照蛋2次，观察5日，并对所有胚液分别测定血凝价，通过对鸡胚的观察和鸡胚液的血凝价的测定，确定胚液的灭活效果。血凝价低于1:4盼为阴性，阴性再次接种10日龄SPF鸡胚5个，0.2m1/胚，5天后测血凝价，仍为阴性的盼为灭活合格。检测结果见下表：

表2灭活病毒接种-SPF鸡胚后HA效价

4、疫苗乳化

4.1油佐剂灭活疫苗1的制备

4.1油相制备取注射用白油94份，加硬脂酸铝2份，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-80 6份，混合后，高压灭菌备用。

4.2水相制备将灭活的鸽副粘病毒I型AF-1株病毒液96份，加入灭菌的吐温-80 4份，充分摇动，直到吐温-80完全溶解。

4.3乳化取6份油相放入乳化罐内，慢速搅拌同时缓缓加入3份水相，加完后，中速混合，然后高速乳化，制成灭活疫苗。

实施例3

1、疫苗安全性试验

用21～30日龄鸽副粘病毒I型抗体阴性鸽15只，10只各颈部皮下注射疫苗1ml，另5只作对照。观察14日，应不出现因注射疫苗而引起的局部和全身不良反应。检验结果见表：

表3灭活疫苗超剂量接种21～30日龄鸽副粘病毒I型抗体阴性鸽安全性检测

	接种前	接种后
			免疫组	10/10正常	10/10正常
对照	5/5正常	5/5正常

2、免疫以及攻毒保护力实验

2.1、免疫

用21～30日龄鸽副粘病毒I型抗体阴性鸽15只，10只各颈部皮下注射疫苗200μl，另5只作对照。

2.2、血清抗体检测

接种后21～28日，每只各采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不小于4log2，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应不大于2log2。免疫后21天采血，检测血清抗体，抗体检测HI结果见下表：

表4灭活疫苗免疫后血清抗体检测

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											免疫组	6	5	6	7	6	6	6	5	7	6
对照组	-	-	-	-	--

2.3、攻毒保护力实验

接种后21～28日，每只鸽肌肉注射疫苗病毒AF-1株10^5.0ELD₅₀，观察14日。攻毒后结果见下表：

表5灭活疫苗免疫后攻毒保护结果

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

免疫组

正常

对照组

3天死亡

4天死亡

3天死亡

试验结果表明：该疫苗安全、无可见不良副反应，疫苗抗体产生时间快，抗体效价4log2以上能有效抵抗强毒株AF-1株感染。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种鸽1型副粘病毒毒株AF-1，其特征在于：毒株命名为鸽1型副粘病毒AF-1，其保藏号为：CCTCC NO：V 201613。

2.根据权利要求1所述鸽1型副粘病毒毒株AF-1，其特征在于：所述毒株AF-1的形态学特征为：在电子显微镜下，PPMV-1病毒颗粒呈多形性，直径约为100～250nm，有不同长度的细丝；有囊膜，在囊膜的外层有呈放射状排列的突起物或称纤突；具有能刺激宿主产生抑制红细胞凝集素和病毒中和抗体的抗原成分病毒粒子以圆形为主，常因囊膜破损而呈现多形性；粒子内部含义直径为16～20μm的卷曲状的核衣壳，其表面覆盖有6～10nm长的纤突。

3.一种权利要求1所述的鸽1型副粘病毒毒株AF-1在制备防治鸽副黏病毒I型病毒引起地鸽瘟的疫苗中应用。

4.利用权利要求1所述鸽1型副粘病毒毒株AF-1制备灭活疫苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)培养鸽1型副粘病毒毒株AF-1，得到AF-1株病毒液；

3)取注射用白油94份，加硬脂酸铝2份，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-80 6份，混合后，高压灭菌备用；

5)按体积比1∶2称取水相溶液和油相溶液，然后将油相溶液和水相溶液置于乳化罐内进行乳化；得到灭活疫苗。

5.根据权利要求4所述鸽1型副粘病毒毒株AF-1制备灭活疫苗的方法，其特征在于：所述步骤1)中，毒株AF-1培养过程中，是将鸽1型副粘病毒毒株AF-1置于SPF鸡胚进行培养。

6.根据权利要求5所述鸽1型副粘病毒毒株AF-1制备灭活疫苗的方法，其特征在于：所述病毒液中，AF-1株病毒数量为 10^7.0EID₅₀/0.1mL。

7.根据权利要求4所述鸽1型副粘病毒毒株AF-1制备灭活疫苗的方法，其特征在于：所述步骤2)中，AF-1株病毒液与β-丙内酯体积比为2000∶1。

8.根据权利要求6所述鸽1型副粘病毒毒株AF-1制备灭活疫苗的方法，其特征在于：所述步骤2)中，灭活温度为4℃，时间为8h。