CN104195114A - 一种禽肺病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种禽肺病毒，为SHS/B株，已于2014年3月24日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9001。本发明的禽肺病毒用于制备疫苗。本发明筛选的禽肺病毒具有安全性好，且免疫原性高的特点，用禽肺病毒SHS/B株接种Vero细胞，收获细胞毒液，经甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。能提高SPF鸡的抗体，预防禽肺病毒引起的肿头、产蛋率下降等症状，此疫苗具有高效、安全性好的优点。

Description

一种禽肺病毒及其应用

技术领域

本发明属于家禽病源微生物筛选技术领域，具体涉及一种禽肺病毒及其在制备疫苗中的应用。

背景技术

禽肺病毒APV(Avian Pneumovirus)属于副黏病毒科肺病毒属，其基因组含有8个基因，分别为N、P、M、F、M2、SH、G、L。根据其G蛋白差异和血清学分析，APV分为A、B、C、D四个亚型。其中A型和B型分布最广，呈世界范围流行，以色列、巴西、莫斯科、日本、黑龙江以及大多数的欧洲国家等地区均有报道。该病毒主要引起鸡的肿头综合症，以流鼻涕、打喷嚏、眶下窦肿胀、头部肿胀和产蛋率下降等症状为主要特征，传染率、发病率可高达100％，死亡率随饲养管理和卫生条件而变化，若有混合感染，死亡率可高达25％～40％。该病传染性强，传播迅速，近年来该病呈现流行并蔓延趋势，能引起多种禽类感染发病并造成严重的经济损失，特别是种鸡的危害越来越严重。因此，就需要在国内分离并培育出一株毒力稳定、安全性、免疫原性好的禽肺病毒来制备疫苗，以预防该病毒对养殖业的侵袭。

发明内容

本发明的目的是提供一种禽肺病毒及其在制备疫苗中的应用；用该病毒制备的疫苗具有高效、安全性好、保护率高的优点，从而为鸡肿头综合征防控措施的制定提供可靠的依据。

本发明首先提供一种禽肺病毒已于2014年3月24日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9001。

上述的禽肺病毒为SHS/B株。

本发明的禽肺病毒用于制备疫苗，制备的疫苗为灭活疫苗。

本发明筛选的禽肺病毒具有安全性好，且免疫原性高的特点，用禽肺病毒SHS/B株接种Vero细胞，收获细胞毒液，经甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。能提高SPF鸡的抗体，预防禽肺病毒引起的肿头、产蛋率下降等症状，此疫苗具有高效、安全性好的优点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

一、禽肺病毒的分离

2010年在山东省多个种鸡场出现了肿头综合症的症状，而发病鸡群之前已经注射了已有的禽肺病毒疫苗，推测感染的病毒发生了变异；因此从发病个体中进行禽肺病毒的筛选。

取发病鸡的鼻甲骨、粘液，加入生理盐水，3000r/min离心10min，取上清液，用220nm的滤器过滤。将病料上清接种已培养纤毛摆动活泼的TOC上，然后吸取上清加到另一已培养24h的TOC上，以此传代。当出现纤毛停滞时，对培养上清进行RT-PCR鉴定。对阳性的TOC上清接种到Vero细胞上，37℃、5％CO₂培养箱中培养，每24h观察细胞病变，直到96h，冻融一次，取上清用Vero细胞传代。将出现细胞病变的上清液进行空斑纯化，纯化后的病毒传代后测定病毒含量。

二、筛选的禽肺病毒的培育及鉴定

1.培育 确定筛选的禽肺病毒为病毒SHS/B株，经PCR检测并测序为B亚型，经气管环培养2代后，出现明显的气管纤毛摆动停止，经Vero细胞培养驯化，病毒含量达10^5.0TCID₅₀/0.1ml以上。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明该毒株病毒含量为10^5.5TCID₅₀/0.1ml以上，最小免疫剂量为0.1ml，该病毒仅与禽肺病毒发生特异性反应，无细菌、支原体及外源病毒污染，适合作为制苗用毒株,已于2014年3月24日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9001。

2.鉴定

2.1 引物设计 参照已发表的B型APV F基因片段中核苷酸保守序列，采用Primer 5.0引物设计软件设计以下1对引物：

F1:5′-ATTAGGCAATGGCGTTCGCA-3′；

F2:5′-CTCCACCTCTGATGCAACAT-3′。

2.2 鉴定结果 对于本发明筛选的毒株进行RT-PCR检测，测序后进行blast分析，发现保藏编号为CGMCC No.9001的禽肺病毒的APV F基因与已报道的禽肺病毒的相对应的序列存在至少3-5个氨基酸的差异，推测上述的差异正是导致已有的禽肺病毒疫苗免疫效果不佳的原因所在。

该毒株作100倍稀释后，与等量禽肺病毒病抗血清中和，病毒均能被高免血清特异性中和；而与等量鸡新城疫病毒、禽流感病毒抗血清中和组，细胞呈现明显的细胞病变，可见该病毒特异性好。该病毒经翅静脉途径攻击后，病毒分离率为9/10以上，病毒分离物测序结果表明为禽肺病毒。该毒株制备的疫苗免疫SPF鸡后，能保护鸡免疫4个月内免受禽肺病毒的攻击。

2.3 毒种保存 由表内结果可见，本发明分离毒湿毒在-70℃保存36个月病毒含量仍较稳定。(参见表1)

表1：保存不同时间病毒含量测定

2.4 物理特性 APV对热敏感，56℃30min可灭活。对乙醚敏感，pH值3～9时稳定，无血细胞凝集素和神经氨酸酶。

三、制苗用抗原的制备

1.制苗用病毒液的制备 将毒种按培养液量的1％接种已长满单层的Vero细胞，置37℃、旋转培养，转速为每小时9～11转。接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况，当80％以上细胞出现CPE时，收获细胞培养物，反复冻融3次，-15℃以下保存。

2.灭活 将SHS/B株病毒液置于灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2％。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。

3.半成品检验

(1)病毒含量测定 用细胞维持液(含1％小牛血清的乳汉液)将毒液作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-63个稀释度，接种已长成单层的vero细胞96孔板，每个稀释度接种5孔，每孔0.1ml。同时设病毒对照孔和接种维持液的细胞对照孔，置37℃、5％CO₂培养箱中培养5日，仔细观察细胞出现病变的情况，每日观察2次，出现CPE者判为感染，计算TCID₅₀。

(2)无菌检验 取灭活的胚液，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

(3)灭活检验 将灭活后的病毒液作10倍稀释，接种于长势良好的Vero细胞，每个样品接种4瓶，每瓶1ml，37℃吸附1.5小时后弃去接种液，加维持液继续培养，同时设未接种的鸡胚成纤维细胞做空白对照，观察5日，样品瓶应不出现细胞病变。将培养物收获反复冻融3次后盲传一代，继续培养5日，样品瓶仍不出现细胞病变时，认为灭活完全。

四、疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。

(1)油相制备 取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－805份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

(2)水相制备 取灭菌后的吐温-805份，加入配液罐中，同时加混合抗原液95份，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

(3)乳化 取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

五、成品检验

(1)性状

外观 疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。

剂型 为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

黏度 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

(2)无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

(3)安全检验 用7～14日龄SPF鸡10只，每只分两点注射疫苗1ml(颈后部两侧皮下各注射0.5ml)，观察14日，记录试验鸡采食、饮水及临床情况。

(4)效力检验

①最小免疫剂量试验 用试制的APV灭活疫苗，以50μl、100μl、200μl免疫剂量分组免疫30日龄SPF鸡，每个免疫剂量免疫30只，并设非免疫对照鸡5只。于免疫后21日逐只编号，采血，测定APV ELISA抗体。同时攻击禽肺病毒强毒SHS/B株，每只鸡各翅静脉攻击10倍稀释的禽肺病毒SHS/B株，每只0.1ml(含10^4.3TCID₅₀)，观察14日。接种后5日，采集每只鸡的喉头拭子，经处理后，接种Vero细胞，5孔/样，每孔0.1ml，孵育观察4日，记录细胞病变，每个拭子样品接种的5孔中只要有1孔出现病变，即可判为病毒分离阳性；对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后，再进行判定，统计病毒分离率。

②免疫原性 用21～35日龄SPF鸡15只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另5只作对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，用禽肺病毒抗体检测试剂盒测定抗体。同时每只鸡各翅静脉攻击10倍稀释的禽肺病毒SHS/B株，每只0.1ml(含10^4.0TCID₅₀)，接种后5日，采集每只鸡的喉头拭子，经处理后，接种Vero细胞，5孔/样，每孔0.1ml，孵育观察4日，记录细胞病变，每个拭子样品接种的5孔中只要有1孔出现病变，即可判为病毒分离阳性；对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后，再进行判定。

③同类产品对比试验 用上述自制疫苗、某进口同类产品，分别按上述方法免疫SPF鸡，进行效力对比试验。

实施例1疫苗的制备及效果检测

一、制苗用病毒液的制备 将毒种按培养液量的1％接种已长满单层的Vero细胞，置37℃、旋转培养，转速为每小时9～11转。接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况，当80％以上细胞出现CPE时，收获细胞培养物，反复冻融3次，-15℃以下保存。(参见表2)。

表2：病毒液的制备

毒株名称	制苗材料	数量(ml)	收获毒液(ml)
				SHS/B株	Vero细胞	1000	1000

灭活 将病毒液倒入灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2％。加甲醛溶液后倒入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。

疫苗半成品检验

(1)病毒含量测定 TCID₅₀为10^5.38TCID₅₀/0.1ml。

(2)无菌检验 取灭活的胚液，按现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。

(3)灭活检验 将培养物收获反复冻融3次后盲传一代，继续培养5日，样品瓶仍无细胞病变，表明灭活完全。

二、疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计，参见表3)。

表3：疫苗乳化和分装

三、疫苗成品检验

(1)性状

外观 乳白色乳剂。

剂型 油包水型，取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水，呈油滴状不扩散。

稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。

黏度 按现行版《中国兽药典》附录进行，为48.6cp。

(2)无菌检验 按现行版《中国兽药典》附录进行,无菌生长。

(3)安全检验 用21日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗1.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，试验鸡全部健活,且均未出现任何因疫苗引起的局部和全身反应。

(4)效力检验

①最小免疫剂量试验 不同剂量免疫灭活苗后21日，用SHS/B株攻毒，从攻毒后病毒分离结果看：50ul/只组，喉头分毒率为60.0％(18/30)；100ul/只组，喉头分毒率为10％(3/30)；200ul/只组，喉头分毒率为0(0/30)，非免疫攻毒对照组，喉头分毒率为100％(5/5)。因此用SHS/B株攻毒后90％以上病毒分离保护的最小免疫剂量为100ul。(参见表4)

表4：毒种最小免疫剂量试验结果

注：①分离阳性率：分子为病毒分离阳性数，分母为攻毒数。

②免疫原性 疫苗接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，用禽肺病毒病ELISA试剂盒测定抗体。对照鸡均为阴性，免疫鸡均≥2000，同时将免疫鸡连同对照鸡，每只翅静脉攻击10倍稀释的禽肺病毒SHS/B株，每只0.1ml(含10^4.3TCID₅₀)，于攻毒后5日进行病毒分离。结果表明，对照鸡全部病毒分离阳性；免疫组均9/10保护。证明SHS/B株具有良好的免疫原性。(参见表5)

表5：疫苗的效力试验

③同类产品对比试验从抗体值来看，自制苗明显高于进口同类产品；从攻毒保护结果上看，自制的疫苗攻毒后90％保护，而同类产品的保护率为60％。由以上结果来看自制的疫苗优于同类产品。(参见表6)

表6：与同类产品效力对比试验

同时，用本发明保藏编号为CGMCC No.9001的禽肺病毒作为病源进行攻毒实验，对象分别为目前市售的禽肺病毒疫苗和本发明制备的疫苗，结果表明本发明疫苗的免疫效果更好，发病率远低于其市售疫苗(p＜0.05)，上述的结果也表明本发明所筛选的病毒与已报道的禽肺病毒存在遗传背景上的差异。

Claims (5)

1.一种禽肺病毒，其特征在于，所述的禽肺病毒于2014年3月24日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9001。

2.如权利要求1所述的禽肺病毒，其特征在于，所述禽肺病毒为SHS/B株。

3.权利要求1所述的禽肺病毒在制备疫苗中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为灭活疫苗。

5.权利要求1所述的禽肺病毒的培养方法，其特征在于，所述的培养方法是将禽肺病毒接种Vero细胞进行培养。