CN112094339A - 一种猪圆环病毒2型阳性血清及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪圆环病毒2型阳性血清及其制备。所述血清主要用于兽用生物制品的质量控制，该血清的制备包括猪圆环病毒2型免疫原的制备、阴性试验动物的筛选、免疫及抗体水平监测及阳性血清检定。采用本发明所述工艺制备的猪圆环病毒2型阳性血清中和效价高，能解决目前兽用生物制品检验中猪圆环病毒2型毒种中和困难的难题；本发明制备的猪圆环病毒2型阳性血清纯净性好，无菌、无支原体、无外源病毒污染；特异性好，不含有除猪圆环病毒2型抗体外的其他猪病常见病原抗体。以上特征充分满足了检验用阳性血清的要求，对于提升我国猪圆环病毒2型疫苗质量具有重要意义。

Description

一种猪圆环病毒2型阳性血清及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种猪圆环病毒2型阳性血清及其制备方法，属于生物技术和动物病毒学领域。

背景技术

猪圆环病毒病(PCVD)的含义是指一系列综合症侯群或是与PCV2(porcinecircovirus 2type)感染相关的疾病。现已证实，PCV2主要侵害猪体的免疫系统，导致免疫抑制及机体抵抗力降低，干扰和破坏猪对其他疫病免疫抗体的产生和维持，从而继发其他疾病。因此，在养殖业中，PCV2的危害往往不是孤立的，常引起其它重要疾病(如猪细小病毒病、猪繁殖与呼吸综合征、猪副嗜血杆菌病、猪肺炎支原体病、猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病等)的继发感染。猪圆环病毒病发病率可达50％，死亡率可能因猪场条件、继发感染情况而不同，一般在5％～70％。猪圆环病毒病中，以断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post weaningmultisystemic wasting syndrome，PMWS)对养猪业造成的危害最为严重。

目前我国猪圆环病以预防为主，主要以全病毒灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗为主。全病毒灭活疫苗采用PK15细胞培养，其生产的过程涉及多种生物性原材料，如血清、胰酶、细胞等，极易受到外源因子的污染。而所污染的外源因子的不确定性给检验带来极大的困难。尤其是种毒，按照现行《中国兽药典》的规定，需进行外源病毒检验，检验时应采用特异性血清对疫苗毒进行中和。抗血清的制备技术虽比较成熟，但因病原特点不同及用途不同，制备的关键点有所差异。目前，国家知识产权局专利查询已公布的动物性抗血清约30余项，但尚未有猪圆环病毒阳性血清制备方法的报道和专利。在兽用生物制品外源病毒检验过程中，低效价的猪圆环病毒2型阳性血清不能完全中和疫苗毒及种毒，且生产企业自行制备的血清存在特异性差、效价低、对细胞毒性大、外源因子污染等问题，严重影响了产品质量检验。

本发明提供了一种针对猪圆环病毒2型高效价、成分单一、纯净良好的特异性阳性血清的制备工艺，该工艺制备的阳性血清充分满足了外源病毒检验对检验试剂的要求，解决猪圆环病毒疫苗质量控制检验试剂短缺问题，对于兽用生物制品行业的健康发展具有重要意义。

发明内容

本发明为解决兽用生物制品标准物质短缺问题，提供了一种猪圆环病毒2型阳性血清制备工艺。采用该工艺制备的阳性血清中和效价高，能解决目前猪圆环病毒2型毒种外源病毒检验中和用标准物质问题；该工艺制备的阳性血清纯净性好，不含有其他猪常见病原；特异性好，不含有除猪圆环病毒2型抗体外的其他猪常见病原抗体。以上特征充分满足了兽用生物制品检验对阳性血清的要求，解决了猪圆环病毒2型疫苗质量控制的标准试剂短缺问题，对于兽用生物制品行业的健康发展具有重要意义。

为实现上述目标，本发明实施了以下技术方案：

1.一种猪圆环病毒2型阳性血清，其特征在于该阳性血清是采用剖腹产、隔离饲养、人工饲喂的方式，排除了母源抗体的干扰的CDCD猪(剖腹产且不吃母乳的猪，下同)经高浓缩抗原多次免疫获得的，其血清的中和抗体效价≥1:64；

2.本发明所述一种猪圆环病毒2型阳性血清，其特征在于该血清的制备方法是：

(1)种毒制备猪圆环病毒2型毒种采用经敏感、纯净的PK15细胞进行微载体悬浮培养，收获病毒液，并经超滤浓缩50～100倍以上去除小分子杂蛋白，收集病毒液，再经无菌检验、支原体检验和外源病毒检验合格，病毒含量不低于10^8.0TCID₅₀/mL；

(2)免疫原制备按病毒液总量1/4000(V/V)加入β-丙内酯(纯度97％)，混匀，置2～8℃灭活24h再经37℃水解2h；经灭活检验合格后，按疫苗含灭活前的PCV2病毒液10^8.0TCID₅₀/mL稀释，按抗原3份与ISA 15A佐剂1份的比例充分混合乳化获得免疫原；

(3)动物的选择采用CDCD猪，隔离饲养、人工饲喂，猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环2型病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、口蹄疫病毒、猪乙脑病毒等病原的抗原和抗体均为阴性；

(4)免疫及抗体水平监测将制备好的乳化抗原每头猪肌肉注射1ml作为基础免疫；基础免疫21天后，每头猪分别肌肉注射乳化抗原5mL，继续观察；加强免疫后28天再用灭活前浓缩抗原(病毒含量为10^8.0TCID₅₀/mL)攻击，2mL/头；攻毒后14天开始每隔7天采血检测血清中猪圆环病毒中和抗体效价；血清中和抗体效价≥1:64，PCV2抗原检测为阴性为最佳采血时间；

(5)血清的检验对血清进行性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、中和效价测定、特异性检验。特异性检验包括猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行型腹泻病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪乙脑病毒等猪常见病原。

3.本发明所述一种猪圆环病毒2型阳性血清，其特征在于该血清主要用于兽用生物制品质量控制，也可用于猪圆环病毒2型的其他相关检测。

本发明的积极意义

本发明用于猪圆环病毒2型阳性血清制备，所制备的阳性血清中和效价高，能解决目前兽用生物制品外源病毒检验时猪圆环病毒2型种毒缺少中和用血清的问题；纯净性好，无菌、无支原体、无外源病毒污染；特异性好，不含有除猪圆环病毒2型抗体外的其他猪常见病原抗体。以上特征充分满足了外源病毒检验用阳性血清的要求，解决了长期困扰猪圆环病毒2型疫苗质量控制的瓶颈问题，对于兽用生物制品行业的健康发展具有重要意义。

本发明所获得新的技术效果在于：

采用纯净、高效价的毒种作为免疫原，确保了阳性血清的纯净性和免疫效果；采用CDCD

猪作为免疫动物，确保了阳性血清纯净性；采用多次免疫，密集监测抗体水平，确保了阳性血清高效价；对阳性血清进行全面的检定，确保了阳性血清的质量。该工艺制备的阳性血清，适用于任何毒株的猪圆环病毒2型毒种、半成品的外源病毒检验、鉴别检验等。

具体实施方式

1.免疫原制备

(1)微载体悬浮培养细胞的制备取PK15工作种子细胞1～2支复苏，按T25、T75、T225等逐级扩大贴壁培养，生长至致密单层后用胰蛋白酶消化分散，细胞活力不低于95％时，按4×10⁵个/mL接种密度转移至生物反应器中，Cytodex 1微载体用量为2～3g/L，设定反应器细胞培养的参数(温度36.5℃，pH值7.1，DO值50％，转速60r/min)。定时取样进行细胞观察、计数。

(2)抗原的制备待反应器细胞长成单层，沉淀排出细胞营养液，更换3％牛血清的DMEM～3％种毒含量接种猪圆环病毒2型毒种(任意株猪圆环病毒2型疫苗生产毒株或经过严格鉴定的猪圆环病毒2型分离毒株均可以作为阳性血清制备毒株)，设定反应器病毒培养的参数为(温度36.5℃，pH值7.40，DO值30％，转速60r/min)，进行病毒的繁殖。如此培养48～72h后，加入含3％牛血清的DMEM继续培养48～72h，收获病毒液，-20℃冻融三次，超声处理收获物，然后高压处理以裂解细胞。

(3)抗原浓缩与纯化将上述制备好的PCV2抗原，先用0.45μm微滤膜或连续流离心机去除细胞碎片，然后采用150KD中空纤维超滤浓缩系统纯化浓缩50～100倍以上去除小分子杂蛋白，收集病毒液备用，一部分留作攻毒用，一部分用于灭活抗原的制备。

(4)灭活按病毒液总量1/4000(V/V)加入β-丙内酯(纯度97％)，混匀，置2～8℃灭活24h，期间每4h振摇1次。将灭活的病毒液再经37℃水解2h，置2～8℃保存，应不超过30日。

(5)半成品检验

1)病毒含量测定取灭活前的病毒液按间接免疫荧光法进行病毒含量测定，病毒含量应≥10^8.0TCID₅₀/mL。

2)无菌检验按现行《中国兽药典》((中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)附录进行检验，应无菌生长。

3)灭活检验取灭活病毒液，按5％(V/V)的比例接种于含PK-15细胞，37℃吸附1小时，弃病毒液，加入维持液，37℃培养72h，应无CPE，接种细胞连续盲传3代，IFA法检测，应无绿色荧光PCV2阳性细胞，则判灭活检验合格。

(6)免疫原的制备按含灭活前的PCV2病毒液10^8.0TCID₅₀/mL稀释半成品，按抗原3份与ISA 15A佐剂1份的标准，根据预配苗的总量、浓缩病毒的毒价结果以及ISA 15A佐剂，分别计算出所需圆环病毒的毒液、ISA 15A佐剂及注射用水的量。先将所需量的注射用水置配苗乳化罐中，然后加入所需量圆环病毒的毒液，低速(3000r/min)搅拌10min，然后缓慢加入ISA 15A佐剂，继续(3000r/min)搅拌30min，使其充分混合乳化，作为免疫原。

2.动物的选择选择经剖腹产且不吃母乳的的1月龄、体重15～20kg猪(CDCD猪)，猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环2型病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、口蹄疫病毒、猪乙脑病毒抗原和抗体均为阴性。实验前动物舍要经过严格的消毒处理，实验期间要严格控制动物舍的环境卫生和人员流动，避免交叉污染。

3.免疫及抗体水平监测将制备好的乳化抗原每头猪肌肉注射1mL作为基础免疫；基础免疫21天后，每头猪分别肌肉注射乳化抗原5mL，继续观察。加强免疫后28天再用灭活前浓缩抗原(病毒含量为10^8.0TCID₅₀/mL)攻击，5mL/头；攻毒后14天开始每隔7天采血检测血清中猪圆环病毒中和抗体效价。以血清中和抗体效价≥1:64，PCV2抗原检测为阴性为最佳采血时间。若离上次攻毒35天以上中和抗体效价仍达不到1:64，可再进行一次攻毒，剂量加倍。

4.血清采集猪血清采集采取颈动脉放血法，可最大程度保证无菌操作。使用的容器具均需灭菌处理。具体操作如下：猪仰卧固定后，将颈部用碘酊消毒后，再用75％酒精脱碘。局部消毒后，在靠近气管的一侧切开皮肤将皮下组织与肌肉作钝性分离，以手指沿气管处摸到强烈博动的颈动脉，轻轻用手指勾出并小心将其与颈静脉和迷走神经分开，剥离动脉外结缔组织，将颈动脉两端用止血钳夹住，以手术刀在两止血钳之间的动脉上作一纵行切口，将连有消毒硅胶管的玻璃牛角管插入动脉腔内并固定，将橡皮管的另一端插入消毒的采血容器内，打开近血端的止血钳让血液流入牛角管内。待采血到猪失去挣扎能力时，将猪四肢松绑，活动其四肢，并锤击猪心脏部位，以增加出血量。每头猪采血时均需更换容器具和器材。采血完毕后将采血容器加盖，在37℃静置1h后，转入2～8℃过夜。第2天在无菌室II级生物安全柜内分离血清后，10000r/min离心20min，取上清。将分离的血清放入56℃水浴灭活30min，每瓶取样10ml待检，其余置-15℃以下保存。

5.血清的检验将上述最小取样单位作为独立的样品分别进行性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、中和效价测定、特异性检验。其中外源病毒检验除满足国家标准要求外，采用细胞培养法对本病原进行检测；特异性检验包括猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行型腹泻病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪乙脑病毒等猪常见病原。检验合格的血清混合，分装，贴上标签，注明血清名称、批号、规格、生产日期等，置-15℃以下保存。

实施例

以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制。

实施例1阳性血清的制备

1.免疫原制备：

(1)微载体悬浮培养细胞的制备及抗原接种取PK15工作种子细胞1支复苏，按T25、T75、T225等逐级扩大贴壁培养，生长至致密单层后用胰蛋白酶消化分散，细胞活力为95％以上时，按4×10⁵个/mL接种密度转移至生物反应器中，Cytodex 1微载体用量为2～3g/L，设定反应器细胞培养的参数(温度36.5℃，pH值7.1，溶氧量DO值50％，转速60r/min)。定时取样进行细胞观察、计数。待反应器细胞长成单层，沉淀排出细胞营养液，更换3％牛血清的DMEM按3％种毒含量接种PCV2毒种(本发明实验室保留的PCV2 IVDC株，该毒株2015年6月由内蒙古自治区呼和浩特分离到)，设定反应器病毒培养的参数为(温度36.5℃，pH值7.40，溶氧量DO值30％，转速60r/min)，进行病毒的繁殖。如此培养72h后，加入含3％牛血清的DMEM继续培养48h，收获病毒液，-20℃冻融三次，超声处理收获物，然后高压处理以裂解细胞。

(2)抗原浓缩与纯化：将上述制备好的PCV2抗原，先用0.45μm微滤膜或连续流离心机去除细胞碎片，然后采用150KD中空纤维超滤浓缩系统纯化浓缩100倍以上去除小分子杂蛋白，收集病毒液备用，一部分留作攻毒用，一部分用于灭活抗原的制备。

(3)抗原的灭活：按病毒液总量1/4000(V/V)加入β-丙内酯(纯度97％)，混匀，置2～8℃灭活24h，期间每4h振摇1次。将灭活的病毒液再经37℃水解2h，置2～8℃保存。

(4)半成品检验

1)病毒含量测定：取灭活前的病毒液按间接免疫荧光法进行病毒含量测定，病毒含量为10^8.5TCID₅₀/mL。

2)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果无菌生长。

3)灭活检验：取灭活病毒液，按5％(V/V)的比例接种于含PK-15细胞，37℃吸附h，弃病毒液，加入维持液，37℃培养72h，无CPE出现，接种细胞连续盲传3代，IFA法检测，未出现绿色荧光PCV2阳性细胞，说明灭活检验合格。

(5)免疫原的制备：将上述灭活后的抗原稀释3倍(即疫苗含灭活前的PCV2病毒液10^8.0TCID₅₀/mL)，按抗原3份与ISA 15A佐剂1份的标准配比。先加入所需量圆环病毒的毒液，低速(3000r/min)搅拌10min，然后缓慢加入ISA 15A佐剂，继续(3000r/min)搅拌30min，使其充分混合乳化，作为免疫原。

2.动物的选择：选择经剖腹产且不吃母乳的1月龄(体重15～20kg)猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环2型病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、口蹄疫病毒、猪乙脑病毒抗原和抗体均为阴性的3头CDCD猪(每头猪为一个批次)。实验前动物舍经过严格的消毒处理，实验期间严格控制动物舍的环境卫生和人员流动，避免交叉污染。3头猪常见病原抗体检测结果见下表1。

表1 3头猪常见病原抗体检测结果

3.免疫及抗体水平监测：将制备好的乳化抗原每头猪肌肉注射1ml作为基础免疫；基础免疫21天后，每头猪分别肌肉注射乳化抗原5mL，继续观察。加强免疫后28天再用灭活前浓缩抗原(病毒含量为10^8.0TCID₅₀/mL)攻击，5mL/头；攻毒后14天、21天、25天、28天(之后每隔3天)采血检测血清中猪圆环病毒中和抗体效价。以血清中和抗体效价≥1:64，PCV2抗原检测为阴性为最佳采血时间。若离上次攻毒35天以上中和抗体效价仍达不到1:64，可再进行一次攻毒，剂量加倍。经监测，在免疫攻毒后28天时，3头猪血清中和抗体效价分别达到1:64、1:128、1:128，且PCV2抗原阴性(荧光定量PCR检测核酸，低于15copies/mL为阴性；待成品检验时采用细胞培养法检测间接免疫荧光检测抗原)，此时为最佳采血时间。

4.血清采集：采取颈动脉放血法每头猪采血时均需更换容器具和器材。采血完毕后将采血容器加盖，在37℃静置1小时后，转入2～8℃过夜。第2天在无菌室II级生物安全柜内分离血清后，10000r/min离心20min，取上清。将分离的血清放入56℃水浴灭活30min，每瓶取样10mL待检，其余置-15℃以下保存。

5.血清的检验：将上述最小取样单位作为独立的样品分别进行性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验(包括PCV2的间接免疫荧光检测)、中和效价测定、特异性检验。特异性检验包括猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行型腹泻病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪乙脑病毒等猪常见病原。检验合格的血清混合，分装，贴上标签，注明血清名称、批号、规格、生产日期等，置-15℃以下保存。结果该3批血清中和效价分别为1:64、1:128、1:128，且均为淡黄色或略带红色澄清稍粘稠液体，无明显溶血或异物；无菌、无支原体、无外源病毒污染；3批血清均未检出猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行型腹泻病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪乙脑病毒抗体，特异性良好。

实施例2——阳性血清在猪圆环病毒2型毒种外源病毒检验中的应用

选取本发明制备的中和效价为1:64的阳性血清分别用于2株猪圆环病毒2型毒种(病毒含量分别为10^6.0TCID₅₀/mL、10^6.5TCID₅₀/mL)的外源病毒检验。按照《中国兽药典》2015年版三部附录3305方法，取1mL毒种原液与阳性血清进行中和，然后进行外源病毒检验。结果：所有批次均未出现中和不完全的现象，且未出现因阳性血清造成的细胞毒性。

实施例3——阳性血清在猪圆环病毒2型鉴别检验中的应用

选取本发明制备的中和效价为1:64的阳性血清分别与两株200FA-TCID₅₀猪圆环病毒2型毒株等量中和，接种PK15细胞，培养72小时，通过间接免疫荧光的方法检测。结果中和组细胞孔未检出绿色荧光，未中和的病毒对照组细胞孔出现绿色荧光。

实施例3——阳性血清在间接免疫荧光方法中的应用

取PCV2(IVDC)毒株按10倍系列稀释，取10^-3稀释度，接种含PK-15细胞单层的96孔培养板，100μL/孔，同时设立阴性对照。置37℃含5％CO₂培养箱中继续培养72小时。弃去维持液，用0.01mol/L pH7.4 PBS洗涤细胞3次；加入冷丙酮(80％丙酮，20％双蒸水)，150μL/孔，4℃30min；弃丙酮，在室温下干燥，用0.01mol/L pH7.4 PBS洗涤1次；将本发明制备的PCV2阳性血清按1:50、1:100、1:200、1:400倍稀释，分别加入上述接种了PCV2病毒的细胞孔，每个稀释度4孔，50μl/孔，37℃1小时；移去孔内液体，用0.01mol/L pH7.4 PBS洗涤5次；加入1:100稀释的FITC标记羊抗猪IgG，50μl/孔，37℃1小时，移去孔内液体，用0.01mol/LpH7.4 PBS洗涤5次。将上述细胞板置于荧光显微镜下观察，细胞对照孔无荧光物质着染，PCV2阳性血清1:50、1:100、1:200、1:400倍荧光染色的PCV2感染细胞孔均出现了绿色荧光，且以阳性血清1:200倍稀释的细胞孔荧光最亮，背景最为干净，非特异性最少。

Claims (3)

1.一种猪圆环病毒2型阳性血清，其特征在于该阳性血清是采用剖腹产、隔离饲养、人工饲喂的方式，排除了母源抗体的干扰的CDCD猪经高浓缩抗原多次免疫获得，其血清的中和抗体效价≥1:64。

2.一种猪圆环病毒2型阳性血清，其特征在于该血清的制备方法是：

(1)种毒制备：PCV2毒种采用经敏感、纯净的PK15细胞进行微载体悬浮培养，收获病毒液，并经超滤浓缩50～100倍以上去除小分子杂蛋白，收集病毒液，再经无菌检验、支原体检验和外源病毒检验合格，病毒含量不低于10^8.0TCID₅₀/mL；

(2)免疫原制备：按病毒液总量1/4000(V/V)加入β-丙内酯(纯度97％)，混匀，置2～8℃灭活24小时再经37℃水解2小时；经灭活检验合格后，按每mL疫苗含灭活前的PCV2病毒液10^8.0TCID₅₀稀释，按抗原3份与ISA 15A佐剂1份的比例充分混合乳化获得免疫原，

(3)动物的选择：采用剖腹产且不吃母乳的CDCD猪，隔离饲养、人工饲喂，猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环2型病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、口蹄疫病毒、猪乙脑病毒等病原的抗原和抗体均为阴性，

(4)免疫及抗体水平监测：将制备好的乳化抗原每头猪肌肉注射1mL作为基础免疫；基础免疫21天后，每头猪分别肌肉注射乳化抗原5ml，继续观察；加强免疫后28天再用灭活前浓缩抗原(病毒含量为10^8.0TCID₅₀/ml)攻击，2ml/头；攻毒后14天开始每隔7天采血检测血清中猪圆环病毒中和抗体效价及血清中PCV2抗原；血清中和抗体效价≥1:64及血清中PCV2抗原检测为阴性为最佳采血时间；

(5)血清的检验：对血清进行性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、中和效价测定、特异性检验。特异性检验包括猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行型腹泻病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪乙脑病毒等猪常见病原。

3.如权利要求1-2所述一种猪圆环病毒2型阳性血清，其特征在于该血清主要用于兽用生物制品质量控制，也可用于猪圆环病毒2型的其他相关检测。