CN104328158A

CN104328158A - 适于动物细胞表达产品大规模生产的化学成分明确培养基

Info

Publication number: CN104328158A
Application number: CN201410513086.8A
Authority: CN
Inventors: 谭文松; 孙亚婷; 赵亮; 范里; 刘旭平; 唐红萍
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2014-09-29
Filing date: 2014-09-29
Publication date: 2015-02-04
Anticipated expiration: 2034-09-29
Also published as: CN104328158B

Abstract

本发明公开一种适于动物细胞表达产品大规模生产的化学成分明确培养基，其成分至少包括14种氨基酸、8种维生素、10种无机盐、2种核酸类化合物、1种激素及生长因子、2种抗氧化剂、1种剪切保护剂、1种螯合剂和2种其他营养物。本发明的积极效果是：化学成分明确，无任何动物来源，有利于产物分离纯化，安全可靠；支持细胞快速生长、高密度维持和产物高效表达，无需适应即可使用，适于表达不同产品的多种动物细胞培养，通用性强；有利于开展细胞代谢、产品质量控制的相关研究，有利于培养工艺开发与优化；成本低廉，配制及使用方便，适于抗体、融合蛋白和疫苗等生物制品大规模生产。

Description

适于动物细胞表达产品大规模生产的化学成分明确培养基

技术领域

本发明涉及现代生物技术领域的培养基开发技术，具体地说，涉及一种适于动物细胞高密度培养和抗体、融合蛋白及疫苗等细胞表达产品生产的化学成分明确培养基。

背景技术

利用动物细胞培养技术生产单克隆抗体、融合蛋白和疫苗等高附加值产品已成为当今生物医药产业发展的核心驱动力。截止至2013年，仅单克隆抗体在全球就拥有700亿美元的市场，其中更有10个单抗药物销售额超过50亿美元，成为“超级重磅炸弹”级药物。应用无血清培养技术建立经济、高效、质量可控的细胞培养工艺，不仅是解决现阶段市场需求快速增长的有效手段，也是我国生物医药产业创新和发展的核心竞争力。

出于对产品质量及安全性的考虑，进入体内的治疗性动物细胞表达产品一般不采用血清培养生产，因此，研究并开发无血清培养基一直是动物细胞培养技术的重要任务，也是提高过程产能，控制产品质量和生产成本的核心技术。目前美国FDA批准的用于动物细胞培养和重组蛋白生产的培养基大多采用无血清培养基。2014年国家高技术研究发展计划(863计划)也已将研制适用于动物细胞规模化培养的无血清培养基列入其中。

经过几十年的发展，动物细胞无血清培养基的研制已取得了可喜的进展，从最初仅仅满足细胞增殖的需求，到现阶段关注细胞密度和产率的提高，并逐步向化学成分明确、通用性方向发展。与此同时，无血清培养基的应用也并不局限于动物细胞表达产品的大规模生产，应用无血清培养技术加深对细胞代谢及产品质量调控等问题的认识，也已成为动物细胞培养技术中不可或缺的部分。

无血清培养基主要分为：

(一)普通的无血清培养基(Serum-free medium)，其特点是含有大量的动物来源蛋白，化学成分不明确；

(二)无动物来源培养基(Animal protein-free medium)，培养基中含有一定量重组蛋白或者植物蛋白水解物，而没有动物来源的蛋白作为添加剂；

(三)无蛋白培养基(Protein-free medium)，培养基中不含有大分子的蛋白添加剂，但含有来源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其它衍生物；

(四)化学成分明确的培养基(Chemically-defined medium)，不添加任何蛋白水解物和动物来源的成分，其特点是培养基的成分及其性质明确，有利于进行细胞培养过程的开发与研究，同时易于产物的分离纯化。

目前，为了支持细胞高密度培养和产物高效表达，大部分无血清培养基仍含有较多的动物蛋白，如胰岛素，转铁蛋白、牛血清白蛋白等。使用这类培养基进行动物细胞表达产品生产时往往会增加下游产物纯化的压力，也不利于产物质量的控制。为此，降低以致完全去除培养基中的蛋白含量成为无血清培养基发展的主要趋势。目前，市场上已有多种商业化的无蛋白培养基，但这类培养基尚需要通过添加植物蛋白水解物以替代动物激素、生长因子的作用，才能达到细胞高密度生长、维持和产物高效表达的目的。虽然植物蛋白水解物的添加可以在一定程度上促进细胞生长，提高产物表达量，但是水解物的使用仍会带来诸多问题：首先，水解物的提取存在批次间差异，使培养基的稳定性降低；其次，水解物中所含营养物质并不均衡，其中如灰分和盐往往是细胞生长代谢不需要的成分，而部分有效成分的含量也远高于实际所需；最后，由于水解物的化学成分不明确，难以进行细胞培养的代谢研究和产品质量的控制，从而不利于开展培养过程的工艺优化。由此可见，在确保细胞高密度生长和产物高效表达的前提下，研制不添加任何动植物蛋白水解物、化学成分明确的培养基是解决以上这些问题的有效途径，也是无血清培养基发展的必然趋势。

目前，无血清培养基在开发与应用方面已取得一定的进展：

Ananth Parampalli等人开发并优化了一种无血清培养基，以商业培养基HAM’s F12:IMDM(1:1)为基础，添加10g/L胰岛素和5.5g/L转铁蛋白，通过对原有氨基酸组成进行优化调整，使细胞密度提高了35％，达到1.4×10⁶cells/ml，单抗产物浓度提高了50％，达到22mg/L。

美国专利US 2006/0073591将脂蛋白、白蛋白、转铁蛋白、生长因子、亚硒酸钠等物质添加至商业无血清培养基EX-CELL^TM 620，细胞培养过程从8天延长至12天，单抗产物浓度提高了25％，达到800mg/L。

Do Yun Kim等人开发并优化了一种无血清培养基，以商业培养基IMDM为基础，添加0.02mg/L生长因子(IGF-1)、2mg/L柠檬酸铁、5g/L酵母提取物。经过150天传代适应后进行细胞培养，最高细胞密度达到0.99×10⁶cells/ml，单抗产物浓度较商业培养基提高了1.9倍，达到420mg/L。研究还发现，维生素的添加使产物比生成速率提高了13％。

Sung Hyun Kim等人以商业培养基IMDM为基础，添加总量为5g/L的植物水解物，并筛选不同植物水解物的配比浓度，使单抗产物浓度较未添加前提高了3.3倍，达到137mg/L，最高细胞密度达到2.6×10⁶cells/ml。

美国专利US 2011/0217772公开了一种无蛋白培养基，以商业培养基DMEM:HAM’s F12(1:1)为基础，含有不高于1％(w/v)的大豆和酵母水解物。应用该培养基进行Vero细胞培养生产病毒疫苗，其产量得到显著提高。

T.S.Stoll等人通过设计培养基中氨基酸的平衡配比，开发并优化了一种化学成分明确的无蛋白培养基，单抗产物浓度达到114mg/L,较未优化前提高了700％，最高细胞密度达到2.5×10⁶cells/ml，提高了130％。

Zhaolie Chen等人开发了一种化学成分明确的无蛋白培养基，以商业培养基DMEM:HAM’s F12(1:1)为基础，添加2mg/L硫酸铁、6.1mg/L乙醇胺、0.32mg/L腐胺、1.1g/L丙酮酸钠、1.06mg/L金精三羧酸等物质。应用该培养基进行重组CHO细胞培养生产人血凝素，最高细胞密度达到1.92×10⁶cells/ml，人血凝素累积浓度达到16.7mg/L。

Erika Spens等人报道了一种化学成分明确的培养基，以商业培养基为基础，添加25mg/L柠檬酸铁、1.85mg/L维生素E、1g/Lβ-环糊精、4.5mg/L胆固醇、6.7mg/L软磷脂，以及各类氨基酸。应用该培养基进行NS0细胞培养生产单抗，最高细胞密度达到3×10⁶cells/ml，单抗产物浓度达到195mg/L，较原有商业培养基提高了3倍。

综上所述，目前大部分无血清培养基仍依赖于重组蛋白或植物水解物的添加，才能有效提高细胞密度和产物浓度，但是这些物质的添加无疑增加了产物分离纯化的难度，同时也增大了产品质量及安全的风险。此外，虽然部分化学成分明确的培养基能够在一定程度上支持细胞生长和产物表达，但其细胞密度和产物浓度仍然偏低，且很难同时满足细胞快速生长、高密度维持和产物高效表达，因此难以应用于大规模的工业化生产。目前，美国GIBCO、JRH Biosciences及德国Biotech GmbH等公司相继推出了无动物来源化学成分明确的商业培养基，尽管这些培养基能有效提高细胞密度和产物浓度，但是商业化培养基往往具有细胞和产品特异性，应用时仍需要根据特定细胞和产品进行配方优化，并不能直接满足高效培养过程的需要。而且目前市售商业化培养基价格高昂，配方是秘而不宣的核心商业机密，不仅对细胞培养工艺的开发与优化造成很大限制，更是大幅提高了大规模生产的成本，严重阻碍了利用细胞培养技术生产生物制品的产业化进程。

发明内容

本发明的第一个目的在于，提供一种适于动物细胞表达产品大规模生产的化学成分明确培养基，以满足细胞高密度培养及动物细胞表达产品工业化生产的需求。

本发明的第二个目的在于，提供上述化学成分明确培养基在动物细胞表达产品大规模生产中的应用。

为实现以上第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种化学成分明确培养基，无动物来源成分，各成分溶解于无热源的超纯水中，其特征在于，其必要组分为，以毫克/升计：丙氨酸240～600，精氨酸550～1800，天冬酰胺100～450，半胱氨酸35～170，谷氨酸120～360，谷氨酰胺240～700，组氨酸155～420，亮氨酸260～850，赖氨酸650～1350，甲硫氨酸78～455，苯丙氨酸105～560，脯氨酸180～735，丝氨酸125～350，缬氨酸300～1100，生物素0.023～0.985，叶酸2.5～8.5，核黄素3.2～15，氯化胆碱22～58，肌醇18～65，泛酸钙6～20，维生素B67～15，维生素B126.5～18.5，氯化钙45～120，硝酸铁3.5～8，硫酸镁95～230，氯化钾500～1000，碳酸氢钠2000～2500，氯化钠2100～3800，磷酸二氢钠300～420，磷酸氢二钠105～245，硫酸铜2.7～8.5，硫酸锌150～460，次黄嘌呤3.4～15.5，胸苷0.7～5.8，腐胺0.75～8.9，亚硒酸钠0.005～0.193，硫辛酸0.065～1.4，嵌段式聚醚1000～2000，乙二胺四乙酸二钠2～10，柠檬酸铁70～210，葡萄糖5400～14400。

作为一个优选方案，还包括以下组分，以毫克/升计：亚油酸0.035～0.87，乙醇胺4.5～16.3，吐温808.5～25，胆固醇0.44～7.5，氢化可的松0.068～0.585，孕酮0.0008～0.0054中的一种或几种。

作为一个优选方案，还包括以下组分，以毫克/升计：天冬氨酸85～320，胱氨酸55～195，甘氨酸480～900，异亮氨酸175～500，苏氨酸110～380，色氨酸130～560，酪氨酸75～230，牛磺酸40～180，烟酰胺5.5～12，维生素B115～35，维生素E 0.5～4.2，硫酸亚铁130～375，氯化镁165～285，丙酮酸钠115～380，柠檬酸15～55中的一种或几种。

作为一个优选方案，还包括以下组分，以毫克/升计：亚油酸0.035～0.87，乙醇胺4.5～16.3，吐温808.5～25，胆固醇0.44～7.5，氢化可的松0.068～0.585，孕酮0.0008～0.0054，天冬氨酸85～320，胱氨酸55～195，甘氨酸480～900，异亮氨酸175～500，苏氨酸110～380，色氨酸130～560，酪氨酸75～230，牛磺酸40～180，烟酰胺5.5～12，维生素B115～35，维生素E 0.5～4.2，硫酸亚铁130～375，氯化镁165～285，丙酮酸钠115～380，柠檬酸15～55中的一种或几种。

作为一个优选方案，还包括以下组分，以毫克/升计：亚油酸0.035～0.87，乙醇胺4.5～16.3，吐温808.5～25，胆固醇0.44～7.5，氢化可的松0.068～0.585，孕酮0.0008～0.0054，天冬氨酸85～320，胱氨酸55～195，甘氨酸480～900，异亮氨酸175～500，苏氨酸110～380，色氨酸130～560，酪氨酸75～230，牛磺酸40～180，烟酰胺5.5～12，维生素B115～35，维生素E0.5～4.2，硫酸亚铁130～375，氯化镁165～285，丙酮酸钠115～380，柠檬酸15～55。

为实现以上第二个目的，本发明公开以下技术方案：化学成分明确培养基在动物细胞表达产品生产中的应用。

本发明的优点在于：(1)化学成分明确，无任何动物来源，有利于产物分离纯化，安全可靠；(2)支持细胞快速生长、高密度维持和产物高效表达，无需适应即可使用，适于表达不同产品的多种动物细胞培养，通用性强；(3)有利于开展细胞代谢、产品质量控制的相关研究，有利于培养工艺开发与优化；(4)成本低廉，配制及使用方便，适于抗体、融合蛋白和疫苗等生物制品大规模生产。

附图说明

图1为实施例1中CHO细胞Cell Line A在本发明的化学成分明确培养基中进行批式培养时活细胞密度和细胞活性随时间变化的坐标图，图中●、▲分别表示细胞密度和细胞活性。

图2为实施例1中CHO细胞Cell Line A在本发明的化学成分明确培养基中进行批式培养时产物浓度随时间变化的坐标图，图中◆表示产物浓度。

图3为实施例2中CHO细胞Cell Line B在本发明的化学成分明确培养基中进行批式培养时活细胞密度和细胞活性随时间变化的坐标图，图中●、▲分别表示细胞密度和细胞活性。

图4为实施例2中CHO细胞Cell Line B在本发明的化学成分明确培养基中进行批式培养时产物浓度随时间变化的坐标图，图中◆表示产物浓度。

图5为实施例3中CHO细胞Cell Line C在本发明的化学成分明确培养基中进行批式培养时活细胞密度和细胞活性随时间变化的坐标图，图中●、▲分别表示细胞密度和细胞活性。

图6为实施例3中CHO细胞Cell Line C在本发明的化学成分明确培养基中进行批式培养时产物浓度随时间变化的坐标图，图中◆表示产物浓度。

图7为实施例4中CHO细胞Cell Line D在本发明的化学成分明确培养基中进行批式培养时活细胞密度和细胞活性随时间变化的坐标图，图中●、▲分别表示细胞密度和细胞活性。

图8为实施例4中CHO细胞Cell Line D在本发明的化学成分明确培养基中进行批式培养时产物浓度随时间变化的坐标图，图中◆表示产物浓度。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.适于动物细胞表达产品大规模生产的化学成分明确培养基——应用于一种嵌合单克隆抗体生产

一种适于动物细胞表达产品大规模生产的化学成分明确培养基，其成分包含：22种氨基酸、11种维生素、12种无机盐、4种脂类化合物、2种核酸类化合物、3种激素及生长因子、2种抗氧化剂、1种剪切保护剂、1种螯合剂和4种其他营养物。

各成分具体含量为(毫克/升)：

将上述各成分溶解于无热源的超纯水中，即可配制成适于动物细胞表达产品大规模生产的化学成分明确培养基。

使用上述培养基，将表达嵌合单克隆抗体α的中仓鼠卵巢细胞(CHO)Cell Line A(处于对数生长期且活性大于95％)，以1.5×10⁶细胞/毫升的细胞密度接种于3升生物反应器(Sartorius A-plus，德国)进行批式培养。培养温度为37℃，培养周期为192小时，对数生长期细胞的平均比生长速率为0.45天^-1，最高活细胞密度为10.71×10⁶细胞/毫升，活细胞对时间的积分值(IVCC)为50×10⁹细胞·天/升，单抗累积浓度为903毫克/升，单位细胞平均每天的抗体表达量为20皮克/细胞/天。

实施例2.适于动物细胞表达产品大规模生产的化学成分明确培养基——应用于一种人源化单克隆抗体生产

各成分具体含量为(毫克/升)：

使用上述培养基，将表达人源化单克隆抗体β的中仓鼠卵巢细胞(CHO)Cell Line B(处于对数生长期且活性大于95％)，以0.5×10⁶细胞/毫升的细胞密度接种于3升生物反应器(Sartorius A-plus，德国)进行批式培养。培养温度为37℃，培养周期为264小时，对数生长期细胞的平均比生长速率为0.45天^-1，最高活细胞密度为5.68×10⁶细胞/毫升，活细胞对时间的积分值(IVCC)为34.73×10⁹细胞·天/升，单抗累积浓度为1618毫克/升，单位细胞平均每天的抗体表达量为46.6皮克/细胞/天。

实施例3.适于动物细胞表达产品大规模生产的化学成分明确培养基——应用于一种嵌合单克隆抗体生产

一种适于动物细胞表达产品大规模生产的化学成分明确培养基，其成分包含：17种氨基酸、9种维生素、10种无机盐、2种核酸类化合物、1种激素及生长因子、2种抗氧化剂、1种剪切保护剂、1种螯合剂和3种其他营养物。

各成分具体含量为(毫克/升)：

使用上述培养基，将表达嵌合单克隆抗体γ的中仓鼠卵巢细胞(CHO)Cell Line C(处于对数生长期且活性大于95％)，以1.095×10⁶细胞/毫升的细胞密度接种于3升生物反应器(Sartorius A-plus，德国)进行批式培养。培养温度为37℃，培养周期为259小时，对数生长期细胞的平均比生长速率为0.55天^-1，最高活细胞密度为6.917×10⁶细胞/毫升，活细胞对时间的积分值(IVCC)为56.6×10⁹细胞·天/升，单抗累积浓度为356毫克/升，单位细胞平均每天的抗体表达量为6.3皮克/细胞/天。

实施例4.适于动物细胞表达产品大规模生产的化学成分明确培养基——应用于一种嵌合单克隆抗体生产

一种适于动物细胞表达产品大规模生产的化学成分明确培养基，其成分包含：19种氨基酸、10种维生素、12种无机盐、3种脂类化合物、2种核酸类化合物、3种激素及生长因子、2种抗氧化剂、1种剪切保护剂、1种螯合剂和3种其他营养物。

各成分具体含量为(毫克/升)：

使用上述培养基，将表达嵌合单克隆抗体δ的中仓鼠卵巢细胞(CHO)Cell Line D(处于对数生长期且活性大于95％)，以1.12×10⁶细胞/毫升的细胞密度接种于3升生物反应器(Sartorius A-plus，德国)进行批式培养。培养温度为37℃，第3天降温至32℃，培养周期为216小时，对数生长期细胞的平均比生长速率为0.41天^-1，最高活细胞密度为5.07×10⁶细胞/毫升，活细胞对时间的积分值(IVCC)为33.2×10⁹细胞·天/升，单抗累积浓度为622毫克/升，单位细胞平均每天的抗体表达量为18.7皮克/细胞/天。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种化学成分明确培养基，无动物来源成分，各成分溶解于无热源的超纯水中，其特征在于，其必要组分为，以毫克/升计：丙氨酸240～600，精氨酸550～1800，天冬酰胺100～450，半胱氨酸35～170，谷氨酸120～360，谷氨酰胺240～700，组氨酸155～420，亮氨酸260～850，赖氨酸650～1350，甲硫氨酸78～455，苯丙氨酸105～560，脯氨酸180～735，丝氨酸125～350，缬氨酸300～1100，生物素0.023～0.985，叶酸2.5～8.5，核黄素3.2～15，氯化胆碱22～58，肌醇18～65，泛酸钙6～20，维生素B6 7～15，维生素B12 6.5～18.5，氯化钙45～120，硝酸铁3.5～8，硫酸镁95～230，氯化钾500～1000，碳酸氢钠2000～2500，氯化钠2100～3800，磷酸二氢钠300～420，磷酸氢二钠105～245，硫酸铜2.7～8.5，硫酸锌150～460，次黄嘌呤3.4～15.5，胸苷0.7～5.8，腐胺0.75～8.9，亚硒酸钠0.005～0.193，硫辛酸0.065～1.4，嵌段式聚醚1000～2000，乙二胺四乙酸二钠2～10，柠檬酸铁70～210，葡萄糖5400～14400。

2.根据权利要求1所述的一种化学成分明确培养基，其特征在于，还包括以下组分，以毫克/升计：亚油酸0.035～0.87，乙醇胺4.5～16.3，吐温808.5～25，胆固醇0.44～7.5，氢化可的松0.068～0.585，孕酮0.0008～0.0054中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的一种化学成分明确培养基，其特征在于，还包括以下组分，以毫克/升计：天冬氨酸85～320，胱氨酸55～195，甘氨酸480～900，异亮氨酸175～500，苏氨酸110～380，色氨酸130～560，酪氨酸75～230，牛磺酸40～180，烟酰胺5.5～12，维生素B115～35，维生素E 0.5～4.2，硫酸亚铁130～375，氯化镁165～285，丙酮酸钠115～380，柠檬酸15～55中的一种或几种。

4.根据权利要求2所述的一种化学成分明确培养基，其特征在于，还包括以下组分，以毫克/升计：天冬氨酸85～320，胱氨酸55～195，甘氨酸480～900，异亮氨酸175～500，苏氨酸110～380，色氨酸130～560，酪氨酸75～230，牛磺酸40～180，烟酰胺5.5～12，维生素B1 15～35，维生素E 0.5～4.2，硫酸亚铁130～375，氯化镁165～285，丙酮酸钠115～380，柠檬酸15～55中的一种或几种。

5.根据权利要求4所述的一种化学成分明确培养基，其特征在于，还包括以下组分，以毫克/升计：亚油酸0.035～0.87，乙醇胺4.5～16.3，吐温808.5～25，胆固醇0.44～7.5，氢化可的松0.068～0.585，孕酮0.0008～0.0054，天冬氨酸85～320，胱氨酸55～195，甘氨酸480～900，异亮氨酸175～500，苏氨酸110～380，色氨酸130～560，酪氨酸75～230，牛磺酸40～180，烟酰胺5.5～12，维生素B1 15～35，维生素E 0.5～4.2，硫酸亚铁130～375，氯化镁165～285，丙酮酸钠115～380，柠檬酸15～55。

6.权利要求1—5任一所述的化学成分明确培养基在动物细胞表达产品生产中的应用。