CN104491856A

CN104491856A - 一种禽肺病毒病灭活疫苗的生产方法

Info

Publication number: CN104491856A
Application number: CN201410742349.2A
Authority: CN
Inventors: 李陆梅; 宫晓; 刘新文; 程增青; 徐保娟; 朱艳梅; 范根成; 邹敏; 郭伟伟; 楚电峰; 杜元钊
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2014-12-07
Filing date: 2014-12-07
Publication date: 2015-04-08

Abstract

本发明公开了一种禽肺病毒病灭活疫苗的生产方法，包括如下步骤禽肺病毒繁殖、禽肺病毒灭活和灭活禽肺病毒乳化步骤；以Vero细胞进行病毒繁殖，方法简单可操作并且成本低，病毒收获量和含量最高；病毒灭活彻底且不影响病毒的免疫性；乳化工艺即有水相，也有油相，水油混合的工艺不但节省时间和成本、便于操作、生产工序简化，并且制备的疫苗的性状指标均合格，并经过上鸡试验验证，其安全性、效力性均比国外产品更稳定有效，产生抗体更快、抗体滴度更高、抗体有效期更长。

Description

一种禽肺病毒病灭活疫苗的生产方法

技术领域

本发明涉及一种禽肺病毒(APV)病灭活疫苗的生产方法，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

禽肺病毒(Avianpneumovims，APV)在上世纪70年代于南非首先分离到，此病在非洲、北美、南美、中东、远东都有发生。禽肺病毒可以感染多种禽类，可导致感染动物鼻气管炎、肿头征、产蛋下降等疾病，给禽类养殖造成严重的危害。近些年来，鸡群对禽肺病毒的感染愈来愈多，此病很容易引起继发感染疫病，给禽业养殖户带来很多烦恼。

美国于1989年分离到禽肺病毒，针对该病毒，应对的疫苗只有国外的活疫苗。抗原的灭活是关系到疫苗安全和有效的关键步骤之一，如果病毒灭活不彻底，可能存在潜在的疫苗安全隐患，而过量灭活又会影响病毒的免疫原性，影响产品的免疫效果。目前禽类的灭活疫苗在生产中许多还是采用鸡胚、鸭胚等等材料的某一部分来繁殖，造价比较高，并且疫苗效果不是特别好，而目前我国没有一家生产针对此病的疫苗。

因此，对于禽肺病毒灭火疫苗，必须在在生产工艺上做改进，不但可以有效的增强免疫效果，并且不存在潜在的安全隐患。

发明内容

本发明所要解决的技术问题针对现有技术存在的不足，而提供一种禽肺病毒病灭活疫苗的生产方法，工艺简单、节约时间和成本，制备的疫苗安全性、效力性均比国外产品更稳定有效，产生抗体更快、抗体滴度更高、抗体有效期更长。

本发明是通过下述技术方案实现的：

本发明首先提供一种禽肺病毒SHS/B病毒株，于2014年3月24日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9001。

一种禽肺病毒病灭活疫苗的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)禽肺病毒繁殖：按常规方法制备Vero单层细胞，培养液为MEM，将禽肺病毒SHS/B病毒株接种于Vero细胞上，接种量为培养液体积的0.5-1.5％；将接种病毒的细胞放置于37℃、CO₂培养箱中旋转培养，转速为7-13转/小时；每日观察2-4次，培养至60-90％以上病毒发生病变时收获病毒液；

(2)禽肺病毒灭活：向步骤1获得的病毒液中加入甲醛溶液，至甲醛溶液为总抗原量体积的0.1-0.05％，于37℃下、在150r/min速度摇床中灭活，灭活时间为10-24h；

(3)灭活禽肺病毒乳化：将步骤(2)的灭活禽肺病毒抗原与吐温-80按95:5体积的比例混匀后制备成水相，将白油、司本-80和硬脂酸铝按95:5:1的体积比例混匀后制备成油相；取油相1-3份于乳化罐中于2500-4000r/min条件下搅拌3-5min，再向乳化罐中加入1份水相，于2500-4000r/min条件下乳化20-50min后得禽肺病毒病疫苗，分装密封保存。

优选的，步骤1中所述的病毒接种量为培养液重量的1％，转速为9-11转/小时，培养至70-80％以上病毒发生病变时收获病毒液。

优选的，步骤2中所述的浓度为0.1％，灭活时间为16h。

优选的，步骤3中所述的水相和油相的重量比为1：2。

优选的，步骤3中所述的搅拌和乳化转速为3500r/min，乳化时间为30-40min。

本发明还提供一种禽肺病毒病灭活疫苗，是按照上述方法制备而成的。

本发明疫苗制备方法，以Vero细胞进行病毒繁殖，方法简单可操作并且成本低，病毒收获量和含量最高；病毒灭活彻底且不影响病毒的免疫性；乳化工艺节省时间和成本、便于操作、生产工序简化，检产品的性状指标均合格，并经过上鸡试验验证，其安全性、效力性均比国外产品更稳定有效，产生抗体更快、抗体滴度更高、抗体有效期更长。

附图说明

图1：本发明禽肺病毒病灭活疫苗的生产方法的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对禽肺病毒病灭活疫苗的生产方法进行详细的描述：

实施例1：

禽肺病毒SHS/B病毒株来源于山东省某养鸡场，由青岛易邦生物工程有限公司分离鉴定，已于2014年3月24日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9001，研究禽肺病毒繁殖的最佳条件：

(1)按常规方法制备Vero单层细胞，培养液为MEM，将禽肺病毒SHS/B病毒株接种于Vero细胞上，接种量为培养液体积的0.5％、1％、1.5％；将接种病毒的细胞放置于37℃、CO₂培养箱中旋转培养，转速为10转/小时；每日观察2-4次，培养至80％以上病毒发生病变时收获病毒液，并测定病毒含量，结果如表1所示：

表1：不同接种量对病毒含量的影响

接毒量	TCID₅₀/0.1ml
		0.5％	10^4.9
1％	10^5.3
		2％	10^5.3

由表1可知，1％接种量组的TCID₅₀明显高于0.5％接毒组，但与2％接毒组相当，但2％接毒量对种毒的需求量大，因此，实际操作时以培养液量的1％接种病毒为佳。

(2)按1％接种量接种后，放置于37℃、CO₂培养箱中旋转培养，转速分别为7、8、9、10、11、12、13转/小时；每日观察2-4次，培养至80％以上病毒发生病变时收获病毒液，并测定病毒含量，结果如表2所示：

表2：不同培养速度对病毒含量的影响

转速转/小时	7	8	9	10	11	12	13
								TCID₅₀/0.1ml	10^4.7	10^4.9	10^5.1	10^5.3	10^5.1	10^4.9	10^4.9

由表2可知，转瓶转速在每小时9～11转时的病毒含量较高，在10^5.1～10^5.3TCID₅₀。

(3)按1％接种量接种后，放置于35、36、37、38℃CO₂培养箱中旋转培养，10转/小时条件下培养；每日观察2-4次，培养至60％、70％、80％、90％以上病毒发生病变时收获病毒液，并测定病毒含量，结果如表3所示：

表3：不同培养温度和收获时间对病毒含量的影响

根据表1-表3，接种剂量为1％、培养温度为37℃、转速为10转/小时的繁殖条件最佳，当80％(即培养60-72h)以上细胞出现细胞病变时为最佳收获时间，并且按照上述最佳条件获得病毒液。

实施例2

将实施例最佳条件获得的病毒液进行灭活，并进行灭活条件的研究：

将病毒液加入甲醛溶液中，至甲醛溶液为总抗原量体积的0.1％、0.05％，于37℃下、150r/min速度摇床中灭活，自病毒液温度升至37℃开始计时，于4小时候开始抽样进行灭活检验，每2小时抽样一次，直至24小时并记录结果。

将不同浓度的甲醛溶液灭活后的病毒液作10倍稀释，接种于长势良好的Vero细胞，每个样品接种4瓶，每瓶1ml，37℃吸附1.5小时后弃去接种液，加维持液继续培养，同时设Vero细胞做空白对照，观察5日。将培养物收获反复冻融3次后盲传一代，继续培养5日，以样品瓶仍不出现细胞病变作为灭活合格指标。

将不同甲醛含量灭活后的抗原制成单苗后，免疫21日龄SPF鸡，各10只，观察免疫鸡的精神状况、采食饮水情况及注射局部有无病变，免后14日解剖，观察疫苗吸收情况，结果如表4和表5所示：

表4 不同浓度甲醛溶液灭活时间的确定

注：分子为接种细胞的正常瓶数，分母为接种细胞瓶数。

表5 APV抗原液不同甲醛含量灭活后制成单苗的安全性检验

不同甲醛含量制苗	免疫鸡数	临床症状	21天后解剖局部病变
				0.1％	10	正常	吸收良好，注射局部正常
0.05％	10	正常	吸收良好，注射局部正常

根据不同浓度甲醛溶液灭活时间和不同甲醛含量的抗原液制成单苗的安全性检验结果，我们所选的浓度对免疫鸡均无肉眼可见影响，考虑到甲醛的残留问题，我们在实际生产中，将APV抗原灭活条件确定为37℃条件，终浓度0.1％甲醛溶液灭活16小时。

实施例3

按照实施例2最佳灭活条件灭活病毒后，制备疫苗：

(1)将灭活禽肺病毒抗原与吐温-80按95:5体积的比例混匀后制备成水相；

(2)将白油、司本-80和硬脂酸铝按95:5:1的体积比例混匀后制备成油相；

(3)乳化转速、乳化时间与疫苗稳定性之间的关系试验：

取油相2份放于乳化罐内，开动电机，搅拌3～5分钟，加入水相1份；加完后再分别以2500r/min、3000r/min、3500r/min、4000r/min的乳化速率，分别乳化20分钟、30分钟、40分钟、50分钟，适时取出，测定其稳定性得出最佳乳化条件：

表6 乳化转速、乳化时间与疫苗稳定性之间的关系

(4)水相与油相比例试验：

以3500r/min的乳化速率乳化30-40min，按照水油比1:1、1:1.5、1:2、1:3的配比(先将油相放于乳化罐中，开动电机，搅拌3～5分钟，然后徐徐加入水相)制成疫苗后检验各组疫苗的外观、剂型、黏度、稳定性(3000r/min离心15分钟)，选出符合《中国兽药典》(二○一○年版)中灭活疫苗性状标准，且各项检测结果均符合质量标准规定的试验组产品进行后续试验：

表7 水相与油相比例试验

(5)疫苗免疫效力对比试验：

A、血清学方法：用21～35日龄SPF鸡15只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另5只作对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，用禽肺病毒ELISA诊断试剂盒测定抗体；

B、免疫攻毒法：用21～35日龄SPF鸡15只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另5只作对照。接种后21～28日，每只鸡各滴鼻攻击10倍稀释的禽肺病毒SHS/B株，每只0.1ml，接种后5日，采集每只鸡的喉头拭子，进行病毒分离；

表8 免疫效力试验

通过试验结果得出，并考虑到生产实际情况，节省时间，节约成本，便于操作，简化生产工序，保证抗原含量，我们根据大生产的乳化工艺确定乳化比例水相:油相为1:2，乳化方法定为3500r/min乳化30～40分钟为宜。

上述说明并非是对本发明专利的限制，在发明专利也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明专利的实质范围内所作出的变化、改型、添加或替换也应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种禽肺病毒SHS/B病毒株，于2014年3月24日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9001。

2.一种禽肺病毒病灭活疫苗，其特征在于，包括有经灭活的禽肺病毒抗原、佐剂和油相。

3.根据权利要求2所述的禽肺病毒病灭活疫苗，其特征在于，所述的佐剂为吐温-80，灭活禽肺病毒抗原与吐温-80的体积比为95:5，二者混匀后制备成水相。

4.根据权利要求2所述的禽肺病毒病灭活疫苗，其特征在于，所述的油相包括白油、司本-80和硬脂酸铝，三者的体积比例为95:5:1，三者混匀后制备成油相。

5.根据权利要求3或权利要求4所述禽肺病毒病灭活疫苗，其特征在于，所述的水相与油相的体积比为1:1-3。

6.权利要求2-5任一项所述的禽肺病毒病灭活疫苗的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)禽肺病毒繁殖：按常规方法制备Vero单层细胞，培养液为MEM，将禽肺病毒SHS/B病毒株接种于Vero细胞上，接种量为培养液体积量的0.5-1.5％；将接种病毒的细胞放置于37℃的CO₂培养箱中旋转培养，转速为7-13转/小时；每日观察2-4次，培养至60-90％以上病毒发生病变时收获病毒液；

(3)灭活禽肺病毒乳化：将步骤(2)的灭活禽肺病毒抗原与吐温-80按95:5的体积比例混匀后制备成水相，将白油、司本-80和硬脂酸铝按95:5:1的体积比例混匀后制备成油相；取油相1-3份于乳化罐中于2500-4000r/min条件下搅拌3-5min，再向乳化罐中加入1份水相，于2500-4000r/min条件下乳化20-50min后得禽肺病毒病疫苗，分装密封保存。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1中所述的病毒接种量为培养液重量的1％，转速为9-11转/小时，培养至70-80％以上病毒发生病变时收获病毒液。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2中所述的浓度为0.1％，灭活时间为16h。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3中所述的水相和油相的重量比为1:2。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3中所述的搅拌和乳化转速为3500r/min，乳化时间为30-40min。