CN103789272A

CN103789272A - H9亚型禽流感病毒分离株以及由其制得的疫苗组合物

Info

Publication number: CN103789272A
Application number: CN201210435106.5A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 白朝勇
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: LUOYANG HUIZHONG BIOTECH CO., LTD.; Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2012-10-31
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2032-10-31
Also published as: CN103789272B

Abstract

根据本发明的禽流感病毒分离株属于H9亚型，其血凝素蛋白的HA1结构域氨基酸序列具有以下特征性位点：69位P；180位A；221位N及236位R。以具有上述特征位点的H9亚型禽流感病毒分离株制得的疫苗组合物具备良好的免疫效力，效果优于现有技术毒株制得的疫苗，可以对流行野毒株提供有效的交叉保护，显示出显著交叉免疫原特性，在预防和治疗禽交叉免疫保护方面具有很好的应用前景。

Description

H9亚型禽流感病毒分离株以及由其制得的疫苗组合物

技术领域

本发明属于禽类生物制药技术领域，涉及一种H9亚型禽流感病毒分离株及由其制得的疫苗组合物。

背景技术

禽流感(AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染和/或疾病综合征。根据病原的致病力不同，分为高致病性和低致病性两种类型。低致病性禽流感病毒中尤以H9亚型分布最为广泛，最具危害性。H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)单病原感染往往不引起临床症状，但由于其易与其它病原发生协同作用，造成继发感染，从而引起肉鸡和蛋鸡的复合型呼吸道疾病甚至死亡、禽类产蛋下降及免疫抑制等，可对养禽业造成重大损失。另外，它可以跨越宿主障碍感染哺乳动物(包括人)。因此，控制H9亚型禽流感疫情的发生和流行具有重要的经济与公共卫生意义。

免疫法是控制所述疫病的主要方法。鸡可以通过接受母源抗体而被动免疫，或者通过活疫苗或灭活疫苗对其进行主动免疫。目前，对所述疫病的控制主要依赖灭活疫苗，这类疫苗通常是一种包含禽流感病毒抗原和药理学上可接受的载剂的组合物。存在于疫苗中的禽流感病毒抗原一般为经灭活的疫苗毒株的全病毒或来自于病毒的保护性蛋白。疫苗毒株需具备良好的抗原性及免疫原性以确保疫苗的免疫效力。

流感病毒有着较强的进化变异能力，病毒的两个表面蛋白(HA和NA)是引起抗原变异的主要根源。一方面，发生在病毒基因组RNA上的点突变逐渐积累会导致抗原漂移；另一方面，病毒之间的基因片段的重配，则会导致一个全新的表面抗原或一个新亚型的出现，即为抗原漂变。同时，由于疫苗的广泛使用，使野生病毒在免疫选择压力下朝着偏离疫苗株的方向加速进化，其结果会导致疫苗株对野毒株的交叉免疫保护效力逐渐下降。

从1998年开始，H9亚型禽流感灭活疫苗在中国逐渐开始广泛使用，主要选用的疫苗株有A/Chicken/Shanghai/F/98(简称F株)、A/Chicken/Guangdong/SS/94(简称SS株)等，疫苗的广泛应用使得H9亚型禽流感的流行得到了有效控制。但禽群的感染仍不断发生，甚至出现在免疫群体，特别是近年来呈现出逐渐增多的趋势。导致这种现象出现的主要原因是由于疫苗株与目前流行的野毒株之间存在着较大的遗传距离及抗原性差异，导致疫苗株的免疫保护效力下降。

因此，目前存在的问题是需要研究开发一种可以对流行野毒株提供有效的交叉保护的，用于H9亚型禽流感的疫苗。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种H9亚型禽流感病毒分离株以及由其制得的疫苗组合物。该禽流感病毒分离株属于H9亚型，以该H9亚型禽流感病毒分离株制得的疫苗组合物可以对流行野毒株提供有效的交叉保护，显示出显著的交叉免疫特性。

为此，本发明提供了一种H9亚型禽流感病毒分离株，其血凝素蛋白的HA1结构域氨基酸序列具有以下特征性位点：69位P；180位A；221位N及236位R。

根据本发明，所述H9亚型禽流感病毒分离株的血凝毒蛋白具有序列表SEQ NO.1的氨基酸序列。

当以根据本发明所述的H9亚型禽流感病毒分离株调配于疫苗组合物中时，所述禽流感病毒SZ株显示出显著交叉免疫特性。因此，对于所述疫苗组合物而言，所述禽流感病毒SZ株，以及其它本质上具有相同本质识别特征的分离株极为优选。

本发明的H9亚型禽流感病毒分离株包含禽流感病毒H9亚型SZ株(Aivan Influenza Virus H9 subtype Strain SZ)，其保藏编号为：CCTCCNO：V201240，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)。保藏日期：2012年9月16日。

本发明中所用术语H9亚型禽流感病毒分离株也称为禽流感病毒H9亚型分离株。

类似的，本发明中所用术语禽流感病毒H9亚型SZ株也称为H9亚型禽流感病毒SZ株。

本发明还提供了一种根据本发明所述禽流感病毒分离株制得的疫苗组合物，其特征在于：所述疫苗组合物含有H9亚型禽流感病毒分离株和可药用载剂。

本发明中，所述疫苗组合物为水包油乳液、油包水乳液或双重乳液。所述双重乳液通常表现为水包油包水乳液。

根据本发明，在所述疫苗组合物中，所述H9亚型禽流感病毒分离株灭活前含量为10^6.5～10^8.5EID₅₀/0.1ml。优选在所述疫苗组合物中，所述H9亚型禽流感病毒分离株灭活前含量为10^7.0～10^8.5EID₅₀/0.1ml。更为优选的，在所述疫苗组合物中，所述H9亚型禽流感病毒分离株灭活前含量为10^7.5～10^8.5EID₅₀/0.1ml。

本发明的疫苗组合物可使用可用技术来调配，优选为与医药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。因此，本发明中，所述可药用疫苗佐剂包括油佐剂，其选自白油、角鲨烷或角鲨烯、德雷克油(Drakeoil)，以及其他动物油、植物油或矿物油。上述油佐剂既可以是来源，也可以是经过人工合成获得的。

在本发明的一个实施方式中，所述疫苗组合物还包括助悬剂、表面活性剂、抗原灭活剂或防腐剂。所述助悬剂可包括，例如，硬脂酸铝，以及所属技术领域可用的其他助悬剂。所述表面活性剂可包括，例如，脱水山犁醇单油酸酯(TWEEN系列)，司本(SPAN)，以及所属技术领域可用的其他表面活性剂。所述抗原灭活剂包括(但不限于)，例如福尔马林、β-丙内酯等等。所述防腐剂包括，例如硫柳汞。上述物质的使用方法及用量均为本领域技术人员所熟知。还可以选择本领域的其它佐剂，包括氢氧化铝、磷酸铝及其它金属盐。

根据本发明，所述疫苗组合物还含有至少一种额外的家禽抗原，其选自抵抗鸡疱疹病毒、鸡贫血病毒(CAV)、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒(IB)、鸡传染性法氏囊炎病毒、减蛋综合症病毒以及呼肠孤病毒抗原。

本发明还进一步提供了一种根据根据本发明所述的疫苗组合物在预防和治疗禽交叉免疫保护中的应用。

菌种保藏

禽流感病毒H9亚型SZ株(Aivan Influenza Virus H9 subtype StrainSZ)，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期：2012年9月16日，保藏编号：CCTCC NO：V201240。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例

实例1：毒株分离鉴定

2008年，从山东诸诚肉鸡场鸡群中采集喉头与泄殖腔拭子，置于病毒保存液中(每ml含青霉素10000U、链霉素2000ug，pH：7.0)，-20℃冻结。拭子样品经处理后接种10日龄SPF鸡胚(北京梅里亚维通实验动物有限公司)。将所收获鸡胚液样品用1％鸡红细胞悬液进行血凝性检测，阳性样品配制4单位抗原，再用H9 AIV、H5 AIV、EDS及ND 4种阳性血清通过血凝抑制(HI)试验进行血清学鉴定，经确认为H9亚型AIV。取病毒液用病毒RNA提取试剂盒提取RNA，并反转录cDNA，反转录引物序列为：5’-AGCAAAAGCAGG-3’。PCR扩增HA基因。PCR产物经电泳鉴定大小正确后，送Invitrogen公司进行核苷酸序列测定，获得编码HA1蛋白的核苷酸序列，见序列表中的SEQ ID NO.1序列，进而推定其HA1结构域的氨基酸序列，见序列表中的SEQ ID NO.2序列，并通过与参考毒株的氨基酸序列比对，确定了血凝素蛋白HA1结构域氨基酸序列的区别性特征位点。

1.血凝素蛋白HA1结构域的氨基酸序列的下列位点为其区别性特征：69位P；101位P；145位S；198位A；239位N及245位R。

2.基因序列比对

从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)获得如下H9亚型禽流感病毒参考株的HA蛋白的核苷酸序列：A/chicken/Shandong/TH9/2010(登录号：JN804001.1)、A/chicken/Shandong/N/2010(登录号：JN683647)、A/chicken/Shandong/PD/2009(登录号：HM751154)、A/chicken/Shandong/SG2/2009(登录号：HM751194)、A/chicken/Zhejiang/ZC28/2007(登录号：FJ434586)、A/chicken/Shandong/JN/1999(登录号：HM773437)、A/chicken/Shandong/K/2010(登录号：JN683644)、A/chicken/Shandong/L/2010(登录号：JN683645)、A/chicken/Shandong/lx316/2008(登录号：FJ190138)。

用DNASTAR软件包中的MegAlign软件(选择Align菜单下的Clustal V方法)，将SZ株血凝素蛋白HA1结构域的氨基酸序列与参考株序列进行比对，获得如下结果：

实例2：疫苗组合物制备

1.病毒液制备

取H9亚型禽流感病毒SZ株(CCTCC V201240)毒种，用无菌生理盐水稀释至10^-3(取病毒液0.1ml加入到0.9ml无菌生理盐水中，震荡混匀后依此再稀释2次)，经尿囊腔接种10日龄易感鸡胚(使用购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司的SPF种蛋自行孵化)，每胚0.1ml(含10⁵EID₅₀)。接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。至96小时，取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。将冷却后的鸡胚收获胚液。所收获病毒液取样，按照《中华人民共和国兽药典》(2010年版)附录7中方法，测定病毒含量，为10^8.5EID₅₀/0.1ml。

2.抗原灭活

将分析纯甲醛溶液(国药集团化学试剂有限公司，批号为20100918)用纯化水10倍稀释后，加入步骤1的病毒液中，边加边摇，使其终浓度为0.1％(V/V)。充分摇震混匀后，转入另一无菌容器中，密封后37℃灭活24小时，间隔4～6小时震摇1次。

灭活后的病毒液取样进行灭活检验。方法及判定标准为：取灭活后的病毒液，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚6枚，每胚0.2ml，置36～37℃孵育，弃去24小时内死亡鸡胚，观察120小时，鸡胚非特异死亡应不超过1枚。对所有胚液分别测定血凝价，均应不出现凝集，并盲传1代，测定血凝性，均应不出现凝集，判为灭活完全。经检验，上述病毒液灭活完全。

3.乳化

取注射用白油(杭州石化责任有限公司产品，批号为20101002)94容积份和司本-80(广东肇庆超能实业有限公司产品，批号为20100806)6容积份混合后，加硬脂酸铝(上海裕明实业有限公司，批号为20101003)2质量份，随加随搅拌至透明为止，高压灭菌冷却后备用，即为油相。

按表1中量，将灭活后的禽流感病毒液用无菌生理盐水配制成不同的抗原浓度，分别置于灭菌容器中，按病毒液体积的4％(V/V)加入灭菌的吐温-80(广东肇庆超能实业有限公司产品，批号为20101012)，充分振摇，使吐温-80完全溶解为止，即为水相。

表1 抗原配制

取油相2容积份置油相罐内，开动电机慢速搅拌，然后徐徐加入1容积份水相，加完后转入乳化罐中，再以2800r/min乳化40分钟即。在乳化终止前加入1％(W/V)硫柳汞钠(国药集团化学试剂有限公司，批号为F20100520)溶液，使硫柳汞钠终浓度为0.01％(W/V)。

4.疫苗组别及含量

根据不同的抗原比例制备5组疫苗，用表2中稀释后的抗原进行疫苗制备。

表2 疫苗组份及制备

按上述方法制备的灭活疫苗中各组份及含量为：灭活的SZ株流感病毒液31.41％(V/V)、白油60.82％(V/V)、吐温-80 1.27％(V/V)、司本-80 3.88％(V/V)、甲醛溶液10倍稀释液0.32％(V/V)、硬脂酸铝1.30％(V/V)、1％硫柳汞钠1.00％(V/V)。

5.动物试验

用3周龄SPF鸡100只，20只/组，分为5组，分别经皮下途径免疫不同抗原含量的禽流感(H9亚型)灭活疫苗(SZ株)灭活疫苗(A1、B1、C1、D1、E1)，0.3ml/羽。另设10只作对照不免疫。

免疫后21天，将免疫组及对照组分别采血分离血清。使用1％鸡红细胞，按照《中华人民共和国兽药典》(2010年版)附录12中方法，进行HI抗体效价测定。结果详见表3。

于免疫后21天采血完成后，将免疫组及对照组各随机分为2个亚组，10只/免疫亚组，5只/攻毒对照亚组。每个免疫或对照亚组分别用SZ株(CCTCC V201240)及HL株(见文献：禽流感病毒(H9N2亚型，HL株)与国内部分省禽流感病毒(H9亚型)流行株抗原相关性及交互免疫的研究，2007年畜牧兽医学会年会论文集，2007，35-38，申请人持有此毒株，并愿意按专利法相关规定自申请日起20年内向公众发放)进行攻毒。

攻毒前将病毒尿囊原液用生理盐水进行稀释，通过静脉注射途径攻毒，每只0.2ml(含10^7.0EID₅₀)。攻毒后第5天，采集气管与泄殖腔拭子，将采自同一只鸡的两种拭子混合后作为一个样品，接种于10日龄SPF鸡胚，5枚/样。37℃继续孵育，每日照检，死胚及时取出(24小时内死胚弃去)并检测鸡胚液血凝价，至接种后5天，将剩余活胚全部冻死后，逐胚测定血凝价，以5枚鸡胚中至少有1枚鸡胚液血凝价≥1∶16(微量法)判为感染。对病毒感染为阴性的鸡胚，应盲传1次，再测定血凝价。结果详见表6。

表3 不同抗原含量的疫苗免疫后抗体及攻毒保护结果

SZ株及HL株攻毒后，各免疫组的排毒率分别为1/10～0/10，各攻毒对照组的排毒率均较高，均为5/5。各免疫组与对照组之间差异显著。说明将SZ株以不同抗原含量(灭活前病毒含量为10^6.5～10^8.5EID₅₀/0.1ml)配苗均可产生良好的保护。

实例3：毒株交叉免疫原性

为研究H9亚型禽流感病毒SZ株(CCTCC V201240)对其它毒株的交叉保护性，按照实例2中疫苗的制备方法，分别制备了禽流感(H9亚型)灭活疫苗(HL株)(简称HL株灭活疫苗)、禽流感(H9亚型)灭活疫苗(SZ株)(简称SZ株灭活疫苗)、及含有HL及SZ两种抗原(抗原配比为1∶1，V/V)的灭活疫苗(简称HL+SZ株灭活疫苗)，分别免疫SPF鸡(购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)，免后3周选用HL株及SZ株分别攻击，并进行病毒分离。结果显示，HL株灭活疫苗免疫组的排毒率分别为0/10、4/10，SZ株灭活疫苗免疫组的排毒率分别为0/10、0/10，SZ+HL株灭活疫苗免疫组的排毒率分别为0/10、0/10，而攻毒对照组的排毒率分别为5/5、4/5。说明SZ株灭活疫苗对两株病毒的攻击均产生了有效保护，交叉免疫原性良好。

1.材料

H9亚型禽流感病毒HL株(见文献：禽流感病毒(H9N2亚型，HL株)与国内部分省禽流感病毒(H9亚型)流行株抗原相关性及交互免疫的研究，2007年畜牧兽医学会年会论文集，2007，35-38)，申请人持有此毒株，并愿意按专利法相关规定自申请日起20年内向公众发放。

禽流感(H9亚型)灭活疫苗(HL株)灭活疫苗、禽流感(H9亚型)灭活疫苗(SZ株)灭活疫苗、禽流感(H9亚型)灭活疫苗(SZ+HL株)灭活疫苗均按照实施例2中方法制备。

SPF种蛋及SPF鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，种蛋自行孵化至10日龄左右用于接种。

2.方法与结果

(1)攻毒用病毒液的增殖与滴度测定

取H9亚型禽流感病毒SZ株(CCTCC V201240)及HL株毒种，分别用无菌生理盐水稀释至10^-3(取病毒液0.1ml加入到0.9ml无菌生理盐水中，震荡混匀后依此再稀释2次)，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚(使用购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司的SPF种蛋自行孵化)，每胚0.1ml(含10⁵EID₅₀)。接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。至96小时，取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。将冷却后的鸡胚收获胚液。所收获病毒液取样，按照《中华人民共和国兽药典》(2010年版)附录12及附录7中方法，分别检测病毒液的HA效价及EID₅₀含量，结果见表4。

表4 病毒增殖后HA效价及EID₅₀含量

(2)动物试验

3周龄SPF鸡分3组，每组20只，分别经皮下途径免疫禽流感(H9亚型)灭活疫苗(HL株)灭活疫苗、禽流感(H9亚型)灭活疫苗(SZ株)灭活疫苗及禽流感(H9亚型)灭活疫苗(SZ+HL株)灭活疫苗，0.3ml/羽。另设10只作对照不免疫。

免疫后21天，将3组免疫组及对照组分别采血分离血清。使用1％鸡红细胞，按照现行《中华人民共和国兽药典》(2010年版)附录12中方法，进行HI抗体效价测定。结果详见表5。

表5 HI抗体检测结果

于免疫后21天采血完成后，将各免疫组及对照组各随机分为2个亚组，10只/免疫亚组，5只/攻毒对照亚组。每个免疫或对照亚组分别用SZ株及HL株进行攻毒。

表6 各组攻毒后病毒分离结果

HL株及SZ株分别攻毒后，HL株灭活疫苗免疫组的排毒率分别为0/10、4/10，SZ株灭活疫苗免疫组的排毒率分别为0/10、0/10，SZ+HL株灭活疫苗免疫组的排毒率分别为0/10、0/10，而攻毒对照组的排毒率分别为5/5、4/5。

上述结果表明，HL株灭活疫苗免疫组未能对SZ株攻击产生良好保护，而SZ株灭活疫苗免疫鸡对HL株或SZ株的攻击均产生了良好的保护，说明SZ株交叉免疫原性良好。

同时，SZ+HL株灭活疫苗也产生了理想的保护效果，说明向疫苗中补充SZ毒株可显著提高疫苗的交叉免疫原性。证明只要具备其血凝素蛋白的HA1结构域氨基酸序列具有以下特征性位点：69位P；180位A；221位N及236位R，的毒株的抗原组合物均具备良好的交叉保护作用。

实例4：免疫效果与现有技术的对比

将实施例2制备的禽流感疫苗与同类制品进行了免疫效力比较。对30日龄SPF鸡进行免疫，免疫后21日测定HI抗体效价并进行攻毒。结果显示，“禽流感(H9亚型)灭活疫苗(SZ株)”的攻毒保护效果优于同类产品。

1.材料

实施例2中制备的禽流感(H9亚型)灭活疫苗(C组)。

按照中国专利CN101843900B中方法制备的禽流感(H9亚型)灭活疫苗(HN307株)。

H9 AIV SZ株(CCTCC V201240)毒种，病毒含量10^8.17EID₅₀/0.1ml。

SPF种蛋与SPF鸡均购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

2.方法

30日龄SPF鸡20羽分为2组，10羽/组，分别免疫上述2种疫苗，免疫采用疫苗推荐剂量。另设对照组10只不免疫。免后21天采血并分离血清，按《中华人民共和国兽药典》(2010年版)附录12中方法进行HI抗体效价测定。同时，使用H9 AIV SZ株(CCTCC V201240)攻击各免疫及对照组，通过静脉注射途径攻毒，每只0.2ml(含10^7.0EID₅₀)。

3.结果

上述试验鸡于免疫21天，测定血清H9 AIV HI抗体效价并进行攻毒，试验结果见表7。

表7 禽流感(H9亚型)灭活疫苗(SZ株)与同类产品的效力比较

注：“-”表示无此项内容。

抗体检测结果可见，免疫后21天，禽流感H9亚型SZ株灭活疫苗免疫组的H9 AIV HI抗体效价的几何平均值为8.7log₂，同类禽流感H9亚型HN307株灭活疫苗免疫组的H9 AIV HI抗体效价的几何平均值为8.5log₂，对照组H9 AIV HI抗体效价均为阴性。禽流感H9亚型SZ株灭活疫苗与禽流感H9亚型HN307株灭活疫苗所诱生的HI抗体水平基本一致，无显著性差异。攻毒结果表明，禽流感H9亚型SZ株灭活疫苗免疫组对SZ株的攻击产生了理想的保护，病毒分离率低于同类产品，说明其攻毒保护效力优于同类产品。本是实实施例证明只要要具备其血凝素蛋白的HA1结构域氨基酸序列具有以下特征性位点：69位P；180位A；221位N及236位R，的毒株的抗原组合物均具备良好的免疫效力，效果优于现有技术毒株尤其在病毒分离率上。

实施例5：抗新城疫、禽流感(H9亚型)疫苗组合物制备

1.种毒

NDV采用La Sota株，毒种每0.1ml病毒含量为10^8.45EID₅₀/0.1ml，血凝价HA为1∶640，无细菌生长；AIV采用SZ株，毒种每0.1ml病毒含量为10^8.15EID₅₀/0.1ml，血凝价HA为1∶640，无细菌生长。详见表8。

表8 制苗用毒种

2.制苗用毒液的制备和检验

(1)ND制苗用病毒液的制备

将新城疫病毒La Sota株毒种用灭菌生理盐水稀释1000倍，经尿囊腔接种10日龄易感鸡胚(蛋黄HI抗体不高于1∶64)，每胚0.1ml。接种后密封针孔，置37℃继续孵育，不必翻蛋。鸡胚接种后，每天照蛋1次，将24小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每隔4～6小时照蛋1次，死亡的胚随时取出，至120小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却。将冷却12～24小时的鸡胚取出，无菌收获鸡胚液。同时测定HA，HA低于1∶128者弃去，同时作无菌检验，均无菌生长。置-15℃以下保存备用。按照上述方法连续制备3批病毒液。

(2)AIV SZ株制苗用毒液的制备

取检验合格的SZ株毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释1000倍，经尿囊腔内接种10日龄易感鸡胚(蛋黄HI抗体不高于1∶16)，每胚0.1ml。接种后密封针孔，置37℃继续孵育，不必翻蛋。鸡胚接种后，每天照蛋1次，将24小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每隔4～6小时照蛋1次，死亡的胚随时取出，至96小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却。将冷却12～24h的鸡胚取出，无菌收获鸡胚液。同时测定HA，HA低于1∶128者弃去，同时作无菌检验，均无菌生长。置-15℃以下保存备用。按照上述方法连续制备3批病毒液。

(3)制苗用毒液的浓缩

使用进口MILLIPORE超滤浓缩装置。该装置有两部分组成，一是病毒鸡胚液预过滤装置，为聚丙烯滤柱，滤过孔径为0.45μm，可滤除细菌和细微颗粒残渣。二是超滤浓缩装置，此装置使用医用不锈钢膜包夹具和管道，动力装置为不锈钢蠕动泵和专用硅胶管，超滤膜包的滤过孔径分子量为10万道尔顿，超滤装置的进液口和回流口均有压力表，以控制系统的压力，保证超滤浓缩过程的安全和高效。

将NDV或AIV鸡胚液先用灭菌的100目/cm²的不锈钢网进行粗滤，除去大颗粒杂质，再用消毒的聚丙烯滤柱进行预过滤。经预过滤的病毒液反复通过消毒的超滤装置，直至达到浓缩终点，即将2种病毒液分别浓缩2倍。结果见表9、表10。

表9 制苗用NDV La Sota株毒液浓缩前后毒价测定

表10 制苗用AIV SZ株毒液浓缩前后毒价测定

(4)制苗用毒液的灭活

向浓缩后的La Sota株和SZ株病毒液，分别加入10倍稀释的甲醛溶液(国药集团化学试剂有限公司，批号为20100918)(配制方法为：取分析纯甲醛1容积份与生理盐水9容积份进行均匀混合)，使甲醛溶液的终浓度为0.1％，充分摇匀后，置37℃温度下进行灭活，待病毒液升温至37℃时，开始计算计时，灭活16小时。灭活完成后，放2～8℃保存，保存时间不超过1个月。

(5)制苗用毒液的检验

①无菌检验

分别取浓缩后的La Sota株和SZ株病毒液，按《中华人民共和国兽药典》(2010年版)附录42中方法进行无菌检验，均无菌生长，结果详见表11。

②灭活检验

取灭活后的La Sota株和SZ株病毒液，分别接种10日龄SPF鸡胚6个，每胚接种灭活毒液0.2ml，每日照蛋3次，观察5日，鸡胚非特异死亡应不超过1个。对所有鸡胚液分别测定血凝价，均不出现血凝性，判为灭活完全。如有可疑，将可疑胚液进行重检，重检不合格者报废。以上结果见表11。

表11 浓缩病毒液的灭活与检验

3抗新城疫、禽流感(H9亚型)疫苗组合物的乳化与分装

(1)油相制备

取注射用白油(杭州石化责任有限公司产品，批号为20101002)94容积份和司本-80(广东肇庆超能实业有限公司产品，批号为20100806)6容积份混合后，加硬脂酸铝(上海裕明实业有限公司，批号为20101003)2质量份，加热至透明，经121℃60分钟高压灭菌后冷却备用，即为油相。

(2)水相制备

经灭活检验合格的La Sota株和SZ株病毒液，按1∶1的比例等量混合，按4％(V/V)加入灭菌后的吐温-80(广东肇庆超能实业有限公司产品，批号为20101012)，充分混合均匀，即成水相。

(3)乳化取油相3份置油相罐内，开动电机慢速搅拌，然后徐徐加入1份水相，加完后转入乳化罐中，再以2800r/min乳化40min即可。在乳化终止前加入1％硫柳汞，使其终浓度为0.01％，乳化后，取3～5ml以3000r/min离心15min，应不出现分层现象。

(4)分装定量分装，每瓶100ml，加盖密封后置2～8℃保存。

4.抗新城疫、禽流感(H9亚型)疫苗组合物检验

对3批抗新城疫、禽流感(H9亚型)疫苗组合物进行了成品检验，包括性状、无菌检验、安全检验、效力检验、甲醛及硫柳汞残留量测定等全面检验。

(1)性状的检验

外观均为乳白色均匀乳剂。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，均呈油滴状，不扩散。剂型均呈油包水型。吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min检测稳定性，管底析出水相不超过0.5ml。按照《中华人民共和国兽药典》(2010年版)附录28中方法测定黏度，均不超过200cP。结果详见表12。

表12 性状检验

(2)无菌检验

按照《中华人民共和国兽药典》(2010年版)附录42中方法，对抗新城疫、禽流感(H9亚型)疫苗组合物进行检验，均无菌生长。结果详见表13。

表13 无菌检验报告

(3)安全检验用2～3周龄SPF鸡10只，各肌肉或皮下注射抗新城疫、禽流感(H9亚型)疫苗组合物1.0ml，观察14日，均未出现因注射疫苗而出现的任何局部和全身反应。结果详见表14。

表14 安全检验

(4)效力检验

采用血清学方法进行鸡新城疫部分效力检验。用30～60日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射抗新城疫、禽流感(H9亚型)疫苗组合物20μl，另5只作对照。接种后21～28日，每只鸡各采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值均不低于4log₂，未免疫对照组HI抗体效价均不高于2log₂。结果详见表15。

表15 抗新城疫、禽流感(H9亚型)疫苗组合物的鸡新城疫部分效力检验

注：表中HI抗体效价为几何平均值

采用血清学方法进行禽流感(H9亚型)部分效力检验。用30日龄左右SPF鸡15只，10只各颈部皮下或肌肉注射抗新城疫、禽流感(H9亚型)疫苗组合物0.3ml，另5只作对照。接种后21日，每只鸡各采血，分离血清，用禽流感病毒H9亚型抗原测定HI抗体。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于6.5log₂，对照组HI抗体效价的几何平均值应不高于2log₂。结果详见表16。

表16 抗新城疫、禽流感(H9亚型)疫苗组合物的禽流感(H9亚型)部分效力检验

注：表中HI抗体效价为几何平均值

(5)甲醛、硫柳汞含量测定

分别按照《中华人民共和国兽药典》(2010年版)附录20及附录10中方法进行，均符合兽用生物制品通则的规定。结果详见表17。

表17 抗新城疫、禽流感(H9亚型)疫苗组合物甲醛、硫柳汞含量测定

5 结论

制备了3批抗新城疫、禽流感(H9亚型)疫苗组合物，并对疫苗成品进行全面检验，结果显示疫苗安全、有效且质量可控。只要具备其血凝素蛋白的HA1结构域氨基酸序列具有以下特征性位点：69位P；180位A；221位N及236位R，的毒株的抗原组合物在联苗中也能发挥较好的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种H9亚型禽流感病毒分离株，其血凝素蛋白的HA1结构域氨基酸序列具有以下特征性位点：69位P；180位A；221位N及236位R。

2.根据权利要求1所述的H9亚型禽流感病毒分离株，其特征在于：其血凝素蛋白具有序列表SEQ NO.1的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的H9亚型禽流感病毒分离株，其特征在于：所述H9亚型禽流感病毒分离株为禽流感病毒H9亚型SZ株(AivanInfluenza Virus H9 subtype Strain SZ)，其保藏编号为：CCTCC NO：V201240，保藏于中国典型培养物保藏中心。

4.一种根据权利要求1～3中任意一项所述的H9亚型禽流感病毒分离株制得的疫苗组合物，其特征在于：所述疫苗组合物含有H9亚型禽流感病毒分离株和可药用载剂。

5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于：在所述疫苗组合物中，所述H9亚型禽流感病毒分离株灭活前含量为106.5～10^8.5EID₅₀/0.1ml。

6.根据权利要求5所述疫苗组合物，其特征在于：在所述疫苗组合物中，所述H9亚型禽流感病毒分离株灭活前含量为10^7.0～10^8.5EID₅₀/0.1ml。

7.根据权利要求6所述疫苗组合物，其特征在于：在所述疫苗组合物中，所述H9亚型禽流感病毒分离株灭活前含量为10^7.5～10^8.5EID₅₀/0.1ml。

8.根据权利要求1～3中任意一项所述的疫苗组合物，其特征在于：所述可药用疫苗佐剂包括油佐剂，其选自白油、角鲨烷或角鲨烯、德雷克油，以及其他动物油、植物油或矿物油。

9.根据权利要求1～3中任意一项所述的疫苗组合物，其特征在于：所述疫苗组合物还含有至少一种额外的家禽抗原，其选自抵抗鸡疱疹病毒、鸡贫血病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊炎病毒、减蛋综合症病毒以及呼肠孤病毒抗原。

10.根据权利要求4～9中任意一项所述的疫苗组合物在预防和治疗禽交叉免疫保护中的应用。