CN111548996A - 一种家禽癌细胞无血清悬浮细胞系及其建立方法和应用 - Google Patents

一种家禽癌细胞无血清悬浮细胞系及其建立方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种家禽癌细胞无血清悬浮细胞系及其建立方法和应用，涉及兽用生物制品技术领域。本发明通过对现有的家禽贴壁培养癌细胞进行驯化，经过多代驯化，可实现每72h正常稀释传代，连续5代保持48h的活细胞密度翻倍，且活率高于90％，而且随着传代次数增加，细胞对无血清培养基越来越适应，比生长速率继续增高，从而获得家禽癌细胞无血清悬浮细胞系。本发明利用所述家禽癌细胞无血清悬浮细胞系可实现多种家禽病毒的培养，从而以培养得到的病毒作为抗原，灭活后可大规模制备疫苗，且不同批次间疫苗差异不明显。本发明利用所述细胞悬浮培养抗原杂蛋白含量低，效价高，内毒素含量低，使得抗体滴度明显高于市售产品。

Description

一种家禽癌细胞无血清悬浮细胞系及其建立方法和应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种家禽癌细胞无血清悬浮细胞系及其建立方法和应用。
背景技术
随着细胞培养技术的进步及研究和生产的需要，LMH细胞(鸡肝癌细胞)已逐渐成为使用最频繁的细胞系之一。目前，LMH细胞可用于禽类腺病毒、鸡传染性喉气管炎病毒等全病毒的培养及多种蛋白的表达。随着高密度细胞培养容器的推广及生物制品质量安全标准的提高，LMH细胞培养具有广泛的应用前景。然而，目前LMH细胞只能贴壁培养或依附载体进行悬浮培养，不管是贴壁培养还是依附载体进行悬浮培养，在LMH细胞培养过程中培养基均需要添加高质量的进口血清，培养基造价昂贵，且国产血清很难替代，使得该培养方式的生产成本一直居高不下，对LMH细胞培养的放大与推广造成了一定阻碍。
细胞悬浮培养制备疫苗工艺逐渐成为兽用生物制品行业发展趋势，目前国内有多个畜禽疫苗实现了细胞悬浮培养制备工艺。随着细胞悬浮培养技术的发展，悬浮细胞培养基成本随之降低，疫苗的批间差降低，疫苗品质提高；易实现规模化生产，可降低能耗、培养基、设备、人工等综合成本。目前已知的悬浮细胞，国内除进口EB66细胞(鸭胚干细胞)外，其余全部为哺乳动物细胞系，没有家禽悬浮细胞系，影响家禽疫苗工艺升级。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于一种家禽癌细胞无血清悬浮细胞系及其建立方法和应用，可利用所述家禽癌细胞无血清悬浮细胞系规模化培养禽病毒，从而降低家禽疫苗的生产成本。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种家禽癌细胞无血清悬浮细胞系的建立方法，包括以下步骤：(1)将家禽癌细胞的贴壁细胞复苏，选择汇合度大于80％的贴壁细胞消化，将消化细胞接种至无血清培养基
Figure BDA0002512847640000011
SF001上；
(2)每24h取样计数一次，当计数的活细胞密度大于步骤(1)所述接种的量时，继续培养至48h，若48h活细胞密度高于1.5×106cells/ml，使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0～1.5×106cells/ml，若48h细胞密度低于1.5×106cells/ml，静置沉降后弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.0～1.5×106cells/ml，继续培养；
当24h取样计数时，计数的活细胞密度小于步骤(1)所述接种的量时，静置沉降弃去部分上清液，使用所述无血清培养基调整细胞至1.0～1.5×106cells/ml后继续培养至48h，若48h活细胞密度高于1.5×106cells/ml，使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0～1.5×106cells/ml，若48h细胞密度低于1.5×106cells/ml，静置沉降后弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.0～1.5×106cells/ml，继续培养；
(3)重复步骤(2)，直至每72h正常稀释传代，连续5代保持48h时活细胞密度翻倍且活率高于90％，得家禽癌细胞无血清悬浮细胞系。
优选的，步骤(1)所述消化后还包括利用原有含血清培养基终止消化。
优选的，步骤(1)所述接种的细胞数量为1.0～1.5×106cells/ml。
优选的，步骤(2)所述静置沉降为在4℃静置3～4h。
本发明还提供了利用上述建立方法构建得到的家禽癌细胞无血清悬浮细胞系，所述家禽癌细胞无血清悬浮细胞系的比生长速率μ＞0.34d-1。
优选的，所述家禽癌细胞无血清悬浮细胞系包括鸡肝癌细胞无血清悬浮细胞系。
本发明提供了一株无血清悬浮培养的鸡肝癌悬浮细胞系LMH，所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH的保藏编号为CCTCCNO：C202072。
本发明还提供了所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH在培养病毒毒株中的应用。
优选的，所述病毒毒株包括H9亚型禽流感病毒、禽腺病毒、水禽星状病毒、禽减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒和禽副粘病毒。
本发明还提供了一种利用上述鸡肝癌悬浮细胞系LMH培养病毒毒株的方法，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为2～5×106cells/ml后，接种所述病毒毒株，培养48～96h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为0.5～2×106cells/ml；所述接种的病毒毒株的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.01～5％。
优选的，当所述病毒毒株为H9亚型禽流感病毒时，在所述接种后还包括添加TPCK胰酶，再进行所述培养。
优选的，所述TPCK胰酶的加入量为3～5μg/ml。
优选的，当所述病毒毒株为H9亚型禽流感病毒时，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为4～5×106cells/ml后，接种H9亚型禽流感病毒，添加TPCK胰酶后，培养48～72h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为0.5～2×106cells/ml；所述接种的H9亚型禽流感病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.1～1％。
优选的，当所述病毒毒株为禽腺病毒时，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为2～3×106cells/ml后，接种禽腺病毒，培养48～72h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为0.5～1.5×106cells/ml；所述接种的禽腺病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.05～0.1％。
优选的，当所述病毒毒株为水禽星状病毒时，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为2～3×106cells/ml后，接种水禽星状病毒，培养48～72h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～1.5×106cells/ml；所述接种的水禽星状病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的1～5％。
优选的，当所述病毒毒株为禽减蛋综合征病毒时，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为2～3×106cells/ml后，接种禽减蛋综合征病毒，培养72～96h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～2×106cells/ml；所述接种的禽减蛋综合征病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的1～5％。
优选的，当所述病毒毒株为禽呼肠孤病毒时，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为3～5×106cells/ml后，接种禽呼肠孤病毒，培养48h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～2×106cells/ml；所述接种的禽呼肠孤病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.01～0.1％。
优选的，当所述病毒毒株为鸡传染性喉气管炎病毒时，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为3～5×106cells/ml后，接种鸡传染性喉气管炎病毒，培养48h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～2×106cells/ml；所述接种的鸡传染性喉气管炎病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.1～1％。
优选的，当所述病毒毒株为鸡传染性法氏囊病毒时，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为2～3×106cells/ml后，接种鸡传染性法氏囊病毒，培养48～72h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～2×106cells/ml；所述接种的鸡传染性法氏囊病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.1～1％。
优选的，当所述病毒毒株为鸡传染性支气管炎病毒时，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为2～3×106cells/ml后，接种鸡传染性支气管炎病毒，培养48h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～2×106cells/ml；所述接种的鸡传染性支气管炎病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的1～5％。
优选的，当所述病毒毒株为禽副粘病毒时，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为3～4×106cells/ml后，接种禽副粘病毒，培养72～96h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～2×106cells/ml；所述接种的禽副粘病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.01～0.1％。
本发明还提供了利用所述方法培养得到的病毒毒株在制备禽疫苗中的应用。
优选的，所述禽疫苗包括抗原灭活疫苗。
本发明还提供了一种利用上述方法培养得到的病毒毒株制备禽疫苗的方法，将利用上述方法培养得到的病毒毒株中的一种或多种毒株灭活后，作为抗原，制备禽疫苗。
一种禽疫苗，所述禽疫苗的有效成分为经灭活的利用上述方法培养得到的病毒毒株。
优选的，所述禽疫苗包括单联疫苗或多联疫苗。
本发明提供了一种家禽癌细胞无血清悬浮细胞系的建立方法，通过对现有的家禽贴壁培养癌细胞进行驯化，经过多代驯化，可实现每72h正常稀释传代，连续5代保持48h的活细胞密度翻倍(比生长速率μ＞0.34d-1)，且活率高于90％，而且随着传代次数增加，细胞对无血清培养基越来越适应，比生长速率继续增高，从而获得家禽癌细胞无血清悬浮细胞系。
本发明利用所述家禽癌细胞无血清悬浮细胞系可实现多种家禽病毒的培养，从而以培养得到的病毒作为抗原，灭活后可大规模制备疫苗，且不同批次间疫苗差异不明显。本发明利用所述细胞悬浮培养抗原杂蛋白含量低，效价高，内毒素含量低。本发明制备得到的疫苗包括多种形式，如单联疫苗或多联疫苗均可。本发明实施例中利用鸡肝癌悬浮细胞系LMH培养H9亚型禽流感病毒、鸡新城疫Lasota株病毒、C4血清型禽腺病毒抗原，制备新流腺三联疫苗，抗体滴度明显高于市售产品。
附图说明
图1为鸡肝癌悬浮细胞系LMH的贴壁细胞形态；
图2为鸡肝癌悬浮细胞系LMH的悬浮细胞形态；
图3为C4血清型禽腺病毒接毒前后细胞形态，其中左侧为接毒前鸡肝癌悬浮细胞系LMH的细胞形态，右侧为接毒后鸡肝癌悬浮细胞系LMH的细胞形态；
图4为鹅星状病毒LMH悬浮毒的琼扩(AGP)效价测定结果图；
图5为鸡传染性喉气管炎病毒接毒后细胞病变图；
图6为禽减蛋综合征悬浮毒血凝价(HA)变化图；
图7为禽副粘悬浮毒血凝价(HA)变化图。
生物保藏信息
鸡肝癌悬浮细胞系LMH，于2020年05月07日保藏于中国典型培养物保藏中心，具体地址为中国武汉市武昌珞珈山，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C202072。
具体实施方式
本发明提供了一种家禽癌细胞无血清悬浮细胞系的建立方法，包括以下步骤：(1)将家禽癌细胞的贴壁细胞复苏，选择汇合度大于80％的贴壁细胞消化，将消化细胞接种至无血清培养基
Figure BDA0002512847640000061
SF001上；
(2)每24h取样计数一次，当计数的活细胞密度大于步骤(1)所述接种的量时，继续培养至48h，若48h活细胞密度高于1.5×106cells/ml，使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0～1.5×106cells/ml，若48h细胞密度低于1.5×106cells/ml，静置沉降后弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.0～1.5×106cells/ml，继续培养；
当24h取样计数时，计数的活细胞密度小于步骤(1)所述接种的量时，静置沉降后弃去部分上清液，使用所述无血清培养基调整细胞至1.0～1.5×106cells/ml继续培养至48h，若48h活细胞密度高于1.5×106cells/ml，使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0～1.5×106cells/ml，若48h细胞密度低于1.5×106cells/ml，静置沉降后弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.0～1.5×106cells/ml，继续培养；
(3)重复步骤(2)，直至每72h正常稀释传代，连续5代保持48h时活细胞密度翻倍且活率高于90％，得家禽癌细胞无血清悬浮细胞系。
本发明将家禽癌细胞的贴壁细胞复苏，选择汇合度大于80％的贴壁细胞消化，将消化细胞接种至无血清培养基上。本发明对所述家禽癌细胞的贴壁细胞的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售或保藏的贴壁培养的家禽癌细胞即可。本发明对所述复苏的方法并没有特殊限定，优选将液氮中保存的贴壁细胞与血清培养基混合后，置于37℃恒温水浴锅中溶化，用1ml移液枪将细胞悬液加入到预热好的T25规格细胞培养瓶内，混匀细胞后置37℃5％CO2培养箱内培养1.5～2h显微镜下观察细胞贴壁后换液。本发明对所述消化的方法并没有特殊限定，优选利用胰酶进行消化。本发明在所述消化后优选还包括利用原有含血清培养基终止消化。本发明所述含血清培养基优选为DMEM/F12+10％胎牛血清，胎牛血清购自于内蒙古金源康生物工程有限公司。本发明对终止消化后的细胞进行计数，而后接种至无血清培养基上，所述接种的密度优选为1.5～2.0×106cells/ml。本发明所述无血清培养基优选的为
Figure BDA0002512847640000071
SF001购自于上海倍谙基生物科技有限公司。
本发明在所述接种后，每24h取样计数一次，当计数的活细胞密度大于步骤(1)所述接种的量时，继续培养至48h，若48h活细胞密度高于1.5×106cells/ml，使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0～1.5×106cells/ml，若48h细胞密度低于1.5×106cells/ml，静置沉降后利用所述无血清培养基调整细胞至1.0～1.5×106cells/ml，继续培养；
当24h取样计数时，计数的活细胞密度小于步骤(1)所述接种的量时，静置沉降后弃去部分上清液，使用所述无血清培养基调整细胞至1.0～1.5×106cells/ml继续培养至48h，若48h活细胞密度高于1.5×106cells/ml，使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0～1.5×106cells/ml，若48h细胞密度低于1.5×106cells/ml，静置沉降后弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.0～1.5×106cells/ml，继续培养。在本发明中，当48h细胞密度低于1.5×106cells/ml时，优选将所述细胞置于50ml离心管中，在4℃静置3～4h，而后弃去部分上清液，人为提高细胞浓度，再添加新的无血清培养基进行稀释，再进行后续的驯化。
本发明重复步骤(2)，直至每72h正常稀释传代，连续5代保持48h时活细胞密度翻倍且活率高于90％，得家禽癌细胞无血清悬浮细胞系。本发明所述家禽癌细胞无血清悬浮细胞系的比生长速率μ优选＞0.34d-1，且随着传代次数增加，细胞对所述无血清培养基越来越适应，比生长速率会继续增高。
本发明还提供了利用上述建立方法构建得到的家禽癌细胞无血清悬浮细胞系，所述家禽癌细胞无血清悬浮细胞系的比生长速率μ＞0.34d-1。在本发明实施例中，以鸡肝癌细胞无血清悬浮细胞系为例进行说明，但是不能仅将其视为本发明的保护范围。
本发明提供了一株无血清悬浮培养的鸡肝癌悬浮细胞系LMH，所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH的保藏编号为CCTCC NO：C202072。
本发明还提供了所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH在培养病毒毒株中的应用。
本发明所述病毒毒株优选包括H9亚型禽流感病毒、禽腺病毒、水禽星状病毒、禽减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒和禽副粘病毒。本发明对所述及病毒毒株的具体分型和毒株种类没有特殊限定，利用本领域的常规毒株即可。
本发明还提供了一种利用上述鸡肝癌悬浮细胞系LMH培养病毒毒株的方法，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为2～5×106cells/ml后，接种所述病毒毒株，培养48～96h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为0.5～2×106cells/ml；所述接种的病毒毒株的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.01～5％。
在本发明中，当针对不同的毒株进行培养时，所需要的条件也不相同，优选的，当所述病毒毒株为H9亚型禽流感病毒时，在所述接种后还包括添加TPCK胰酶，再进行所述培养；所述TPCK胰酶的加入量优选为3～5μg/ml。具体的包括：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为4～5×106cells/ml后，接种H9亚型禽流感病毒，添加TPCK胰酶后，培养48～72h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为0.5～2×106cells/ml；所述接种的H9亚型禽流感病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.1～1％。
在本发明中，当所述病毒毒株为禽腺病毒时，优选包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为2～3×106cells/ml后，接种禽腺病毒，培养48～72h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为0.5～1.5×106cells/ml；所述接种的禽腺病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.05～0.1％。本发明所述禽腺病毒的毒种优选包括C4、D11、E8b和E8a四个血清型禽腺病毒。
在本发明中，当所述病毒毒株为水禽星状病毒时，优选包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为2～3×106cells/ml后，接种水禽星状病毒，培养48～72h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～1.5×106cells/ml；所述接种的水禽星状病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的1～5％。本发明所述水禽星状病毒的毒种优选包括鹅星状病毒(俗称“鹅痛风”)。
在本发明中，当所述病毒毒株为禽减蛋综合征病毒时，优选包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为2～3×106cells/ml后，接种禽减蛋综合征病毒，培养72～96h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～2×106cells/ml；所述接种的禽减蛋综合征病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的1～5％。
在本发明中，当所述病毒毒株为禽呼肠孤病毒时，优选包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为3～5×106cells/ml后，接种禽呼肠孤病毒，培养48h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～2×106cells/ml；所述接种的禽呼肠孤病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.01～0.1％。本发明所述禽呼肠孤病毒病毒的毒种优选包括ARV。
在本发明中，当所述病毒毒株为鸡传染性喉气管炎病毒时，优选包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为3～5×106cells/ml后，接种鸡传染性喉气管炎病毒，培养48h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～2×106cells/ml；所述接种的鸡传染性喉气管炎病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.1～1％。本发明所述鸡传染性喉气管炎病毒的毒种优选包括TLV。
在本发明中，当所述病毒毒株为鸡传染性法氏囊病毒时，优选包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为2～3×106cells/ml后，接种鸡传染性法氏囊病毒，培养48～72h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～2×106cells/ml；所述接种的鸡传染性法氏囊病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.1～1％。本发明所述鸡传染性法氏囊病毒的毒种优选包括IBDV B87。
在本发明中，当所述病毒毒株为鸡传染性支气管炎病毒时，优选包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为2～3×106cells/ml后，接种鸡传染性支气管炎病毒，培养48h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～2×106cells/ml；所述接种的鸡传染性支气管炎病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的1～5％。本发明所述鸡传染性支气管炎病毒的毒种优选包括IBV M41。
在本发明中，当所述病毒毒株为禽副粘病毒时，优选包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为3～4×106cells/ml后，接种禽副粘病毒，培养72～96h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～2×106cells/ml；所述接种的禽副粘病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.01～0.1％。本发明所述禽副粘病毒的毒种优选包括Lasota株。
本发明对上述病毒的毒种来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售毒种即可，在本发明实施例中，所用毒种均为山东诸子生物科技有限公司保存毒株，且公司承诺，自本发明申请日起20年内向公众发放上述所有生物材料。
本发明还提供了利用所述方法培养得到的病毒毒株在制备禽疫苗中的应用。本发明所述禽疫苗优选包括抗原灭活疫苗。
本发明还提供了一种利用上述方法培养得到的病毒毒株制备禽疫苗的方法，将利用上述方法培养得到的病毒毒株中的一种或多种毒株灭活后，作为抗原，制备禽疫苗。本发明对所述禽疫苗的具体制备方法并没有特殊限定，利用本领域的常规疫苗制备方法即可。
本发明还提供了一种禽疫苗，所述禽疫苗的有效成分为经灭活的利用上述方法培养得到的病毒毒株。本发明所述禽疫苗优选包括单联疫苗或多联疫苗。
下面结合实施例对本发明提供的家禽癌细胞无血清悬浮细胞系及其建立方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
LMH贴壁细胞复苏、培养及驯化
1、细胞：贴壁型LMH细胞，山东诸子生物科技有限公司培养保存。
2、主要试剂：胎牛血清购自内蒙古金源康生物工程有限公司，培养基DMEM和DMEM-F12、胰蛋白酶均购自GIBCO，LMH无血清悬浮培养基
Figure BDA0002512847640000111
SF001购自上海倍谙基生物科技有限公司。
3、设备：水浴锅购自常州荣华仪器制造有限公司，超净工作台购自上海博讯，方瓶购自NEST，CO2培养箱购自购自松下健康医疗器械株式会社。
4、LMH细胞复苏
提前打开37℃恒温水浴锅，分装并预热8～10ml培养基。迅速从液氮罐中取出1支冻存管于37℃恒温水浴锅摇晃使之溶化，溶化后用75％酒精擦拭后放入超净工作台，用1ml移液枪将细胞悬液加入到预热好的T25规格细胞培养瓶内，混匀细胞后置37℃ 5％CO2培养箱内培养1.5～2h显微镜下观察细胞贴壁后换液。
5、LMH细胞传代
5.1 取长满单层的细胞(48～72h)、培养基、PBS缓冲液、胰酶用75％的酒精喷洒后放入超净工作台。
5.2 弃去旧培养基，PBS 5～8ml清洗两遍。
5.3 加入3～5ml胰酶，轻轻摇晃方瓶使所有细胞都沾染上胰酶。
5.4 待细胞有明显雾状弃去胰酶留约0.5ml移至培养箱消化或室温消化约3～5分钟观察细胞有脱落时，用传代培养基终止消化。轻轻吹打均匀细胞后按传代比例分瓶。
5.5 将传代好的细胞置于显微镜下观察形态密度后置37℃ 5％CO2培养箱培养。
6、LMH悬浮细胞驯化
6.1 选择汇合度80％以上的贴壁细胞，按上述消化方法消化，使用不超过15ml的原有含血清培养基(DMEM/F12+10％胎牛血清)终止消化，细胞完全吹打下来，收集消化下来细胞，补加无血清培养基至30ml，接种密度控制在1.5～2.0×106cells/ml。
6.2 每24h取样计数，若活细胞密度有提高，可继续培养至48h处理，若48h细胞密度高于2.0×106cells/ml，使用无血清培养基
Figure BDA0002512847640000121
SF001稀释细胞至1.0～1.5×106cells/ml，若48h细胞密度低于1.5×106cells/ml，静置处理，将细胞转移至50ml离心管中，于4℃沉降3～4小时。
6.3 24h取样计数，若活细胞密度较24h前降低，在24h时即可静置处理。
6.4 重复6.2-6.3，直至每72h可以正常稀释传代，连续5代保持48h的活细胞密度翻倍(比生长速率μ＞0.34d-1)且活率高于90％，驯化初步成功，随着传代次数增加，细胞对该培养基越来越适应，比生长速率会继续增高。
6.5 经经过60代细胞驯化，成功驯化一株LMH悬浮细胞系，命名为鸡肝癌悬浮细胞系LMH，细胞按1.5×106cells/ml密度进行接种传代，48h后细胞密度可以达到6～8×106cells/ml。
7细胞形态观察：
LMH贴壁细胞形态见图1，LMH悬浮细胞形态见图2。
实施例2
H9亚型禽流感病毒在鸡肝癌悬浮细胞系LMH上培养
1.病毒：H9亚型禽流感病毒
2.细胞系：实施例1得到的悬浮细胞系
3.培养基：LMH无血清悬浮培养基
Figure BDA0002512847640000122
SF001购自上海倍谙基生物科技有限公司
4.仪器设备：细胞培养瓶、摇床、二氧化碳培养箱
5.H9亚型禽流感病毒接毒
培养48h的正常健康鸡肝癌悬浮细胞系LMH，调整活细胞密度在4～5×106cells/ml，按0.1～1％接毒量接种H9亚型禽流感病毒，添加TPCK胰酶终浓度3～5μg/ml，33℃培养48～72h后，活细胞密度在0.5～2×106cells/ml，活率在30～60％时收获血凝价(HA)大于10的病毒液作为抗原，用于疫苗的制备。
实施例3
应用鸡肝癌悬浮细胞系LMH对禽腺病毒C4、D11、E8b、E8a进行培养
1.细胞：鸡肝癌悬浮细胞系LMH
2.毒种：C4、D11、E8b、E8a四个血清型禽腺病毒。
3.培养基：LMH无血清悬浮培养基
Figure BDA0002512847640000131
SF001购自上海倍谙基生物科技有限公司
4.仪器设备：细胞培养瓶、摇床、二氧化碳培养箱，水浴锅
5.禽腺病毒接毒
5.1 C4血清型禽腺病毒接毒
培养48h的正常健康鸡肝癌悬浮细胞系LMH，调整活细胞密度在2～3×106cells/ml，按0.1～0.5％接毒量接种，37℃培养48h后，活细胞密度在0.5～1.5×106cells/ml，活率在30～60％时收获病毒液作为抗原，测定病毒TCID50，用于疫苗的制备。
5.2 D11血清型禽腺病毒接毒
培养48h的正常健康鸡肝癌悬浮细胞系LMH，调整活细胞密度在2～3×106cells/ml，按1～0.5％接毒量接种，37℃培养48～72h后，活细胞密度在0.5～1.5×106cells/ml，活率在30～60％时收获病毒液作为抗原，测定病毒TCID50，用于疫苗的制备。
5.3 E8b血清型禽腺病毒接毒
培养48h的正常健康鸡肝癌悬浮细胞系LMH，调整活细胞密度在2×106cells/ml，按3～5％接毒量接种，37℃培养72h后，活细胞密度在1～1.5×106cells/ml，活率在30～60％时收获病毒液作为抗原，测定病毒TCID50，用于疫苗的制备。
5.4 E8a血清型禽腺病毒接毒
培养48h的正常健康鸡肝癌悬浮细胞系LMH，调整活细胞密度在2×106cells/ml，按3～5％接毒量接种，37℃培养72h后，活细胞密度在0.5～1.5×106cells/ml，活率在30～60％时收获病毒液作为抗原，测定病毒TCID50，用于疫苗的制备。
6.C4、D11、E8b、E8a四个血清型禽腺病毒TCID50结果
经过在鸡肝癌悬浮细胞系LMH上传代，C4、D11、E8b、E8a四个血清型禽腺病毒F3代的TCID50结果如表1所示，四个血清型毒的TCID50滴度均高于常规LMH贴壁细胞培养的病毒滴度。
表1 不同血清型禽腺病毒F3代的TCID50
TCID<sub>50</sub>(0.1ml) C4 D11 E8b E8a
LMH悬浮毒 10<sup>8.50</sup> 10<sup>8.13</sup> 10<sup>7.50</sup> 10<sup>7.80</sup>
LMH贴壁毒 10<sup>7.88</sup> 10<sup>7.13</sup> 10<sup>5.88</sup> 10<sup>6.5</sup>
7.C4血清型禽腺病毒接毒前后细胞形态如图3所示，其中左侧为接毒前鸡肝癌悬浮细胞系LMH的细胞形态，右侧为接毒后鸡肝癌悬浮细胞系LMH的细胞形态，接毒后细胞形态不规格，有大量破碎细胞碎片产生，细胞活率降低。
实施例4
应用鸡肝癌悬浮细胞系LMH对水禽星状病毒进行培养
1细胞：鸡肝癌悬浮细胞系LMH
2毒种：鹅星状病毒(俗称“鹅痛风”)为山东诸子生物科技有限公司临床分离株。
3.培养基：LMH无血清悬浮培养基
Figure BDA0002512847640000141
SF001购自上海倍谙基生物科技有限公司
4.仪器设备：细胞培养瓶、摇床、二氧化碳培养箱，水浴锅
5.鹅星状病毒接毒：
培养48h的正常健康鸡肝癌悬浮细胞系LMH，调整活细胞密度在2～3×106cells/ml，按3％接毒量接种鹅星状病毒，37℃培养72h后，活细胞密度在1～1.5×106cells/ml，活率在50～70％时收获病毒液作为抗原，测定病毒琼扩(AGP)效价，用于疫苗的制备。
6.鹅星状病毒抗原效价测定
采用琼脂糖双向扩散实验方法，利用鹅星状病毒(胚毒)阳性血清测定LMH悬浮毒的琼扩(AGP)效价，结果如图4所示，鹅星状病毒LMH悬浮毒的琼扩(AGP)效价可以达到26以上。
实施例5
应用鸡肝癌悬浮细胞系LMH对鸡传染性喉气管炎病毒进行培养
1.细胞：鸡肝癌悬浮细胞系LMH
2.毒种：鸡传染性喉气管炎病毒(LTV)为山东诸子生物科技有限公司保存毒株
3.培养基：LMH无血清悬浮培养基
Figure BDA0002512847640000151
SF001购自上海倍谙基生物科技有限公司
4.仪器设备：细胞培养瓶、摇床、二氧化碳培养箱，水浴锅
5.鸡传染性喉气管炎病毒接毒：
培养48h的正常健康鸡肝癌悬浮细胞系LMH，调整活细胞密度在3～5×106cells/ml，按0.1～1％接毒量接种鸡传染性喉气管炎病毒，37℃培养48h后，活细胞密度在1～2×106cells/ml，活率在30～50％时收获病毒液作为抗原，测定病毒的TCID50，用于疫苗的制备。
6.鸡传染性喉气管炎病毒TCID50测定
鸡传染性喉气管炎病毒按上述接毒工艺在鸡肝癌悬浮细胞系LMH上进行传代，传代至第五代，在LMH贴壁细胞上测定五代悬浮毒的TCID50，结果如表2所示。
表2 五代悬浮毒的TCID50
代次 F<sub>1</sub> F<sub>2</sub> F<sub>3</sub> F<sub>4</sub> F<sub>5</sub>
TCID<sub>50</sub>(0.1ml) 10<sup>7.5</sup> 10<sup>7.8</sup> 10<sup>8.1</sup> 10<sup>8.3</sup> 10<sup>7.8</sup>
7.鸡传染性喉气管炎病毒接毒后细胞病变情况如图5所示，接毒后细胞形态改变，折光性增强，死细胞增多，细胞破碎产生大量细胞碎片。
实施例6
应用鸡肝癌悬浮细胞系LMH对禽呼肠孤病毒进行培养。
1.细胞：鸡肝癌悬浮细胞系LMH
2.毒种：禽呼肠孤病毒病毒(ARV)为山东诸子生物科技有限公司保存毒株
3.培养基：LMH无血清悬浮培养基
Figure BDA0002512847640000161
SF001购自上海倍谙基生物科技有限公司
4.仪器设备：细胞培养瓶、摇床、二氧化碳培养箱，水浴锅
5.禽呼肠孤病毒接毒：
培养48h的正常健康鸡肝癌悬浮细胞系LMH，调整活细胞密度在3～5×106cells/ml，按0.01～0.1％接毒量接种禽呼肠孤病毒，37℃培养48h后，活细胞密度在1～2×106cells/ml，活率在30～50％时收获病毒液作为抗原，测定病毒的TCID50，用于疫苗的制备。
6.禽呼肠孤病毒TCID50测定
禽呼肠孤病毒按上述接毒工艺在鸡肝癌悬浮细胞系LMH上进行传代，传代至第五代，在LMH贴壁细胞上测定五代悬浮毒的TCID50，结果如表3所示，禽呼肠孤病毒直接可以适应鸡肝癌悬浮细胞系LMH，并产生较高病毒滴度。
表3 五代悬浮毒的TCID50
代次 F<sub>1</sub> F<sub>2</sub> F<sub>3</sub> F<sub>4</sub> F<sub>5</sub>
TCID<sub>50</sub>(0.1ml) 10<sup>9.2</sup> 10<sup>9.2</sup> 10<sup>9.5</sup> 10<sup>9.2</sup> 10<sup>9.8</sup>
实施例7
应用鸡肝癌悬浮细胞系LMH对鸡传染性支气管炎病毒进行培养
1.细胞：鸡肝癌悬浮细胞系LMH
2.毒种：鸡传染性支气管炎病毒(IBV M41)为山东诸子生物科技有限公司保存毒株
3.培养基：LMH无血清悬浮培养基
Figure BDA0002512847640000162
SF001购自上海倍谙基生物科技有限公司
4.仪器设备：细胞培养瓶、摇床、二氧化碳培养箱，水浴锅
5.鸡传染性支气管炎病毒接毒：
培养48h的正常健康鸡肝癌悬浮细胞系LMH，调整活细胞密度在2～3×106cells/ml，按1～5％接毒量接种鸡传染性支气管炎病毒，37℃培养72h后，活细胞密度在1～2×106cells/ml，活率在50～60％时收获病毒液作为抗原，测定病毒的EID50，用于疫苗的制备。
6.鸡传染性支气管炎病毒EID50测定
鸡传染性支气管炎病毒按上述接毒工艺在鸡肝癌悬浮细胞系LMH上进行传代，传代至第十代，利用SPF鸡胚测定6～10代悬浮毒的EID50，结果如表4所示。
表4 6～10代悬浮毒的EID50
代次 F<sub>6</sub> F<sub>7</sub> F<sub>8</sub> F<sub>9</sub> F<sub>10</sub>
EID<sub>50</sub>(0.1ml) 10<sup>6.7</sup> 10<sup>6.7</sup> 10<sup>6.2</sup> 10<sup>6.2</sup> 10<sup>6.2</sup>
实施例8
应用鸡肝癌悬浮细胞系LMH对鸡传染性法氏囊病毒进行培养
1细胞：鸡肝癌悬浮细胞系LMH
2毒种：鸡传染性法氏囊病毒(IBDVB87)为山东诸子生物科技有限公司保存毒株
3.培养基：LMH无血清悬浮培养基
Figure BDA0002512847640000171
SF001购自上海倍谙基生物科技有限公司
4.仪器设备：细胞培养瓶、摇床、二氧化碳培养箱，水浴锅
5鸡传染性法氏囊病毒接毒：
培养48h的正常健康鸡肝癌悬浮细胞系LMH，调整活细胞密度在2～3×106cells/ml，按0.1～1％接毒量接种鸡传染性法氏囊病毒，37℃培养48～72h后，活细胞密度在1～2×106cells/ml，活率在30～50％时收获病毒液作为抗原，测定病毒的ELD50，用于疫苗的制备。
6鸡传染性法氏囊病毒ELD50测定
鸡传染性法氏囊病毒按上述接毒工艺在鸡肝癌悬浮细胞系LMH上进行传代，传代至第三代，利用SPF鸡胚测定1～3代悬浮毒的ELD50，结果如表5所示，
表5 1～3代悬浮毒的ELD50
代次 F<sub>1</sub> F<sub>2</sub> F<sub>3</sub>
ELD<sub>50</sub>(0.1ml) 10<sup>5.5</sup> 10<sup>4.8</sup> 10<sup>5.0</sup>
实施例9
应用鸡肝癌悬浮细胞系LMH对禽减蛋综合征病毒进行培养
1.细胞：鸡肝癌悬浮细胞系LMH
2.毒种：禽减蛋综合征病毒为山东诸子生物科技有限公司保存毒株
3.培养基：LMH无血清悬浮培养基
Figure BDA0002512847640000181
SF001购自上海倍谙基生物科技有限公司
4.仪器设备：细胞培养瓶、摇床、二氧化碳培养箱，水浴锅
5.禽减蛋综合征病毒接毒：
培养48h的正常健康鸡肝癌悬浮细胞系LMH，调整活细胞密度在2～3×106cells/ml，按1～5％接毒量接种禽减蛋综合征病毒，37℃培养72～96h后，活细胞密度在1～2×106cells/ml，活率在50～60％时收获血凝价(HA)大于15的病毒液作为抗原，用于疫苗的制备。
6.禽减蛋综合征病毒血凝价测定
禽减蛋综合征病毒按上述接毒工艺在鸡肝癌悬浮细胞系LMH上进行传代，传代至第十五代，利用血凝实验检测禽减蛋综合征悬浮毒血凝价(HA)，结果如图6所示，经持续传代禽减蛋综合征病毒可以很好适应鸡肝癌悬浮细胞系LMH，其悬浮毒血凝价(HA)可以稳定在15，最高可以达到16。
实施例10
应用鸡肝癌悬浮细胞系LMH对禽副粘病毒进行培养
1.细胞：鸡肝癌悬浮细胞系LMH
2.毒种：禽副粘病毒(Lasota株)山东诸子生物科技有限公司保存毒株
3.培养基：LMH无血清悬浮培养基
Figure BDA0002512847640000182
SF001购自上海倍谙基生物科技有限公司
4.仪器设备：细胞培养瓶、摇床、二氧化碳培养箱，水浴锅
5.禽副粘病毒接毒：
培养48h的正常健康鸡肝癌悬浮细胞系LMH，调整活细胞密度在3～4×106cells/ml，按0.01～0.1％接毒量接种禽副粘病毒，37℃培养72～96h后，活细胞密度在1～2×106cells/ml，活率在50～60％时收获血凝价(HA)大于9的病毒液作为抗原，用于疫苗的制备。
6.禽副粘病毒血凝价测定
禽副粘病毒按上述接毒工艺在LMH悬浮细胞上进行传代，传代至第十二代，利用血凝实验检测禽副粘悬浮毒血凝价(HA)，结果如图7所示，经持续传代禽副粘病毒可以很好适应鸡肝癌悬浮细胞系LMH，其悬浮毒血凝价(HA)可以稳定在10，最高可以达到11。
实施例11
新流腺三联疫苗制备
1试验目的：利用鸡肝癌悬浮细胞系LMH培养H9亚型禽流感病毒、鸡新城疫Lasota株病毒、C4血清型禽腺病毒抗原制备新流腺三联疫苗
2抗原灭活：
H9亚型禽流感病毒、鸡新城疫Lasota株病毒抗原、C4血清型禽腺病毒信息见表6，灭活方式全部采用甲醛灭活，灭活方式及条件见表7。(20200102灭活，20200105制苗)。
表6 不同批次灭活抗原效价
Figure BDA0002512847640000191
Figure BDA0002512847640000201
表7 制苗方法
Figure BDA0002512847640000202
分装250ml疫苗瓶，疫苗批次编号为HLC-01A1、HLC-01A2和HLC-01A3。
实施例12
新流腺三联疫苗质量检验
1疫苗稳定性检验
依据现行《中国兽药典》二〇一五年版制定规程分别进行疫苗稳定性检验、油乳剂疫苗中甲醛残留量和疫苗粘度检验。
检测结果如表8所示：
表8 疫苗质量检测
Figure BDA0002512847640000211
实施例13
新流腺三联疫苗安全性检验和效力检验
依据现行《中国兽药典》二〇一五年版制定规程进行疫苗安全检验和疫苗效力检验，其中疫苗效力检验步骤如下：
1)21-28日龄健康的SPF鸡45只，将其分为五组中，免疫组一组10只，对照组一组5只，分别饲养在安效检区的五台隔离器中。
2)将检的疫苗产品、1ml注射器、75％酒精棉和脚环放入隔离器传递窗中，消毒30分钟(根据消毒液性质而定)。消毒结束后，将物品传入隔离器内。
3)对免疫组10只SPF鸡进行疫苗接种。操作人员通过隔离器操作手套，一人保定SPF鸡，另一人先对注射部位进行消毒，然后将疫苗启封，各皮下注射疫苗0.3ml。
4)在全部接种完成后，将待检的疫苗产品等物品放入隔离器传递窗中，喷雾消毒，静置30分钟(根据消毒液性质而定)。消毒结束后，将物品传出。
5)另5只SPF鸡不接种作为对照组单独饲养。
6)在全部接种完成后，继续对动物观察0.5～1个小时。填写《实验动物饲养观察记录》。
7)正常饲养管理，观察21日，每日记录。
8)接种后21日，将两组SPF鸡分别进行翅静脉采血。一人保定SPF鸡，一人采血，每只鸡采1ml，将血液注入1.5mlEP管中(每只鸡一个EP管)。将EP管放入自封袋中，封口，做好标记，交与生物制品检验员，分离血清，采用HI和AGP方法测定三个毒株的抗体效价。
疫苗安全检验结果如表9所示，三个批次疫苗接种后，观察21日，在注射部位及全身没有引起明显不良反应，疫苗注射组与对照组SPF鸡采食及精神状态无太大变化，解剖观察，注射局部疫苗吸收良好，无肿胀，炎症等。试验结果表明，悬浮培养收获抗原制备新流腺三联苗对于鸡群免疫是安全的。同时与市售产品进行对比实验，市售产品为鸡胚抗原生产，疫苗免疫鸡只有2只未完全吸收的疫苗存在，并有一只存在精神状态不良表现。综合来说悬浮培养收获H9亚型禽流感病毒、新城疫Lasota病毒和C4血清型禽腺病毒抗原制备的新流腺三联苗安全性上优于鸡胚抗原疫苗。
表9 疫苗安全检验结果
Figure BDA0002512847640000221
疫苗效力检验结果如表10所示，悬浮培养收获H9亚型禽流感病毒、新城疫Lasota病毒、C4禽腺病毒抗原制备的新流腺三联苗抗体滴度明显高于市售产品。
表10 疫苗效力检验结果
Figure BDA0002512847640000222
Figure BDA0002512847640000231
施例14
新支减三联疫苗制备及检验
1试验目的：利用鸡肝癌悬浮细胞系LMH培养鸡新城疫Lasota株病毒、鸡传染性支气管炎病毒M41、禽减蛋综合征病毒抗原制备新支减三联疫苗
2抗原灭活：
鸡新城疫Lasota株病毒、鸡传染性支气管炎病毒M41、禽减蛋综合征病毒见表11，灭活方式全部采用甲醛灭活，制苗方式及灭活条件见表12。(20200102灭活，20200105制苗)。
表11 不同批次灭活抗原效价
Figure BDA0002512847640000241
表12 制苗方法
Figure BDA0002512847640000242
分装250ml疫苗瓶，疫苗批次编号为MLE-01A1。
3新支减三联疫苗稳定性检验
依据现行《中国兽药典》二〇一五年版制定规程分别进行疫苗稳定性检验、油乳剂疫苗中甲醛残留量和疫苗粘度检验。
检测结果如表13所示：
表13 疫苗质量检测
Figure BDA0002512847640000243
Figure BDA0002512847640000251
4新支减三联疫苗安全性检验和效力检验
安全性检验依据现行《中国兽药典》二〇一五年版制定规程进行，疫苗效力检验依据《兽药质量标准》2017年版生物制品卷进行，具体方法参考上述依据。
疫苗安全检验结果如表14所示，三个批次疫苗接种后，观察21日，在注射部位及全身没有引起明显不良反应，疫苗注射组与对照组SPF鸡采食及精神状态无太大变化，解剖观察，注射局部疫苗吸收良好，无肿胀，炎症等。试验结果表明，悬浮培养收获抗原制备新支减三联苗对于鸡群免疫是安全的。同时与市售产品进行对比实验，市售产品为鸡胚抗原生产，疫苗免疫鸡只有1只未完全吸收的疫苗存在。综合来说悬浮培养收获抗原制备的新支减三联苗安全性上优于鸡胚抗原疫苗。
表14 疫苗安全检验结果
Figure BDA0002512847640000252
疫苗效力检验结果如表15所示，悬浮培养收获鸡新城疫Lasota株病毒、鸡传染性支气管炎病毒M41、禽减蛋综合征病毒制备的新支减三联苗抗体滴度明显高于市售产品。
表15 疫苗效力检验结果
Figure BDA0002512847640000253
Figure BDA0002512847640000261
实施例15
新流法三联疫苗制备及检验
1试验目的：利用鸡肝癌悬浮细胞系LMH培养鸡新城疫Lasota株病毒、H9亚型禽流感病毒、禽传染性法氏囊病毒抗原制备新支减三联疫苗
2抗原灭活：
鸡新城疫Lasota株病毒、鸡传染性法氏囊病毒B87、H9亚型禽流感病毒见表16，灭活方式全部采用甲醛灭活，制苗方式及灭活条件见表17。(20200102灭活，20200105制苗)。
表16 不同批次灭活抗原效价
Figure BDA0002512847640000262
Figure BDA0002512847640000271
表17 制苗方法
Figure BDA0002512847640000272
分装250ml疫苗瓶，疫苗批次编号为HLB-01A1。
3新流法三联疫苗稳定性检验
依据现行《中国兽药典》二〇一五年版制定规程分别进行疫苗稳定性检验、油乳剂疫苗中甲醛残留量和疫苗粘度检验。
检测结果如表18所示：
表18 疫苗质量检测
Figure BDA0002512847640000273
4新流法三联疫苗安全性检验和效力检验
安全性检验依据现行《中国兽药典》二〇一五年版制定规程进行，疫苗效力检验依据《兽药质量标准》2017年版生物制品卷进行，具体方法参考上述依据。
疫苗安全检验结果如表19所示，三个批次疫苗接种后，观察21日，在注射部位及全身没有引起明显不良反应，疫苗注射组与对照组SPF鸡采食及精神状态无太大变化，解剖观察，注射局部疫苗吸收良好，无肿胀，炎症等。试验结果表明，悬浮培养收获抗原制备新流法三联苗对于鸡群免疫是安全的。同时与市售产品进行对比实验，市售产品为鸡胚抗原生产，疫苗免疫鸡只有1只未完全吸收的疫苗存在。综合来说悬浮培养收获抗原制备的新流法三联苗安全性上优于鸡胚抗原疫苗。
表19 疫苗安全检验结果
Figure BDA0002512847640000281
疫苗效力检验结果如表20所示，悬浮培养收获鸡新城疫Lasota株病毒、鸡传染性法氏囊病毒B87、H9亚型禽流感病毒制备的新流法三联苗抗体滴度明显高于市售产品。
表20 疫苗效力检验结果
Figure BDA0002512847640000282
Figure BDA0002512847640000291
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种家禽癌细胞无血清悬浮细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将家禽癌细胞的贴壁细胞复苏，选择汇合度大于80％的贴壁细胞消化，将消化细胞接种至无血清培养基
Figure FDA0002512847630000011
SF001上；
(2)每24h取样计数一次，当计数的活细胞密度大于步骤(1)所述接种的量时，继续培养至48h，若48h活细胞密度高于1.5×106cells/ml，使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0～1.5×106cells/ml，若48h细胞密度低于1.5×106cells/ml，静置沉降后弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.0～1.5×106cells/ml，继续培养；
当24h取样计数时，计数的活细胞密度小于步骤(1)所述接种的量时，静置沉降后弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.0～1.5×106cells/ml继续培养至48h，若48h活细胞密度高于1.5×106cells/ml，使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0～1.5×106cells/ml，若48h细胞密度低于1.5×106cells/ml，静置沉降后弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.0～1.5×106cells/ml，继续培养；
(3)重复步骤(2)，直至每72h正常稀释传代，连续5代保持48h时活细胞密度翻倍且活率高于90％，得家禽癌细胞无血清悬浮细胞系；
优选的，步骤(1)所述消化后还包括利用原有含血清培养基终止消化；
优选的，步骤(1)所述接种的密度为1.0～1.5×106cells/ml；
优选的，步骤(2)所述静置沉降为在4℃静置3～4h。
2.利用权利要求1所述建立方法构建得到的家禽癌细胞无血清悬浮细胞系，其特征在于，所述家禽癌细胞无血清悬浮细胞系的比生长速率μ＞0.34d-1。
3.根据权利要求2所述家禽癌细胞无血清悬浮细胞系，其特征在于，所述家禽癌细胞无血清悬浮细胞系包括鸡肝癌细胞无血清悬浮细胞系。
4.一株无血清悬浮培养的鸡肝癌悬浮细胞系LMH，其特征在于，所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH的保藏编号为CCTCC NO：C202072。
5.权利要求4所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH在培养病毒毒株中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述病毒毒株包括H9亚型禽流感病毒、禽腺病毒、水禽星状病毒、禽减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒和禽副粘病毒。
7.一种利用权利要求4所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH培养病毒毒株的方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节细胞密度为2～5×106cells/ml后，接种病毒毒株，培养48～96h后，收集病毒液；
所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为0.5～2×106cells/ml；
所述接种的病毒毒株的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.01～5％；
优选的，当所述病毒毒株为H9亚型禽流感病毒时，在所述接种后还包括添加TPCK胰酶，再进行所述培养；
优选的，所述TPCK胰酶的加入量为3～5μg/ml；
优选的，当所述病毒毒株为H9亚型禽流感病毒时，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为4～5×106cells/ml后，接种H9亚型禽流感病毒，添加TPCK胰酶后，培养48～72h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为0.5～2×106cells/ml；所述接种的H9亚型禽流感病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.1～1％；
优选的，当所述病毒毒株为禽腺病毒时，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为2～3×106cells/ml后，接种禽腺病毒，培养48～72h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为0.5～1.5×106cells/ml；所述接种的禽腺病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.05～0.1％；
优选的，当所述病毒毒株为水禽星状病毒时，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为2～3×106cells/ml后，接种水禽星状病毒，培养48～72h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～1.5×106cells/ml；所述接种的水禽星状病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的1～5％；
优选的，当所述病毒毒株为禽减蛋综合征病毒时，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为2～3×106cells/ml后，接种禽减蛋综合征病毒，培养72～96h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～2×106cells/ml；所述接种的禽减蛋综合征病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的1～5％；
优选的，当所述病毒毒株为禽呼肠孤病毒时，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为3～5×106cells/ml后，接种禽呼肠孤病毒，培养48h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～2×106cells/ml；所述接种的禽呼肠孤病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.01～0.1％；
优选的，当所述病毒毒株为鸡传染性喉气管炎病毒时，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为3～5×106cells/ml后，接种鸡传染性喉气管炎病毒，培养48h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～2×106cells/ml；所述接种的鸡传染性喉气管炎病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.1～1％；
优选的，当所述病毒毒株为鸡传染性法氏囊病毒时，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为2～3×106cells/ml后，接种鸡传染性法氏囊病毒，培养48～72h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～2×106cells/ml；所述接种的鸡传染性法氏囊病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.1～1％；
优选的，当所述病毒毒株为鸡传染性支气管炎病毒时，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为2～3×106cells/ml后，接种鸡传染性支气管炎病毒，培养48h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～2×106cells/ml；所述接种的鸡传染性支气管炎病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的1～5％；
优选的，当所述病毒毒株为禽副粘病毒时，包括以下步骤：将所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞培养48h后，调节浓度为3～4×106cells/ml后，接种禽副粘病毒，培养72～96h后，收集病毒液；所述病毒液中所述鸡肝癌悬浮细胞系LMH细胞的活细胞密度为1～2×106cells/ml；所述接种的禽副粘病毒的体积为调节浓度后鸡肝癌悬浮细胞系LMH体积的0.01～0.1％。
8.利用权利要求7所述方法培养得到的病毒毒株在制备禽疫苗中的应用。
9.一种利用权利要求7所述方法培养得到的病毒毒株制备禽疫苗的方法，其特征在于，将利用权利要求7所述方法培养得到的病毒毒株中的一种或多种毒株灭活后，作为抗原，制备禽疫苗。
10.一种禽疫苗，其特征在于，所述禽疫苗的有效成分包括经灭活的利用权利要求7所述方法培养得到的病毒毒株；
优选的，所述禽疫苗包括单联疫苗或多联疫苗。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113564127A (zh) * 2021-09-01 2021-10-29 青岛易邦生物工程有限公司 一种大规模悬浮培养禽腺病毒的方法
CN113755454A (zh) * 2021-10-18 2021-12-07 贵州福斯特生物科技有限公司 一种8a型禽腺病毒毒株、灭活疫苗及其制备方法和应用
CN114410584A (zh) * 2021-12-17 2022-04-29 乾元浩生物股份有限公司 Lmh细胞克隆株及利用lmh细胞克隆株全悬浮培养禽腺病毒-4型的方法
CN114480286A (zh) * 2022-02-16 2022-05-13 上海健士拜生物科技有限公司 无血清悬浮型lmh细胞系及其制备方法和应用
CN115161284A (zh) * 2022-07-04 2022-10-11 无锡多宁生物科技有限公司 一种lmh悬浮细胞复苏培养方法及其应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113564127A (zh) * 2021-09-01 2021-10-29 青岛易邦生物工程有限公司 一种大规模悬浮培养禽腺病毒的方法
CN113755454A (zh) * 2021-10-18 2021-12-07 贵州福斯特生物科技有限公司 一种8a型禽腺病毒毒株、灭活疫苗及其制备方法和应用
CN113755454B (zh) * 2021-10-18 2023-07-07 贵州福斯特生物科技有限公司 一种8a型禽腺病毒毒株、灭活疫苗及其制备方法和应用
CN114410584A (zh) * 2021-12-17 2022-04-29 乾元浩生物股份有限公司 Lmh细胞克隆株及利用lmh细胞克隆株全悬浮培养禽腺病毒-4型的方法
CN114480286A (zh) * 2022-02-16 2022-05-13 上海健士拜生物科技有限公司 无血清悬浮型lmh细胞系及其制备方法和应用
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