CN113122508A - 一株鸡传染性支气管炎细胞适应毒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株鸡传染性支气管炎细胞适应毒及其应用，属于疫苗生产领域。本发明的鸡传染性支气管炎细胞适应毒是将鸡传染性支气管炎病毒(IBV)在鸡胚和AGE1细胞交替传代，驯化得到，该细胞适应毒可在AGE1细胞中稳定生长和传代，且保持免疫原性，使动物有效产生针对IBV的免疫力。本发明的细胞适应毒对IBV疫苗产能升级具有十分重大的意义。

Description

一株鸡传染性支气管炎细胞适应毒及其应用
技术领域
本发明属于疫苗生产领域。
背景技术
鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种鸡的急性、高度接触性呼吸道传染病。该病毒在世界范围内广泛流行，拥有众多基因型和血清型，对养鸡业造成了巨大的损害。现有IBV疫苗均由鸡胚培养，所制备的抗原杂蛋白多、免疫原性差、生产成本高、生产效率低。
悬浮细胞培养病毒是近年来生产疫苗的趋势，其培养的病毒纯度高、免疫原性好、生产成本低。然而，相比其它冠状病毒，IBV很难在传代细胞上培养，目前仅IBV Beaudette弱毒株能在Vero细胞系及部分p53突变或缺失细胞系生长，但Beaudette弱毒株免疫原性差，未有相关商品化的疫苗上市。
H120毒株是一株最早应用于IBV疫苗制备的IBV毒株，其免疫原性较高，可有效诱导机体产生IBV抗体，至今仍在广泛应用，但H120毒株不能在悬浮细胞中正常生长和传代。中国专利申请CN 106119207 A公开，S基因对IBV的组织嗜性起着决定性作用，而H120毒株不能在细胞系内传代很可能是因为S基因，因此，将H120毒株的S基因替换为Beaudette弱毒株的S基因，替换后可获得适应细胞系内生长传代的高免疫原性重组病毒。但是该方法涉及反向遗传系统和No See’M技术，对技术操作的要求较高。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一株鸡传染性支气管炎细胞适应毒及其应用。
术语“细胞适应毒”，指适应细胞内生长和传代的病毒，所述细胞为非鸡胚的人工培养的细胞。
本发明的技术方案如下：
一株鸡传染性支气管炎细胞适应毒，所述细胞适应毒为保藏于中国武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：V202022的病毒毒株。
一种在细胞系中培养鸡传染性支气管炎病毒的方法，它包括如下步骤：
1)培养AGE1细胞；
2)向AGE1细胞接种权利要求1所述的鸡传染性支气管炎细胞适应毒，同时添加终浓度5～8μg/ml的胰酶，并补充提供病毒繁殖所需营养的培养基；
3)33～37℃下培养。
进一步地，步骤2)中AGE1细胞的密度为2.0×106/ml～6.0×106/ml；优选地，AGE1细胞的密度为4.0×106/ml。
进一步地，步骤2)的接种量为0.0001～0.1MOI；优选地，步骤2)的接种量为0.01MOI。
进一步地，步骤2)的胰酶的终浓度为5～8μg/ml；优选地，胰酶的终浓度为5μg/ml。
进一步地，步骤2)所述培养基为DMEM培养基；优选地，培养基按体积比15％添加。
进一步地，步骤3)的培养温度为35℃。
进一步地，步骤3)的培养时间为48h。
前述的鸡传染性支气管炎细胞适应毒在制备鸡传染性支气管炎疫苗中的用途。
一种鸡传染性支气管炎疫苗，由鸡传染性支气管炎病毒抗原和药学上可接受的辅助性成分组成，所述鸡传染性支气管炎病毒抗原为前述的鸡传染性支气管炎细胞适应毒。
有益效果：本发明通过驯化得到一株可在AGE1细胞中快速传代的鸡传染性支气管炎病毒。将该株病毒用于IBV疫苗规模化生产，可以克服鸡胚生产疫苗的抗原杂蛋白多、免疫原性差、生产成本高、生产效率低等问题。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：未接毒AGE1细胞；可见细胞较为完整。
图2：接毒后的AGE1细胞；可见较多细胞破碎、裂解。
具体实施方式
实施例1鸡传染性支气管炎细胞适应毒的驯化
1AGE1细胞的复苏及培养
从液氮罐中取出1支AGE1细胞，37℃水浴迅速融化，200g离心5分钟，弃去上清，用30ml细胞生长液悬浮细胞，接种于125ml的摇瓶中，置于摇床中培养，转速为160r/min，温度为37℃，CO2浓度为5％。培养2～3日，当细胞密度达到4.0×106/ml以上时，进行扩大传代至250ml摇瓶中，细胞起始密度为1.0×106/ml，放于摇床中，继续培养。
2IBV H120株鸡胚毒在AGE1细胞与鸡胚上的交替传代
AGE1细胞复苏后，传2～3代。取生长状态良好的细胞，当细胞密度达到4×106/ml以上时，接种H120株鸡胚毒(即由鸡胚培养的H120株)，以1％的体积比接种，同时添加终浓度为5μg/ml的胰酶及体积比为15％的DMEM培养基溶液，摇床转速为160r/min，35℃培养。接毒后72h，收获病毒，将收获的病毒再稀释100倍，接种10日龄SPF鸡胚，0.1ml/枚，培养36h收获。如此交替传5代，获得一株鸡传染性支气管炎细胞适应毒，记为S-H120株，代次为F1代，将获得细胞适应毒在AGE1细胞上传至F3代，每个代次细胞毒培养36h，测定其病毒含量。
结果显示，H120鸡胚毒在AGE1细胞上交替传5次，病毒含量从103.5EID50/0.1ml，增加至107.17EID50/0.1ml，且能在AGE1细胞上稳定传代，病毒含量稳定在107.0EID50/0.1ml以上；详见表1。接毒后，IBV能引起AGE1细胞的病变，细胞破碎、裂解，结果见图1、图2。
表1 H120株病毒交替传代试验结果
Figure BDA0003000078710000031
Figure BDA0003000078710000041
S-H120株已于2020年03月14日保藏于中国武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：V202022，分类命名为鸡传染性支气管炎病毒S-H120株。
以下用实验例进一步说明本发明的方法的有益效果。
实验例1 S-H120株细胞适应毒在AGE1细胞上的最佳培养温度及最佳培养时间试验
取3个250ml的摇瓶培养AGE1细胞，当细胞密度培养至4.0×106/ml以上时，按照0.01MOI接种S-H120株细胞适应毒，同时添加终浓度为5μg/ml的胰酶溶液及体积比为15％的DMEM培养基溶液，放入摇床，分别以33℃、35℃、37℃培养，摇床转速为160r/min，CO2浓度为5％培养。分别培养至24h、48h、72h，取样测定其病毒含量。
结果显示，S-H120株细胞适应毒接种AGE1细胞，以35℃培养，48h收获病毒，病毒含量最高，为107.63EID50/0.1ml，所以将S-H120株细胞适应毒的培养最佳温度定为35℃，培养最佳时间为48h。结果详见表2。
表2 S-H120株病毒最件培养温度及培养时间试验结果
Figure BDA0003000078710000042
实验例2 S-H120株细胞适应毒在AGE1细胞上的最佳接毒量及最佳接种细胞密度试验
取9个250ml的摇瓶培养AGE1细胞，当细胞密度培养至约2.0×106/ml、4.0×106/ml、6.0×106/ml时，分别取3瓶，按照0.1MOI、0.01MOI、0.0001MOI接种S-H120株细胞适应毒，同时添加终浓度为5μg/ml的胰酶溶液及体积比为15％的DMEM培养基溶液，放入摇床，35℃培养，摇床转速为160r/min，CO2浓度为5％培养。于48h收毒，测定其病毒含量。
结果显示，当AGE1细胞密度为4.0×106/ml时，以0.01MOI接种S-H120株细胞适应毒，收获的病毒含量最高，为107.83EID50/0.1ml，所以将S-H120株细胞适应毒的最佳接毒量定为0.01MOI。结果详见表3。
表3 S-H120株病毒最佳细胞接种量及接毒量试验结果
Figure BDA0003000078710000051
实验例3 S-H120株细胞适应毒与H120鸡胚毒免疫原性对比试验
取F3代S-H120株细胞适应毒及H120鸡胚毒，均稀释至103.5EID50/0.1ml，分别点眼免疫10只1日龄SPF鸡，0.1ml/只，另取10只1日龄SPF鸡不免疫作为对照组。免后14日，取IBV强毒SD株，进行攻毒，攻毒后观察14日，统计发病率及攻毒保护率。
结果显示，攻毒对照组于感染后第6天出现精神沉郁、甩头、张口呼吸等症状，并于感染后第6天和第7天各死亡1只鸡，发病率为9/10，S-H120株细胞适应毒与H120鸡胚毒免疫组均未发病，可见，经过驯化后，S-H120株细胞适应毒的免疫原性并未丢失，免疫原性良好，与鸡胚毒免疫效果相当。结果详见表4。
表4 S-H120株细胞适应毒与H120鸡胚毒免疫原件比对试验结果
Figure BDA0003000078710000052
综上，本发明的鸡传染性支气管炎细胞适应毒可在AGE1细胞中快速传代，能大幅度提高工业扩增该病毒的效率，减小纯化难度，克服鸡胚生产IBV疫苗的抗原杂蛋白多、免疫原性差、生产成本高、生产效率低等问题。

Claims (10)

1.一株鸡传染性支气管炎细胞适应毒，其特征在于：所述细胞适应毒为保藏于中国武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：V202022的病毒毒株。
2.一种在细胞系中培养鸡传染性支气管炎病毒的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1)培养AGE1细胞；
2)向AGE1细胞接种权利要求1所述的鸡传染性支气管炎细胞适应毒，同时添加终浓度5～8μg/ml的胰酶，并补充提供病毒繁殖所需营养的培养基；
3)33～37℃下培养。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2)中AGE1细胞的密度为2.0×106/ml～6.0×106/ml；优选地，AGE1细胞的密度为4.0×106/ml。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2)的接种量为0.0001～0.1MOI；优选地，步骤2)的接种量为0.01MOI。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2)的胰酶的终浓度为5～8μg/ml；优选地，胰酶的终浓度为5μg/ml。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2)所述培养基为DMEM培养基；优选地，培养基按体积比15％添加。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤3)的培养温度为35℃。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤3)的培养时间为48h。
9.权利要求1所述的鸡传染性支气管炎细胞适应毒在制备鸡传染性支气管炎疫苗中的用途。
10.一种鸡传染性支气管炎疫苗，由鸡传染性支气管炎病毒抗原和药学上可接受的辅助性成分组成，其特征在于：所述鸡传染性支气管炎病毒抗原为权利要求1所述的鸡传染性支气管炎细胞适应毒。
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