CN108300704B - 一种用传代细胞系悬浮培养传染性支气管炎病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用传代细胞系悬浮培养传染性支气管炎病毒的方法，包括：步骤1：取EB66细胞进行复苏与传代培养；步骤2：对步骤1所得EB66细胞进行鸡传染性支气管炎病毒的接种培养；步骤3：接毒后的EB66细胞每隔6‑12h进行取样，测定病毒的EID50，在病毒EID50达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的鸡传染性支气管炎病毒。本发明采用EB66细胞作为鸡传染性支气管炎病毒的培养基质，利用提供用全悬浮传代细胞系EB66细胞进行高效的病毒生产，有效提高支气管炎病毒的培育滴度，从而为实现鸡传染性支气管炎病毒疫苗的大规模培养，降低病毒的培育成本。

Description

一种用传代细胞系悬浮培养传染性支气管炎病毒的方法

技术领域

本发明涉及一种鸡传染性支气管炎病毒的全悬浮培养方法，特别涉及一种使用传代细胞系进行全悬浮培养鸡传染性支气管炎病毒的方法，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)作为一种急性、高度接触性的病毒性传染病，主要由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的，该病广泛流行于世界各地，是严重危害世界养禽业的重大传染病之一，被世界动物卫生组织(OIE)列为B类疫病。该病主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿系统和消化系统，表现出广泛的组织嗜性和高度的遗传变异性，可导致不同日龄、性别和品种的鸡只发生不同程度的疾病，且死亡率较高。此外，IBV还可侵害鸡的肾脏、生殖道、肠道、肌肉等器官，导致鸡只增重和饲料报酬率降低、产蛋鸡的产蛋量及产蛋品质下降，给养鸡业的生产带来巨大损失。

迄今为止，防治本病多采用弱毒株IB H120和IB H52生产鸡胚组织弱毒苗及IBM41生产的鸡胚组织灭活苗作为疫苗对鸡传染性支气管炎进行防治。但目前，该疫苗的生产主要采用传统的鸡胚接种收获尿囊液的方式，导致疫苗需要消耗大量SPF鸡胚，具有生产周期长、易污染的缺点，且每枚SPF鸡胚一次只能注射一个病毒毒株，在各类禽病大爆发的时候，该方法无法通过快速生产来满足养禽业对于疫苗的需求。

细胞悬浮培养是一种利用生物反应器来大规模培养动物细胞、生产生物制品的核心技术，是当前国际上生物制品生产的主流模式，其最大优势是通过更为精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量。随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。目前，已有报道采用传代细胞系Vero细胞系、BHK-21细胞系培养鸡传染性支气管炎病毒，但都因培养的病毒滴度过低或无法实现大规模全悬浮培养而无法真正取代传统的鸡胚接种培养法。

发明内容

本发明提供了一种用传代细胞系悬浮培养传染性支气管炎病毒的方法，提供用全悬浮传代细胞系EB66细胞生产鸡传染性支气管炎病毒的方法，有效提高支气管炎病毒的培育滴度，从而为实现鸡传染性支气管炎病毒疫苗的大规模培养。

本发明提供了一种用传代细胞系悬浮培养传染性支气管炎病毒的方法，包括：

步骤1：取EB66细胞进行复苏与传代培养；

步骤2：对步骤1所得EB66细胞进行鸡传染性支气管炎病毒的接

种培养；

步骤3：接毒后的EB66细胞每隔6-12h进行取样，测定病毒的EID₅₀，在病毒ED₅₀达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的鸡传染性支气管炎病毒。

进一步地，所述步骤2的鸡传染性支气管炎病毒接种方法为二阶培养法，所述步骤2的操作方式如下：待EB66细胞的密度培养生长至适于接毒时，进行鸡传染性支气管炎病毒的接种，待接毒完成后，将EB66细胞放回具有5％CO₂的培养箱中进行吸附0.5h-2h，吸附完成后补加病毒生产液，并放回到5％CO₂培养箱中继续培养。

进一步地，所述方法还包括步骤4：取步骤3所得培养后的传染性支气管炎病毒作为下一代病毒传代培养的种毒，并继续采用二阶培养法，将病毒接种至EB66细胞中进行病毒的传代驯化与增殖，并按此方法连续传代2-30代，最终收获传染性支气管炎病毒在EB66细胞系传代细胞中的适应毒。

进一步地，所述步骤1中EB66细胞复苏与传代培养方法如下：

从液氮中迅速取出EB66细胞，在37℃水浴锅中迅速融化，待EB66细胞完全融化后，将复苏细胞加入约复苏细胞30倍体积的培养基中，经离心机300g离心10min，倒掉上清液，加入培养基将细胞吹打重悬均匀，接种至三角摇瓶中，并放置于轨道摇床上进行悬浮培养，每天取样进行细胞计数并计算活率，待培养至第2-3天时，进行细胞传代，细胞经连续传代3代次以上，且细胞倍增速率稳定时，用于病毒的接种或者继续传代。

进一步地，所述步骤2中传染性支气管炎病毒接毒量为0.001MOI-1MOI，优选为0.01MOI。进一步地，所述步骤2中EB66细胞培养温度为35℃-37℃，优选为37℃；培养转速为130rpm-150rpm，优选为150rpm。

进一步地，所述步骤2中EB66细胞的接种密度为6×10⁶/mL-15×10⁶/mL时，用于传染性支气管炎病毒的接种，优选的，细胞密度为8×10⁶/mL～10×10⁶/mL时，用于接毒。

进一步地，所述步骤2中细胞接毒后在5％CO₂的培养箱中培养，培养温度为33℃35℃，优选为33℃；培养转速为110rpm-140rpm，优选为120rpm。

进一步地，所述病毒接种吸附完成后，需补加新的病毒生产培养基，补加比例为原工作培养基体积的1-3倍，优选为补加原工作体积2倍的生产培养基。

进一步地，所述步骤2中病毒的培养还需要补加TPCK胰酶，补加策略为接种病毒后的第0天、第1天、第2天、第3天分别补加1mg/L或接种病毒后的第0天一次性补加4mg/L，优选为第0天一次性补加4mg/L。

更进一步地，所述的EB66传代细胞培养基为CD210(健顺CD210)，该培养基属于无血清、化学界定培养基。

进一步地，所述的传染性支气管炎病毒为IBV(M41株)，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定、保管和供应。

本发明相对于现有技术，使用传代细胞系EB66细胞培养鸡传染性支气管炎病毒，利EB66细胞对病毒适应性好，使病毒的滴度提高，为鸡传染性支气管炎病毒的培养提供了一种新的、更好的培养基质，解决了鸡传染性支气管炎病毒无法在传代细胞中培养或培养适应性差的问题。同时，本发明通过选择EB66细胞系全悬浮传代细胞系进行鸡传染性支气管炎病毒的培养，不仅病毒滴度高，且可实现大规模全悬浮培养，具有广阔的前景及巨大的社会效益和经济效益。此外，本发明培养的传染性支气管炎病毒具有滴度高、免疫原性好的优点，且生产工艺简单，培养周期短，生产效率高，大大降低病毒的培育成本。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

本发明实施例1-4所用材料来源如下：

1细胞：全悬浮传代细胞系鸭EB66细胞；

2.无血清、化学界定培养基：CD210培养基。

实施例1-4所得传染性支气管炎病毒的EID₅₀检测方法如下：

取灭菌生理盐水对收获的传染性支气管炎病毒做10倍系列稀释，取3个适宜稀释度分为3组，每组分别向5个10日龄SPF鸡胚尿囊腔中按照每胚0.1ml病毒液的接种量来接种病毒，接种后的鸡胚置于36～37℃温度下继续孵育144h。24h以内死亡的鸡胚弃去不计，根据接种后24-144h的死胚及144h的活胚中具有胎儿失水、蜷缩、发育小等特异性病痕的鸡胚收获鸡胚液，并将使用同一稀释度病毒悬液接种的鸡胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，计算EID₅₀。

实施例1：不同接毒量对鸡传染性支气管炎病毒在EB66细胞中增殖的影响

本发明实施例1所用病毒为鸡传染性支气管炎病毒为IBV(M41株)，毒价为10^7.3EID₅₀/0.1mL，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定、保管和供应。

本发明实施例1鸡传染性支气管炎病毒(M41株)的培养方法如下：

步骤1：从液氮罐中取出冻存的EB66细胞株，置于37℃水浴中，融化后的细胞株加入到约30mL的EB66细胞系(健顺生物货号CD210)培养基中，经离心机以300g离心10min，去掉上清液，使用125mL三角摇瓶将细胞重悬于15mL的鸭胚细胞衍生的传代细胞系培养基中，将培养基置于37℃，5％CO₂培养箱中，将轨道摇床转速设置为150rpm，进行悬浮培养，第一天补充培养基10mL，第二天再次补充培养基10mL，第三天进行传代；

步骤2：对步骤1所得的EB66细胞株进行细胞密度计数，并接种至三角瓶中，使细胞的接种密度为0.35×10⁶cells/mL-0.75×10⁶cellsmL，将三角瓶置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养，并设定轨道摇床转速为150rpm，继续培养3天后，重复此方法进行继续传代，对连续传代三代次后的细胞进行扩增，用于病毒接种实验；

步骤3：取用第3代扩增至第4代的种子细胞200mL，并重复步骤2的操作，使细胞密度达到8.38×10⁶/mL；

步骤4：取步骤3所得细胞株分为四组，并将鸡传染性支气管炎病毒(M41株)按接毒量为1MOI、0.1MOI、0.01MOI、0.001MOI分别接种至各组中；接毒完成后，将四组细胞株放回至37℃、5％的CO₂培养箱中进行吸附培养1小时，轨道摇床转速为120rpm；吸附完成后补加2倍体积的病毒生产液，并放回到35℃、5％CO₂培养箱中继续培养，轨道摇床转速为120rpm；同时，按照接毒后第0天补加4mg/L的添加方法加入TPCK胰酶；鸡传染性支气管炎病毒种毒IBV(M41株)来源为肇庆大华农生物药品有限公司；

5.接毒后每隔12小时取样，进行EID₅₀的检测。

对实施例1取样检测EID₅₀，结果(表1)如下：

表1：不同接毒量对鸡传染性支气管炎病毒(M41株)在EB66细胞中增殖的影响

接毒量(MOI)	EID<sub>50</sub>/0.1mL
		1	10<sup>3.83</sup>
0.1	10<sup>5.33</sup>
		0.01	10<sup>6.5</sup>
0.001	10<sup>6</sup>

从表中可以看出，鸡传染性支气管炎病毒(M41株)在EB66细胞中的培养效果受到接毒量的影响，在接毒量过低或者过高都不能达到最佳的培养效果，当接毒量为0.01MOI时，所得到传染性支气管炎病毒的EID50滴度最高(高达106.5/0.1mL)，因此后续的鸡传染性支气管炎病毒传代驯化按此比例进行病毒的接种。

实施例2：不同TPCK补加策略对鸡传染性支气管炎病毒增殖的影响

本发明实施例2所用病毒来源为实施例1中收获的EID₅₀效价最高时的鸡传染性支气管炎病毒(M41株)。

本发明实施例2传染性支气管炎病毒的培养方法如下：

步骤1：本次实施案例中使用的细胞依然为实施案例1中继续传代的细胞，传代方法与细胞培养条件同实施例1；其中，EB66细胞接毒细胞代次限制为细胞工作库复苏后的3-30代之内；

步骤2：当步骤1中细胞生长至密度为8×10⁶/mL～10×10⁶/mL时，按接毒量为0.01MOI进行鸡传染性支气管炎病毒(M41株)的接种，将接种后的培养基分为两组，病毒培养条件除TPCK胰酶补加策略不同，其余与实施例1相同；其中，第1组的TPCK胰酶补加策略为在接毒后的第0天、第1天、第2天、第3天分别补加1mg/L的TPCK胰酶；第2组的TPCK胰酶补加策略为接毒后的第0天一次性补加4mg/L的TPCK胰酶；

步骤3：接毒后，每隔12h取样进行EID₅₀的检测，从而比较不同TPCK胰酶补加策略对传染性支气管炎病毒在EB66细胞中增殖的影响。

表2：不同TPCK补加策略对鸡传染性支气管炎病毒(M41株)在EB66细胞中增殖的影响

如上表中可以看出，两种不同的TPCK胰酶补加方法并不会影响鸡传染性支气管炎病毒在EB66细胞中的增殖。但为了试验操作的简便，选择接毒后第0天一次性补加4mg/L的TPCK胰酶进行补加。

实施例3：鸡传染性支气管炎病毒在EB66细胞培养中不同收获时间的EID₅₀比较

本发明实施例3所用病毒来源为实施例2中收获的EID₅₀效价最高时的鸡传染性支气管炎病毒(M41株)。

本发明实施例3传染性支气管炎病毒的培养方法如下：

1.对EB66细胞进行传代及培养，本次实施案例中使用的细胞依然为实施案例1中继续传代的细胞，传代方法与细胞培养条件同实施例1；其中，鸭胚细胞衍生的传代细胞系接毒细胞代次限制为细胞工作库复苏后的3-30代之内；

2.当步骤1中细胞生长至密度为8×10⁶/mL～10×10⁶/mL时，按接毒量为0.01MOI进行传染性支气管炎病毒的接种，接毒方法和病毒培养条件均采用实施例1、2所优化的最佳条件，在接毒24h后开始采样，并每隔6h进行后续取样；

3.对各个时间段收获的传染性支气管炎病毒进行EID₅₀的检测，探索鸡传染性支气管炎在鸭胚细胞衍生的传代细胞培养中的最佳收毒时间。

表3：鸡传染性支气管炎病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞培养中不同收获时间的EID₅₀比较结果如下

从表中可以看出，鸡传染性支气管炎病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞培养中的最佳收毒时间为36h-42h左右。因此，后续的收毒时间定为36h-42h之间。

实施例4：鸡传染性支气管炎病毒在EB66细胞中的传代驯化

本发明实施例4所用材料来源为实施例3收获的EID₅₀效价最高时的鸡传染性支气管炎病毒(M41株)。

本发明实施例4传染性支气管炎病毒的培养方法如下：

1.对鸭胚细胞衍生的传代细胞进行传代及培养，本次实施案例中使用的细胞依然为实施案例1中继续传代的细胞，传代方法与细胞培养条件同实施例1；其中，EB66细胞系接毒细胞代次限制为细胞工作库复苏后的3-30代之内；

2.当步骤1中细胞生长至密度为8×10⁶/mL～10×10⁶/mL时，按接毒量为0.01MOI进行传染性支气管炎病毒的接种，接种的病毒来源为上一代中收获的EID₅₀最高时的鸡传染性支气管炎病毒，接毒方法和病毒培养条件采用的为经实施例1、2、3优化的最佳条件，按此方法将传染性支气管炎病毒(M41株)连续传代7代次，在对每代传染性支气管炎病毒(M41株)接毒后，每隔12h取样并进行EID₅₀的检测，取各代EID₅₀最高的传染性支气管炎病毒进行收集；

3.对各代收获滴度最高的传染性支气管炎病毒进行EID₅₀的检测，并列表(表4)如下：表4：传染性支气管炎病毒(M41株)在鸭胚细胞衍生的传代细胞中连续传代驯化后的EID₅

代次	EID<sub>50</sub>/0.1mL
		P1	10<sup>6</sup>
P2	10<sup>6.6</sup>
		P3	10<sup>6.5</sup>
P4	10<sup>7</sup>
		P5	10<sup>6.8</sup>
P6	10<sup>7.3</sup>
		P7	10<sup>7.5</sup>

从上表可以看出，随看鸡传染性支气管炎病毒(M41株)在EB66细胞中的连续传代驯化，鸡传染性支气管炎病毒在多次传代后能够很好的适应EB66细胞，达到提高传染性支气管炎病毒滴度的效果。经检测，EID50最高可达10^7.5/0.1ml，且病毒的滴度稳定。因此选择全悬浮传代细胞系EB66细胞作为鸡传染性支气管炎病毒培养的靶细胞具有非常广阔的前景。

本发明实施例1-4通过以EB66细胞作为鸡传染性支气管炎病毒的靶细胞，可有效解决鸡传染性支气管炎病毒无法在传代细胞中培养或培养适应性差的问题；同时本发明采用无血清化学界定的个性化培养基又可实现鸡传染性支气管炎病毒在EB66细胞中的全悬浮培养，大大提高了病毒培养规模和效率，降低培养成本，符合未来疫苗培养的必然趋势。更重要的是，根据申请人的测试，鸡新城疫、禽流感病毒在EB66细胞同样具有良好的适应性，因此，如果要进行细胞源多联苗生产时，本方法可以有效解决生产联苗需要用多种细胞、工艺复杂、很难保证批次稳定性的缺点，降低生产成本。

综上所述，由于传染性支气管炎病毒宿主范围窄，较难适应细胞培养，现有技术中对鸡传染性支气管炎病毒的培养主要靠鸡胚进行制备，而很少采用传代细胞的方式进行传染性支气管炎病毒培养。而本发明独创性的方法使用传代细胞系EB66细胞培养鸡传染性支气管炎病毒，达到病毒适应性好、滴度高的优点，为鸡传染性支气管炎病毒的培养提供了一种新的、更好的培养基质及方法，解决了鸡传染性支气管炎病毒无法在传代细胞中培养或培养适应性差的问题。

同时，本发明通过采用全悬浮传代细胞系EB66细胞进行传染性支气管炎病毒培养，培养简单方便，可实现全悬浮细胞的大规模培养，相比传统的鸡胚培养，大大提高了病毒培养规模和效率，符合未来疫苗培养的必然趋势，具有巨大的应用前景和社会经济效益。

此外，本发明方法具有培养的传染性支气管炎病毒病毒滴度高、免疫原性好的优点，且生产工艺简单，培养周期短，生产效率高，成本大大降低，适于传染性支气管炎病毒的推广生产。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用传代细胞系悬浮培养传染性支气管炎病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤1：取EB66细胞进行复苏与传代培养；

步骤2：待步骤l所得EB66细胞的密度培养生长至适于接毒时，采用二阶培养法对进行鸡传染性支气管炎病毒的接种，且传染性支气管炎病毒接毒量为0.001MOI-1MOI，待接毒完成后，将EB66细胞放回具有5％CO₂的培养箱中进行吸附0.5h-2h，吸附完成后补加病毒生产液，并放回到5％CO₂培养箱中继续培养；

步骤3：接毒后的EB66细胞每隔6-12h进行取样，测定病毒的EID₅₀，病毒EID₅₀达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的鸡传染性支气管炎病毒；

步骤4：取步骤3所得培养后的传染性支气管炎病毒作为下一代病毒传代培养的种毒，并继续采用二阶培养法，将病毒接种至EB66细胞中进行病毒的传代驯化与增殖，并按此方法连续传代2-30代，最终收获传染性支气管炎病毒在EB66细胞系传代细胞中的适应毒；

其中，步骤2中EB66细胞在接种病毒后还需要补加TPCK胰酶，补加策略为接种病毒后的第0天、第1天、第2天、第3天分别补加1mg/L的TPCK膜酶或接种病毒后的第0天一次性补加4mg/L的TPCK胰酶。

2.根据权利要求l所述的方法，其特征在于，所述步骤l中EB66细胞复苏与传代培养方法如下：

从液氮中迅速取出鸭胚细胞衍生的传代细胞，在37℃水浴锅中迅速融化，待EB66细胞完全融化后，将复苏细胞加入约复苏细胞30倍体积的培养基中，经离心机以300g离心10min，倒掉上清液，加入培养基将细胞吹打重悬均匀，并接种至三角摇瓶中，并放置于轨道摇床上进行悬浮培养，每天取样进行细胞计数并计算活率，待培养至第2-3天时，进行细胞传代，细胞经连续传代3代次以上，且细胞倍增速率稳定时，用于病毒的接种或者继续传代。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中EB66细胞培养温度为35℃-37℃，培养转速为130rpm-150rpm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中EB66细胞的接种密度为6×10⁶/mL-15×10⁶/mL，此时，用于传染性支气管炎病毒的接种。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中细胞接毒后在5％CO₂的培养箱中培养，培养温度为33℃-35℃；培养转速为110rpm-140rpm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述补加病毒生产培养基的补加比例为原工作培养基体积的1-3倍。