CN113564127A - 一种大规模悬浮培养禽腺病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种大规模悬浮培养禽腺病毒的方法,所提供的方法可以获得高效价的Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型等禽腺病毒;所述的方法中使用的一种驯化的LMH细胞,为鸡肝癌悬浮LMH细胞,其保藏号为CCTCC NO:C2021202。本发明采用逐步降血清法将贴壁LMH细胞驯化为可稳定连续传代的悬浮细胞。然后用生物反应器全悬浮培养LMH细胞,然后逐级放大悬浮培养LMH细胞,并在悬浮细胞上分别接种增殖禽腺病毒抗原的方法,本发明方法可以获得高效价的禽腺病毒悬浮培养工艺病毒抗原,抗原效价是现行疫苗规程抗原效价的5~10倍左右。
Description
技术领域
本发明属于病毒培养技术领域,具体涉及一种大规模悬浮培养禽腺病毒的方法,即采用驯化的悬浮LMH细胞(鸡肝癌细胞)来悬浮培养禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型)的方法,包含有贴壁LMH细胞的悬浮驯化、悬浮细胞的培养及禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型)的悬浮培养放大的步骤。
背景技术
在过去十几年中我国的禽腺病毒灭活疫苗主要经历了组织灭活疫苗、鸡胚灭活疫苗和细胞灭活疫苗。组织灭活疫苗是用感染鸡的肝脏匀浆经氯仿抽提和甲醛灭活制成的疫苗,该疫苗工艺简单粗放,根本不能应用于大规模生产而逐渐淘汰。鸡胚灭活疫苗采用SPF鸡胚接种腺病毒,收获尿囊液,灭活后制备成成品疫苗,该疫苗由于效价较低,成本较高也被放弃。鸡胚成纤维细胞灭活疫苗也因为工艺复杂,成本高,效价低也被淘汰。目前比较可行的是采用贴壁LMH细胞上进行培养,收获病毒液,灭活后制备成成品疫苗,但该工艺采用转瓶或者细胞工厂等传统的贴壁生产方式生产,存在工艺繁琐,效价不理想,依赖血清,劳动强度大,受到培养空间的限制而不能大规模放大。近几年,随着禽腺病毒疫病的频繁暴发,危害越来越严重,疫苗工作者迫切需要研究一种安全、高效的新型工艺,以替代现行的生产工艺。
因此,细胞悬浮培养技术成为目前值得发展的新兴技术,是一种新兴的大规模细胞培养技术,是大规模细胞培养的最理想模式,相较于贴壁细胞培养模式全悬浮细胞培养技术更易于放大,工艺简单快捷,大大降低成本,培养条件(温度、pH值、CO2浓度等)容易控制,并且培养过程系统化、自动化,不易被污染;另外全悬浮培养可作到无血清培养,动物成分大大降低,获得抗原效价高,不良反应小,可大大提高劳动生产效率,减少劳动强度等优势而备受青睐。
近几年禽腺病毒爆发频繁,造成危害比较大,对于该疫苗需求巨大,有几家疫苗厂家都在积极研发悬浮LMH细胞培养禽腺病毒工艺,均处在试验阶段。而本发明的方法是申请人所在的公司能够率先进行悬浮驯化LMH细胞,并放大培养至1500L反应器的厂家。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大规模悬浮培养禽腺病毒的方法,所提供的方法可以获得高效价的禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型)悬浮培养工艺病毒抗原,达到或超过现行贴壁细胞规程的效价。
本发明首先提供一种驯化的LMH细胞,为鸡肝癌悬浮LMH细胞,于2021年8月4日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心,其保藏号为CCTCC NO:C2021202。
所提供的驯化LMH细胞,是采用逐步降低培养基中血清含量来驯化获得的;
本发明还提供一种培养禽腺病毒的方法,是使用驯化的LMH细胞悬浮培养后,再扩增禽腺病毒;
所述的悬浮培养,是采用无血清培养基来悬浮培养LMH细胞;
所述的悬浮培养,其中培养基的体积为7L~1500L
所述的悬浮培养,其中的培养条件如下:接种密度在1.5×106.0~2.0×106.0个细胞/ml,温度为37℃、溶解氧值(DO)为40、pH值7.0±0.2条件下培养;当LMH细胞密度达到2.5×106.0个细胞/ml时,将Ⅰ群4型/8b/D11/8a禽腺病毒生产用种毒按MOI=0.2~1.0接毒,设定温度为37℃、溶解氧值(DO)为40、pH值7.2±0.2条件下进行病毒培养。
本发明采用逐步降血清法将贴壁LMH细胞驯化为可稳定连续传代的悬浮细胞。然后用生物反应器全悬浮培养LMH细胞,然后逐级放大悬浮培养LMH细胞,并在悬浮细胞上分别接种增殖禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型)病毒抗原的方法,本发明方法可以获得高效价的禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型)悬浮培养工艺病毒抗原,抗原效价是现行疫苗规程抗原效价的5~10倍左右。
附图说明
图1:LMH细胞的悬浮驯化流程图,
图2:悬浮LMH细胞照片图(200倍),
图3:悬浮LMH细胞生长曲线图;
图4:悬浮培养禽腺病毒Ⅰ群4型和贴壁培养病毒液免疫抗体比较图;
图5:悬浮培养禽腺病毒8b、D11型和贴壁培养病毒液免疫抗体比较图。
具体实施方式
本发明采用生物反应器全悬浮培养LMH细胞增殖禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型)抗原的方法,与传统的贴壁细胞培养方法比较,该方法可以获得高效价的禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型)全悬浮细胞培养工艺病毒抗原,抗原效价是现行疫苗规程抗原效价的5倍左右;即半成品病毒含量不低于108.0TCID50/0.1ml方可用于制苗(现有规程病毒含量不低于107.0TCID50/0.1ml)。
本发明筛选的全悬浮LMH细胞是对来源于中国动物卫生与流行病学中心馈赠的贴壁LMH细胞,该细胞经过分子生物学改造优化,对禽腺病毒更加敏感。再基于此贴壁细胞经悬浮驯化筛选获得的;SF501全悬浮干粉培养基(专用于LMH悬浮细胞)购于上海倍谙基生物科技有限公司,货号FG0105701;DMEM(高糖)干粉培养基为Hyclone公司生产,货号:SH30045.05;胎牛血清为兰州百灵公司生产,货号:SA212.02;其他常用试剂均为国产分析纯试剂。
下面将结合实施例对发明作进一步说明。
实施例1:LMH细胞的驯化
采用生物反应器全悬浮培养LMH细胞增殖禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型)抗原的接毒流程:即全悬浮LMH细胞复苏和500ml摇瓶培养;小反应器(5L~25L)细胞培养、生物反应器细胞放大培养(100~1500L)、病毒接种、病毒液的收获灭活,并且半成品制备成多联灭活疫苗后免疫35日龄SPF鸡,分别测定21日和28日免疫抗体。
1、LMH细胞的悬浮驯化
用含10%的胎牛血清DMEM培养液复苏贴壁LMH细胞P3,生长致密后传代为P4。挑选P4代生长良好的细胞,用含不同血清浓度DMEM培养液逐步适应培养。通过采用逐步降低血清含量的方法进行了悬浮培养细胞的驯化,方法如图1所示。
按照图1所示的方法悬浮驯化54代,成功的将中国动物卫生与流行病学中心馈赠的贴壁LMH细胞驯化成可在无血清条件下进行高密度悬浮培养的新型细胞株。将P54代确定为悬浮LMH细胞原始细胞第一代,即F1。
所筛选的细胞呈圆形,大小均一,悬浮均匀分布于培养液中,细胞间培养液清亮,细胞透亮,有轻微结团(图2)。该细胞对营养物要求不高,耗糖少,产酸少,整个细胞培养和病毒培养过程不用添加额外补料,也不用外接酸碱去调节pH,培养过程平稳好操控。培养过程保证接种密度在1.5×106.0~2.0×106.0个细胞/ml,调整反应器合适转速(液面轻微转动即可,转速不可过大),设定温度为37℃、溶解氧值(DO)为40、pH值7.0±0.2条件下培养,每24小时倍增50%~75%左右。
按照上述的培养条件来制备细胞的生长曲线,以培养时间为横轴,细胞密度和细胞活力为纵轴,绘制细胞生长曲线(表1和图3)。
表1:悬浮LMH细胞生长情况表
对克隆纯化后的悬浮LMH细胞进行了系统鉴定。结果表明,该细胞纯净,无细菌、霉菌、支原体、外源病毒污染;细胞各代次核型基本相同;对禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型)具有高敏感性的悬浮细胞。
2、全悬浮LMH细胞的制备:
抽取密度为5.0×107的LMH冻存细胞4.0ml,置于37℃水浴中,晃动溶解2~3min,加入100ml悬浮细胞培养液,转入500ml三角摇瓶中,充分混匀后取样进行细胞计数并并统计细胞活率,记录数据。在温度为37℃、以转速120转/分的摇床中培养,每24h后,取样,细胞计数并统计细胞活率,细胞以60%~90%的速度增殖,当补液至150ml时可以分瓶培养,进行细胞扩增,当达到接种5L~25L反应器最少需要数量时进行接种,接种的起始细胞密度保证在150万/ml以上,过低不利于细胞的快速增殖。
3、小反应器(5L~25L)细胞培养
(1)小反应器(5L~25L)生物反应器的灭菌将校正好的pH电极、DO探头、进液管、排液管和取样管与反应器相连接;加入没过pH电极体积的PBS(浓度为0.01mmol/L,pH值7.2),使pH电极、DO探头端要保证在液面以下,各管口端确保密闭,仅留罐顶的排气端连接空气滤器与外界相通,检查整个罐体密闭不漏气后,将罐体置于高压灭菌柜中,在121℃下,高压灭菌30~40min。
(2)培养基预处理接种细胞前一天将生物反应器与控制系统连接,排出反应器罐体内的PBS(浓度为0.01mmol/L,pH值7.2),然后加入无菌的悬浮细胞营养液,调整反应器合适转速(液面轻微转动即可,转速过快会损伤细胞)设定温度为37℃、溶解氧值(DO)为40、pH值7.0±0.2的条件下,预孵1日。
(3)细胞接种和培养将其1制备的LMH全悬浮细胞1.5L~2L接种于小生物反应器中,保证接种密度在1.5×106.0~2.0×106.0个细胞/ml,调整反应器合适转速(液面轻微转动即可),设定温度为37℃、溶解氧值(DO)为40、pH值7.0±0.2条件下培养,期间每隔24h取样,观察细胞生长情况,同时进行细胞计数。当细胞密度达6.0×106/ml以上时,可以进行细胞放大培养。
4、生物反应器放大(100~1500L)细胞培养
(1)生物反应器(100~1500L)的灭菌将校正好的pH电极、DO探头与反应器相连接,各端口T型阀确保密闭,仅留排气端连接空气滤器与外界相通,在121℃下,在线高压蒸汽灭菌30~40min。
(2)培养基预处理接种细胞前一天用无菌滤器过滤除菌加入无菌的悬浮细胞营养液,液面没过pH电极和搅拌桨,设定温度为37℃、溶解氧值(DO)为40、pH值7.0±0.2条件下,预孵1日。
(3)细胞接种和培养将小反应器(5L~25L)中的细胞接种于大生物反应器中,保证接种密度在1.5×106.0~2.0×106.0个细胞/ml,调整反应器合适转速(液面轻微转动即可),设定温度为37℃、溶解氧值(DO)为40、pH值7.0±0.2条件下培养,期间每隔24h取样,观察细胞生长情况,同时进行细胞计数。当细胞密度达6.0×106/ml以上时,可以进行细胞放大培养或接毒培养。
5、病毒液的制备
(1)病毒接种将细胞悬液转入提前灭菌并预孵细胞培养液的反应器中,搅拌均匀后保证细胞密度达到2.5×106.0个细胞/ml时,将Ⅰ群4型/8b/D11禽腺病毒生产用种毒按MOI=0.2接毒,调整反应器合适转速(液面轻微转动即可),设定温度为37℃、溶解氧值(DO)为40、pH值7.2±0.2条件下进行病毒培养。
(2)观察接毒24小时后,每日取样1次,观察细胞病变情况,同时进行细胞计数,观察并记录细胞病变(细胞膨大,破碎)情况。
(3)收获细胞活力降低至70%~80%时,收获病毒液并取样进行中间产品检验。﹣15℃以下保存,应不超过30日。
上述的DMEM培养液,取13.54gDMEM(高糖)干粉培养基(专用于LMH贴壁细胞),用注射用水配成1000ml配制而成。
上述细胞营养液,取23.3g SF501全悬浮干粉培养基(专用于LMH悬浮细胞),用注射用水配制成1000ml制得。
上述pH7.2的PBS溶液,由取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.25g、磷酸二氢钾0.2g、用注射用水配制成1000ml,制得。
本发明方法验证1:
将禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型)分别接种全悬浮LMH细胞和贴壁细胞后病毒液病毒含量对比,结果见表2、表3、表4、表5。
表2:禽腺病毒Ⅰ群4型种毒接种悬浮LMH细胞和贴壁细胞后病毒含量比较
由上表数据的得知:禽腺病毒Ⅰ群4型种毒接种悬浮LMH细胞获得病毒液病毒含量比贴壁细胞病毒液病毒含量高0.4~1.0个滴度,即悬浮培养的病毒含量是贴壁培养的5~10倍。另外悬浮培养整个过程都是无血清培养,摆脱了血清依赖,这样可以避免由于血清而引起的外源病毒影响,并降低由于血清引起的副反应。可大大提高产品品质。
表3:禽腺病毒8b型种毒接种悬浮LMH细胞和贴壁细胞后病毒含量比较表
由上表数据的得知:禽腺病毒8b型种毒接种悬浮LMH细胞获得病毒液病毒含量比贴壁细胞病毒液病毒含量高1.0~1.5个滴度左右,即悬浮培养的病毒含量是贴壁培养的10倍以上。另外悬浮培养整个过程都是无血清培养,摆脱了血清依赖,这样可以避免由于血清而引起的外源病毒影响,并降低由于血清引起的副反应。可大大提高产品品质。
表4:禽腺病毒D11型种毒接种悬浮LMH细胞和贴壁细胞后病毒含量比较表
由上表数据的得知:禽腺病毒D11型种毒接种悬浮LMH细胞获得病毒液病毒含量比贴壁细胞病毒液病毒含量高1.0~1.4个滴度左右,即悬浮培养的病毒含量是贴壁培养的10倍左右。另外悬浮培养整个过程都是无血清培养,摆脱了血清依赖,这样可以避免由于血清而引起的外源病毒影响,并降低由于血清引起的副反应。可大大提高产品品质。
表5:禽腺病毒8a型种毒接种悬浮LMH细胞和贴壁细胞后病毒含量比较表
由上表数据的得知:禽腺病毒8a型种毒接种悬浮LMH细胞获得病毒液病毒含量比贴壁细胞病毒液病毒含量高1.0~1.4个滴度左右,即悬浮培养的病毒含量是贴壁培养的10倍左右。另外悬浮培养整个过程都是无血清培养,摆脱了血清依赖,这样可以避免由于血清而引起的外源病毒影响,并降低由于血清引起的副反应。可大大提高产品品质。
实施例2:制备疫苗
1、禽腺病毒Ⅰ群4型种毒分别接种全悬浮LMH细胞和贴壁细胞后病毒液灭活,灭活半成品乳化制成新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群4型)三联灭活疫苗,分别免疫35日龄SPF鸡,每只鸡肌肉注射0.2ml。免疫21天后采血,分离血清,用琼扩方法测抗体,免疫21天同时进行攻毒,所有免疫鸡和对照鸡各肌肉注射禽腺病毒Ⅰ群4型YBAV-4株病毒液,每只0.2ml(含2×105.5TCID50)。攻毒后观察7日,统计攻毒保护率。试验结果如表5和图4。
表5:悬浮培养禽腺病毒Ⅰ群4型和贴壁培养病毒液免疫抗体及攻毒保护比较
编号 | 抗原 | 21d抗体 | GMT | 攻毒保护 |
1(C4原倍贴壁培养) | C4 | 1,1,1,1,1,1,1 | 1 | 6/7健活 |
2(C4 2倍浓缩贴壁壁培养) | C4 | 1,4,2,2,2,2,2 | 2 | 7/7健活 |
3(LMH~C4原倍悬浮培养) | C4 | 16,2,4,8,4,8 | 5.66 | 7/7健活 |
3(LMH~C4 2倍浓缩悬浮培养) | C4 | 8,8,32,32,8,4,8 | 10.78 | 7/7健活 |
通过免疫攻毒试验结果得出:
(1)悬浮培养的禽腺病毒Ⅰ群4型原倍病毒液的免疫抗体是贴壁培养原倍病毒液的5倍,是贴壁培养2倍浓缩病毒液的2倍
(2)悬浮培养的禽腺病毒Ⅰ群4型2倍病毒液的免疫抗体是贴壁培养2倍浓缩病毒液的5倍;
(3)悬浮培养的禽腺病毒Ⅰ群4型原倍病毒液和2倍病毒液都达到7/7保护,贴壁培养仅2倍浓缩病毒液获得100%(7/7)保护。所以传统贴壁培养的疫苗禽腺病毒Ⅰ群4型病毒液需要2倍浓缩,而悬浮培养病毒液不需要浓缩。
综上:悬浮培养禽腺病毒Ⅰ群4型可以获得高抗体效价和确实的保护效率,同时简化工艺,大大降低生产成本。悬浮培养工艺是一种比较高效的生产方式。
2、禽腺病毒8b、8a、D11型种毒分别接种全悬浮LMH细胞和贴壁细胞后病毒液灭活,灭活半成品乳化制成新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(8b、8a、D11型)三联灭活疫苗,分别免疫35日龄SPF鸡,每只鸡肌肉注射0.2ml。免疫21天,28天后采血,分离血清,用琼扩方法测抗体。由于禽腺病毒8b、D11型攻毒不发病,所以只能用琼扩方法测抗体来评价。试验结果如表6和图5。
表6:悬浮培养禽腺病毒8b、D11型和贴壁培养病毒液免疫抗体比较表
通过免疫攻毒试验结果得出:
(1)悬浮培养的禽腺病毒8b型病毒液的21天和28天免疫抗体是贴壁培养病毒液的2倍左右。
(2)悬浮培养的禽腺病毒D11型病毒液的21天和28天免疫抗体是贴壁培养病毒液的3倍以上。
(3)悬浮培养的禽腺病毒8a型病毒液的21天和28天免疫抗体是贴壁培养病毒液的2倍左右。
(4)实际大生产中贴壁培养的疫苗禽腺病毒8b、D11型病毒液需要3倍浓缩,而悬浮培养病毒液不需要浓缩即可达到贴壁培养3倍浓缩的效果。
综上:悬浮培养禽腺病毒8b、8a、D11型可以获得高抗体效价,同时大大简化生产工艺,大大降低生产成本。悬浮培养工艺是一种比较高效的生产方式。
综上所有实验结果,禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型)悬浮培养方法的优势如下:
(1)禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型)在LMH全悬浮细胞上培养,半成品效价可达到较高水平(半成品效价>8.0TCID50/0.1ml)。从半成品效价看,Ⅰ群4型比原来提高近0.4~1.0个滴度,8b型、8a型和D11型比原来提高1.0个滴度以上。
(2)从细胞工艺上,操作流程简单化,易操作,人员和时间上的优势远大于贴壁细胞的,操作人员可节约一半。
(3)节约生产车间占地面积,不受车间面积限制,容易放大规模。
(4)悬浮培养整个过程都是无血清培养,摆脱了血清依赖,这样可以避免由于血清而引起的外源病毒影响,并降低由于血清引起的副反应。可大大提高产品品质。
(5)从生产成本上,同样生产100L半成品情况下,原来贴壁细胞的工艺所需培养基及血清的成本约10800元,而悬浮细胞生产工艺只需要8000元。节约近30%的原材料成本。配苗时贴壁培养抗原需要3倍浓缩,悬浮培养工艺不浓缩,所以整体节约成本50%以上。
Claims (7)
1.一种LMH细胞,其特征在于,所述的LMH细胞的保藏编号为CCTCC NO:V202158。
2.如权利要求1所述的LMH细胞,其特征在于,所述的LMH细胞是采用逐步降低培养基中血清含量来驯化获得的。
3.一种培养禽腺病毒的方法,其特征在于,所述的方法,是使用权利要求1所述的LMH细胞悬浮培养后,再扩增禽腺病毒。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的悬浮培养是采用无血清培养基来悬浮培养LMH细胞。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的悬浮培养,其中培养基的体积为7L~1500L。
6.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的悬浮培养,其中培养条件如下:接种密度在1.5×106.0~2.0×106.0个细胞/ml,温度为37℃、溶解氧值DO为40、pH值7.0±0.2条件下培养;当LMH细胞密度达到2.5×106.0个细胞/ml时,将Ⅰ群4型/8b/D11禽腺病毒生产用种毒按MOI=0.2接毒,设定温度为37℃、溶解氧值DO为40、pH值7.2±0.2条件下进行病毒培养。
7.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的禽腺病毒为Ⅰ群4型、8b型或D11型。
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