CN102258777B - 用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备灭活疫苗和联苗的方法 - Google Patents

用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备灭活疫苗和联苗的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用鸡胚源细胞系繁殖IBDV制备疫苗的方法。其主要包括：①制苗用细胞DF-1的传代与培养；②繁殖IBDV HQ株细胞毒种；③繁殖制苗用病毒液；④制苗用毒液的浓缩、灭活；⑤制备新-法、新-支-法、新-支-减-法联苗其它病毒液的制备与浓缩；⑥灭活联苗的配比、乳化与分装。本发明生产工艺简单、稳定、易操作；消除了常规疫苗生产中存在的生物安全隐患，克服了疫苗大量生产受制于鸡胚的供应，成本下降，批间差异降低，病毒毒价和疫苗质量提高，为疫苗行业利用悬浮培养技术大规模培养病毒液的革新奠定了基础；生产出的传染性法氏囊病灭活疫苗与联苗安全性好、免疫效力高，对IBDV强毒攻击具有完全的免疫保护作用。

Description

用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备灭活疫苗和联苗的方法
技术领域
本发明涉及兽用生物物制品技术领域，具体涉及一种用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备灭活疫苗和联苗的方法。
背景技术
传染性法氏囊病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)属双股RNA病毒科，双股RNA病毒属，是一种主要侵害3～12周龄的雏鸡与青年鸡的高度接触性传染病，该病原主要破坏鸡的中枢免疫器官-法氏囊，造成机体的免疫抑制，导致感染雏鸡死亡和对(其他)致病因子的感染性增加、对(其他)疫苗的免疫应答能力下降，给养禽业造成严重的危害。目前，该病主要通过疫苗接种来防控。除给雏鸡使用活疫苗免疫外，通常还给种鸡注射灭活疫苗使雏鸡获得高的母源抗体，以保护其在生命早期不感染传染性法氏囊病病毒。
我国目前传染性法氏囊病灭活疫苗及其联苗的生产主要采用传统的转瓶原代细胞培养病毒液。转瓶原代细胞(成纤维细胞)培养法是培养细胞贴壁生长于玻璃培养瓶内壁上，技术成熟稳定，但培养病毒滴度不高，通常在10-6.0～6.5，且批间差异大，制苗时需加大浓缩倍数、增加生产成本。另外生产时要用大量鸡胚，不仅劳动强度大，而且仍存在外源病毒污染的安全隐患。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用鸡胚源细胞系生产法氏囊病毒液制备灭活疫苗及其联苗的方法，其生产工艺简单且稳定、易操作，病毒含量高、批间差异小，质量易控，可显箸提高疫苗产量和质量，更可为疫苗行业利用悬浮培养技术的革新奠定基础，生产出的传染性法氏囊病灭活疫苗与联苗安全性好、免疫效力高，对传染性法氏囊强毒攻击具有完全的免疫保护作用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备疫苗的方法，包括如下步骤：
(1)制苗用细胞的传代与培养：取鸡胚源性的DF-1细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；
(2)细胞毒种的繁殖：取生产用传染性法氏囊病毒HQ株CGMCC NO.4935毒种，按维持液体积量的1％接种于已长成良好单层的鸡胚传代细胞中，置37～38℃继续培养，细胞病变率达75％以上时收获细胞液；
(3)制苗用毒液的繁殖：取步骤(1)中已形成良好单层的上述细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种含1％法氏囊细胞适应毒HQ株的维持液，置37～38℃继续培养，当细胞病变达75％以上时收获毒液，-15℃以下保存；
(4)制苗用毒液的浓缩与灭活：将上步所得毒液浓缩至规定的毒价后，加入10％甲醛溶液，随加随摇，直至溶液中的甲醛终浓度为0.1％，置37℃灭活16小时，得传染性法氏囊病水相；
(5)配比、乳化与分装：按规定的配比取传染性法氏囊病水相和油相混配乳化后定量分装，加盖密封即成。
在所述步骤(4)中，将上步所得毒液浓缩至病毒含量≥4×107.0TCID50/0.1ml；再于所述步骤(5)中，取油相3份，传染性法氏囊病水相1份进行乳化后制成传染性法氏囊病灭活单疫苗。
在所述步骤(4)中，将上步所得毒液浓缩至病毒含量≥8×107.0TCID50/0.1ml后制成传染性法氏囊病水相；同时按下述步骤制备鸡新城疫水相：将鸡新城疫病毒接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.1ml，收获60～96h死胚与96h活胚的鸡胚液，将检验无菌、对1％鸡红细胞悬液凝集价≥1∶640的鸡胚液混合，浓缩至病毒含量≥2×108.0EID50/0.1ml、红细胞凝集价≥1∶1280，灭活后即成；再于所述步骤(5)中，分别取鸡新城疫水相和传染性法氏囊病水相1份，再各自与油相3份混合制成鸡新城疫、传染性法氏囊病两种单疫苗，再将该两种单疫苗等体积充分混合即制成鸡新城疫、传染性法氏囊病二联灭活疫苗。
在所述步骤(4)中，将上步所得毒液浓缩至病毒含量≥12×107.0TCID50/0.1ml后制成传染性法氏囊病水相；同时按下述步骤制备鸡新城疫水相：将鸡新城疫病毒接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.1ml，收获60～96h死胚与96h活胚的鸡胚液，将检验无菌、对1％鸡红细胞悬液凝集价≥1∶640的鸡胚液混合后，再浓缩至病毒含量≥3×108.0EID50/0.1ml、红细胞凝集价≥1∶3×640，灭活后即成；并以下述步骤制备传染性支气管炎水相：将传染性支气管炎病毒接种10日龄SPF鸡胚，培养收获毒液后将含毒鸡胚液浓缩至病毒含量≥3×106.0EID50/0.1ml，灭活后即成；再于所述步骤(5)中，分别取鸡新城疫水相、传染性法氏囊病水相和传染性支气管炎水相1份，再各自与油相3份混合制成鸡新城疫、传染性法氏囊病、传染性支气管炎三种单疫苗，再将该三种单疫苗等体积充分混合即制成鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病三联灭活疫苗。
在所述步骤(4)中，将上步所得毒液浓缩至病毒含量≥16×107.0TCID50/0.1ml后制成传染性法氏囊病水相；同时按下述步骤制备鸡新城疫水相：将鸡新城疫病毒接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.1ml，收获60～96h死胚与96h活胚的鸡胚液，将检验无菌、对1％鸡红细胞悬液凝集价≥1∶640的鸡胚液混合，浓缩至病毒含量≥4×108.0EID50/0.1ml、红细胞凝集价≥1∶4×640，灭活后即成；并以下述步骤制备传染性支气管炎水相：将传染性支气管炎病毒接种10日龄SPF鸡胚，培养收获毒液后将含毒鸡胚液浓缩至病毒含量≥4×106.0EID50/0.1ml，灭活后即成；且以下述步骤制备减蛋综合征水相：产蛋下降综合征病毒接种10～11日龄易感鸭胚，每胚0.1ml，收获72～120h死胚和120h活胚的鸭胚液，将检验无菌、对1％鸡红细胞悬液凝集价≥1∶10240的鸭胚液混合后进行浓缩，浓缩至红细胞凝集价≥1∶4×10240，灭活后即成；再于所述步骤(5)中，分别取鸡新城疫水相、传染性支气管炎水相、减蛋综合征水相和传染性法氏囊病水相各1份，再各自与油相3份混合制成鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征水相和传染性法氏囊病四种单疫苗，再将该四种单疫苗等体积充分混合即制成鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、传染性法氏囊病四联灭活疫苗。
所述产蛋下降综合征病毒为Z16株，其保藏编号为CGMCC NO.4934。
所述传染性支气管炎病毒为M41株。
所述鸡新城疫病毒为La Sota株。
所述细胞生长液含含90％DMEM/F12(GIBCO 12500)、10％胎牛血清、90～110U/ml抗菌素，其pH 7.2～7.3、DO(溶氧)体积百分含量30％～60％。
所述维持液含98％DMEM/F12、2％胎牛血清、90～100U/ml抗菌素，其pH 7.2～7.3、DO 30％～50％(溶氧)。
本发明具有积极有益的效果：
(1)用鸡胚源传代细胞系替代鸡胚成纤维细胞或鸡胚繁殖传染性法氏囊病毒制备灭活疫苗可避免用鸡胚和原代细胞生产的生物安全隐患，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生产出来的疫苗纯粹，确保疫苗的安全性。
(2)采用本发明培养的法氏囊病毒液病毒含量可提高8～10倍，用高滴度的抗原制造的传染性法氏囊病灭活疫苗可大大提高疫苗的免疫效力，经免疫攻毒试验结果显示，对鸡传染性法氏囊病强毒的攻击能100％保护。
(3)用细胞系生产传染性法氏囊病毒液各批间质量差异小，提高了疫苗质量，又克服了疫苗大量生产受制于鸡胚的供应，节省了生产成本。另外还具有生产工艺简单、稳定、易操作、产量大、成本低等特点，更为疫苗行业利用悬浮培养技术的革新奠定基础，因而有很好的经济效益和应用前景。
本发明所述传染性法氏囊病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)HQ株，已于2011年6月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，该传染性法氏囊病毒的保藏编号为CGMCC NO.4935。
本发明所述产蛋下降综合征病毒Z16株，已于2011年6月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，该传染性法氏囊病毒的保藏编号为CGMCC NO.4934。
附图说明
图1为本发明方法的工艺流程图。
具体实施方式
实施例1传染性法氏囊病毒HQ株的分离、培育、鉴定过程
上世纪90年代初期，国际上流行的传染性法氏囊超强毒传入中国，引起未免疫的雏鸡大批发病和死亡，死亡率高达40～60％。发明人于1992年6月在郑州郊区的一个发病鸡场中收取鸡亡鸡只的法氏囊用于病毒分离。HQ株囊毒是从暴发传染性法氏囊病的鸡群中分离的超强毒株，HQ株细胞毒是自然囊毒经鸡胚囊源细胞、鸡胚肾细胞、鸡胚成纤维细胞多次传代、训化而成的，经过培育、训化后细胞毒致病性减弱，对细胞的适应性大大增强，在成纤维细胞上的毒价，TCID50≤10-6.0/0.1ml；在DF-1细胞上的毒价，TCID50≤10-7.0/0.1ml；HQ株细胞毒经克隆纯化和外源病检测后，于2000年初委托中国兽医药品监察所作毒价检验，结论认为符合《鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、传染性法氏囊病四联灭活疫苗试行规程》的规定(报告编号：2000S004)。HQ株具有良好的免疫原性，是一株优秀的制苗毒株。
实施例2产蛋下降综合征病毒Z16株的分离、培育、鉴定过程
上世九十年代初期，国外早在76年就暴发的减蛋综合征(EDS-76)病传入中国，引起产蛋鸡大批发病。该病无明显的临床症状，但产蛋明显下降，白壳、软壳、畸型蛋大大增多。发明人于1993年5月在郑州郊区某养鸡场从发病鸡的输卵管内取样，在12日龄鸭胚上连续盲传4～5代，鸭胚出现有规律的死亡，且胚液出现血凝效价。随传代次数增多，血凝价逐步上升至最大值，HA效价可达2～8万以上。经有限稀释法克隆、纯化后于是1999年11月22日送山东斯帕法斯济南实验室进行外源病毒检测、于2000年初送中国兽药监察所进行种毒标准毒价鉴定(报告编号：2000S004)，检测结果均符合产蛋下降综合征病毒种毒要求，随后建立生产种子批，用于疫苗生产。
实施例3一种传染性法氏囊病灭活单疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)制苗用细胞的传代与培养：选用鸡胚源性传代细胞系DF-1，经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；细胞生长液的配方是：DMEM/F12(GIBCO 12500)含10％优级胎牛血清(武汉三利)，加适量的抗菌素(100U/ml)，pH调整为7.0～7.2；
(2)细胞毒种的繁殖：取生产用毒种，按维持液量的1％接种已长成良好单层的鸡胚传代细胞系，置37℃下继续培养，细胞病变率达75％以上时收获细胞液为生产种毒；
(3)制苗用毒液的繁殖：取已形成良好单层的上述细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种含1％法氏囊细胞适应毒的维持液，置37～38℃继续培养，当细胞病变达75％以上时收获毒液，-15℃以下保存，所用维持液的配方是：DMEM/F12，含2％优级胎牛血清(武汉三利)、加适量的抗菌素(100U/ml)，pH调整为7.0～7.2；
试验表明，鸡胚源DF-1细胞对HQ毒株非常敏感，将转瓶成纤维细胞培养病毒液改成转瓶DF-1细胞细胞培养病毒液，其毒价可提高1个滴度，即10倍。
(4)制苗毒液的检验：按《中华人民共和国兽药典》检验应无细菌、霉菌、支原体生长，细胞毒液每0.1ml病毒含量应≥107.0TCID50；
(5)制苗用毒液的浓缩与灭活：制备传染性法氏囊病灭活单疫苗时将病毒液浓缩至原体积量的1/4(病毒含量≥4×107.0TCID50/0.1ml)；灭活时甲醛的终浓度为0.1％，37℃下灭活16小时。
(6)灭活检验：取灭活后的细胞液，按5％接毒量接种已长成良好的单层鸡胚成纤维细胞，观察96小时，应不出现细胞病变。将细胞液传代培养1次，观察96小时，若不出现细胞病变，认为灭活完全。
(7)传染性法氏囊病灭活疫苗制备：灭活传染性法氏囊病病毒液后，取油相3份，传染性法氏囊病水相1份进行乳化后制成传染性法氏囊病灭活单疫苗。
实施例4一种新、法二联灭活疫苗的制备方法，其传染性法氏囊病水相的制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于：将所得制苗用毒液浓缩至原体积量的1/8(病毒含量≥8×107.0TCID50/0.1ml)，同时按下述步骤制备鸡新城疫水相：将鸡新城疫病毒La Sota株(购自中国兽医药品监察所)接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.1ml，收获60～96h死胚与96h活胚的鸡胚液，将检验无菌、对1％鸡红细胞悬液凝集价≥1∶640的鸡胚液混合，浓缩至原体积量的1/2～1/3(病毒含量≥2×108.0EID50/0.1ml、红细胞凝集价≥1∶1280)，灭活后即成；再于所述步骤(7)中，分别取鸡新城疫水相和传染性法氏囊病水相1份，再各自与油相3份混合制成鸡新城疫、传染性法氏囊病两种单疫苗，再将该两种单疫苗等体积充分混合即制成鸡新城疫、传染性法氏囊病二联灭活疫苗。
实施例5一种新、支、法三联灭活疫苗的制备方法，其传染性法氏囊病水相的制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于：将所得制苗用毒液浓缩至原体积量的1/12(病毒含量≥12×107.0TCID50/0.1ml)，同时按下述步骤制备鸡新城疫水相：将鸡新城疫病毒La Sota株(购自中国兽医药品监察所)接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.1ml，收获60～96h死胚与96h活胚的鸡胚液，将检验无菌、对1％鸡红细胞悬液凝集价≥1∶640的鸡胚液混合，浓缩至原体积量的1/3～1/4.5(病毒含量≥3×108.0EID50/0.1ml、红细胞凝集价≥1∶3×640)，灭活后即成；并以下述步骤制备传染性支气管炎水相：将传染性支气管炎病毒M41株(购自中国兽医药品监察所)接种10日龄SPF鸡胚，培养收获毒液后将含毒鸡胚液浓缩至原体积量的1/3～1/4.5(病毒含量≥3×106.0EID50/0.1ml)，灭活后即成；再于所述步骤(7)中，分别取鸡新城疫水相、传染性法氏囊病水相和传染性支气管炎水相1份，再各自与油相3份混合制成鸡新城疫、传染性法氏囊病、传染性支气管炎三种单疫苗，再将该三种单疫苗等体积充分混合即制成鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病三联灭活疫苗。
实施例6一种新、支、减、法四联灭活疫苗的制备方法，其传染性法氏囊病水相的制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于：将所得制苗用毒液浓缩至原体积量的1/16(病毒含量≥16×107.0TCID50/0.1ml)，同时按下述步骤制备鸡新城疫水相：将鸡新城疫病毒La Sota株(购自中国兽医药品监察所)接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.1ml，收获60～96h死胚与96h活胚的鸡胚液，将检验无菌、对1％鸡红细胞悬液凝集价≥1∶640的鸡胚液混合，再浓缩至原体积量的1/4～1/6(病毒含量≥4×108.0EID50/0.1ml)，灭活后即成；并以下述步骤制备传染性支气管炎水相：将传染性支气管炎病毒M41株(购自中国兽医药品监察所)接种10日龄SPF鸡胚，培养收获毒液后将含毒鸡胚液浓缩至原体积量的1/4～1/6(病毒含量≥4×106.0EID50/0.1ml)，灭活后即成；且以下述步骤制备减蛋综合征水相：产蛋下降综合征病毒Z16株(CGMCC NO.4934)接种10～11日龄易感鸭胚，每胚0.1ml，收获72～120h死胚和120h活胚的鸭胚液，将检验无菌、对1％鸡红细胞悬液凝集价≥1∶10240的鸭胚液混合后进行浓缩，浓缩至原体积量的1/4～1/6(红细胞凝集价≥1∶4×10240)，灭活后即成；再于所述步骤(7)中，分别取鸡新城疫水相、传染性支气管炎水相、减蛋综合征水相和传染性法氏囊病水相各1份，再各自与油相3份混合制成鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征水相和传染性法氏囊病四种单疫苗，再将该四种单疫苗等体积充分混合即制成鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、传染性法氏囊病四联灭活疫苗。
实施例7成品检验：
按照《中华人民共和国兽药典》、“鸡新城疫、传染性法氏囊病二联灭活疫苗制造及检验试行规程”、“鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病三联灭活疫苗制造及检验试行规程”、“鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、传染性法氏囊病四联灭活疫苗制造及检验试行规程”中成品检验规定。其中鸡传染性法氏囊病部分的效力检验：用21～28日龄SPF鸡20只，各肌肉或皮下注射疫苗0.5ml，30日后，连同条件相同的对照鸡20只，分别采血、分离血清，测定中和抗体，免疫鸡几何平均效价应≥1∶5000；对照鸡几何平均效价应≤1∶8；或经口接种鸡传染性法氏囊病病毒BC6-85株强毒，每只0.2ml(含2×104BID)，72小时后全部剖杀，检查法氏囊病病变。对照组应至少有16只鸡发病，免疫组应全部保护。
(1)按照实施例4中的方法制成的1001、1002、1003三批鸡新城疫、传染性法氏囊病二联灭活疫苗法氏囊病部分效力检验用28日龄SPF鸡各20只，分别肌肉注射上述二联苗，每只0.5ml；另用20只SPF鸡肌肉注射用原代成纤维细胞制备的二联苗作比较试验，30日后，连同条件相同的对照鸡20只，分别采血，用成纤维细胞和DF-1细胞测定中和抗体，免疫鸡几何平均效价均≥1∶5000；对照鸡几何平均效价应≤1∶8。同时经口接种鸡传染性法氏囊病BC6-85株强毒，每只0.2ml(含2×104BID)，72小时后全部剖杀，检查法氏囊病病变。对照组鸡全部发病，免疫组鸡全部保护。表明这三批鸡新城疫、传染性法氏囊病二联灭活苗均符合“试行规程”中“鸡传染性法氏囊部分”效力检验标准的要求。详细结果见表1。
表1二联灭活油苗(La Sota+HQ株)IBD效力试验
Figure GSB00000632619300101
表1中结果显示，1001～1003三批鸡新城疫苗、传染性法氏囊病二联疫苗的中和抗体水平为214.8～215.8，明显地高于规程要求的1∶5000(212.3)，也高于用原代成纤维细胞生产的法氏囊毒液制备的二联苗(212.6)；对强毒的攻击免疫组100％保护，对照组100％发病，具有完全的保护力。
(2)新-法二联、新-支-法三联、新-支-减-法四联灭活疫苗传染性法氏囊病部分最小免疫量测定
分别按上述实施例4、5、6中的方法和要求，分别制备上述含传染性法氏囊病的二联、三联、四联疫苗。每批用不含抗原的生理盐水制备的油乳剂稀释成1/2、1/4、1/8、1/16羽份，分别免疫28日龄SPF鸡各10只，肌注0.5ml/只，另设对照组鸡10只，不做任何免疫。免疫后30天采血，测定各组传染性法氏囊病的中和抗体和琼扩抗体水平，并用鸡传染性法氏囊病病毒强毒BC6-85株，经口接种，每只0.2ml(含2×104BID)，72小时后剖杀所有鸡，检查传染性法氏囊病病变。按照IBD效力检验的判定标准，中和抗体几何平均效价应≥1∶5000，对照鸡几何平均效价应≤1∶8；攻毒后对照组应至少有16只鸡有病变，免疫组应全部保护。确定能使IBD效力检验合格的最小免疫剂量，结果见表2。
表2鸡传染性法氏囊病细胞系灭活联苗的最小免疫量测定
Figure GSB00000632619300111
从表2中可见，新-法二联、新-支-法三联、新-支-减-法四联灭活疫苗的1/2、1/4、1/8、1/16头份中，IBD的血清学检查都达到了“质量标准”中的效力检验标准，但攻毒的结果在1/8头份中新法二联和新支法三联均未达到100％的保护。因此传染性法氏囊病联苗的最小免疫剂量为1/4头份，即125μl/每头份。

Claims (9)

1.一种用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备灭活疫苗的方法，包括如下步骤：
（1）制苗用细胞的传代与培养：取鸡胚源性的DF-1细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；
（2）细胞毒种的繁殖：取生产用传染性法氏囊病毒毒种，按维持液体积量的1%接种于已长成单层的DF-1鸡胚传代细胞中，置37～38℃下继续培养，细胞病变率达75%以上时收获细胞液；所述生产用传染性法氏囊病毒为HQ株，其保藏编号为CGMCC NO.4935；
（3）制苗用毒液的繁殖：取步骤（1）中已形成良好单层的上述细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种含1% 传染性法氏囊病毒HQ株的维持液，置37～38℃继续培养，当细胞病变达75%以上时收获毒液，-15℃以下保存，所述传染性法氏囊病毒HQ株的接种滴度为TCID50≤10-7.0；
（4）制苗用毒液的浓缩与灭活：将上步所得毒液浓缩至病毒含量≥4×107.0TCID50/0.1ml后，加入10%甲醛溶液，随加随摇，直至溶液中的甲醛终浓度为0.1%，置37℃灭活16小时，得传染性法氏囊病毒水相；
（5）配比、乳化与分装：取疫苗用油相3份，传染性法氏囊病毒水相1份混合乳化后制成传染性法氏囊病灭活单疫苗。
2.根据权利要求1所述的用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备灭活疫苗的方法，其特征在于，所述细胞生长液含90%DMEM/F12、10%胎牛血清、100U/ml抗菌素，其pH 7.2～7.3、DO体积百分含量30%～60%。
3.根据权利要求1所述的用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备灭活疫苗的方法，其特征在于，所述维持液含98%DMEM/F12、2%胎牛血清、100U/ml抗菌素，其pH 7.2～7.3、 DO 30%～50%。
4.一种用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备鸡新城疫、传染性法氏囊病二联疫苗的方法，包括如下步骤：
（1）、（2）、（3）步骤同权利要求1、2或3中的步骤（1）、（2）、（3）；
（4）将上步所得毒液浓缩至病毒含量≥8×107.0TCID50/0.1ml后灭活制成传染性法氏囊病毒水相；
（5）同时按下述步骤制备鸡新城疫病毒水相：将鸡新城疫病毒接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.1ml，收获60～96h之间的死胚的鸡胚液和96h后活胚的鸡胚液，将检验无菌、对1%鸡红细胞悬液凝集价≥1∶640的鸡胚液混合，浓缩至病毒含量≥2×108.0EID50/0.1ml、红细胞凝集价≥1∶1280，灭活后即成；
（6）分别取鸡新城疫病毒水相和传染性法氏囊病毒水相1份，再各自与疫苗用油相3份混合制成鸡新城疫、传染性法氏囊病两种单疫苗，再将该两种单疫苗等体积充分混合即制成鸡新城疫、传染性法氏囊病二联灭活疫苗。
5.一种用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病三联灭活疫苗的方法，包括如下步骤：
（1）、（2）、（3）步骤同权利要求1、2或3中的步骤（1）、（2）、（3）；
（4）将上步所得毒液浓缩至病毒含量≥12×107.0TCID50/0.1ml后灭活制成传染性法氏囊病毒水相；
（5）同时按下述步骤制备鸡新城疫病毒水相：将鸡新城疫病毒接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.1ml，收获60～96h之间的死胚鸡胚液与96h后活胚的鸡胚液，将检验无菌、对1%鸡红细胞悬液凝集价≥1∶640的鸡胚液混合后，再浓缩至病毒含量≥3×108.0EID50/0.1ml、红细胞凝集价≥1∶3×640，灭活后即成；
（6）并以下述步骤制备传染性支气管炎病毒水相：将传染性支气管炎病毒接种10日龄SPF鸡胚，培养收获毒液后将含毒鸡胚液浓缩至病毒含量≥3×106.0EID50/0.1ml，灭活后即成；
（7）分别取鸡新城疫病毒水相、传染性法氏囊病毒水相和传染性支气管炎病毒水相1份，再各自与油相3份混合制成鸡新城疫、传染性法氏囊病、传染性支气管炎三种单疫苗，再将该三种单疫苗等体积充分混合即制成鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病三联灭活疫苗。
6.一种用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备鸡新城疫、传染性支气管炎、产蛋下降综合征、传染性法氏囊病四联灭活疫苗的方法，包括如下步骤：
（1）、（2）、（3）步骤同权利要求1、2或3中的步骤（1）、（2）、（3）；
（4）将上步所得毒液浓缩至病毒含量≥16×107.0TCID50/0.1ml后灭活制成传染性法氏囊病毒水相；
（5）制备鸡新城疫病毒水相：将鸡新城疫病毒接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.1ml，收获60～96h之间的死胚鸡胚液与96h后活胚的鸡胚液，将检验无菌、对1%鸡红细胞悬液凝集价≥1∶640的鸡胚液混合，浓缩至病毒含量≥4×108.0EID50/0.1ml、红细胞凝集价≥1∶4×640，灭活后即成；
（6）制备传染性支气管炎病毒水相：将传染性支气管炎病毒接种10日龄SPF鸡胚，培养收获毒液后将含毒鸡胚液浓缩至病毒含量≥4×106.0EID50/0.1ml，灭活后即成；
（7）制备产蛋下降综合征病毒水相：产蛋下降综合征病毒接种10～11日龄易感鸭胚，每胚0.1ml，收获72～120h死胚的鸭胚液和120h活胚的鸭胚液，将检验无菌、对1%鸡红细胞悬液凝集价≥1∶10240的鸭胚液混合后进行浓缩，浓缩至红细胞凝集价≥1∶4×10240，灭活后即成；
（8）分别取鸡新城疫病毒水相、传染性支气管炎病毒水相、产蛋下降综合征病毒水相和传染性法氏囊病毒水相各1份，再各自与疫苗用油相3份混合制成鸡新城疫、传染性支气管炎、产蛋下降综合征和传染性法氏囊病四种单疫苗，再将该四种单疫苗等体积充分混合即制成鸡新城疫、传染性支气管炎、产蛋下降综合征、传染性法氏囊病四联灭活疫苗。
7.根据权利要求6所述的用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备鸡新城疫、传染性支气管炎、产蛋下降综合征、传染性法氏囊病四联灭活疫苗的方法，其特征在于，所述产蛋下降综合征病毒为Z16株，其保藏编号为CGMCC NO.4934。
8.根据权利要求6所述的用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备鸡新城疫、传染性支气管炎、产蛋下降综合征、传染性法氏囊病四联灭活疫苗的方法，其特征在于，所述传染性支气管炎病毒为M41株。
9.根据权利要求6所述的用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备鸡新城疫、传染性支气管炎、产蛋下降综合征、传染性法氏囊病四联灭活疫苗的方法，其特征在于，所述鸡新城疫病毒为La Sota株。
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