CN101020054A - 防制鸽禽i型副粘病毒病新型灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种防制鸽禽I型副粘病毒病新型灭活疫苗及其制备方法,所述的防制鸽禽I型副粘病毒病新型灭活疫苗,是应用申请人所筛选出的免疫原性强、对流行毒株有高保护率的鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902 CCTCC V200605,接种非免疫鸡胚,再从死胚的胚液中提取PA/PMV-I抗原,将PA/PMV-I抗原灭活后,加入佐剂混配而成。本疫苗对防制鸽禽PA/PMV-I病,特异、安全、有效。
Description
技术领域
本发明涉及防治鸽禽I型副粘病毒病的疫苗及其制备方法。
背景技术
鸽禽I型副粘病毒(PA/PMV-I)病,俗称鸽瘟,又称鸽新城疫,是由禽I型副粘病毒(A/PMV-I)引起鸽的一种高度接触性、败血性的急性传染病。自从20世纪80年代初,在我国部分地区发现以来,现已普遍发生于我国各养鸽地区,且一直是鸽病中发生频率最高、危害性最大的一种疾病,在不同品种、龄期的鸽子中都能感染发病,且传播迅速,发病率高,死亡率一般为20%~80%之间,耐过者常因有神经症状而被迫淘汰,造成了很大的经济损失。此外,本病病原与鸡新城疫的病原(NDV)同属禽副粘病毒,现场发病情况及流行病学的研究证明本病病原对鸡的毒力较弱,NDV也能感染敏感鸽,并使之发病和死亡。因此本病病原对鸡等家禽也是一种严重的潜在威胁。
为防制本病,目前许多鸽场均应用鸡新城疫弱毒(NDV)疫苗或PA/PMV-I同源病毒制备的灭活疫苗免疫接种。应用鸡NDV疫苗免疫鸽群,一般不能获得满意的效果,只能获得低水平保护,保护率仅有20%左右,且免疫期短;而目前以PA/PMV-1同源病毒制备的灭活疫苗免疫,虽能为免疫鸽提供较为持久的免疫保护,但亦有免疫鸽群仍发生PA/PMV-I病。因此,安全、有效的PA/PMV-I疫苗的研究和开发显得非常迫切和重要。
为提高疫苗的免疫保护效果,在疫苗的制备过程中常采用添加免疫系统的调节剂及免疫佐剂。
发明内容
多年来,本申请人在防治禽病的临诊和开展科研工作的基础上,对PA/PMV-I进行了流行病学跟踪调查和现场防治实践,在此过程中从全国多个省市的不同地区、品种、龄期的发病鸽群中成功分离并鉴定到的23株PA/PMV-1中,筛选出1株免疫原性强、对流行毒株有高保护率的疫苗种毒。另外,在对家禽疫苗、抗体、免疫增强剂等生物制剂以及中药制剂等方面,进行了大量的研究,提出了疫苗、佐剂的研制方法和工艺;结果研制出了鸽禽I型副粘病毒病疫苗,经实验室及适度的现场试验,证明本疫苗安全,有效。
本发明的目的就是提出一种安全、有效的防制鸽禽I型副粘病毒病新型灭活疫苗及其制备方法。
本发明所提出的防制鸽禽I型副粘病毒病新型灭活疫苗,是应用申请人所筛选出的免疫原性强、对流行毒株有高保护率的疫苗种毒,该种毒被鉴定命名为:鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902,用该种毒接种非免疫鸡胚,再从死胚的胚液中提取PA/PMV-I抗原,将PA/PMV-I抗原灭活后,加入佐剂混配而制成所述的疫苗。
所述的鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902的相关特性测定结果如下:
1.1种毒的特性测定:
本病毒属副粘病毒科,为RNA病毒,电镜下观察病毒呈圆形、椭圆形或不规则的病毒粒子,在电镜下为有纤突的病毒粒子,直径均为120~200nm。对理化因素的抵抗力不强,经紫外线照射或在100℃条件下1min,55℃时20~60min可全部被灭活。对氯仿、乙醚、胰酶及酸敏感,能被二价镁离子保护。病毒的囊膜上具有HN纤突,具有凝集红细胞的能力,能凝集鸡、鸭、鹅、鸽、人、猪、牛、羊、豚鼠、小白鼠的红细胞。本病毒可在鸡(鸭)胚中繁殖,尿囊腔接种9~11日龄的易感鸡胚,37℃培养72h~96h,可致死鸡胚,收获胚液测定HA效价≥7log2。分别取抗NDV、AI-H5、AI-H9和EDSV血清抗体,4~8个血凝单位的本病毒液为抗原,作HI试验,结果表明,本病毒能被抗NDV血清所抑制,而不能被抗AI-H5、AI-H9、AI-H7和EDSV血清抗体所抑制。
本病毒接种SPF鸡胚成纤维细胞单层后,44~48h出现细胞病变,形成多核巨细胞;空斑试验结果表明,分离毒于接种5d后形成3种大小不同的空斑,随着时间的延长,空斑日渐增大,最后连成一片。于接种7d后测量空斑大小为:大斑2.0~2.5mm,中斑1.3~1.8mm,小斑0.5~1.0mm。
1.2种毒毒力测定
1.2.1攻毒用种毒,选用本种毒毒株的原代毒,经SPF鸡胚传代,毒力在第6~13代内不变,用其200个ELD50/0.2ml经肌肉注射攻击1月龄非免疫乳鸽(无特异抗体),结果为乳鸽出现明显症状和病变,并有死亡。其鸡胚半数致死量(ELD50)分别为10-8.34/0.2ml,鸡胚平均致死时间(MDT)为104h,1日龄SPF雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.38,六周龄雏鸡静脉接种致病指数(IVPI)分别为2.0。
1.2.2制苗用种毒
选用本病毒,经SPF鸡胚传代,在第20~28代内毒力不变,用其200个ELD50/0.1ml分别经肌肉注射攻击1月龄非免疫乳鸽(无特异抗体)结果为乳鸽出现明显症状和病变,并有死亡。其鸡胚半数致死量(ELD50)分别为10-8.34/0.2ml、10-8.52/0.2ml、10-7.80/0.2ml,鸡胚平均致死时间(MDT)分别为96h,106h,98.4h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)分别为1.58、1.56、1.43,六周龄雏鸡静脉接种致病指数(IVPI)分别为2.21、2.30、1.95。
1.2.3种毒纯净 毒种没有细菌、霉菌、支原体、禽流感及其它外源病原污染。
1.2.4种毒保存 湿毒:在-30℃不超过12个月,-15~-20℃不超过6个月;
冻干毒:在-30℃不超过24个月,-15~-20℃不超过18个月。
所述的鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902已于2006年9月8日寄交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏编号为:CCTCC NO:V200605。
本发明所述的新型灭活疫苗,所用的佐剂为油乳佐剂、蜂胶佐剂或中药复方佐剂。
所述的油乳佐剂,其组份包括白矿油、吐温-80、司本-80和硬脂酸铝,其中,白矿油、吐温-80、司本-80的配比按体积百分比计为:白矿油93%~96%、吐温-80 2%~3%、司本-802%~4%,硬脂酸铝占油乳佐剂总重量的1~3%。将各组分混配,煮溶后,高压灭菌。
所述的蜂胶佐剂,为纯蜂胶的95%乙醇浸液,浸液中蜂胶的质量浓度为10~50%。
所述的中药复方佐剂,其原料药的重量份配比为:黄芪1~3份、扶芳藤1~3份、党参1~3份、灵芝1~3份和蜂胶0.01~0.03份,由所述的黄芪、扶芳藤、党参和灵芝提纯浸液与蜂胶95%乙醇浸液混配而成。
本发明所述的新型灭活疫苗的制备方法,包括下列步骤:
a)PA/PMV-I抗原的培养:将鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902 CCTCC V200605用无菌生理盐水作适当稀释,使每0.1ml~0.5ml含毒量约104.0~5.0EID50,尿囊腔接种10~11日龄非免疫鸡胚,每胚0.2ml,37℃孵育48~96小时,24小时前死胚为非特异性死亡废弃,收获24小时以后的死亡的胚液,测定其HA效价,取HA效价27~9的鸡胚液,即得PA/PMV-I抗原,分装,-15℃~-20℃保存备用;
b)PA/PMV-I抗原的灭活:在每1000ml鸡胚液中加入1ml~3ml甲醛含量为37%~40%的福尔马林溶液,并将其转入另外的高压消毒瓶中,置摇床上37℃灭活48小时,即为灭活抗原,按常规进行灭活效果检验;
c)将灭活抗原配入佐剂而成灭活疫苗。
在上述步骤c)中,如应用所述的油乳佐剂,其制备方法是:将灭活抗原与所述的油乳佐剂按1∶1~2比例混合均匀,再倾入匀浆泵乳化,无菌及安全检查后,分装,即成为油乳剂灭活疫苗。
在上述步骤c)中,如应用所述的蜂胶佐剂,其制备方法是:按每1000毫升灭活抗原中加入所述的蜂胶佐剂20~50毫升,混合均匀,再倾入匀浆泵乳化,无菌及安全检查后,分装,即成为蜂胶佐剂灭活疫苗。
在上述步骤c)中,如应用所述的中药复方佐剂,其制备方法是:将灭活抗原与所述的中药复方佐剂混悬液按重量比1∶1~1.5混合,后将灭菌吐温-80加入混悬液中,灭菌吐温-80的加入量为混悬液重量的1%~2%,搅拌混合均匀,再倾入匀浆泵乳化,无菌及安全检查后,分装,即成为纯中药复合佐剂灭活疫苗。
本发明从生产实际出发,应用经筛选出的抗原性良好的1株地方流行病毒,作为制苗用种毒,辅以免疫佐剂(包括白矿油佐剂、蜂胶佐剂、复合中药免疫佐剂)研制成一系列安全、有效的灭活疫苗。研制的蜂胶佐剂、复合中药免疫佐剂PA/PMV-I灭活疫苗,均具有不损伤鸽体,易被机体吸收,在接种部位不会形成硬结,不影响胴体品质,且易于组织规模生产及成本低的优势。既适用于紧急免疫接种和受威胁区小日龄后备种鸽的免疫接种,也适用于种鸽的免疫。使之成为对防制鸽PA/PMV-I病,具有特异、效佳、安全、使用方便的新型系列灭活疫苗。
本发明达到的技术效果如下:
1、灭活疫苗的安全性试验
1.1取以上三种疫苗各5批,分别以单(0.5ml/羽份)免疫剂量,肌肉或颈皮下各接种10只30日龄非免疫鸽和10只1年龄非免疫产鸽,观察接种免疫鸽的反应,观察期15天。结果表明,接种鸽食欲、精神状况正常,均无不良反应。
1.2取以上三种疫苗各5批,分别以4倍(2ml/羽份)免疫剂量,肌肉或颈皮下各接种10只30日龄非免疫鸽和10只1年龄非免疫产鸽,观察接种免疫鸽的反应,观察期15天。结果表明,接种鸽食欲、精神状况正常,均无不良反应。
2、灭活疫苗的免疫效力试验
取30日龄非免疫鸽1320只,随机分成4个试验组,第1组(330只)肌肉接种中药佐剂灭活苗0.5ml/只,第2组(330只)肌肉接种蜂胶佐剂灭活苗0.5ml/只,第3组(330只)肌肉接种油佐剂灭活苗0.5ml/只,第4组(330只)不进行疫苗免疫以作为对照。在免疫前后定期(免疫前1天及免疫后3天、6天、9天、14天、21天、35天、60天、90天、120天、150天、180天)抽血1ml分离血清,用鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902为抗原,按常规微量法分别测定其HI价,其HI价结果判定以完全抑制血凝的最高稀释度为终点,以Xlog2表示,每次测定均重复一次,取平均值。并于免疫后7天、14天、21天、35天、90天、120天、150天、180天,4个组各随机抽取20只,用鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902强毒(200个ELD50/0.1ml)进行攻击,隔离饲养,连续观察25天,以检测其免疫保护效果。试验结果表明,使用中药复合佐剂、蜂胶佐剂和油佐剂苗免疫后6天即可检出抗体,14天至30天维持最高峰(10.8~11.5log2),6个月仍能维持较高的抗体水平(6.9log2),且没有油苗的难于注射和局部形成硬结的问题。在实验室内,中药复合佐剂苗、蜂胶佐剂苗和油佐剂苗于免疫后21天、60天、90天、120天、150天、180天分别用强毒株200个ELD50/0.1ml攻击,其保护指数分别为100%、100%、100%、94.4%、88.9%、83.5%;100%、96.7%、90.2%、83.7%、83.0%、80.2%和100%、100%、94.2%、83.7%、82.7%、81.1%。疫苗免疫21天后,用强毒攻击,均可得到100%的保护;此时,检测其血清抗体HI价,平均(10.5log2~11.5log2)log2以上。根据“HI抗体效价与攻毒保护率平行关系的试验报告”我们制定为免疫21天后测定HI效价平均应≥6log2。
3、灭活疫苗的保存期试验
将批号为200305的蜂胶佐剂灭活苗、中药复方佐剂灭活苗和油佐剂灭活苗分别分成10小瓶,10毫升/瓶,置4℃~8℃冰箱内保存,并分别于第90天、120天和180天抽取保存的疫苗各1瓶,按0.5毫升/只的剂量各免疫30天龄青年鸽10只,于免疫后21天,各抽检HI抗体水平及用鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902强毒(200个ELD50/0.1毫升)攻击,免疫鸽均得到保护,且疫苗的性状和免疫特性不变。个别油佐剂灭活苗保存12个月后表面有少量的白油析出,摇匀后又成为均匀的乳白色油苗,不影响效价。蜂胶佐剂灭活疫苗和中药复方佐剂灭活疫苗保存180天后,瓶底均有少许沉淀,但在使用前摇匀,不影响效价。
4、灭活疫苗的免疫期试验
研制的中药复合佐剂疫苗、蜂胶佐剂疫苗和油佐剂疫苗分别作了180天的免疫攻毒试验,证实其免疫期分别至少6个月以上。在实验室内,使用蜂胶佐剂灭活苗、中药复方佐剂灭活苗、油乳剂灭活疫苗免疫后4天可产生抗体,6~9天即可达较高抗体水平,分别至14天、14天、21天时达最高峰(10.5log2、11.0log2、11.5log2),6个月仍能维持较高的抗体水平(5.9log2、6.2log2、7.2log2),于免疫后21天、30天、60天、90天、180天用强毒株200个ELD50/0.1毫升攻击,其保护指数分别是油佐剂苗为100%、100%、100%、94.4%、94.4%;蜂胶佐剂苗为100%、100%、100%、88.9%、88.9%;中药复方佐剂苗为100%、100%、100%、94.4%、88.9%。在试验过程中,使用本三种疫苗后,均没发生鸽新城疫病毒的感染。
具体实施方式
实施例一
按下述步骤制备防制鸽禽I型副粘病毒病油乳佐剂灭活疫苗:
1、PA/PMV-I抗原的制备
a)PA/PMV-I抗原的培养:将鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902 CCTCC V200605用无菌生理盐水100倍稀释,使每0.5ml含毒量约104.0~5.0EID50,尿囊腔接种10~11日龄非免疫鸡胚,每胚0.2ml,37℃孵育48~96小时,收获24小时以后的死亡的胚液,测定其HA效价,取HA效价27~9的鸡胚液,分装,-15℃~-20℃保存备用;
b)PA/PMV-I抗原的灭活:在每1000ml鸡胚液中加入2ml甲醛含量为37%的福尔马林溶液,并将其转入另外的高压消毒瓶中,置摇床上37℃灭活48小时,即为灭活抗原,按常规进行灭活效果检验;
2、油乳佐剂的制备
将960ml白矿油、20ml吐温-80、20ml司本-80和200克硬脂酸铝配合,煮溶后,高压灭菌,制得油乳佐剂。
3.PA/PMV-I油乳佐剂灭活疫苗的配制
经效价测定调至合格的抗原与油乳佐剂按1∶1.5比例混合均匀,再倾入匀浆泵乳化,无菌及安全检查后,分装,成为油乳剂灭活疫苗。
实施例二
按下述步骤制备防制鸽禽I型副粘病毒病蜂胶佐剂灭活疫苗:
1、PA/PMV-I抗原的制备
a)PA/PMV-I抗原的培养:将鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP19990 CCTCC V200605用无菌生理盐水100倍稀释,使每0.2ml含毒量约104.0~5.0EID50,尿囊腔接科10~11日龄非免疫鸡胚,每胚0.2ml,37℃孵育48~96小时,收获24小时以后的死亡的胚液,测定其HA效价,取HA效价27~9的鸡胚液,分装,-15℃~-20℃保存备用;
b)PA/PMV-I抗原的灭活:在每1000ml鸡胚液中加入1ml~3ml甲醛含量为40%的福尔马林溶液,并将其转入另外的高压消毒瓶中,置摇床上37℃灭活48小时,即为灭活抗原,按常规进行灭活效果检验;
2、蜂胶佐剂的制备
纯蜂胶的95%乙醇浸液,浸液中蜂胶质量浓度为50%。
3、PA/PMV-I蜂胶佐剂灭活疫苗的配制
经效价测定调至合格的抗原每1000毫升中加入蜂胶佐剂20毫升,混合均匀,再倾入匀浆泵乳化,无菌及安全检查后,分装,成为蜂胶佐剂灭活疫苗。
实施例三
按下述步骤制备防制鸽禽I型副粘病毒病纯中药复合佐剂灭活疫苗:
1、PA/PMV-I抗原的制备
a)PA/PMV-I抗原的培养:将鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902 CCTCC V200605用无菌生理盐水100倍稀释,使每0.3ml含毒量约104.0~5.0EID50,尿囊腔接种10~11日龄非免疫鸡胚,每胚0.2ml,37℃孵育48~96小时,收获24小时以后的死亡的胚液,测定其HA效价,取HA效价27~9的鸡胚液,分装,-15℃~-20℃保存备用;
b)PA/PMV-I抗原的灭活:在每1000ml鸡胚液中加入2ml甲醛含量为37%的福尔马林溶液,并将其转入另外的高压消毒瓶中,置摇床上37℃灭活48小时,即为灭活抗原,按常规进行灭活效果检验;
2、纯中药复合佐剂的制备
原料药的重量份配比:纯蜂胶0.01份、黄芪1份、扶芳藤1份、党参1份和灵芝1份,将黄芪、扶芳藤、党参和灵芝的提纯浸液与蜂胶的95%乙醇浸液混配而成纯中药复合佐剂混悬液。
3、PA/PMV-I纯中药复合佐剂灭活疫苗的配制
经效价测定调至合格的抗原后与中药复方佐剂混悬液1∶1~1.5混合,后将灭菌吐温-80按1%~2%加入混悬液中,搅拌混合均匀,再倾入匀浆泵乳化,无菌及安全检查后,分装,成为纯中药复合佐剂灭活疫苗。
上述三个实施例所制得蜂胶佐剂、中药复方佐剂PA/PMV-I灭活疫苗为棕黑色混悬液,均匀度好,粘度低,通针性良好;在4℃下存放2月以上,瓶底可能有少许沉淀,但在使用前摇匀,不影响效价;油乳剂PA/PMV-I灭活疫苗为油包水型乳白色乳剂苗。以上三种疫苗均不含其它病原;无菌;分别以4倍免疫剂量(2ml/只)和单免疫剂量(0.5ml/只),肌肉注射免疫10只30日龄鸽,观察20天,无不良反应,安全,有效。胚液抗原HA效价达27以上。
所制得的PA/PMV-I灭活疫苗的使用方法:
预防:肌肉或皮下注射0.5ml/羽份;
紧急防疫接种:肌肉或皮下注射0.8ml~1.0ml/羽份。
Claims (8)
1.一种防制鸽禽I型副粘病毒病新型灭活疫苗,其特征在于用鸽1型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902 CCTCC V200605接种非免疫鸡胚,再从死胚的胚液中提取PA/PMV-I抗原,将PA/PMV-I抗原灭活后,加入佐剂混配而成。
2.根据权利要求1所述的新型灭活疫苗,其特征在于所述的佐剂为油乳佐剂,其组份包括白矿油、吐温-80、司本-80和硬脂酸铝,其中,白矿油、吐温-80、司本-80的配比按体积百分比计为:白矿油93%~96%、吐温-80 2%~3%、司本-80 2%~4%,硬脂酸铝占油乳佐剂总重量的1~3%。
3.根据权利要求1所述的新型灭活疫苗,其特征在于所述的佐剂为蜂胶佐剂,该佐剂为纯蜂胶的95%乙醇浸液,浸液中蜂胶的质量浓度为10~50%。
4.根据权利要求1所述的新型灭活疫苗,其特征在于所述的佐剂为中药复方佐剂,该佐剂的原料药重量份配比为:黄芪1~3份、扶芳藤1~3份、党参1~3份、灵芝1~3份和蜂胶0.01~0.03份,由所述的黄芪、扶芳藤、党参和灵芝提纯浸液与蜂胶95%乙醇浸液混配而成。
5.权利要求1所述的新型灭活疫苗的制备方法,其特征在于包括下列步骤:
a)PA/PMV-I抗原的培养:将鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902 CCTCC V200605用无菌生理盐水作适当稀释,使每0.1ml~0.5ml含毒量约104.0~5.0EID50,尿囊腔接种10~11日龄非免疫鸡胚,每胚0.2ml,37℃孵育48~96小时,24小时前死胚为非特异性死亡废弃,收获24小时以后的死亡的胚液,测定其HA效价,取HA效价27~9的鸡胚液,分装,-15℃~-20℃保存备用:
b)PA/PMV-I抗原的灭活:在每1000ml鸡胚液中加入1ml~3ml甲醛含量为37%~40%的福尔马林溶液,并将其转入另外的高压消毒瓶中,置摇床上37℃灭活48小时,即为灭活抗原;
c)将灭活抗原配入佐剂而成灭活疫苗。
6.根据权利要求5所述的新型灭活疫苗的制备方法,其特征在于在步骤c)中,将灭活抗原与油乳佐剂按1∶1~2比例混合均匀,再倾入匀浆泵乳化而成油乳剂灭活疫苗,所述的油乳佐剂的组份包括白矿油、吐温-80、司本-80和硬脂酸铝,其中,白矿油、吐温-80、司本-80的配比按体积百分比计为:白矿油93%~96%、吐温-80 2%~3%、司本-80 2%~4%,硬脂酸铝占油乳佐剂总重量的1~3%。
7.根据权利要求5所述的新型灭活疫苗的制备方法,其特征在于在步骤c)中,按每1000毫升灭活抗原中加入蜂胶佐剂20~50毫升,混合均匀,再倾入匀浆泵乳化而制成灭活疫苗,所述的蜂胶佐剂为纯蜂胶的95%乙醇浸液,浸液中蜂胶的质量浓度为10~50%。
8.根据权利要求5所述的新型灭活疫苗的制备方法,其特征在于在步骤c)中,将灭活抗原与中药复方佐剂混悬液按重量比1∶1~1.5混合,后将灭菌吐温-80加入混悬液中,灭菌吐温-80的加入量为混悬液重量的1%~2%,搅拌混合均匀,再倾入匀浆泵乳化而制成中药复合佐剂灭活疫苗,所述的中药复方佐剂的原料药重量份配比为:黄芪1~3份、扶芳藤1~3份、党参1~3份、灵芝1~3份和蜂胶0.01~0.03份,由所述的黄芪、扶芳藤、党参和灵芝提纯浸液与蜂胶95%乙醇浸液混配而成。
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