CN105779376A

CN105779376A - 一种流感病毒分离无血清培养基及其用途和制备

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Publication number: CN105779376A
Application number: CN201610171883.1A
Authority: CN
Inventors: 曲宝赤
Original assignee: Uniom Hengye Biological Technology (beijing) Co Ltd
Current assignee: Youkang Houde Biotechnology (Beijing) Co.,Ltd.
Priority date: 2016-03-24
Filing date: 2016-03-24
Publication date: 2016-07-20
Anticipated expiration: 2036-03-24
Also published as: CN105779376B

Abstract

本发明涉及生物、医学领域，具体地是涉及一种流感病毒分离无血清培养基及其用途和制备。本发明的流感病毒分离无血清培养基对MDCK细胞具有很好的维持能力，能显著地缩短流感病毒分离出来所需要的时间，分离出的流感病毒滴度高，病毒完整性好。

Description

一种流感病毒分离无血清培养基及其用途和制备

技术领域

本发明涉及生物、医学领域，具体地是涉及一种流感病毒分离无血清培养基及其用途和制备。

背景技术

流行性感冒(简称流感)是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一种传染性强、传播速度快的疾病。其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。典型的临床症状是：急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。一般秋冬季节是其高发期，所引起的并发症和死亡现象非常严重。该病是由流感病毒引起，可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，甲型病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，极易发生大范围流行。甲型H1N1也就是甲型一种。本病具有自限性，但在婴幼儿、老年人和存在心肺基础疾病的患者容易并发肺炎等严重并发症而导致死亡。乙型流感病毒的抗原变异较小，通常只引起流感的局部爆发。丙型流感病毒的抗原稳定，且致病力较弱，主要侵犯幼儿和免疫力低下的人群。

流感病毒传染性强，传播快，易造成大流行，接种疫苗可明显降低发病率和减轻症状。但由于流感病毒不断发生变异，只有经常掌握流感病毒变异的动态，选育新流行病毒株，才能及时制备出有特异性预防作用的疫苗。

目前流感疫苗制备时首先需要获得大量的流感病毒，病毒的获取最常见的就是组织培养，可用于流感疫苗制备的细胞系包括：人胚肾细胞、鸡胚肾细胞、MDCK细胞。一般的培养方法如下：

i)在培养基中增殖细胞；

ii)用流感病毒感染这些细胞；

iii)继续培养，分离在细胞中复制的病毒。

传统的第iii)步骤中细胞培养大多采用DMEM或MEM加BSA和HEPES培养方式，在第i)步骤中细胞增殖阶段使用了胎牛血清，残留的血清会干扰第ii)步骤中病毒感染细胞。血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种复杂混合物，其含有细胞生长所需的生长因子、激素、载体蛋白、贴壁因子、微量元素以及其他营养物质，可以有效地促进细胞生长和产物表达。然而，血清的应用也存在许多问题：血清中已知的组分能干扰流感病毒感染细胞，使病毒分离困难，同时血清易受病毒、支原体或其他病原体的污染；批间差异造成产品批次间的质量难以严格控制。

鉴于流感是至今尚无法完全加以控制的一种重要病毒性急性呼吸道传染病，因此，及时的分离出流感毒株，特变是有代表意义的毒株，可以预测流感的发生和流行，为制备流感疫苗和诊断试剂提供毒株，在第iii)步中，现有的不含血清的培养基培养MDCK细胞，分离和收获病毒的周期较长，获得的病毒滴度低，难以满足快速获得毒株的需要。

本发明就是在此基础上研究获得的能够克服上述缺陷的培养基。

发明内容

本发明将提供一种维持MDCK细胞生长，分离和收获病毒周期短的培养基。

本发明提供一种流感病毒分离无血清培养基，其特征在于包括如下成分：甘氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、核黄素、硫胺素盐酸盐、维生素B12、肌醇、硝酸钙(4水)、硫酸镁(7水)、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、葡萄糖、还原型谷胱甘肽(还原型)、HEPES、酚红钠盐。

进一步，其还包括如下成分：硫酸铜(5水)、硝酸铁(9水)、硫酸亚铁(7水)、氯化镁(无水)、硫酸锌(7水)、磷酸二氢钠(1水)、丙酮酸钠、腐胺盐酸盐、白蛋白。

进一步，各成分含量如下(所述含量单位为mg/L)：甘氨酸0.1-300、L-精氨酸盐酸盐0.1-500、L-天冬酰胺0.05-200、L-天冬氨酸0.05-200、L-胱氨酸盐酸盐0.1-200、L-谷氨酰胺0.1-500、L-谷氨酸0.01-200、L-组氨酸盐酸盐0.1-300、L-异亮氨酸0.5-150、L-亮氨酸0.5-150、L-赖氨酸盐酸盐1-350、L-甲硫氨酸0.1-150、L-苯丙氨酸0.5-300、L-脯氨酸0.01-100、L-丝氨酸0.01-150、L-苏氨酸0.1-200、L-色氨酸0.01-50、L-酪氨酸0.05-150、L-缬氨酸0.05-150、生物素0.001-0.01、氯化胆碱0.01-50、D-泛酸钙0.005-20、叶酸0.005-30、烟酰胺0.005-30、对氨基苯甲酸0.001-50、盐酸吡哆醇0.005-50、盐酸吡哆醛0.005-50、核黄素0.001-10、硫胺素盐酸盐0.01-100、维生素B120.01-75、肌醇0.1-150、硝酸钙(4水)0.1-200、硫酸镁(7水)0.1-150、氯化钾0.5-500、碳酸氢钠1-6000、氯化钠10-10000、磷酸氢二钠1-500、葡萄糖1-5000、谷胱甘肽(还原型)0.001-300、HEPES100-8000、酚红钠盐0.1-200。

进一步，各成分含量为(所述含量单位为mg/L)：硫5水酸铜(5水)0.001-0.01、硝9水酸铁(9水)0.01-0.01、7水硫酸亚铁(7水)0.05-100、氯化镁(无水)0.1-100、7水硫酸锌(7水)0.01-100、1水磷酸二氢钠(1水)0.1-200、丙酮酸钠0.1-300、腐胺盐酸盐0.001-0.01。

进一步，成分含量如下，所述含量单位为mg/L：甘氨酸0.1-300、L-精氨酸盐酸盐0.1-500、L-天冬酰胺0.05-200、L-天冬氨酸0.05-200、L-胱氨酸盐酸盐0.1-200、L-谷氨酰胺0.1-500、L-谷氨酸0.01-200、L-组氨酸盐酸盐0.1-300、L-异亮氨酸0.5-150、L-亮氨酸0.5-150、L-赖氨酸盐酸盐1-350、L-甲硫氨酸0.1-150、L-苯丙氨酸0.5-300、L-脯氨酸0.01-100、L-丝氨酸0.01-150、L-苏氨酸0.1-200、L-色氨酸0.01-50、L-酪氨酸0.05-150、L-缬氨酸0.05-150、生物素0.001-0.01、氯化胆碱0.01-50、D-泛酸钙0.005-20、叶酸0.005-30、烟酰胺0.005-30、对氨基苯甲酸0.001-50、盐酸吡哆醇0.005-50、盐酸吡哆醛0.005-50、核黄素0.001-10、硫胺素盐酸盐0.01-100、维生素B120.01-75、肌醇0.1-150、硝酸钙(4水)0.1-200、硫酸镁(7水)0.1-150、氯化钾0.5-500、碳酸氢钠1-6000、氯化钠10-10000、磷酸氢二钠1-500、葡萄糖1-5000、谷胱甘肽(还原型)0.001-300、HEPES100-8000、酚红钠盐0.1-200、硫酸铜(5水)0.001-0.01、硝酸铁(9水)0.01-0.01、硫酸亚铁(7水)0.05-100、氯化镁(无水)0.1-100、硫酸锌(7水)0.01-100、磷酸二氢钠(1水)0.1-200、丙酮酸钠0.1-300、腐胺盐酸盐0.001-0.01。

进一步，其PH值为7.0-7.6。

本发明还提供一种维持MDCK细胞生长，分离流感病毒的方法，其特征在于使用前述培养基培养MDCK。

进一步，病毒复制所使用的细胞为MDCK细胞或Vero细胞，所述流感病毒为甲型、乙型或丙型流感。

本发明还提供一种流感病毒分离无血清培养基的检测方法，其特征在于从如下几个方面检测1-5之一的细胞培养基：渗透压、内毒素指标、无菌性、支原体检测。

本发明还提供一种流感病毒培养基的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将权利要求1-5之一所述的培养基，用蒸馏水溶解，

2)调节PH值，

3)用工业滤芯过滤，

4)在氮气保护下分装。

本发明的培养基还有稳定性好、可质控的特点。

本发明的培养基能替代市售的DMEM(或MEM)培养基中添加白蛋白、HEPES等组分，在病毒接种后，维持MDCK细胞的生长，可显著地缩短病毒分离的时间和提高病毒分离的阳性率。使用本发明的培养基在24小时即能分离到病毒，比目前疾控中心使用的DMEM或MEM早两天。

本发明制备工艺全部采用在线清洗及在线灭菌设备，保证批间差的稳定，同时生产中采用惰性气体氮气保护，避免不稳定性成分被氧化，该工艺生产的流感病毒分离无血清培养基质量稳定，解决了大多数厂家生产质量不易控制的问题。

附图说明

附图1流感病毒在MDCK细胞中的生长曲线

附图2流感病毒感染细胞病变

具体实施方式

实施例1

按如下配比称取试剂，溶剂为蒸馏水，其最终的浓度单位为mg/L，并调节PH值为7.2，通过工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装，此培养基即为市售的DMEM(高糖)培养基：

甘氨酸30、L-精氨酸盐酸盐84、L-胱氨酸盐酸盐63、L-谷氨酰胺584、L-组氨酸盐酸盐42、L-异亮氨酸105、L-亮氨酸105、L-赖氨酸盐酸盐146、L-蛋氨酸30、L-苯丙氨酸66、L-丝氨酸42、L-苏氨酸95、L-色氨酸16、L-酪氨酸二钠盐104、L-缬氨酸94、维生素类、氯化胆碱4、D-泛酸钙4、叶酸4、烟酰胺4、盐酸吡哆醇4、核黄素0.4、硫胺素盐酸盐4、肌醇7.2、氯化钙(无水)200、硝酸铁(9水)0.1、硫酸镁(无水)97.67、氯化钾400、碳酸氢钠3700、氯化钠6400、磷酸二氢钠(1水)125、葡萄糖4500、酚红钠盐15、丙酮酸钠110。

实施例2

按如下配比称取试剂，溶剂为蒸馏水，其最终的浓度单位为mg/L，并调节PH值为7.2，通过工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装，此培养基即为市售的MEM培养基：

L-精氨酸盐酸盐126、L-胱氨酸盐酸盐31、L-组氨酸盐酸盐42、L-异亮氨酸52、L-亮氨酸52、L-赖氨酸盐酸盐73、L-蛋氨酸15、L-苯丙氨酸32、L-苏氨酸48、L-色氨酸10、L-酪氨酸二钠盐52、L-缬氨酸46、L-谷氨酰胺292、氯化胆碱1、D-泛酸钙1、叶酸1、烟酰胺1、盐酸吡哆醇1、核黄素0.1、硫胺素盐酸盐1、肌醇2、氯化钙(无水)200、硫酸镁(无水)97.67、氯化钾400、碳酸氢钠2200、氯化钠6800、磷酸二氢钠(1水)140、葡萄糖1000、酚红钠盐10。

实施例3

按如下配比称取试剂，溶剂为蒸馏水，其最终的浓度单位为mg/L，并调节PH值为7.2，通过工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装，

甘氨酸100、L-精氨酸盐酸盐200、L-天冬酰胺100、L-天冬氨酸100、L-胱氨酸盐酸盐100、L-谷氨酰胺200、L-谷氨酸100、L-组氨酸盐酸盐100、L-异亮氨酸80、L-亮氨酸80、L-赖氨酸盐酸盐150、L-甲硫氨酸80、L-苯丙氨酸100、L-脯氨酸50、L-丝氨酸80、L-苏氨酸100、L-色氨酸20、L-酪氨酸100、L-缬氨酸100、生物素0.008、氯化胆碱20、D-泛酸钙10、叶酸10、烟酰胺10、对氨基苯甲酸20、盐酸吡哆醇20、盐酸吡哆醛20、核黄素5、硫胺素盐酸盐60、维生素B1255、肌醇100、硝酸钙(4水)100、硫酸镁(7水)80、氯化钾200、碳酸氢钠3000、氯化钠5000、磷酸氢二钠200、葡萄糖2000、谷胱甘肽(还原型)200、HEPES4000、酚红钠盐100、硫酸铜(5水)0.008、硝酸铁(9水)0.08、硫酸亚铁(7水)50、氯化镁(无水)50、硫酸锌(7水)50、1水磷酸二氢钠(1水)100、丙酮酸钠100、腐胺盐酸盐0.008。

实施例4

分离流感病毒

方法：

1、MDCK细胞(购自中科院上海细胞库中科院上海细胞库，NBL-2)，用友康MDCK细胞无血清细胞培养基(批号：NC02150901)传代5代后，以初始浓度7×10⁴cells/cm²接种在T25细胞培养瓶中，在37℃，5％CO₂条件下培养24小时。

2、弃去培养液，用PBS或不含钙镁的Hank’s液清洗细胞2-3遍，加入200uL的甲型H5N1流感病毒(或甲型H3N2流感病毒、乙型BY流感病毒，购自广州博特生物技术开发有限公司)样本，温和摇动数次，置于37℃，5％CO₂培养箱中吸附1-2小时。

3、分别加入6ml下列培养基，放置于33℃-35℃，5％CO₂条件下培养，每日观察细胞病变情况。

1号培养基：实施例1中DMEM(高糖)培养基(需额外添加2000mg/的BSA、5958mg/L的HEPES、2ug/ml的TPCK-胰酶、100U/ml的青霉素、100mg/L的链霉素)

2号培养基：实施例2中MEM培养基(需额外添加2000mg/L的BSA、5958mg/L的HEPES、2ug/ml的TPCK-胰酶、100U/ml的青霉素、100mg/L的链霉素)；

3号培养基：流感病毒分离无血清培养基(需额外添加2ug/ml的TPCK-胰酶、100U/ml的青霉素、100mg/L的链霉素)。

4、病毒的收获。当75％-100％的细胞出现病变时，收集上清液，加入0.5％的稳定剂(甘油，BSA，明胶)后置于-80℃冰箱保存。当细胞未出现病变时，在接种后的第7天收获病毒，收获病毒时先温和摇动细胞瓶数次，吸取上清液加稳定剂后保存。

5、红细胞凝集试验

1)取干净的96孔V型板，每孔加入50ul生理盐水，吸50ul混匀的病毒于每排第1孔，然后做倍比稀释，稀释到第11孔，留每排最后一孔(第12孔)做阴性对照，如果是用分离出的流感病毒做对比试验，需要设置

阳性对照。

2)从高稀释度向低稀释度方向稀释每孔加50ul充分混匀的1％鸡红细胞悬液，室温条件下反应30min，观察试验结果，红细胞不出现凝集反应的最大稀释度的倒数即为病毒的滴度。

实施例5

MDCK细胞分离流感病毒的病毒滴度柱状图

三组产品根据实施例3的培养方法，在步骤3的不同时间点取MDCK细胞上清液并检测血凝，制备流感病毒滴度柱状图。如附图1所示，使用1-2号培养基的细胞最早在72小时检测血凝，而使用3号培养基的细胞最早在24小时即能检测到血凝。

可见3号培养基培养分离出流感病毒的时间要比1-2号培养基早两天。

实施例6

流感病毒阳性率测试

三组产品根据实施例4的培养方法，在步骤3的不同时间点观察细胞病变，在MDCK细胞发生病变后，取MDCK细胞上清液并检测血凝(红细胞凝集试验)。如下表及附图2所示，使用1-2号培养基的细胞分离不出甲型H3N2流感病毒，MDCK细胞未发生病变，而使用3号培养基的细胞在24小时即能观察到明显的病变，并用实时荧光定量PCR检测了甲型H3N2流感病毒，结果显示28小时比24小时的CT值小1，说明经过4小时后，MDCK细胞的上清液中的病毒滴度增加了。

1号、2号培养基培养的MDCK细胞一直未观察到细胞肿胀圆化、细胞间歇增大、细胞不贴壁及碎裂等病变特征，而3号培养基培养的MDCK细胞24小时后即能观察到细胞病变,48小时细胞病变明显。

	CT值
		侵染后24h上清	28.10
侵染后28h上清	27.19
		强阳性	24.27
临界阳性	30.17

实施例7

本发明MDCK培养基质控方法

鉴别：

1、渗透压

2、内毒素

(1).标准品稀释：取10EU/支工作标准品1支，加BET水1ml，在漩涡混合器上混合15分钟后，制成10EU/ml的工作标准品母液；用检查用水将内毒素标准品稀释制成2λ浓度的内毒素标准溶液。

(2).根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ)用BET水将标准品母液稀释至2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30s。

(3).取鲎试剂2支加BET水0.2ml作为阴性对照，2支加0.1mlBET水和2λ的工作标准品0.1ml作为阳性对照。取鲎试剂各加0.1mlBET水和0.1ml2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的样品作为供试品管，放入37℃±1℃水浴，保温60±2分钟。产品内毒素指标小于0.25EU/ml.

3、无菌

供试品的制备：用灭菌镊子取出蒸馏器，在火焰旁将针芯插入针管并安上针头，供试品瓶盖和注射器针头均应迅速通过火焰数次，用注射器吸取已混合好的供试品2ml。

取上述供试品在近火焰上以右手小指为主拔开培养基管的塞子，管口通过火焰后，移至火焰下侧，沿培养管壁分别接种于需氧菌、厌氧菌培养6管(其中1管于操作结束后移至接种室接种金黄色葡萄球菌对照菌液1ml)，真菌培养基5管，轻摇使匀，需氧菌、厌氧菌培养基在30-35℃培养，真菌培养基在20-25℃培养7日，培养期间应逐日检查是否有菌生长(阳性对照在24h内应有菌生长)，并填写检查记录。

在加入供试品后，培养基出现混浊，培养7日后，不能从外观上判断无微生物生长，可取该培养液适量接种于同种新鲜培养基中或斜面上，继续培养，细菌培养2日，真菌培养3日，观察是否再现混浊或斜面上有无菌落生长，在接种同时，取培养液少量，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有菌生长

4、支原体检测

供试品如在分装后24小时内进行支原体检查可储存在2～8℃，超过24小时应置-20℃以下贮存。

检查支原体采用支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基(或支原体琼脂培养基)，半流体培养基(或支原体琼脂培养基)121℃高压灭菌25分钟，冷却至56℃左右加入灭活的小牛血清(培养基：血清为8:2)并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。

取每支装量为10ml的支原体半流体培养基(已冷至36℃士1℃)和支原体肉汤培养基各4支，每支培养基接种供试品0.5～1.0ml，置36℃士1℃培养21天。于接种后的第7天从4支中取2支进行次代培养，每1支培养基转种支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基各2支，置36℃士l℃培养21天，每隔3天观察1次.

结果判定：培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。

Claims

1.一种流感病毒分离无血清培养基，其特征在于包括如下成分：

甘氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、核黄素、硫胺素盐酸盐、维生素B12、肌醇、4水硝酸钙、7水硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、葡萄糖、还原型谷胱甘肽、HEPES、酚红钠盐。

2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于还包括如下成分：

5水硫酸铜、9水硝酸铁、7水硫酸亚铁、无水氯化镁、7水硫酸锌、1水磷酸二氢钠、丙酮酸钠、腐胺盐酸盐、白蛋白。

3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于各成分含量如下,所述含量单位为mg/L：

甘氨酸0.1-300、L-精氨酸盐酸盐0.1-500、L-天冬酰胺0.05-200、L-天冬氨酸0.05-200、L-胱氨酸盐酸盐0.1-200、L-谷氨酰胺0.1-500、L-谷氨酸0.01-200、L-组氨酸盐酸盐0.1-300、L-异亮氨酸0.5-150、L-亮氨酸0.5-150、L-赖氨酸盐酸盐1-350、L-甲硫氨酸0.1-150、L-苯丙氨酸0.5-300、L-脯氨酸0.01-100、L-丝氨酸0.01-150、L-苏氨酸0.1-200、L-色氨酸0.01-50、L-酪氨酸0.05-150、L-缬氨酸0.05-150、生物素0.001-0.01、氯化胆碱0.01-50、D-泛酸钙0.005-20、叶酸0.005-30、烟酰胺0.005-30、对氨基苯甲酸0.001-50、盐酸吡哆醇0.005-50、盐酸吡哆醛0.005-50、核黄素0.001-10、硫胺素盐酸盐0.01-100、维生素B120.01-75、肌醇0.1-150、4水硝酸钙0.1-200、7水硫酸镁0.1-150、氯化钾0.5-500、碳酸氢钠1-6000、氯化钠10-10000、磷酸氢二钠1-500、葡萄糖1-5000、还原型谷胱甘肽0.001-300、HEPES100-8000、酚红钠盐0.1-200。

4.如权利要求1-3之一所述的培养基，其特征在于各成分含量为,所述含量单位为mg/L：

5水硫酸铜0.001-0.01、9水硝酸铁0.01-0.1、7水硫酸亚铁0.05-100、氯化镁0.1-100、7水硫酸锌0.01-100、磷1水酸二氢钠0.1-200、丙酮酸钠0.1-300、腐胺盐酸盐0.001-0.01、白蛋白1-5000。

5.如权利要求1-4之一所述的培养基，其PH值为7.0-7.6。

6.一种维持MDCK细胞生长，分离流感病毒的方法，其特征在于使用如权利要求1-4之一所述的培养基培养MDCK。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于病毒复制所使用的细胞为MDCK细胞或Vero细胞，所述流感病毒为甲型、乙型或丙型流感。

8.一种流感病毒分离无血清培养基的检测方法，其特征在于从如下几个方面检测1-4之一的细胞培养基：渗透压、内毒素指标、无菌性、支原体检测。

9.一种流感病毒培养基的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将权利要求1-4之一所述的培养基，用蒸馏水溶解，

2)调节PH值，

3)用工业滤芯过滤，

4)在氮气保护下分装。