CN102399754A - 一株h9n2禽流感病毒疫苗株及其在免疫保护上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供了一株重组的鸡源H9N2禽流感病毒毒株，及其分离鉴定和纯化方法，并研究了其生物学特性特别是作为疫苗株的特点和在SPF鸡上免疫效果评价，其保藏号为CCTCCNO：V201030，本发明从分子水平阐明了本病毒株与其他分离毒株的抗原变异情况；该毒株制成疫苗后，免疫4周龄SPF鸡，通过对同源和异源H9流感野毒株的保护效果分析，证明该病毒株可以用作H9亚型禽流感疫苗备用株。本发明为使用疫苗防治禽流感爆发提供疫苗备用株，并且为如何筛选禽流感疫苗株提供分子生物学技术方案，对于研究禽流感感染动物机制提供分子生物学背景，具有重要公共卫生意义。

Description

一株H9N2禽流感病毒疫苗株及其在免疫保护上的应用

技术领域

本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供了一株H9N2禽流感病毒疫苗株，其实际上为一株自然重组的鸡源H9N2禽流感病毒毒株，且提供了该疫苗株的筛选过程及其在免疫保护特别是制成灭火疫苗后在SPF鸡上的免疫效果分析。 

背景技术

禽流感病毒(AIV)隶属于正粘病毒科A型流感病毒属，基因组分为8个节段。核酸总长度约为13.6kb，编码至少11个病毒蛋白。由于AIV负链、分节段的RNA病毒性质，病毒很容易发生变异并不断的突破其感染宿主的种属障碍，引起新的流感流行。AIV据其致病性可分为高致病性AIV(Highly Pathogenic Avian Influenza virus，HPAlV)和低致病性AIV(Low Pathogenic Avian Influenza virus，LPAIV)，感染家禽的HPAIV和LPAIV分别以H5和H9亚型为主。 

H9N2亚型流感属于低致病性流感病毒，但它的危害却不容忽视。H9N2AIV在世界范围内广泛存在，在北美，H9N2AIV主要存在于海鸟和野鸭体内(Kawaoka et al.1988；Sharp et al.1993)。1966年，H9N2AIV开始在美国火鸡群中广泛暴发流行(Homme et al.1970)，1981至1996年美国连续爆发过16次H9N2AIV感染火鸡群事件(Alexander 2000)。 

1994年，陈伯伦等在广东省某鸡场分离到6株H9N2亚型AIV(陈伯伦et al.1994)，将这些病毒实验室接种鸡，表现为典型的临床症状，但不引起鸡死亡。这次AI发生之后，H9N2 AIV在我国一直呈上升趋势，严重制约了养禽业的发展，同时，众多的人和猪暴露于H9N2 AIV中，也增加了人和猪感染H9N2 AIV的可能性。 

近年来，随着我国养殖业飞速发展，我国成为养殖大国，但还不是养殖强国。H9N2亚型是目前我国鸡群中存在的AIV的主要亚型，占禽流感总发病率90％以上。H9N2亚型禽流感发病后虽然致死率不高(一般不超过30％)，但常导致呼吸道症状，蛋鸡的产蛋下降，并使鸡群易继发严重的呼吸道疾病，影响家禽生产性能；肉鸡感染后造成免疫抑制，容易造成继发感染和混合感染，从而给肉鸡养殖业造成巨大经济损失。我国在禽流感的防控中采取了疫苗免疫和扑杀的政策，实践证明该政策对控制禽流感的大规模流行起到了重要作用。积极开展流行病学调查，密切追踪AIV的分子进化和抗原变异，选择免疫保护性好的H9N2流感病毒疫苗株，才能保证疫苗良好的免疫效果。 

众所周知，禽流感病毒变异非常快，因此及时的发现新的毒株研究其特性，并最终筛选出可以作为疫苗株的毒株是保证禽流感疫苗效果的最重要方式之一。 

发明内容

本发明的发明人提供了一株H9N2禽流感病毒疫苗株，其实际上是一株自然重组的A/Chicken/Shangong/SG2/2009(简称CK/SD/SG2/2009)(H9N2)禽流感病毒毒株，并提供了该毒株的全基因组序列，阐明其8个基因片段与国内经典的H9N2病毒株在系统进化上的差异，从而为H9N2病毒的分子进化和流行病学研究提供资料；同时提供了该毒株作为疫苗株的试验数据和指标，以明确其作为H9N2流感疫苗备用毒株的可行性。 

发明人对该毒株进行了生物保藏，其保藏编号为：CCTCC NO：V201030。 

该病毒的全基因组序列测定表明，其PB2基因隶属于CK-SH-Y-2008-like谱系，其它七个基因属于CK-SH-F-98-like谱系，进而这是一株重组H9N2禽流感病毒毒株。 

针对该病毒遗传背景，发明人采用的分离及鉴定方法如下： 

病毒分离鉴定： 

取发病鸡的内脏器官(肝、肾、脾等)加入适量的灭菌生理盐水研磨成匀浆，8000转/分钟(rpm)离心8分钟，吸取上清。然后加入青霉素和链霉素4℃处理1小时后，取上清经尿囊腔接种9-10日龄的SPF鸡胚，0.2ml/枚，置孵化器中培养。每天观察两次，弃除24小时内的污染胚，收取死亡胚的尿囊液。通过血凝试验检测尿囊液有无血凝性，收集有血凝性尿囊液，通过血凝抑制试验(HI)和PCR方法鉴定为H9N2亚型禽流感。血凝抑制试验用到的H5、H9、新城疫(ND)标准抗体购自哈尔滨兽医研究所。 

纯化： 

把鉴定好的病毒在9-10日龄SPF鸡胚上连续传三代纯化病毒，无菌收集尿囊液并且分装在冻存管中在-70℃冰箱保存备用。 

通过上述方法得到的纯化的H9亚型AIV，可以进行下述的各种操作，其确定其各种性质： 

1.遗传演化分析：该病毒的全基因序列如说明书中所示，发明人参考已发表的H9亚型AIV序列资料，设计并合成了AIV基因组8个基因片段(PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M、NS)的RT-PCR引物。分别扩增H9亚型AIV各基因片段。该病毒的全基因组序列测定表明，其PB2基因隶属于CK-SH-Y-2008-like谱系，其它七个基因属于CK-SH-F-98-like谱系，进而这是一株重组毒株，其具体的基因进化树见附图，发明人采用的分析软件是DNAstar7.0。 

2.病毒在鸡胚中的生长特性该病毒在鸡胚中可高滴度生长，血凝素效价稳定在2¹⁰左右。 

EID₅₀测定：种毒按10倍倍比稀释，将各稀释度分别接种4枚SPF鸡胚，37℃继续孵化48h，通过测定感染鸡胚尿囊液的血凝活性来判断其是否感染，利用Reed-Muench法计算EID₅₀(Reed，et al，1938)。该病毒对鸡胚的半数感染量(EID₅₀)为10^-9.25/ml，结果表明该病毒在鸡胚上很容易增值，这是可以制作疫苗的条件之一。 

3.SPF鸡体内产生较高抗体：将该病毒用0.35％甲醛灭活72h，与白油混和均匀(1∶3)制成油乳剂疫苗，免疫4周龄SPF鸡后(每只鸡皮下注射0.3ml)2周采集血清，检测血清H9抗体滴度，抗体在2周达到较高滴度，CK/SD/SG2/2009在免疫后第二周抗体就就达到了9(lg2)。所以CK/SD/SG2/2009病毒株制作油苗在SPF鸡上很容易引起免疫应答。 

4.HA抗原相关性分析分别制备11株AIV分离毒株的油乳剂灭活苗，免疫SPF鸡，在隔离饲养器内制备单因子血清，用于交叉HI试验，检测该H9N2病毒的HA抗原谱是否广谱。该病毒与其余10株H9N2病毒的HA抗原相关性均大于0.81，表明这株病毒与其余毒株的HA抗原相关性好，其血凝素蛋白HA抗原 谱广，可用做H9N2禽流感疫苗的候选毒株； 

除此之外还可以将其作为H9N2亚型禽流感病毒AIV血凝和血凝抑制实验HA-HI用抗原。 

5.该病毒制成疫苗后在SPF鸡上免疫保护效果分析： 

该毒株制成疫苗后，先免疫4周龄SPF鸡，2周后检测抗体，用同源和异源H9亚型野毒株进行攻毒，每天采集试验组和对照组鸡的鼻咽拭子和腔拭子，在9-10日龄SPF鸡胚进行病毒滴定，结果表明，该疫苗株无论对同源还是异源野毒攻击，都能产生较好的免疫保护效果。 

其具体的基因组序列如说明书中所示，说明书中序列表按照PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，M，NS的顺序顺次排列为1-8。 

综上所述，通过该毒株生物学性质的测定可A/Chicken/Shangong/SG2/2009(H9N2)可在鸡胚中高滴度增殖，而且其血凝素蛋白(HA)抗原性好，同时可以在SPF鸡体内产生较高抗体，因此可以作为H9N2流感疫苗侯选毒株，用于灭活疫苗或基因工程疫苗的研发，可采用现有的疫苗加工方法。 

发明人对本发明所公开的自然重组的A/Chicken/Shangong/SG2/2009(简称CK/SD/SG2/2009)(H9N2)禽流感病毒毒株进行了生物保藏，具体保藏信息如下： 

保藏信息 

保藏时间：2010年11月26日 

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心CCTCC 

保藏编号：CCTCC NO：V201030 

保藏单位地址：中国武汉大学 

分类命名：H9N2流感病毒CK/SD/SG2/2009 

A/Chicken/Shangong/SG2/2009 

附图说明

图1为PB2基因的系统进化树； 

图2为PA基因的系统进化树。 

具体实施方式

实施例1 

病毒的分离和鉴定 

一株H9N2禽流感病毒疫苗株，即一株重组的鸡源H9N2禽流感病毒毒株A/Chicken/Shangong/SG2/2009，该病毒的分离和鉴定方法如下： 

1.病料的处理与鸡胚尿囊腔接种 

将采集的病料无菌研磨，收集浸出物，或将鼻咽或气管棉拭子在生理盐水中反复冻螎3次后低速离心，收取上清液，在9～11日龄的SPF鸡胚的尿囊腔接种0.2ML的病毒液，35℃～37℃培养，收取24～72h内自然死亡或未死亡的鸡胚尿 囊液，用血凝抑制和PCR方法鉴定病毒亚型，PCR鉴定引物见表1-1；在连续传代过程中，筛选血凝效价较高且稳定的病毒液保存于-70℃备用。 

表1-1 H1、H3、H5、H9、N1和N2鉴定引物 

以上引物是根据GenBank中的相关序列，利用DNAstar(7.1)设计引物。 

实验结果： 

收获的鸡胚尿囊液HA效价为10，据此制备的4单位病毒对标准NDV、H5和H9阳性血清的HI效价分别为：0，0，9.该实验结果表明，该鸡胚尿囊液只中含有H9亚型AIV；PCR结果只扩增出H9和N2的目的条带，进一步证明该毒株是H9N2亚型AIV。 

该病毒的纯化方法如下： 

有限稀释法：将得到的鸡胚尿囊液做10倍系列稀释，取各稀释度的尿囊液分别接种9-10日龄的SPF鸡胚尿囊腔。收获对0.5％鸡红细胞血凝价最高的鸡胚的尿囊液，重复上述方法，在SPF鸡胚上连续传三代，最终收获血凝价最高且稳定的鸡胚的尿囊液作为种毒贮存在-70℃冰箱备用。 

遗传演化分析： 

引物设计：根据GenBank中的相关序列，利用DNAstar(7.1)设计引物。 

反转录上游引物：5‘-AGTGCAAAAGCAGG-3’ 

反转录下游引物：5‘-ACTGTAGAAACAAGG-3’ 

扩增H9N2亚型流感病毒全基因序列引物见表1-2. 

表1-2 扩增H9N2的基因组全长引物 

病毒RNA的提取和目的条带扩增 

以含毒的鸡胚尿囊液为RNA提取的材料，按照Trizol试剂盒(Invitragen)说明书进行操作。 

提取病毒RNA按照试剂盒要求进行反转录，之后再分别扩增8个片段目的条 带，PCR产物直接送到大连宝生物公司进行测序。最终获得各个片段的基因序列如下：PB2的基因序列如Seq ID No：1所示，PB1的基因序列如Seq ID No：2所示，PA的基因序列如Seq ID No：3所示，HA的基因序列如Seq ID No：4所示，NP的基因序列如Seq ID No：5所示，NA的基因序列如Seq ID No：6所示，M的基因序列如Seq ID No：7所示，NS的基因序列如Seq ID No：8所示。 

测序后通过与已经发表相关序列进行比较，使用DNAstar软件，做出进化树，通过附图1和图2。可以看出，该病毒PB2基因属于CK-SH-Y280-2008-like谱系，其它7个基因属于CK-SH-F-98-like谱系，显然该病毒是一个重组病毒。 

实施例2 

病毒HA抗原性分析 

实验方法： 

1.H9单因子血清的制备 

将09年分离的6株H9N2亚型AIV(包括本分明涉及的疫苗后备毒株A/Chicken/Shangong/SG2/2009)，以及08年以前分离的5株H9亚型禽流感病毒共11株病毒，分别制备油乳剂灭活苗。以上述疫苗分别免疫4周龄龄的SPF鸡，在隔离饲养器内饲养制备单因子血清，共免疫两次，之间间隔2周，第二次免疫后14天收集血液，分别制备阳性血清。 

2.交叉HI试验 

11株病毒为抗原，分别制备其4单位病毒，与11种单因子血清进行交叉HI试验，检测这些H9N2病毒的HA抗原的反应性，实验重复三次，取三次实验的平均值用于R值分析，从而确定上述H9N2病毒HA抗原之间的相关性。抗原相关性的判定标准如下： 

抗原间的相关性R＝√(r1×r2)， 

R一2株病毒间的抗原性差异 

r1一甲病毒对乙血清的HI滴度/甲病毒对甲血清的HI滴度 

r2一乙病毒对甲血清的HI滴度/乙病毒对乙血清的HI滴度 

如果R＝1，表明两个毒株间抗原性相同；如果0.67≤R≤1.5，表明两个毒株间抗原性无明显差异；如果0.5≤R＜0.67，表明两个毒株间抗原性有小的差异；如果R＜0.5，表明两个毒株间抗原性的明显差异；R值越小，抗原性差异越大。结果如下 

表1-3 11株病毒之间交叉血凝抑制结果 

“*”表示本发明所述的毒株； 

表1-4 11株病毒之间的抗原相关性系数R值 

“*”表示本发明所述的毒株； 

不同H9N2亚型AIV毒株间的HI交叉试验结果以及HA抗原相关性分析结果分别见表1-3和表1-4.由表1-4可见，A/Chicken/Shangong/SG2/2009(H9N2)与其余10株H9N2病毒的HA抗原相关性均大于0.81，表明该病毒与其余毒株的HA抗原相关性好，可作为H9N2亚型禽流感疫苗的候选毒株。 

实施例3 

疫苗株免疫效果分析 

1.疫苗制备和免疫攻毒 

为确定疫苗株病毒的免疫原性和疫苗保护效果，制备油乳剂灭活疫苗，免疫3周龄SPF鸡20只，同时6只SPF鸡免疫PBS作为空白对照，在免疫后三周采集血清，检测病毒的HI抗体水平。免疫鸡分为两组，每组10只，I组用本发明 所述疫苗毒A/Chicken/Shangong/SG2/2009(H9N2)(简称CK/SD/SG2/2009)进行攻毒(静脉注射)，II组用A/Chicken/Henan/L3/2008(H9N2)(简称CK/HN/L3/2008，)攻毒，剂量为100ul，(100ul含有10⁵EID₅₀)。攻毒后3、5天分别采集试验组和对照组的每只鸡咽喉棉式子和泄殖腔棉式子，立即放到-70℃冰箱，用9～10日龄SPF鸡胚进行病毒滴定。每天观察实验组和对照组鸡只精神状态和饮食情况。每个棉式子做10倍系列稀释，每个稀释度接种3枚SPF鸡胚，37℃继续孵化48h，通过测定感染鸡胚尿囊液的血凝活性来判断其是否感染，利用Reed-Muench法计算病毒含量。 

2.免疫后2周检测抗体结果 

将CK/SD/SG2/2009毒株制成疫苗后，免疫3周龄SPF鸡，免疫15天后采集血清检测抗体结果，试验组鸡只H9抗体效价到了9左右，见表2-1。 

表2-1 疫苗株免疫SPF鸡15天后采集血清检测抗体结果 

3.H9N2禽流感灭活疫苗对SPF鸡免疫效果 

攻毒后第3、5天采集棉式子在9日龄SPF鸡胚上进行病毒滴定，具体结果见表2-2。对照组6只鸡咽喉和泄殖腔都有排毒，第五天比第三天排毒量有所降低； 

表2-2 H9病毒灭火疫苗对SPF鸡的免疫保护试验 

“*”表示为本发明所述的毒株。“b”表示在攻毒后3，5天分别采集咽喉和泄殖腔拭子，并且在9日龄SPF鸡上进行病毒滴定的结果。 

实验组，异源毒株CK/HN/L3/2008攻毒的鸡只，第三天咽喉棉式子10只有3只鸡排毒，第五天棉式子只有1只在排毒，而且排毒量大大降低；泄殖腔棉式子，实验组中，第三天有2只鸡排毒，第五天有1只排毒，情况类似咽喉。因此疫苗在第三天有效保护率70％以上，第五天保护率达到90％，表明该疫苗株具有一定的保护作用。 

试验组中，本发明所提供毒株CK/SD/SG2/2009攻毒的鸡只，免疫保护效果与上面异源毒株的免疫效果类似，综上所述，疫苗株制成疫苗后，免疫SPF鸡，无论对同源还是异源毒株攻毒，都能产生良好免疫保护效果，可见其在免疫保护上的应用可以得到广泛的推广和应用。 

4.H9N2禽流感灭活疫苗对SPF鸡安全效果 

免疫后15天就开始攻毒，实验组和对照组鸡只都没有表现出异常症状，吃 料和饮水都正常，这也表明H9是弱毒，也证明该疫苗对鸡的是安全的。 

Claims (5)

1.一株H9N2禽流感病毒疫苗株，为自然重组的鸡源H9N2禽流感病毒毒株，其保藏编号为：CCTCC NO：V201030。

2.如权利要求1所述的H9N2禽流感病毒疫苗株，其特征在于：其在鸡胚中高滴度增殖，血凝素效价稳定在2¹⁰；其血凝素蛋白HA抗原谱广。

3.如权利要求1所述的H9N2禽流感病毒疫苗株，其作为H9N2亚型禽流感疫苗株的应用。

4.根据权利要求3所述的作为H9N2亚型禽流感疫苗株的应用，其特征在于制成疫苗后免疫SPF鸡后产生H9-抗体滴度为9(lg2)。

5.如权利要求1所述的H9N2禽流感病毒疫苗株，其用作H9N2亚型禽流感病毒AIV血凝和血凝抑制实验HA-HI用抗原。

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