CN110241090A - 一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，该方法可以大量降低生产成本，无需载体和血清，生产过程更为简便，无需细胞驯化或换液操作，且该工艺占地小，可迅速进行规模化生产，对环境要求较低，自动化程度高，人工成本少，生产批间差异小，质量稳定易于控制，可明显提高产品的产量及质量。一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，包括如下步骤：(1)种子细胞的培养及传代；(2)种子细胞的接毒；(3)病毒的收获和含量测定；其中，步骤(1)中，种子细胞为PK‑15B1，步骤(2)中，种毒为PRV ZJ011G，各步骤培养采用无血清细胞培养基CD PK15 259。

Description

一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法
技术领域
本发明涉及一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术
猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科成员，可引起新生仔猪中枢神经系统紊乱，生长猪呼吸道症状，并能导致妊娠母猪流产、死胎与弱仔。美国与部分欧洲国家已宣布消灭和根除该病。我国广泛使用该病基因缺失弱毒疫苗有效控制并逐步净化。但随着近年伪狂犬出现变异，毒力返强现象，传统毒株疫苗保护效果明显下降，因此市场急需变异毒株的伪狂犬疫苗。
国内猪伪狂犬病毒的疫苗抗原生产主要采用转瓶培养方法，少数采用微载体悬浮培养方法。转瓶工艺生产半成品抗原效价为107.0～8.0TCID50/ml，转瓶工艺劳动强度大，生产一批需要100～200个大转瓶，需多人同时进行长时间的消化传代操作，增加污染风险；因培养基中含有一定浓度的血清，其制备的抗原中杂蛋白比较多，易造成免疫动物的应激反应；生产成本较高，人工、场地及原料费用大；对环境要求较高，需要较大的场地和符合GMP要求的高级别的净化厂房；不同生产批次及同一生产批次的转瓶之间生产的抗原效价存在较大差异，容易造成批内及批间的抗原质量差异，进而影响疫苗质量的稳定性。
而微载体悬浮培养工艺，较转瓶工艺虽有提高，仍存在较大改进空间，另微载体昂贵，可重复利用次数较少，厂商建议重复利用2～3次，因此微载体成本占疫苗成本比例较高，此外，微载体扩大培养时的球转球工艺相对较难。
另现有其它公司开发了伪狂犬全悬浮培养工艺(申请号CN201710318022.6；CN201710652407.6；CN2017100822116.8)，其使用ST或BHK21细胞，培养过程中需要对细胞进行驯化、添加血清或进行换液，培养获得的伪狂犬病毒最高滴度在108.5～8.9TCID50/ml，与其相比，本发明采用PK15细胞，培养过程细胞无需驯化、全程采用无血清细胞培养基，且无需换液，获得伪狂犬病毒滴度稳定在109.0TCID50/ml以上，具有明显优势。
发明内容
本发明的目的在于克服现有生产培养法的不足之处，提供了一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法。该方法可以大量降低生产成本，相比转瓶工艺单位抗原成本降低80％以上，较传统反应器培养工艺单位抗原成本降低50％以上，无需载体和血清，生产过程更为简便，无需细胞驯化或换液操作，且该工艺占地小，可迅速进行规模化生产，对环境要求较低，自动化程度高，人工成本少，生产批间差异小，质量稳定易于控制，可明显提高产品的产量及质量。
为了实现上述指标，本发明采取了如下技术方案：
一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，包括如下步骤：
(1)种子细胞的培养采用无血清细胞培养基CD PK15 259，将种子细胞PK-15B1按照0.5～1×106个/ml的密度接入反应器，培养体积为反应器最终培养液体积的一半，并在37℃，80～120r/min转速的条件下培养；
(2)种子细胞的接毒待种子细胞PK-15B1的细胞密度达到4～6×106个/ml时，将反应器最终培养液体积3％～5％的PRVZJ011G种毒液接入种子细胞中，所述PRV ZJ011G种毒液病毒含量为106.5～7.0TCID50/ml，并在37℃，40～80r/min的条件下在反应器中维持1h后，加入无血清细胞培养基CD PK15 259，达到反应器最终培养液体积，反应器控制条件为：pH7.0～7.4，DO 20％～80％，搅拌速度50～100r/min；
(3)病毒的收获和含量测定待细胞在反应器中培养了48后取样，进行细胞活力测定，如细胞活力下降至40～60％，将细胞培养液全部收获，否则，继续培养，并在24小时后再测定，将收获的抗原反复冻融3次后，再经过滤去除细胞碎片，作为猪伪狂犬病毒抗原半成品，进行病毒含量测定；
所述无血清细胞培养基CD PK15 259含有：DMEM/F1271.47％-93.75％(V/V)，硫酸葡聚糖0.1％～1.0％(m/V)，Pluronic F681％-7％(m/V)，氯化乙酰胆碱0.05％-0.15％(m/V)，软磷脂0.02％-0.08％(m/V)，草酰乙酸0.05％-0.2％(m/V)，柠檬酸0.03％-0.1％(m/V)，葡萄糖5％-20％(m/V)和双抗1％(V/V)。
进一步的，无血清细胞培养基CD PK15 259含有：DMEM/F12 75％(V/V)，硫酸葡聚糖1.0％(m/V)，Pluronic F685％(m/V)，氯化乙酰胆碱0.08％(m/V)，软磷脂0.05％(m/V)，草酰乙酸0.12％(m/V)，柠檬酸0.05％(m/V)，葡萄糖18％(m/V)和双抗1％(V/V)。
进一步的，所述双抗为含10000IU/ml的青霉素和10mg/ml的链霉素溶液。
进一步的，所述反应器可自动控制培养温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，容积为2L～3000L；培养温度为33～38℃、pH6.5～7.4、溶氧20％～80％、搅拌速度80～200r/min。
进一步的，所述细胞活力测定采用美国Conter star自动细胞计数仪结合台盼蓝染色法进行。
微生物资源信息
猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)ZJ011G株(保藏号为CGMCC No.7957，由南京农业大学姜平教授提供)；PK-15B1株细胞(保藏号：CCTCC No.C200936，由南京农业大学姜平教授提供)。
本发明使用生物反应器全悬浮无血清培养生产PRV抗原，制备灭活疫苗，该发明方法可以大量降低生产成本，相比转瓶工艺单位抗原成本降低80％以上，较传统反应器培养工艺单位抗原成本降低50％以上，此发明无需载体，全程采用无血清细胞培养基，生产的疫苗安全性更高，同时制品的批间差异小，质量稳定易于控制，可明显提高制品的产量及质量，具体的：
(1)本发明用生物反应器全悬浮培养工艺代替转瓶培养工艺生产猪伪狂犬病毒抗原，可解决生产效率低、产品质量不稳定、病毒效价低、成本高、成品苗不良反应强的问题，通过生产技术和工艺的改变，全面提高疫苗质量和产量，提升疫苗的安全性。
(2)本发明应用生物反应器进行疫苗生产，较转瓶工艺自动化水平高，降低人工成本，生产工艺简单稳定，操作简便易扩大，较传统生物反应器工艺，无需使用微载体，避免使用胰酶进行细胞传代，从而避免胰酶对细胞的损伤，全程无血清培养且无需换液，操作简便，提高生产效率，PK15B1细胞对PRV ZJ011G毒株敏感性高，提升了病毒抗原效价，进一步降低制苗成本。
(3)本发明的产品病毒效价比传统转瓶细胞培养法提高10～30倍，病毒效价可以稳定在109.0TCID50/ml左右；抗原质量稳定，每罐收获的病毒抗原一致均一，易于规模化生产，且整个生产工艺过程带毒部分均完全在密闭的罐体和管道中进行，为封闭状态，不涉及传统转瓶生产工艺及传统反应器生产工艺所存在的其他生物安全和公共卫生问题。
附图说明
图1为仔猪攻毒后5日状态观察照片；其中，
A为对照组，仔猪发热聚堆、厌食呕吐；
B为实施例1疫苗组，仔猪体温正常、食欲正常；
C为实施例4疫苗组，仔猪体温正常、食欲正常。
具体实施方式
以下结合说明书附图及具体实施例来对本发明作进一步的描述。
实施例1
——全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原
1.猪伪狂犬病毒抗原的制备
(1)种子细胞的培养及传代
种子细胞PK-15B1(CCTCC No.C200936，由南京农业大学姜平教授提供)在摇瓶中培养生长，取样进行细胞计数，细胞密度达到3.7×106个/ml，加入无血清细胞培养基CDPK15259后，按照0.5×106个/ml的密度加入反应器中培养，培养体积为反应器最终培养液体积的一半2.5L；
(2)种子细胞的接毒
测得细胞密度达到6.4×106个/ml，将反应器最终培养液体积5％的PRVZJ011G(CGMCC No.7957)种毒液接入种子细胞中，PRVZJ011G种毒液病毒含量为107.0TCID50/ml，并在37℃，40r/min的条件下在反应器中维持1h后，加入无血清细胞培养基CD PK15 259，达到反应器最终培养液体积5L，反应器控制条件为：pH 7.2，DO 40％，搅拌速度60r/min；
(3)病毒的收获和含量测定
待细胞在反应器中培养了48h后取样，进行细胞活力测定，细胞活力为78.5％，继续培养24h后，取样测定细胞活力，细胞活力为53.7％，将细胞培养液全部收获，将收获的抗原反复冻融3次后，再经过滤去除细胞碎片，作为猪伪狂犬病毒抗原半成品，进行病毒含量测定。
其中，无血清细胞培养基CD PK15 259含有：DMEM/F12 75％(V/V)，硫酸葡聚糖1.0％(m/V)，Pluronic F685％(m/V)，氯化乙酰胆碱0.08％(m/V)，软磷脂0.05％(m/V)，草酰乙酸0.12％(m/V)，柠檬酸0.05％(m/V)，葡萄糖18％(m/V)和双抗1％(V/V)。
2.半成品检验
将病毒用MEM维持液做10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-83个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板PK15-B1细胞单层4孔，每孔0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃含5％CO2的温箱中继续培养72h，在显微镜下观察每个稀释度呈现细胞病变(CPE)的孔数，根据Reed-Muench法计算病毒TCID50。
(1)半成品病毒含量测定根据国家标准病毒含量应≥105.0TCID50/ml，此实施例中猪伪狂犬病毒抗原的病毒含量为109.5TCID50/ml。
(2)无菌检验按《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典。2015年版三部.中国农业出版社，2016.9，本发明以下简称《中国兽药典》)，无菌生长。
3.疫苗制造
用以上所述的猪伪狂犬病毒抗原半成品制备疫苗，具体步骤如下：
(1)抗原灭活将检验合格的病毒液加入10％甲醛溶液灭活，使甲醛溶液的终浓度为0.2％，随即充分摇匀升温，当温度升至37℃时开始计时，保持18小时灭活完毕，加入0.2％的焦亚硫酸钠终止灭活，置2～8℃保存，应不超过1个月。
(2)灭活疫苗的制备将矿物油佐剂和灭活病毒液按3:17比例放入乳化罐内，开动电机，以300r/min慢速转动搅拌10min，混合乳化，吸取疫苗10ml加入15mm×100mm离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底出现微量水相≤0.5ml，不出现分层现象即可。
(3)分装分装，加盖密封。
本实施例采用的技术方案中，生物反应器(BC-7.5L广东齐志生物工程设备有限公司)为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于全悬浮培养细胞的生物反应器，容积为7.5L。
本技术方案中，所述双抗为含10000IU/ml青霉素和10mg/ml的链霉素溶液。
本技术方案中，所述细胞活力测定，采用美国Conter star自动细胞计数仪结合台盼蓝染色法进行。
实施例2-4
实施例2-4是在实施例1的基础上，采用不同配方的无血清细胞培养基CD PK15259进行培养(各步骤工艺参数保持一致)，无血清细胞培养基CD PK15 259配方参见表1。
表1为实施例2-4采用的无血清细胞培养基CD PK15 259的配方。
实施例2的猪伪狂犬病毒抗原半成品病毒含量109.33TCID50/mL；
实施例3的猪伪狂犬病毒抗原半成品病毒含量109.0TCID50/mL；
实施例4的猪伪狂犬病毒抗原半成品病毒含量109.33TCID50/mL。
实施例5
——全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原
1.猪伪狂犬病毒抗原的制备
(1)种子细胞的培养及传代
种子细胞PK-15B1在摇瓶中培养生长，取样进行细胞计数，细胞密度达到3.5×106个/ml时，加入无血清细胞培养基CD PK15 259后，按照0.5×106个/ml的密度等量分装入数个摇瓶，并在37℃，120r/min转速的条件下继续培养；
待培养65h后，测定摇瓶细胞混合液密度，细胞密度达到4.5×106个/ml，加入无血清细胞培养基CD PK15 259后，按照0.5×106个/ml的密度将细胞接入反应器中，培养体积为反应器最终培养液体积的一半35L。
(2)种子细胞的接毒
测得细胞密度达到6.4×106个/ml，将反应器最终培养液体积5％的PRVZJ011G(CGMCC No.7957)种毒液接入种子细胞中，并在37℃，50r/min的条件下在反应器中维持1h后，加入无血清细胞培养基CD PK15 259，达到反应器最终培养液体积70L，反应器控制条件为：pH7.2，DO 40％，搅拌速度60r/min；
(3)病毒的收获和含量测定
待细胞在反应器中培养了48h后取样，进行细胞活力测定，细胞活力为72.7％，继续培养24h后，取样测定细胞活力，细胞活力为45.8％，将细胞培养液全部收获，将收获的抗原反复冻融3次后，再经过滤去除细胞碎片，作为猪伪狂犬病毒抗原半成品，进行病毒含量测定。
其中，无血清细胞培养基CD PK15 259含有：DMEM/F12 76％(V/V)，硫酸葡聚糖1.0％(m/V)，Pluronic F684％(m/V)，氯化乙酰胆碱0.1％(m/V)，软磷脂0.04％(m/V)，草酰乙酸0.14％(m/V)，柠檬酸0.05％(m/V)，葡萄糖16％(m/V)和双抗1％(V/V)。
2.半成品检验
将病毒用MEM维持液做10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-83个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板PK15-B1细胞单层4孔，每孔0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃含5％CO2的温箱中继续培养72h，在显微镜下观察每个稀释度呈现细胞病变(CPE)的孔数，根据Reed-Muench法计算病毒TCID50。
(1)半成品病毒含量测定根据国家标准病毒含量应≥105.0TCID50/ml，此实施例中猪伪狂犬病毒抗原的病毒含量为109.28TCID50/ml。
(2)无菌检验按《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典。2015年版三部.中国农业出版社，2016.9，本发明以下简称《中国兽药典》)，无菌生长。
3.疫苗制造
用以上所述的猪伪狂犬病毒抗原半成品制备疫苗，具体步骤如下：
(1)抗原灭活将检验合格的病毒液加入10％甲醛溶液灭活，使甲醛溶液的终浓度为0.2％，随即充分摇匀升温，当温度升至37℃时开始计时，保持18小时灭活完毕，加入0.2％的焦亚硫酸钠终止灭活，置2～8℃保存，应不超过1个月。
(2)灭活疫苗的制备将矿物油佐剂和灭活病毒液按3:17比例放入乳化罐内，开动电机，以300r/min慢速转动搅拌10min，混合乳化，吸取疫苗10ml加入15mm×100mm离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底出现微量水相≤0.5ml，不出现分层现象即可。
(3)分装分装，加盖密封。
本实施例采用的技术方案中，生物反应器(BC-100L广东齐志生物工程设备有限公司)为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于全悬浮细胞培养的生物反应器，容积为100L。
本技术方案中，所述细胞活力测定，采用美国Conter star自动细胞计数仪结合台盼蓝染色法进行
实施例6
——伪狂犬灭活疫苗成品检验
成品检验取实例1和实例2中制成的疫苗进行成品检验
1.性状检验。
(1)外观乳白色均匀乳状液。
(2)剂型呈水包油乳剂(O/W)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，呈云雾状扩散。
2.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
3.安全检验实施例1和实施例4两组疫苗分别采用21～28日龄PRV gB ELISA抗体阴性健康易感仔猪3头，每头颈部肌肉注射疫苗4ml，连续观察14日，仔猪全部健活。
4.效力检验取21～28日龄PRV gB ELISA抗体阴性的健康仔猪20头，随机分成三组，每组5只，第一组和第二组仔猪分别颈部肌肉注射实例1和实例4疫苗1ml，间隔21日后用相同免疫剂量加强免疫一次，第三组做空白对照，隔离饲养。首次免疫后35日每组用PRVZJ01株(含106.0TCID50/ml)攻击，每头猪滴鼻1ml，隔离饲养，连续观察14日，扑杀剖检，根据体温变化、临床症状、病理变化进行判定。结果对照猪全部发病，免疫猪全部保护，见图1。
实施例7
——三种不同细胞培养工艺生产猪伪狂犬病毒灭活疫苗(ZJ011G株)的比较结果，见表2。
表2不同细胞培养工艺对比表。
其中，转瓶工艺参见专利名称为“猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的生产方法”，专利号为201710317063.3的发明专利；
传统反应器微载体悬浮培养工艺参见专利名称为“微载体悬浮培养细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法”，申请号为201710317050.6的发明专利申请。
尽管这里参照本发明的实例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说,在本申请公开和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。

Claims (3)

1.一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，包括如下步骤：
(1)种子细胞的培养采用无血清细胞培养基CD PK15 259，将种子细胞PK-15B1按照0.5～1×106个/ml的密度接入反应器，培养体积为反应器最终培养液体积的一半，并在37℃，80～120r/min转速的条件下培养；
(2)种子细胞的接毒待种子细胞PK-15B1的细胞密度达到4～6×106个/ml时，将反应器最终培养液体积3％～5％的PRV ZJ011G种毒液接入种子细胞中，并在37℃，40～80r/min的条件下在反应器中维持1h后，加入无血清细胞培养基CD PK15 259，达到反应器最终培养液体积，反应器控制条件为：pH 7.0～7.4，DO 20％～80％，搅拌速度50～100r/min；
(3)病毒的收获和含量测定待细胞在反应器中培养了48后取样，进行细胞活力测定，如细胞活力下降至40～60％，将细胞培养液全部收获，否则，继续培养，并在24小时后再测定，将收获的抗原反复冻融3次后，再经过滤去除细胞碎片，作为猪伪狂犬病毒抗原半成品，进行病毒含量测定；
所述无血清细胞培养基CD PK15 259含有：DMEM/F12 71.47％-93.75％(V/V)，硫酸葡聚糖0.1％～1.0％(m/V)，Pluronic F68 1％-7％(m/V)，氯化乙酰胆碱0.05％-0.15％(m/V)，软磷脂0.02％-0.08％(m/V)，草酰乙酸0.05％-0.2％(m/V)，柠檬酸0.03％-0.1％(m/V)，葡萄糖5％-20％(m/V)和双抗1％(V/V)。
2.根据权利要求1所述的一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，其特征在于：无血清细胞培养基CD PK15 259含有：DMEM/F12 75％(V/V)，硫酸葡聚糖1.0％(m/V)，Pluronic F68 5％(m/V)，氯化乙酰胆碱0.08％(m/V)，软磷脂0.05％(m/V)，草酰乙酸0.12％(m/V)，柠檬酸0.05％(m/V)，葡萄糖18％(m/V)和双抗1％(V/V)。
3.根据权利要求2所述的一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，其特征在于：所述双抗为含10000IU/ml的青霉素和10mg/ml的链霉素溶液。
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