CN111529702B - 一种中药复合鸡新城疫疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于畜禽用生物疫苗制品技术领域，本发明提供了一种中药复合鸡新城疫疫苗及其制备方法。本发明将鸡新城疫病毒细胞培养液与中药复方佐剂混合，冷冻干燥，粉碎得到中药复合鸡新城疫疫苗，其中所述中药复方佐剂的原料包括黄芪、山楂、佛手、仙鹤草、紫苏和甘草；将所述原料混合、粉碎，得到中药粉末；将所述中药粉末加水浸泡，得到提取液；将提取液浓缩后加入乙醇沉淀，得到中药沉淀，即为中药复方佐剂。本发明提供的中药复合鸡新城疫疫苗能诱导鸡体产生更高的抗体效价，且产生抗体更快，持续时间更长，免疫效果更稳定，且制备方法简单易行。

Description

一种中药复合鸡新城疫疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及疫苗制品技术领域，尤其涉及一种中药复合鸡新城疫疫苗及其制备方法。
背景技术
鸡新城疫是由鸡新城疫病毒(Newcastle DiseaseVirus，NDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，主要侵害鸡和火鸡，但也可导致鸭、鹅等水禽感染发病，该病是严重危害禽业养殖的重要病毒病之一。NDV为单股负链RNA病毒，属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)。近年来，随着养殖规模与饲养环境等条件的改变，NDV的毒力和宿主范围等方面也在不断变化发展。
目前，我国对鸡新城疫的防制主要依靠疫苗免疫接种加以预防。但是现代疫苗普遍存在着免疫原性弱、免疫保护期短等问题，因此，需要配合免疫佐剂来克服。免疫佐剂也称佐剂或抗原佐剂，是一类单独使用时无免疫原性，但与抗原物质合并使用时能增强抗原物质免疫原性，增强机体免疫应答，或改变机体免疫应答类型的物质。常用的免疫佐剂有铝盐佐剂、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、细胞因子以及微生物类免疫佐剂。但是铝盐佐剂不能冻干且批次间差异较大，而且铝盐佐剂还有增加超敏反应的危险；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂会引起慢性肉芽肿和溃疡，且有潜在的致癌作用。因此，研制开发安全有效的新型免疫增强剂是非常必要的。
我国中药资源丰富、品种繁多。据报道，我国中草药的品种达12807种，其中植物药11146种，动物药1581种，矿物药80种，居世界之首，且我国对中医药的研究历史悠久。最重要的是中药来源的天然性和安全可靠性是举世公认的特点。目前对中药佐剂的研究主要集中在单一中药的多糖类物质的研究，例如：研究发现党参多糖、柴胡多糖、黄芪多糖、香菇多糖、当归多糖、玉米花粉多糖、银耳多糖等对鸡新城疫疫苗具有佐剂的效果。多糖类佐剂虽然安全、有效、可靠，是一个很有发展前景的佐剂，但是其提取工艺繁琐、成本高，效果不稳定，因此限制了它的发展。而中药复方是在中医理论指导下按照一定的原则组方应用，其药效远远超过单一药物，且效果稳定，制备工艺简便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种安全、高效、稳定的中药复合鸡新城疫疫苗及其制备方法，通过中药复方增强鸡新城疫疫苗的免疫原性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种中药复合鸡新城疫疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备中药复方佐剂：所述中药复方佐剂的原料包括黄芪、山楂、佛手、仙鹤草、紫苏和甘草；
将所述原料混合、粉碎，得到中药粉末；
将所述中药粉末加水浸泡，得到提取液；
将提取液浓缩后加入乙醇沉淀，得到中药沉淀，即为中药复方佐剂。
(2)将鸡新城疫病毒细胞培养液与中药复方佐剂混合，冷冻干燥，得到中药复合鸡新城疫疫苗。
优选的，所述原料的重量份数为黄芪12～20份、山楂10～15份、佛手5～10份、仙鹤草8～12份、紫苏10～15份、甘草5～12份。
优选的，所述中药粉末与水的重量比例为1:(2～4)，所述浸泡的时间为3～5h。
优选的，所述提取液浓缩至原体积的1/4～1/6。
优选的，所述乙醇的浓度为60～85％，所述乙醇与浓缩后的提取液的体积比为(2～4):1。
优选的，所述鸡新城疫病毒细胞培养液是在BHK-ST6-15-XF细胞系中接种鸡新城疫病毒株增殖培养得到。
优选的，所述鸡新城疫病毒细胞培养液为弱毒活细胞培养液或灭活细胞培养液。
优选的，所述鸡新城疫病毒细胞培养液与所述中药复方佐剂的体积质量比为1mL:(0.8～1.2)mg。
本发明还提供了一种中药复合鸡新城疫疫苗。
本发明提供的中药复合鸡新城疫疫苗能诱导鸡体产生更高的抗体效价，且产生抗体更快，持续时间更长，免疫效果更稳定，且制备方法简单易行。
附图说明
图1为中药复合鸡新城疫疫苗与传统疫苗的免疫效果对比实验结果。
具体实施方式
本发明提供了一种中药复合鸡新城疫疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备中药复方佐剂：所述中药复方佐剂的原料包括黄芪、山楂、佛手、仙鹤草、紫苏和甘草；
将所述原料混合、粉碎，得到中药粉末；
将所述中药粉末加水浸泡，得到提取液；
将提取液浓缩后加入乙醇沉淀，得到中药沉淀，即为中药复方佐剂。
(2)将鸡新城疫病毒细胞培养液与中药复方佐剂混合，冷冻干燥，得到中药复合鸡新城疫疫苗。
本发明提供了制备中药复方佐剂的方法，所述中药复方佐剂的原料包括黄芪、山楂、佛手、仙鹤草、紫苏和甘草；将所述原料混合、粉碎，得到中药粉末；将所述中药粉末加水浸泡，得到提取液；将提取液浓缩后加入乙醇沉淀，得到中药沉淀，即为中药复方佐剂。
在本发明中，所述黄芪优选为12～20份，进一步优选为14～18份，再进一步优选为16份；所述山楂优选为10～15份，进一步优选为12～14份，再进一步优选为13份；所述佛手优选为5～10份，进一步优选为7～9份，再进一步优选为8份；所述仙鹤草优选为8～12份，进一步优选为9～11份，再进一步优选为10份；所述紫苏优选为10～15份，进一步优选为12～14份，再进一步优选为13份；所述甘草优选为5～12份，进一步优选为8～10份，再进一步优选为9份。
在本发明中，所述粉碎后优选进行过筛处理，取筛下物；所述过筛用筛网的目数优选为20～40目，进一步优选为30目。经过实验发现，本发明提供的筛网目数范围有利于中药的浸泡提取。
在本发明中，所述中药粉末与水的重量比例优选为1:(2～4)，进一步优选为1:3。
在本发明中，所述浸泡用水优选为蒸馏水。
在本发明中，所述浸泡的时间优选为3～5h，进一步优选为3.5～4.5h，再进一步优选为4h。
在本发明中，所述浸泡过程中还优选采用超声提取，所述超声提取优选进行两次，两次超声的时间间隔优选为1h。
在本发明中所述超声的功率独立的优选为150～200瓦，进一步独立的优选为180瓦；所述超声的时间独立的优选为15～30min，进一步优选为20min。
在本发明中，所述提取液优选浓缩至原体积的1/4～1/6，进一步优选为1/5。
在本发明中，所述乙醇的浓度优选为60～85％，进一步优选为70～80％，再进一步优选为75％。
在本发明中，所述乙醇与浓缩后的提取液的体积比优选为(2～4):1，进一步优选为3:1。
在本发明中，所述浓缩液中加入乙醇后优选静置30～60min，进一步优选为30～45min。
在本发明中，所述静置完成后，采用离心分离，得到中药沉淀。
本发明将鸡新城疫病毒细胞培养液与中药复方佐剂混合，冷冻干燥，得到中药复合鸡新城疫疫苗。
在本发明中，所述鸡新城疫病毒细胞培养液是在BHK-ST6-15-XF细胞系中接种鸡新城疫病毒株增殖培养得到。
在本发明中，所述鸡新城疫病毒株优选为鸡新城疫病毒Lasota株。
在本发明中，所述BHK-ST6-15-XF细胞系优选为文献《鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶(ST6Gal)细胞株的构建及其应用》中公开的鸡新城疫病毒增殖培养细胞系——BHK-ST6-15-XF细胞系。并优选采用该文献提供的方法获得了未经冻干处理的鸡新城疫病毒细胞培养液。并将所述鸡新城疫病毒细胞培养液与中药复方佐剂混合。
在本发明中，所述鸡新城疫病毒细胞培养液与所述中药复方佐剂的体积质量比为1mL:(0.8～1.2)mg，进一步优选为1mL:1mg。
在本发明中，还优选采用去离子水对所述鸡新城疫病毒细胞培养液与所述中药复方佐剂的混合物质进行稀释。
在本发明中，还优选在鸡新城疫病毒细胞培养液与所述中药复方佐剂的混合物质中加入冻干保护剂，所述冻干保护剂优选为蔗糖和脱脂乳的混合冻干保护剂。
在本发明中，所述混合冻干保护剂中优选含有5wt％的蔗糖和10wt％的脱脂牛乳。
在本发明中，所述冷冻干燥的温度优选为-3～-5℃，进一步优选为-4℃，真空度优选为7～9Pa，进一步优选为8Pa，冷冻干燥的时间优选为27～28h。
在本发明中，所述鸡新城疫病毒细胞培养液优选为弱毒活细胞培养液或灭活细胞培养液，进一步优选为鸡新城疫病毒弱毒活细胞培养液。
本发明还提供了一种中药复合鸡新城疫疫苗。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
称取洗净干燥的黄芪16份、山楂13份、佛手8份、仙鹤草10份、紫苏13份和甘草9份，混合粉碎，过30目筛，取筛下物，得到中药粉末；按照重量比1:3加入3倍的蒸馏水浸泡4h，在浸泡30min后进行第一次超声处理，超声处理的功率为180瓦，超声处理20min，继续浸泡1h，然后进行第二次超声处理，超声处理的功率为180瓦，超声处理20min，继续浸泡，浸泡完成后将浸泡液过滤，得到提取液；加热浓缩提取液至原体积的1/5，然后加入浓缩后提取液体积3倍的75％的乙醇进行沉淀，静置45min；离心分离得到中药沉淀，即为中药复方佐剂。
根据鸡新城疫病毒细胞培养液EID50值，取制备具有弱毒活性的鸡新城疫病毒细胞培养液280mL(1000羽份)，加入280mg的中药复方佐剂，加入720mL的去离子水进行稀释，然后再加入1000mL含有5wt％蔗糖和10％脱脂牛乳的冻干保护剂，充分摇匀，按照2mL/瓶分装；设置冷冻干燥的温度为-4℃，真空度为8Pa，立刻进行冷冻干燥，冷冻干燥27h后，即得到中药复合鸡新城疫疫苗。
实施例2
称取洗净干燥的黄芪14份、山楂10份、佛手9份、仙鹤草11份、紫苏14份和甘草12份，混合粉碎，过20目筛，取筛下物，得到中药粉末；按照重量比1：2加入2倍的蒸馏水浸泡5h，在浸泡30min后进行第一次超声处理，超声处理的功率为150瓦，超声处理30min，继续浸泡1h，然后进行第二次超声处理，超声处理的功率为180瓦，超声处理30min，继续浸泡，浸泡完成后将浸泡液过滤，得到提取液；加热浓缩提取液至原体积的1/4，然后加入浓缩后提取液体积4倍的80％的乙醇进行沉淀，静置30min；离心分离得到中药沉淀，即为中药复方佐剂。
根据鸡新城疫病毒细胞培养液EID50值，取制备具有弱毒活性的鸡新城疫病毒细胞培养液280mL(1000羽份)，加入224mg的中药复方佐剂，加入720mL的去离子水进行稀释，然后再加入1000mL含有5wt％蔗糖和10％脱脂牛乳的冻干保护剂，充分摇匀，按照2mL/瓶分装；设置冷冻干燥的温度为-3℃，真空度为9Pa，立刻进行冷冻干燥，冷冻干燥27h后，即得到中药复合鸡新城疫疫苗。
实施例3
称取洗净干燥的黄芪20份、山楂12份、佛手7份、仙鹤草8份、紫苏15份和甘草10份，混合粉碎，过40目筛，取筛下物，得到中药粉末；按照重量比1：3加入3倍的蒸馏水浸泡4h，在浸泡1h后进行第一次超声处理，超声处理的功率为200瓦，超声处理15min，继续浸泡1h，然后进行第二次超声处理，超声处理的功率为150瓦，超声处理15min，继续浸泡，浸泡完成后将浸泡液过滤，得到提取液；加热浓缩提取液至原体积的1/4，然后加入浓缩后提取液体积2倍的85％的乙醇进行沉淀，静置45min；离心分离得到中药沉淀，即为中药复方佐剂。
根据鸡新城疫病毒细胞培养液EID50值，取制备具有弱毒活性的鸡新城疫病毒细胞培养液280mL(1000羽份)，加入336mg的中药复方佐剂，加入720mL的去离子水进行稀释，然后再加入1000mL含有5wt％蔗糖和10％脱脂牛乳的冻干保护剂，充分摇匀，按照2mL/瓶分装；设置冷冻干燥的温度为-4℃，真空度为7Pa，立刻进行冷冻干燥，冷冻干燥28h后，即得到中药复合鸡新城疫疫苗。
实施例4
称取洗净干燥的黄芪12份、山楂14份、佛手10份、仙鹤草12份、紫苏12份和甘草8份，混合粉碎，过30目筛，取筛下物，得到中药粉末；按照重量比1：4加入4倍的蒸馏水浸泡3h，在浸泡10min后进行第一次超声处理，超声处理的功率为150瓦，超声处理15min，继续浸泡1h，然后进行第二次超声处理，超声处理的功率为180瓦，超声处理20min，继续浸泡，浸泡完成后将浸泡液过滤，得到提取液；加热浓缩提取液至原体积的1/5，然后加入浓缩后提取液体积3倍的75％的乙醇进行沉淀，静置60min；离心分离得到中药沉淀，即为中药复方佐剂。
根据鸡新城疫病毒细胞培养液EID50值，取制备具有弱毒活性的鸡新城疫病毒细胞培养液280mL(1000羽份)，加入252mg的中药复方佐剂，加入720mL的去离子水进行稀释，然后再加入1000mL含有5wt％蔗糖和10％脱脂牛乳的冻干保护剂，充分摇匀，按照2mL/瓶分装；设置冷冻干燥的温度为-5℃，真空度为9Pa，立刻进行冷冻干燥，冷冻干燥28h后，即得到中药复合鸡新城疫疫苗。
实施例5
称取洗净干燥的黄芪18份、山楂15份、佛手5份、仙鹤草9份、紫苏10份和甘草5份，混合粉碎，过40目筛，取筛下物，得到中药粉末；按照重量比1：4加入4倍的蒸馏水浸泡4h，在浸泡30min后进行第一次超声处理，超声处理的功率为180瓦，超声处理20min，继续浸泡1h，然后进行第二次超声处理，超声处理的功率为180瓦，超声处理20min，继续浸泡，浸泡完成后将浸泡液过滤，得到提取液；加热浓缩提取液至原体积的1/5，然后加入浓缩后提取液体积3倍的60％的乙醇进行沉淀，静置45min；离心分离得到中药沉淀，即为中药复方佐剂。
根据鸡新城疫病毒细胞培养液EID50值，取制备具有弱毒活性的鸡新城疫病毒细胞培养液280mL(1000羽份)，加入280mg的中药复方佐剂，加入720mL的去离子水进行稀释，然后再加入1000mL含有5wt％蔗糖和10％脱脂牛乳的冻干保护剂，充分摇匀，按照2mL/瓶分装；设置冷冻干燥的温度为-5℃，真空度为8Pa，立刻进行冷冻干燥，冷冻干燥28h后，即得到中药复合鸡新城疫疫苗。
对比例1
本发明还提供了以中药复方佐剂中单味中药为原料，按照实施例1提供的制备方法制备的黄芪鸡新城疫疫苗、山楂鸡新城疫疫苗、佛手鸡新城疫疫苗、仙鹤草鸡新城疫疫苗、紫苏鸡新城疫疫苗、甘草鸡新城疫疫苗。其中，黄芪、山楂、佛手、仙鹤草、紫苏、甘草的用量分别与实施例1中原料的总量相同。
实验例1
购买50日龄的SPF鸡1300只，随机分成13组，每组100只。其中，第1～5组分别接种本发明实施例1～5制备的中药复合鸡新城疫疫苗，0.01羽份/只；第6～11组分别接种对比例1提供的黄芪鸡新城疫疫苗、山楂鸡新城疫疫苗、佛手鸡新城疫疫苗、仙鹤草鸡新城疫疫苗、紫苏鸡新城疫疫苗、甘草鸡新城疫疫苗，0.01羽份/只；第12组设为对照组，接种等量的生理盐水；第13组设为阳性对照，接种传统疫苗。接种14天后，每只鸡各注射新城疫病毒强毒北京株(CVCCAV 1611)0.5mL(含104.0ELD50)，观察14日，计算存活率如下表：
表1不同鸡新城疫疫苗的免疫效果
Figure BDA0002511960110000081
Figure BDA0002511960110000091
由表1可知，本发明提供的中药复合鸡新城疫疫苗可有效抵御新城疫病毒强毒株的攻击，对鸡具有极强的免疫效果。实验结果还证明：本发明提供的组合中药的免疫效果要显著好于黄芪、山楂、佛手、仙鹤草、紫苏、甘草的单独添加的效果，显示本发明提供的中药复方佐剂具有协同增效的作用。
本实验还检测了对照组和实施例1的HI抗体效价，对照组HI抗体效价均低于1:4，实验组HI抗体效价均高于1:128。
实验例2
7日龄SPF鸡220只，其中100只接种NDV Lasota株传统疫苗，作为传统疫苗组；100只接种本发明实施例1制备的中药复合鸡新城疫疫苗，作为中药复方组；剩下的20只接种生理盐水，作为对照组。将中药复合鸡新城疫疫苗用生理盐水稀释，接种量为1羽份/只，接种方式为滴鼻；传统疫苗按照购买说明书接种即可；对照组的20只鸡接种与中药复方组等量的生理盐水。本实验在21日龄时进行第二次免疫接种。首次免疫后，每组(包括对照组)分别于0天、14天、28天、42天、56天、70天、84天、98天和112天随机采集20只鸡的血清，应用血凝抑制试验(HI)进行ND抗体水平的测定，并计算其平均值。血凝抑制试验操作方法与结果判断依据GB/T16550-2008新城疫诊断技术进行。检测结果如下表：
表2对照组不同时间的HI抗体效价
Figure BDA0002511960110000092
Figure BDA0002511960110000101
表3传统疫苗组不同时间的HI抗体效价
Figure BDA0002511960110000102
Figure BDA0002511960110000111
表4中药复方组不同时间的HI抗体效价
Figure BDA0002511960110000112
从表2～4中可以看出，对照组的平均效价均小于2；中药复方疫苗组免疫后HI抗体水平在免疫后各个时期均高于传统疫苗组；传统疫苗组的平均效价在首免后的第56天达到最高，中药复方组的平均效价在首免后第70天达到最高，表明中药复方组具有更长的免疫时效。本发明还将三组实验检测到的平均效价绘制成折线图，如图1所示。从图1中可以更直观的看出，本发明提供的中药复合鸡新城疫疫苗诱导鸡体产生的HI抗体效价更高，且产生的抗体更快，持续的时间更长。从表3中的跟踪检测数据也可以看出，中药复方组数据离散范围更小，说明鸡群的免疫应答水平一致，中药复合鸡新城疫疫苗的免疫效果更稳定。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种中药复合鸡新城疫疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备中药复方佐剂：所述中药复方佐剂的原料包括黄芪12～20份、山楂10～15份、佛手5～10份、仙鹤草8～12份、紫苏10～15份和甘草5～12份；
将所述原料混合、粉碎，得到中药粉末；
将所述中药粉末加水浸泡，得到提取液；
将提取液浓缩后加入乙醇沉淀，得到中药沉淀，即为中药复方佐剂；
(2)将鸡新城疫病毒细胞培养液与中药复方佐剂混合，冷冻干燥，得到中药复合鸡新城疫疫苗。
2.如权利要求1所述的中药复合鸡新城疫疫苗的制备方法，其特征在于，所述中药粉末与水的重量比例为1:(2～4)，所述浸泡的时间为3～5h。
3.如权利要求1所述的中药复合鸡新城疫疫苗的制备方法，其特征在于，所述提取液浓缩至原体积的1/4～1/6。
4.如权利要求3所述的中药复合鸡新城疫疫苗的制备方法，其特征在于，所述乙醇的浓度为60～85％，所述乙醇与浓缩后的提取液的体积比为(2～4)：1。
5.如权利要求1所述的中药复合鸡新城疫疫苗的制备方法，其特征在于，所述鸡新城疫病毒细胞培养液是在BHK-ST6-15-XF细胞系中接种鸡新城疫病毒株增殖培养得到。
6.如权利要求1或5所述的中药复合鸡新城疫疫苗的制备方法，其特征在于，所述鸡新城疫病毒细胞培养液为弱毒活细胞培养液或灭活细胞培养液。
7.如权利要求6所述的中药复合鸡新城疫疫苗的制备方法，其特征在于，所述鸡新城疫病毒细胞培养液与所述中药复方佐剂的体积质量比为1mL:(0.8～1.2)mg。
8.由权利要求1～7任一项所述的中药复合鸡新城疫疫苗的制备方法制备的中药复合鸡新城疫疫苗。
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