CN101760442A - 适于mdck细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及现代生物技术之培养基研发技术领域，为一种适于MDCK细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基，它包括21种氨基酸、6种维生素、8种盐类、8种脂类、4种微量元素、2种缓冲剂、1种蛋白水解物、1种酸碱指示剂以及6种其他添加物；该无血清培养基可采用常规的制备方法进行制取，其使用方法也为常规方法；本发明的积极效果为：不含血清，组分明确，有利于产物的分离纯化，提高产品品质；支持MDCK细胞长期传代培养，无需长期而复杂的适应过程；能良好地支持MDCK细胞的贴壁生长和MDCK细胞的单细胞悬浮生长，组分明确、配制和使用容易，适于生物制品的大规模生产。
Description
【技术领域】
本发明涉及现代生物技术之培养基研发技术领域，具体地说，是一种适于MDCK细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基。
【技术背景】
防止病毒危害人类是各国都非常关心的事情。多少年来，人类每年因病毒的侵害而蒙受巨大的损失，如狂犬病、禽流感对人类的危害。狂犬病是由狂犬病病毒引起的，是危害非常严重的传染疾病之一，一旦发病，死亡率非常高，而且至今除预防的疫苗外没有特殊有效的治疗药物。此外，流感病毒引起的危害也非常大，每年都会有5～15％的人被季节性流感感染，有300～500万个严重病例，有高达50万人因之死亡。更为严重的是，现在的流感病毒变异后可由禽类传染给人，禽流感就曾肆虐了全球多个国家，给人类造成了严重危害。有调查表明，1989年法国因流感而消耗的卫生服务费约为19亿法郎，潜在的经济损失为143亿法郎。美国每年因流感而导致的直接经济损失为10～30亿美元，潜在的经济损失为100～150亿美元。中国香港地区因禽流感损失估计高达8000万港币。由此可见，防止病毒危害人类是项重要而紧迫的工作。
目前已上市的流感疫苗基本上都是用鸡胚培养制取的。鸡胚在疫苗的生产中被用作培养介质，使用的鸡胚必须要能保证培养病毒的存活，属于病毒生长所需的特殊环境。因此，一般须使用健康鸡群产下的受精卵，要求产蛋鸡的年龄不能超过1岁，同时，必须对鸡群进行定期检测，确保在生长过程中不受相关疾病的影响，确保受精卵内也不存在任何病毒。由于受到这些因素的限制，所以鸡胚的供应量一直较小。由于鸡胚带有潜在污染的可能，且培养周期长，不易控制产量，不利于大规模应用，因此，美国等一些国家和世界卫生组织都鼓励发展细胞培养技术以替代目前的鸡胚培养技术用于流感疫苗的生产。
应用动物细胞成规模生产流感疫苗，是将病毒适应到传代细胞，并在生物反应器上进行大规模的病毒繁殖和培养以实现流感疫苗的规模化生产，其优点主要是：(1)可完全避免鸡胚中的蛋白质引起的不良反应，有利于提高疫苗质量；(2)克服鸡胚要求严，来源少的问题，可降低生产成本；(3)细胞培养体系易于放大，且病毒繁殖快，更易满足市场的需求。
目前以细胞培养制备疫苗最为广泛的是Vero、MDCK和PER.C6三个细胞系。其中的MDCK细胞是一种非常重要的动物细胞系，它可以用来生产弱化的病毒，进而用于病毒疫苗的生产，如流感和狂犬病疫苗的生产。用MDCK细胞生产疫苗有很多优点：首先，MDCK细胞培养容易，增殖快，生产周期短，易于放大；其次，与鸡胚生产的病毒相比，用MDCK细胞生产的病毒与从人体分离的病毒更加相似，性质更均一，病毒表面糖蛋白不易发生变异，感染效率高；再次，用MDCK细胞生产的疫苗也适用于对鸡胚蛋白过敏的患者；最后，由于生产过程中不涉及人的细胞和动物个体，不会引起伦理学纷争。
但是，传统的MDCK细胞生产疫苗的过程需要用血清。使用血清有几个明显的缺点：首先，因动物个体不同，血清产地、批号不同，血清的批次质量差异甚大，使得实验和生产的标准化困难；其次，血清的成分复杂，其中既含有促进一些细胞生长的成分，也含有抑制另一些细胞生长的成分，并且还含有对细胞产生毒性的物质，如补体、抗体、细菌毒素等，会影响细胞的生长，甚至造成细胞的死亡；再次，在血清的取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性；第四、应对大规模生产时，血清的来源越来越困难，且价格昂贵；最后、血清的引入还会加大产品下游分离纯化的困难，增加生产成本，很难实现规范生产，并可能带来安全隐患。
现在，由于在强力推行GMP规范，有血清的细胞培养系统将会失去其应用的市场，因此，迫切需要开发MDCK细胞的无血清培养基。
用无血清培养基进行细胞培养从1911年就开始研究了，目前多数细胞已经能在无血清培养系统中正常地生长和增殖。MDCK细胞的无血清培养基近些年也有了很大的发展。
1979年Mary Taub等人开发出的MediumK-1无血清培养基能支持贴壁的MDCK细胞生长，但该培养基含多种激素和生长因子，成分复杂。1994年法国的O.-W.Merten等人开发了无血清培养基MDSS2，1996年对其改进后得到MDSS2N(用植物来源组分代替动物来源组分)。这两种培养基均可用于MDCK细胞贴壁培养，但是细胞生长慢，延滞期长(约48小时)，不能达到很高的细胞密度。
2001年美国Sigma-Aldrich公司的St.Louis等人开发出无血清培养基MDCK-LP和MMDCK-LPM；2005年日本Kyoritsu Seiyaku集团的MasamiMochizuki开发出无血清低蛋白RPMI/SP培养基。这些培养基虽然都能支持MDCK细胞贴壁生长，但细胞生长缓慢，培养周期长。
近几年有文献报道，美国JRH Bioscience的商业培养基Ex-Cell MDCK和Gibco公司的无血清商业培养基EpiSerf可以支持MDCK细胞贴壁生长。美国Sigma-Aldrich的分公司SAFC生物科学2006年推出了一种无血清无动物蛋白的商业培养基Ex-Cell MDCK，并宣称该培养基能够支持MDCK细胞贴壁和单细胞悬浮生长，但是，直到目前尚未有文献报道该培养基培养单细胞悬浮的MDCK细胞。这些商业培养基虽然能够支持细胞稳定生长和用于生物制品的生产，但也存在一些明显的缺点，例如：成分保密，化学成分不明确，给科研和生产过程带来困难；价格都比较昂贵，只适用于部分小规模的实验研究而不适合大规模生产；只能支持MDCK细胞贴壁生长，在大规模培养过程中多采用微载体等细胞贴附基质，既增加了成本也为生物制品的后期纯化带来了麻烦。
利用MDCK细胞无血清悬浮生产生物制品，既可避免有血清培养的种种不利因素，又可以消除引用微载体所带来的其他影响，从而提高MDCK细胞培养的生产效率并降低生产成本，同时确保产品的质量，具有良好的应用价值和巨大的市场前景。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种适于MDCK细胞大规模贴壁培养或单细胞悬浮培养的无血清培养基，其有明确的培养基组分，能去除血清对生产过程的干扰，降低生产成本，实现MDCK细胞高密度贴壁培养和单细胞悬浮培养，突破MDCK细胞对贴附基质的依赖，为生物制品的规模化生产提供方便。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种适于MDCK细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，包括21种氨基酸、6种维生素、8种盐类、8种脂类、4种微量元素、2种缓冲剂、1种蛋白水解物、1种酸碱指示剂以及6种其他添加物；
——所述的21种氨基酸为：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸；
——所述的6种维生素为：生物素、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、硫胺素、硫辛酸；
——所述的8种盐类为：氯化镁、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、丙酮酸钠；
——所述的8种脂类为：胆固醇、生育酚醋酸酯、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、吐温80、嵌段式聚醚F68；
——所述的4种微量元素为：硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁、亚硒酸钠；
——所述的2种缓冲剂为：碳酸氢钠、羟乙基哌嗪乙磺酸；
——所述的蛋白水解物为：胰蛋白水解物；
——所述的酸碱指示剂为：酚红；
——所述的6种其他添加物为：葡萄糖、次黄嘌呤、胸苷、转铁蛋白、白蛋白、胰岛素。
所述的氨基酸的含量为：
丙氨酸 3～6毫克/升，
精氨酸 50～200毫克/升，
天冬酰胺 5～15毫克/升，
天冬氨酸 2～15毫克/升，
胱氨酸 5～30毫克/升，
半胱氨酸 10～40毫克/升，
谷氨酸 7～20毫克/升，
谷氨酰胺 100～1000毫克/升，
甘氨酸 5～30毫克/升，
组氨酸 10～50毫克/升，
异亮氨酸 20～60毫克/升，
亮氨酸 30～70毫克/升，
赖氨酸 50～150毫克/升，
甲硫氨酸 10～30毫克/升，
苯丙氨酸 20～50毫克/升，
脯氨酸 2～30毫克/升，
丝氨酸 10～40毫克/升，
苏氨酸 10～60毫克/升，
色氨酸 5～20毫克/升，
酪氨酸 30～70毫克/升，
缬氨酸 30～70毫克/升。
所述的维生素的含量为：
生物素 0.003～0.1毫克/升，
叶酸 2～5毫克/升，
烟酰胺 2～10毫克/升，
吡哆醇 1～5毫克/升，
硫胺素 1～5毫克/升，
硫辛酸 0.1～0.5毫克/升。
所述的盐类的含量为：
氯化镁 20～100毫克/升，
硫酸镁 20～100毫克/升，
氯化钙 150～200毫克/升，
氯化钾 300～500毫克/升，
氯化钠 1000～7000毫克/升，
磷酸氢二钠 50～100毫克/升，
磷酸二氢钠 50～100毫克/升，
丙酮酸钠 50～150毫克/升。
所述的脂类的含量为：
胆固醇 1～5毫克/升，
生育酚醋酸酯 0.005～0.1毫克/升，
豆蔻酸 0.005～0.1毫克/升，
棕榈酸 0.005～0.1毫克/升，
棕榈油酸 0.005～0.1毫克/升，
硬脂酸 0.005～0.1毫克/升，
吐温80 1～3.1毫克/升，
嵌段式聚醚F68 0.1～2000毫克/升。
所述的微量元素的含量为：
硫酸铜 5～20毫克/升，
硝酸铁 20～100毫克/升，
硫酸亚铁 0.1～0.6毫克/升，
亚硒酸钠 50～150毫克/升。
所述的缓冲剂的含量为：
碳酸氢钠 1000～3700毫克/升，
羟乙基哌嗪乙磺酸 1000～5000毫克/升。
所述的蛋白水解物的含量为：胰蛋白水解物 1500～3000毫克/升。
所述的酸碱指示剂的含量为：酚红 5～10毫克/升。
所述的其他添加物的含量为：
葡萄糖 1000～6000毫克/升，
次黄嘌呤 2～10毫克/升，
胸苷 0.1～0.8毫克/升，
转铁蛋白 5～30毫克/升，
白蛋白 20～300毫克/升，
胰岛素 5～50毫克/升。
一种适于MDCK细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基，含有种氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、缓冲剂、蛋白水解物、酸碱指示剂以及添加物，其特征在于，其各种组分的含量为(毫克/升)：
硫酸铜(Cupric Sulfate Pentahydrate) 5～20
硝酸铁(Ferric Nitrate Nonahydrate) 20～100
硫酸亚铁(Ferrous Sulfate Heptahydrate) 0.1～0.6
氯化镁(Magnesium Chloride Hexahydrate) 20～100
硫酸镁(Magnesium Sulfate) 20～100
氯化钙(Calcium Chloride Dihydrate) 150～200
氯化钾(Potassium Chloride) 300～500
碳酸氢钠(Sodium Bicarbonate) 1000～3700
氯化钠(Sodium Chloride) 1000～7000
磷酸氢二钠(Dibasic Sodium Phosphate) 50～100
磷酸二氢钠(Sodium Dihydrogen Phosphate) 50～100
丙氨酸(L-Alanine) 3～6
精氨酸(L-Arginine Hydrochloride) 50～200
天冬酰胺(L-Asparagine Monohydrate) 5～15
天冬氨酸(L-Aspartic cid) 2～15
胱氨酸(L-Cystine Dihydrochloride) 5～30
半胱氨酸(L-Cysteine Hydrochloride Monohydrate) 10～40
谷氨酸(L-Glutamic Acid) 7～20
谷氨酰胺(L-Glutamine) 100～1000
甘氨酸(Glycine) 5～30
组氨酸(L-Histidine Hydrochloride Monohydrate) 10～50
异亮氨酸(L-Isoleucine) 20～60
亮氨酸(L-Leucine) 30～70
赖氨酸(L-Lydine hydrochloride) 50～150
甲硫氨酸(L-Methionine) 10～30
苯丙氨酸(L-Phenylalanine) 20～50
脯氨酸(L-Proline) 2～30
丝氨酸(L-Serine) 10～40
苏氨酸(L-Threonine) 10～60
色氨酸(L-Tryptophan) 5～20
酪氨酸(L-Tyrosine Disodium Dihydrate) 30～70
缬氨酸(L-Valine) 30～70
生物素(D-Biotin) 0.003～0.1
叶酸(Folic Acid) 2～5
烟酰胺(Niacinamide) 2～10
吡哆醇(Pyridoxine Hydrochloride) 1～5
硫胺素(Thiamine Hydrochloride) 1～5
硫辛酸(Lipoic Acid) 0.1～0.5
葡萄糖(D-Glucose) 1000～6000
丙酮酸钠(Sodium Pyruvate) 50～150
次黄嘌呤(Hypoxanthine) 2～10
胸苷(Thymidine) 0.1～0.8
羟乙基哌嗪乙磺酸(Hydroxyethyl Piperazine Ethanesulfonic Acid) 1000～5000
胆固醇(Cholesterol) 1～5
生育酚醋酸酯(DL-alpha-Tocopherol Acetate) 0.005～0.1
豆蔻酸(Myristic Acid) 0.005～0.1
棕榈酸(Palmitic Acid) 0.005～0.1
棕榈油酸(Palmitoleic Acid) 0.005～0.1
硬脂酸(Stearic Acid) 0.005～0.1
吐温80(Tween 80) 1～3.1
转铁蛋白(Transferrin) 5～30
白蛋白(Bovine Serum Albumin) 20～300
胰岛素(Insulin) 5～50
亚硒酸钠(Sodium Selenite) 50～150
胰蛋白水解物(Lucaratone Tryptone USP) 1500～3000
嵌段式聚醚F68(Pluronic F68) 0.1～2000
酚红(Sodium Phenol Red) 5～10
本发明的无血清培养基主要是采用硝酸铁、转铁蛋白、亚硒酸钠、胸苷、次黄嘌呤、白蛋白和胰岛素等物质代替血清，以胆固醇、生育酚醋酸酯、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、吐温80和嵌段式聚醚F68的组合物为MDCK细胞提供生长必需的脂类物质，同时加入氨基酸、维生素、盐类、微量元素和蛋白水解物等物质促进细胞生长与维持。其中，氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，为细胞生长、进行正常代谢和维持生命提供了物质基础；维生素是细胞代谢中必不可少的有机化合物，许多维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子，细胞的各种生长代谢活动离开了维生素都无法正常进行；盐类可以调节细胞膜的通透性，控制水分，维持正常渗透压和酸碱平衡，维持细胞的形态和功能，有些为无机或有机化合物以构成酶的辅基、激素、维生素、蛋白质和核酸的成分，或作为多种酶系统的激活剂，参与许多重要的重理功能；脂类具有能量储存、构成生物膜骨架、参与信号传递、酶激活剂、糖基载体、生长因子与抗氧化剂激素、参与信号识别和免疫、作为维生素和色素的前体等生物学功能；微量元素通过与蛋白质和其他有机基团结合，形成了酶、激素、维生素等生物大分子，发挥着重要的生理生化功能；缓冲剂能维持培养基正常渗透压和酸碱平衡，维持细胞的形态和功能；蛋白水解物为细胞生长提供重要的氨基酸、短肽等营养物，促进细胞生长；酸碱指示剂可以在线指示细胞培养液的酸碱度变化，方便更换新鲜培养液、细胞传代等操作；其他添加物中包括能源物质和血清替代物。
本发明所述的无血清培养基可采用常规的制备方法制取，即，将上述组分溶解于无热源超纯水即可配制得所述的培养基。
本发明所述的无血清培养基的使用方法也为常规方法。
本发明的积极效果为：
(1)不含血清，组分明确，有利于产物的分离纯化，提高产品品质；
(2)支持MDCK细胞长期传代培养，无需长期而复杂的适应过程；
(3)能良好地支持MDCK细胞的贴壁生长，其最高细胞密度接近甚至超过有血清培养基和已知的商业培养基；
(4)能良好地支持MDCK细胞的单细胞悬浮生长，培养过程中无需使用微载体等支持细胞依附的基质，从而能有效地降低生产成本，减少生物制品的后期分离纯化负担；
(5)组分明确，适合对细胞进行生长代谢、病毒扩增等方面的研究工作；
(6)成分简单、配制和使用容易、成本不高，适于大规模生产。
【附图说明】
附图1为MDCK细胞在本发明的无血清培养基中贴壁培养的生长曲线坐标图；
附图2为MDCK细胞在本发明的无血清培养基中单细胞悬浮培养的生长曲线坐标图；
图中的标识分别为：
【具体实施方式】
以下介绍本发明适于MDCK细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基的具体实施方式，提供2个实施例，但本发明的实施不限于以下的实施例。
实施例1
一种适于MDCK细胞大规模贴壁和单细胞悬浮培养的无血清培养基，包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、激素、缓冲剂、蛋白水解物及添加物，其各种成分的含量为：毫克/升
硫酸铜(Cupric Sulfate Pentahydrate) 15.97
硝酸铁(Ferric Nitrate Nonahydrate) 20.02
硫酸亚铁(Ferrous Sulfate Heptahydrate) 0.417
氯化镁(Magnesium Chloride Hexahydrate) 61.2
硫酸镁(Magnesium Sulfate) 48.84
氯化钙(Calcium Chloride Dihydrate) 154.5
氯化钾(Potassium Chloride) 311.8
碳酸氢钠(Sodium Bicarbonate) 1200
氯化钠(Sodium Chloride) 6996
磷酸氢二钠(Dibasic Sodium Phosphate) 71.02
磷酸二氢钠(Sodium Dihydrogen Phosphate) 54.3
丙氨酸(L-Alanine) 4.45
精氨酸(L-Arginine Hydrochlori de) 147.5
天冬酰胺(L-Asparagine Monohydrate) 7.5
天冬氨酸(L-Aspartic cid) 6.65
胱氨酸(L-Cystine Dihydrochloride) 17.56
半胱氨酸(L-Cysteine Hydrochloride Monohydrate) 31.29
谷氨酸(L-Glutamic Acid) 7.35
谷氨酰胺(L-Glutamine) 292
甘氨酸(Glycine) 18.75
组氨酸(L-Histidine Hydrochloride Monohydrate) 31.48
异亮氨酸(L-Isoleucine) 54.47
亮氨酸(L-Leucine) 59.05
赖氨酸(L-Lydine hydrochloride) 91.25
甲硫氨酸(L-Methionine) 17.24
苯丙氨酸(L-Phenylalanine) 35.48
脯氨酸(L-Proline) 17.25
丝氨酸(L-Serine) 26.25
苏氨酸(L-Threonine) 53.45
色氨酸(L-Tryptophan) 9.02
酪氨酸(L-Tyrosine Disodium Dihydrate) 55.79
缬氨酸(L-Valine) 52.85
生物素(D-Biotin) 0.0035
叶酸(Folic Acid) 2.66
烟酰胺(Niacinamide) 2.02
吡哆醇(Pyridoxine Hydrochloride) 2
硫胺素(Thiamine Hydrochloride) 2.17
硫辛酸(Lipoic Acid) 0.105
葡萄糖(D-Glucose) 3151
丙酮酸钠(Sodium Pyruvate) 55
次黄嘌呤(Hypoxanthine) 2.1
胸苷(Thymidine) 0.365
羟乙基哌嗪乙磺酸(Hydroxyethyl Piperazine Ethanesulfonic Acid) 3574.5
胆固醇(Cholesterol) 3.87
生育酚醋酸酯(DL-alpha-Tocopherol Acetate) 0.03
豆蔻酸(Myristic Acid) 0.005
棕榈酸(Palmitic Acid) 0.005
棕榈油酸(Palmitoleic Acid) 0.005
硬脂酸(Stearic Acid) 0.005
吐温80(Tween 80) 1.1
转铁蛋白(Transferrin) 10
白蛋白(Bovine Serum Albumin) 100
胰岛素(Insulin) 10
亚硒酸钠(Sodium Selenite) 81.47
胰蛋白水解物(Lucaratone Tryptone USP) 2100
嵌段式聚醚F68(Pluronic F68) 0.1
酚红(Sodium Phenol Red) 8.63
将上述组分溶解于无热源超纯水中进行配制，可得适合MDCK细胞大规模贴壁培养的无血清培养基。
将用于生产狂犬病毒疫苗和流感病毒疫苗的MDCK细胞置于本发明所述的无血清培养基中进行贴壁培养：接种于50平方厘米的方瓶中，培养液体积为20毫升，接种密度为1.8×105细胞/毫升，培养至84小时时的活细胞密度达到最高，为11.02×105细胞/毫升，其结果见附图1。
实施例2
一种适于MDCK细胞大规模贴壁和单细胞悬浮培养的无血清培养基，包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、激素、缓冲剂、蛋白水解物及添加物，其各种成分的含量为：毫克/升
硫酸铜(Cupric Sulfate Pentahydrate) 15.97
硝酸铁(Ferric Nitrate Nonahydrate) 40.04
硫酸亚铁(Ferrous Sulfate Heptahydrate) 0.6
氯化镁(Magnesium Chloride Hexahydrate) 61.2
硫酸镁(Magnesium Sulfate) 48.84
氯化钙(Calcium Chloride Dihydrate) 154.5
氯化钾(Potassium Chloride) 311.8
碳酸氢钠(Sodium Bicarbonate) 1200
氯化钠(Sodium Chloride) 6996
磷酸氢二钠(Dibasic Sodium Phosphate) 71.02
磷酸二氢钠(Sodium Dihydrogen Phosphate) 54.3
丙氨酸(L-Alanine) 4.45
精氨酸(L-Arginine Hydrochloride) 147.5
天冬酰胺(L-Asparagine Monohydrate) 7.5
天冬氨酸(L-Aspartic cid) 6.65
胱氨酸(L-Cystine Dihydrochloride) 17.56
半胱氨酸(L-Cysteine Hydrochloride Monohydrate) 31.29
谷氨酸(L-Glutamic Acid) 7.35
谷氨酰胺(L-Glutamine) 584
甘氨酸(Glycine) 18.75
组氨酸(L-Histidine Hydrochloride Monohydrate) 31.48
异亮氨酸(L-Isoleucine) 54.47
亮氨酸(L-Leucine) 59.05
赖氨酸(L-Lydine hydrochloride) 91.25
甲硫氨酸(L-Methionine) 17.24
苯丙氨酸(L-Phenylalanine) 35.48
脯氨酸(L-Proline) 17.25
丝氨酸(L-Serine) 26.25
苏氨酸(L-Threonine) 53.45
色氨酸(L-Tryptophan) 9.02
酪氨酸(L-Tyrosine Disodium Dihydrate) 55.79
缬氨酸(L-Valine) 52.85
生物素(D-Biotin) 0.0035
叶酸(Folic Acid) 2.66
烟酰胺(Niacinamide) 2.02
吡哆醇(Pyridoxine Hydrochloride) 2
硫胺素(Thiamine Hydrochloride) 2.17
硫辛酸(Lipoic Acid) 0.105
葡萄糖(D-Glucose) 4500
丙酮酸钠(Sodium Pyruvate) 110
次黄嘌呤(Hypoxanthine) 2.1
胸苷(Thymidine) 0.365
羟乙基哌嗪乙磺酸(Hydroxyethyl Piperazine Ethanesulfonic Acid) 3574.5
胆固醇(Cholesterol) 3.87
生育酚醋酸酯(DL-alpha-Tocopherol Acetate) 0.07
豆蔻酸(Myristic Acid) 0.01
棕榈酸(Palmitic Acid) 0.01
棕榈油酸(Palmitoleic Acid) 0.01
硬脂酸(Stearic Acid) 0.01
吐温80(Tween 80) 2.2
转铁蛋白(Transferrin) 10
白蛋白(Bovine Serum Albumin) 100
胰岛素(Insulin) 10
亚硒酸钠(Sodium Selenite) 81.47
胰蛋白水解物(Lucaratone Tryptone USP) 2100
嵌段式聚醚F68(Pluronic F68) 1000
酚红(Sodium Phenol Red) 8.63
将上述组分溶解于无热源超纯水中进行配制，可得适合MDCK细胞大规模贴壁培养的无血清培养基。
将用于生产狂犬病毒疫苗和流感病毒疫苗的MDCK细胞置于本发明所述的无血清培养基中进行单细胞悬浮培养：接种于美国Corning公司的500毫升搅拌瓶中，培养液体积为150毫升，接种密度为3.38×105细胞/毫升，培养至84小时时活细胞密度达到最高，为38.05×105细胞/毫升，结果见附图2。
Claims (10)
1.一种适于MDCK细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，包括21种氨基酸、6种维生素、8种盐类、8种脂类、4种微量元素、2种缓冲剂、1种蛋白水解物、1种酸碱指示剂以及6种其他添加物；
——所述的21种氨基酸为：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸；
——所述的6种维生素为：生物素、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、硫胺素、硫辛酸；
——所述的8种盐类为：氯化镁、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、丙酮酸钠；
——所述的8种脂类为：胆固醇、生育酚醋酸酯、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、吐温80、嵌段式聚醚F68；
——所述的4种微量元素为：硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁、亚硒酸钠；
——所述的2种缓冲剂为：碳酸氢钠、羟乙基哌嗪乙磺酸；
——所述的蛋白水解物为胰蛋白水解物；
——所述的酸碱指示剂为酚红；
——所述的6种其他添加物为：葡萄糖、次黄嘌呤、胸苷、转铁蛋白、白蛋白、胰岛素。
2.根据权利要求1所述的适于MDCK细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所述的氨基酸的含量为：
丙氨酸 3～6毫克/升，
精氨酸 50～200毫克/升，
天冬酰胺 5～15毫克/升，
天冬氨酸 2～15毫克/升，
胱氨酸 5～30毫克/升，
半胱氨酸 10～40毫克/升，
谷氨酸 7～20毫克/升，
谷氨酰胺 100～1000毫克/升，
甘氨酸 5～30毫克/升，
组氨酸 10～50毫克/升，
异亮氨酸 20～60毫克/升，
亮氨酸 30～70毫克/升，
赖氨酸 50～150毫克/升，
甲硫氨酸 10～30毫克/升，
苯丙氨酸 20～50毫克/升，
脯氨酸 2～30毫克/升，
丝氨酸 10～40毫克/升，
苏氨酸 10～60毫克/升，
色氨酸 5～20毫克/升，
酪氨酸 30～70毫克/升，
缬氨酸 30～70毫克/升。
3.根据权利要求1所述的适于MDCK细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所述的维生素的含量为：
生物素 0.003～0.1毫克/升，
叶酸 2～5毫克/升，
烟酰胺 2～10毫克/升，
吡哆醇 1～5毫克/升，
硫胺素 1～5毫克/升，
硫辛酸 0.1～0.5毫克/升。
4.根据权利要求1所述的适于MDCK细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所述的盐类的含量为：
氯化镁 20～100毫克/升，
硫酸镁 20～100毫克/升，
氯化钙 150～200毫克/升，
氯化钾 300～500毫克/升，
氯化钠 1000～7000毫克/升，
磷酸氢二钠 50～100毫克/升，
磷酸二氢钠 50～100毫克/升，
丙酮酸钠 50～150毫克/升。
5.根据权利要求1所述的适于MDCK细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所述的脂类的含量为：
胆固醇 1～5毫克/升，
生育酚醋酸酯 0.005～0.1毫克/升，
豆蔻酸 0.005～0.1毫克/升，
棕榈酸 0.005～0.1毫克/升，
棕榈油酸 0.005～0.1毫克/升，
硬脂酸 0.005～0.1毫克/升，
吐温80 1～3.1毫克/升，
嵌段式聚醚F68 0.1～2000毫克/升。
6.根据权利要求1所述的适于MDCK细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所述的微量元素的含量为：
硫酸铜 5～20毫克/升，
硝酸铁 20～100毫克/升，
硫酸亚铁 0.1～0.6毫克/升，
亚硒酸钠 50～150毫克/升。
7.根据权利要求1所述的适于MDCK细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所述的缓冲剂的含量为：
碳酸氢钠 1000～3700毫克/升，
羟乙基哌嗪乙磺酸 1000～5000毫克/升。
8.根据权利要求1所述的适于MDCK细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所述的蛋白水解物的含量为：胰蛋白水解物1500～3000毫克/升；所述的酸碱指示剂的含量为：酚5～10毫克/升。
9.根据权利要求1所述的适于MDCK细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所述的其他添加物的含量为：
葡萄糖 1000～6000毫克/升，
次黄嘌呤 2～10毫克/升，
胸苷 0.1～0.8毫克/升，
转铁蛋白 5～30毫克/升，
白蛋白 20～300毫克/升，
胰岛素 5～50毫克/升。
10.一种适于MDCK细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基，含有种氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、缓冲剂、蛋白水解物、酸碱指示剂以及添加物，其特征在于，其各种组分的含量毫克/升为：
硫酸铜(Cupric Sulfate Pentahydrate) 5～20
硝酸铁(Ferric Nitrate Nonahydrate) 20～100
硫酸亚铁(Ferrous Sulfate Heptahydrate) 0.1～0.6
氯化镁(Magnesium Chloride Hexahydrate) 20～100
硫酸镁(Magnesium Sulfate) 20～100
氯化钙(Calcium Chloride Dihydrate) 150～200
氯化钾(Potassium Chloride) 300～500
碳酸氢钠(Sodium Bicarbonate ) 1000～3700
氯化钠(Sodium Chloride) 1000～7000
磷酸氢二钠(Dibasic Sodium Phosphate) 50～100
磷酸二氢钠(Sodium Dihydrogen Phosphate) 50～100
丙氨酸(L-Alanine) 3～6
精氨酸(L-Arginine Hydrochloride) 50～200
天冬酰胺(L-Asparagine Monohydrate) 5～15
天冬氨酸(L-Aspartic cid) 2～15
胱氨酸(L-Cystine Dihydrochloride) 5～30
半胱氨酸(L-Cysteine Hydrochloride Monohydrate) 10～40
谷氨酸(L-Glutamic Acid) 7～20
谷氨酰胺(L-Glutamine) 100～1000
甘氨酸(Glycine) 5～30
组氨酸(L-Histidine Hydrochloride Monohydrate) 10～50
异亮氨酸(L-Isoleucine) 20～60
亮氨酸(L-Leucine) 30～70
赖氨酸(L-Lydine hydrochloride) 50～150
甲硫氨酸(L-Methionine) 10～30
苯丙氨酸(L-Phenylalanine) 20～50
脯氨酸(L-Proline) 2～30
丝氨酸(L-Serine) 10～40
苏氨酸(L-Threonine) 10～60
色氨酸(L-Tryptophan) 5～20
酪氨酸(L-Tyrosine Disodium Dihydrate) 30～70
缬氨酸(L-Valine) 30～70
生物素(D-Biotin) 0.003～0.1
叶酸(Folic Acid) 2～5
烟酰胺(Niacinamide) 2～10
吡哆醇(Pyridoxine Hydrochloride) 1～5
硫胺素(Thiamine Hydrochloride) 1～5
硫辛酸(Lipoic Acid) 0.1～0.5
葡萄糖(D-Glucose) 1000～6000
丙酮酸钠(Sodium Pyruvate) 50～150
次黄嘌呤(Hypoxanthine) 2～10
胸苷(Thymidine) 0.1～0.8
羟乙基哌嗪乙磺酸(Hydroxyethyl Piperazine Ethanesulfonic Acid) 1000～5000
胆固醇(Cholesterol) 1～5
生育酚醋酸酯(DL-alpha-Tocopherol Acetate) 0.005～0.1
豆蔻酸(Myristic Acid) 0.005～0.1
棕榈酸(Palmitic Acid) 0.005～0.1
棕榈油酸(Palmitoleic Acid) 0.005～0.1
硬脂酸(Stearic Acid) 0.005～0.1
吐温80(Tween 80) 1～3.1
转铁蛋白(Transferrin) 5～30
白蛋白(Bovine Serum Albumin) 20～300
胰岛素(Insulin) 5～50
亚硒酸钠(Sodium Selenite) 50～150
胰蛋白水解物(Lucaratone Tryptone USP) 1500～3000
嵌段式聚醚F68(Pluronic F68) 0.1～2000
酚红(Sodium Phenol Red) 5～10。
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