CN105866434B - 一种九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用免疫层析试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用免疫层析试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫层析检测技术领域，具体公开了一种九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒及其制备方法。包括具有三个视窗壳体，壳体内放置第一试纸条、第二试纸条和第三试纸条，每个试纸条均包括塑料板、设置在塑料板上的玻璃纤维素膜、设置在玻璃纤维素膜上的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上一端设有样本垫，对应的另一端设有吸水垫，硝酸纤维素膜上设置有检测线1、检测线2、检测线3和控制线；玻璃纤维塑模上包被有量子点标记的九项呼吸道感染病原体抗体，检测线上分别对应包被有九项呼吸道感染病原体抗原。该试剂盒，利用间接法原理结合量子点的荧光特性实现对九项呼吸道感染病原体IgM抗体进行快速、灵敏的联合检测。

Description

一种九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用免疫层析试剂盒 及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫层析检测技术领域，具体涉及一种九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用免疫层析试剂盒及其制备方法。
背景技术
呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统。分为上呼吸道感染和下呼吸道感染，上呼吸道感染常见的是急性上呼吸道感染(acute upperrespir tract infection)，指鼻腔、咽或喉部急性炎症的概称，是呼吸道最常见的一种传染病，常见病因为病毒，少数由细菌引起。患者不分年龄、性别、职业和地区，不仅具有较强的传染性，而且可引起严重并发症。下呼吸道感染是最常见的感染性疾患，包括急性气管——支气管炎、慢性支气管炎、肺炎、支气管扩张等，由病毒、细菌、支原体、衣原体、军团菌等微生物引起，其防治应遵循预防为主、准确诊断、及时治疗的原则，治疗时必须明确引起感染的病原体以选择有效的抗生素。已报道的非典型呼吸道病原体有很多，最常见的有嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、Q热立克次体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒等。
嗜肺军团菌(Legionella pneumophila,LP)是一种兼性细胞内致病菌，有鞭毛，革兰氏阴性，军团菌科军团菌属多形态性的短小球杆菌。其不抗酸，无孢子，无荚膜，类似于杆菌。不能分解明胶、糖类或是尿素，同时，不可参加酵解反应。嗜肺军团菌无色，也非自身荧光，氧化酶与过氧化氢酶测试阳性，β-内酰胺酶阳性。专性需氧，在自然界可长期存活，如在蒸馏水中可存活100d以上，污水中可存活一年，对热和一般消毒剂敏感。菌落特征为灰白色，有光泽，湿润，圆形，凸起，并有特殊臭味，革兰氏染色不明显，多用镀银法或Giemsa法染色。广泛分布于天然淡水环境或人工水域中，在阿米巴体内寄生，亦可感染人巨噬细胞，在其胞内繁殖和杀死人巨噬细胞，是引起军团菌病(军团菌肺炎)的重要病原体。军团菌病在国内外时有爆发流行，中央空调冷凝塔水系统是引起军团菌病的主要传染源，病死率较高。目前已知军团菌有48个种70多个血清型，其中嗜肺军团菌有15个血清型，血清型-1是引起社区获得性肺炎和院内感染性肺炎的重要病原体。通常军团病的爆发时间是在仲夏和初秋，易发生在封闭式中央空调房间里。军团菌的易感人群通常为老年人、吸烟者和有慢性肺部疾患者；同时，免疫功能低下，如癌症病人、肾透析病人和艾滋病人也特别易感。它的症状类似于肺炎，表现为发冷、不适、肌痛、头晕、头痛，并有烦躁、呼吸困难、胸痛。90％以上的患者体温迅速上升，咳嗽并伴有粘痰，偶尔出现伴有腹泻呕吐的胃肠道紊乱，重症病人可发生肝功能变化及肾衰竭。由于其非典型症状，其诊断主要依靠实验室诊断。
肺炎支原体，曾名为类胸膜肺炎微生物(PPLO)，是介于病毒与细菌之间的一种没有细胞壁的病原体，可通过细菌滤器，在琼脂培养基中生长时，需要含胆固醇的酵母浸出液及20％马血清，其菌落很小，很少超过0.5mm，肉眼不易观察，在显微镜下菌落呈圆形均匀的颗粒状，外围有透明带，MP呈球形，杆状和丝状等多种形态，仅有由三层膜组成的胞浆膜，革兰染色呈阴性，胞质内含核糖体和双股DNA，在有氧或无氧条件下生长较其他支原体为慢，接种后5～10天才能见到，能发酵葡萄糖产生乳酸，能产生过氧化酶类溶血素。肺炎支原体对呼吸道上皮细胞有特殊的亲和力，对青霉素耐药，对红霉素等大环内酯类抗生素极为敏感。肺炎支原体感染主要通过呼吸道飞沫传播，平时多为散发病例，全年均可发病，以冬季较多。约每隔3～7年发生一次地区性流行。学龄儿童患病较多，学龄前儿童包括婴幼儿也可发生肺炎支原体感染。其发病机制主要由于支原体穿过宿主呼吸道黏膜表面的黏液纤毛层，黏附于黏膜上皮细胞上，此黏附作用与肺炎支原体表面的P1蛋白的末端结构有关，当此黏附因子附着于呼吸道黏膜上皮细胞时，释放的有毒代谢产物可导致纤毛运动减弱，细胞损伤。其病症主要为支气管炎，毛细支气管炎及间质性肺炎，管壁水肿，增厚，有浸润斑，支气管及细支气管内有黏液甚至脓性分泌物，镜下所示为急性细支气管炎伴有间质性肺炎，肺泡内可见有少量水肿液及巨噬细胞，细支气管壁有水肿，充血以及单核细胞和淋巴细胞浸润，腔内可见到中性粒细胞，脱落上皮细胞及细胞残片，附近的肺泡间隔内有淋巴细胞及单核细胞浸润，重症可见弥漫性肺泡坏死和透明膜病变。要确诊是否为肺炎支原体感染，要到医院去检测血中肺炎支原体抗体，特异性IgM、IgG抗体检测和聚合酶链反应检测是目前公认的确诊标准之一，抗体滴定度>1:40(+)是诊断肺炎支原体感染的客观证据。
Q热立克次体，又名伯纳特立克次体，是介于最小细菌和病毒之间的一类独特的微生物，是一类严格的活细胞内寄生的原核细胞型微生物。它的许多生物学性状接近细菌，具有滤过性，多在宿主细胞空泡内繁殖，不含有与变形杆菌X株起交叉反应的X凝集原，对实验室动物一般不显急性中毒反应，对理化因素抵抗力强。在干燥沙土中4～6℃可存活7～9个月，-56℃能活数年，加热60～70℃30～60分钟才能灭活。抗原分为二相。初次从动物或壁虱分离的立克次体具Ⅰ相抗原(表面抗原，毒力抗原)；经鸡胚卵黄囊多次传代后成为Ⅱ相抗原(毒力减低)，但经动物或蜱传代后又可逆转为Ⅰ相抗原。两相抗原在补体结合试验、凝集试验、吞噬试验、间接血凝试验及免疫荧光试验的反应性均有差别。家畜是主要传染源，如牛、羊、马、骡、犬等，次为野啮齿动物，飞禽(鸽、鹅、火鸡等)及爬虫类动物。有些地区家畜感染率为20～80％，受染动物外观健康，而分泌物、排泄物以及胎盘、羊水中均含有Q热立克次体。患者通常并非传染源，但病人血、痰中均可分离出Q热立克次体。其传播途径多样，可通过呼吸道传播、接触传播、消化道传播，其中呼吸道传播，Q热立克次体随动物尿粪、羊水等排泄物以及蜱粪便污染尘埃或形成气溶胶进入呼吸道致病。Q热立克次体普遍易感，特别是屠宰场肉品加工厂、牛奶厂、各种畜牧业、制革皮毛工作者受染机率较高，受染后不一定发病，血清学调查证明隐性感染率可达0.5～3.5％。病后免疫力持久。其流行行分布全世界，多见于男性青壮年，我国吉林、四川、云南、新疆、西藏、广西、福建、贵州等十几个省市、自治区均有本病流行。其潜伏期12～39天，平均18天。起病大多急骤，少数较缓。突然发作，伴发热，剧烈头痛，寒颤，严重乏力，肌痛，且常有胸痛.体温可升至40℃持续1～3周.与其他立克次体病不同，Q热无皮肤出疹.在发病第2周，有干咳，X线显示有肺炎.在严重病例，常发生大叶实变，肺的大体影像类似细菌性肺炎.Q热肺炎组织学变化相似于鹦鹉热和某些病毒性肺炎，小支气管和血管及邻近肺泡壁有严重的间质浸润，且多浆细胞.小支气管腔可能含多形核白细胞，肺泡内层细胞肿胀，肺泡内出现脱落的内层细胞和大的单核细胞.约1/3病程拖延的Q热病人会发生肝炎，特点为发热，乏力，肝肿大伴右上腹疼痛及黄胆.肝活检标本显示弥散的肉芽肿变化，免疫荧光可检出Q热立克次体.头痛和呼吸道症状常常缺如，但在老年人或体弱者大叶性肺炎可能特别严重.重型慢性Q热常有慢性肝炎和心内膜炎.慢性Q热肝炎必须与其他肝肉芽肿相区别(如结核，肉瘤，组织浆胞菌病，布氏菌病，兔热病和梅毒).Q热立克次体引起的心内膜炎严重但不常见，临床上类似亚急性细菌性心内膜炎但更多累及主动脉瓣.常规血培养阴性，Q热很少致死(未治疗者为1％，治疗者更低).其诊断多为临床和实验室检查相结合。
肺炎衣原体是一种比细菌小但比病毒大的生物，具有两相生活环。即具有感染性的原体(elementary body，EB)和无感染性的始体(initial body,亦称网状体reticulatebody,RB)。EB颗粒呈球形，小而致密，直径0.2～0.4μm,普通光学显微镜下勉强可见；EB是发育成熟了的衣原体，主要存在细胞外。RB是衣原体在宿主细胞内发育周期的幼稚阶段，是繁殖型，不具感染性。衣原体是专性细胞内寄生的、近似细菌与病毒的病原体，属于衣原体目(Chlamydiales)、衣原体科(Chlamydiaceae，仅有一个科)、衣原体属(Chlamydia)，有四个种。其具有脱氧核糖核酸和RNA两种核酸，二分裂增殖，有核糖体和近似细胞壁的膜；细胞内寄生，完全依赖宿主细胞供应能量(因缺乏ATP酶)；其生活周期分为细胞外期(即具有感染性的原始小体)和细胞内期(即增殖性的网状小体)两个时期；用Giemsa或荧光抗体染色可在细胞核附近原浆查见衣原体包涵体；衣原体基因组的Mr为660×106,比除支原体外的任何原核生物都小。肺炎衣原体常在儿童和成人中产生上呼吸道和呼吸道感染。现仅知人是该衣原体宿主，感染方式可能为人与人之间通过呼吸道分泌物传播。5岁以下儿童极少受染，8岁以上儿童及青年易被感染，尤其是人群聚集处，如家庭、学校、兵营中易于流行。经血清流行病学调查，证实成人中至少有40％已受到该衣原体感染，大部分为亚临床型。老年人可再次受到感染。其无特异性临床表现，早期多为上感症状，咽痛、声音嘶哑，呼吸系统最多见的症状是咳嗽，1—2周后上感症状逐渐消退而咳嗽逐渐加重，并出现下呼吸道感染征象，如未经有效治疗，则咳嗽可持续1—2个月或更长，肺部偶闻及干、湿罗音或喘鸣音。由于其非典型症状，其诊断主要依靠实验室诊断。
腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，基因组长约36kb，衣壳(capsid)呈规则的20面体结构，直径约80-110nm。自上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人腺病毒有47种，分为A、B、C、D、E和F六个亚群(subgroup)，其很多与人类上、下呼吸道感染密切有关。腺病毒主要在细胞核内繁殖，耐温、耐酸、耐脂溶剂的能力较强，除了咽、结合膜及淋巴组织外，还在肠道繁殖。1958年以来我国各地相继证实，腺病毒除引起上呼吸道感染外，还可引致小儿肺炎，多见于6个月至2岁的婴幼儿腺病毒肺炎最为危重，尤以北方各省多见，病情严重者也较南方为多。华北，东北及西北于1958年冬及1963年冬有较大规模的腺病毒肺炎流行，病情极其严重。腺病毒一般通过呼吸道传染，在集体儿童机构中往往同时发生腺病毒上呼吸道感染及肺炎。人群血清学研究说明，生后最初数月常存留从母体传递的腺病毒特异抗体，此后一直到2岁抗体缺乏，2岁以后才逐渐增加。这与腺病毒肺炎80％发生在7～24月婴幼儿的临床观察完全符合，各年龄组易感人群数量越多，发生腺病毒呼吸道感染的人数就多，而婴幼儿发生腺病毒肺炎的机会也越大，腺病毒肺炎在我国北方多见于冬春两季，夏、秋季仅偶见，在广州的高流行年则多见于秋季。这类肺炎在北京约占病毒性肺炎的20％～30％。其症状主要表现为病灶性或融合性坏死性肺浸润和支气管炎，起病时潜伏期3～8天，一般急骤发热，往往自第1～2日起即发生39℃以上的高热，至第3～4日多呈稽留或不规则的高热；3/5以上的病病例最高体温超过40℃。另外其在呼吸系统、神经系统、循环系统、消化系统也都有症状显现。其诊断可根据临床和实验室结合。
呼吸道合胞病毒是RNA病毒，属于副粘液病毒属，按血清学确认有两种亚型(A和B)。在生物学表现方面呼吸道合胞病毒比其他病毒更接近于流感和副流感病毒，但在血清学和其他方面(例如不能在鸡蛋中生长及产生血凝素)可与之进行鉴别。它是婴幼儿下呼吸道感染(包括毛细支气管炎和肺炎)最重要的病因之一，可能是致命性的；在健康成人和年长儿，呼吸道合胞病毒仅引起轻症呼吸道感染，但也可引起支气管肺炎和慢性支气管炎，致使病情加剧。老年人和那些原有肺部疾病患者对呼吸道合胞病毒特别易感。其流行于每年的冬季或早春，成为流行很广的急性呼吸道疾病，能使支气管炎和肺炎的发病率和病死率上升。呼吸道合胞病毒亚型每年反复流行表明，病人可反复感染得病。虽然在5岁儿童中有70％存在血清抗呼吸道合胞病毒的抗体，但感染仍可不断发生于任何年龄。血清抗体抗感染作用不很明显的典型例子可见于6个月以下的婴儿，这类小儿的支气管，肺均未发育成熟；虽然这些婴儿具有母亲的抗体，但仍能发生严重的下呼吸道疾病，导致病死数明显上升。其感染症状差异很大。一般说来，与年龄，以前接触呼吸道合胞病毒和潜在疾病(尤其是呼吸道疾病)有关。临床体征没有什么特殊，呼吸困难，咳嗽，喘鸣是最突出的症状，通常出现在上呼吸道体征后的数日之内。婴幼儿常伴发热，气急可见于婴儿中，并可在其他症状和体征以前最早出现。X线胸片常显示明显的支气管肺炎和/或毛细支气管炎表现。白细胞计数正常也可能增高，但中性粒细胞可能中度升高。在成人和年长儿，感染可能不明显或仅表现为无热性上呼吸道感染(普通感冒)，呼吸道合胞病毒感染还非常像流感。因慢性支气管炎急性恶化而住院者中有15％是合胞病毒感染。由于其非典型症状，其诊断主要依靠实验室诊断，另外由于呼吸道合胞病毒不耐冰冻和冻融，除非通过特殊的培养基保护，标本很难贮存或远距离运送。
流行性感冒病毒，简称流感病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，呈球形，新分离的毒株则多呈丝状，其直径在80至120纳米之间，丝状流感病毒的长度可达400纳米。其病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分，其传染性强，传播速度快。在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行，一年四季人都可能受到流感病毒的攻击，但冬季是一个高发季节。流行性感冒病毒对免疫力较弱的老人或小孩及一些免疫失调的病人会引起较严重的症状，如肺炎或是心肺衰竭等根据流感病毒感染的对象，可以将病毒分为人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒以及禽流感病毒等类群，其中人类流感病毒根据其核蛋白的抗原性可以分为三类:甲型流感病毒(I nfluenza A virus)，又称A型流感病毒，乙型流感病毒(Influenza B virus)，又称B型流感病毒，丙型流感病毒(Influenza Cvirus)，又称C型流感病毒，在核蛋白抗原性的基础上，流感病毒还根据血凝素和神经氨酸酶的抗原性分为不同的亚型。在感染人类的三种流感病毒中，甲型流感病毒有着极强的变异性，乙型次之，而丙型流感病毒的抗原性非常稳定。乙型流感病毒的变异会产生新的主流毒株，但是新毒株与旧毒株之间存在交叉免疫，即针对旧毒株的免疫反应对新毒株依然有效。流感病毒侵袭的目标是呼吸道粘膜上皮细胞，它会引起宿主细胞变性、坏死乃至脱落，造成粘膜充血、水肿和分泌物增加，从而产生鼻塞、流涕、咽喉疼痛、干咳以及其它上呼吸道感染症状，当病毒蔓延至下呼吸道，则可能引起毛细支气管炎和间质性肺炎。偶有侵袭肠粘膜的病例，则会引起胃肠型流感。另外，病毒感染还会诱导干扰素的表达和细胞免疫调理，造成一些自身免疫反应，包括高热、头痛、腓肠肌及全身肌肉疼痛等，病毒代谢的毒素样产物以及细胞坏死释放产物也会造成和加剧上述反应。由于流感病毒感染会降低呼吸道粘膜上皮细胞清除和黏附异物的能力，所以大大降低了人体抵御呼吸道感染的能力，因此流感经常会造成继发性感染，由流感造成的继发性肺炎是流感致死的主要死因之一。早期与传染性非典型肺炎的鉴别诊断困难。
人类副流感病毒(HPIVs)是常常引起儿童下呼吸道感染的一种病毒，其致病性仅次于呼吸道合胞病毒，它是单链的RNA病毒，病毒表面含有溶合酶和红血球凝聚素—神经氨酸苷酶的糖蛋白质。从血清学上人类副流感病毒可分为4型(1型到4型)，其中4型又分a和b两个亚型。病毒颗粒大小不一(平均直径大小在150纳米～300纳米之间)，形态各异。在外环境下不稳定，在物体表面存活几个小时，肥皂水就很容易使其失去活性。当有传染性的物质接触了人的眼睛、口腔或鼻子里的粘膜后就会发生感染，或通过吸入由于喷嚏和咳嗽产生的呼吸道分泌物的飞沫而感染。人类副流感病毒可以在这种悬浮状态下存活一个小时以上。副流感病毒感染全年均可发生(尤其是第3型)。第1和第3型副流感病毒感染常见于幼儿，局部流行发生于托儿所，儿科病房，小学及其他儿童场所。第3型为地方性流行，传染性强，四季均可发生，多数儿童1岁内可感染。由副流感病毒1型或2型引起的流行性疾病有每年均可发生并交替占主导地位的倾向。第2型引起的疾病更趋于散发。第1，2，3型可在秋季流行。第4型引起轻度呼吸道疾病；在成人中几乎普遍存在的免疫力可减轻疾病的严重程度并阻止副流感病毒的传播。然而，同一型副流感病毒，尤其是第1型和第3型，可引起第2次甚至第3次感染。与呼吸道合胞病毒(RSV)一样，人类副流感病毒可以造成反复发作的上呼吸道感染(如感冒和喉咙痛)。它也能造成严重的反复感染的下呼吸道疾病(如肺炎，支气管炎和细支气管炎)，特别是在老年人中和有免疫缺陷人群中。人类副流感病毒的四种亚型各有不同的临床和流行病学特征。1型和2型的最典型的临床特征是造成儿童喉气管支气管炎，1型是这种儿童喉气管支气管炎的主要原因，而2型次之。1型和2型均能造成其它的上呼吸道和下呼吸道疾病。3型经常导致肺炎和细支气管炎。4型很难检出，可能是因为它很少导致严重的疾病。人类副流感病毒的潜伏期一般在1～7天左右。其主要通过实验室检测来诊断，临床上无法作出副流感的特异性诊断。需要时，病毒的分离和鉴定可通过组织培养接种；应用免疫和分子生物学技术可检测呼吸道受感染细胞中的病毒抗原。用急性期和恢复期血清作CF(补体结合试验)，HI(血凝集抑制反应)和中和试验可证实副流感病毒感染，但如果不作病毒分离，由于血清学的交叉反应，就难以鉴定特异的病毒型。
因此，研究开发出一种检测方法实现对上述九项呼吸道感染病原体IgM抗体的联合检测，对于呼吸道感染疾病的治疗和诊断具有重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种灵敏度高、准确度高、操作简便、成本低的九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒，实现对九项呼吸道感染病原体IgM抗体的同时联合检测。
本发明的目的还在于提供一种九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒的制备方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒，包括具有三个视窗壳体，所述壳体内放置第一试纸条、第二试纸条和第三试纸条，所述第一试纸条、第二试纸条和第三试纸条均包括塑料板、设置在塑料板上的玻璃纤维素膜、设置在玻璃纤维素膜上的硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上一端设有样本垫，对应的另一端设有吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线1、检测线2、检测线3和控制线；所述第一试纸条的玻璃纤维塑模上包被有量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体和量子点标记的Q热立克次体抗体的混合物；所述第一试纸条的检测线1上包被有嗜肺军团菌血清1型抗原，检测线2上包被有肺炎支原体抗原，检测线3上包被有Q热立克次体抗原；所述第二试纸条的玻璃纤维素膜上包被有量子点标记的肺炎衣原体抗体、量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的呼吸道合胞病毒抗体的混合物；所述第二试纸条的检测线1上包被有肺炎衣原体抗原，检测线2上包被有腺病毒抗原，检测线3上包被有呼吸道合胞病毒抗原；所述第三试纸条的玻璃纤维素膜上包被有量子点标记的甲型流感病毒抗体、量子点标记的乙型流感病毒抗体和量子点标记的副流感病毒抗体的混合物；所述第三试纸条检测线1上包被有甲型流感病毒抗原，检测线2上包被有乙型流感病毒抗原，检测线3上包被有副流感病毒抗原；所述第一试纸条、第二试纸条和第三试纸条的控制线上均包被有羊抗鼠IgG。
所述量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体、量子点标记的Q热立克次体抗体的混合物中量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体、量子点标记的Q热立克次体抗体的质量比为1：1：1；所述量子点标记的肺炎衣原体抗体、量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的呼吸道合胞病毒抗体混合物中量子点标记的肺炎衣原体抗体、量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的呼吸道合胞病毒抗体的质量比也为1：1：1；所述量子点标记的甲型流感病毒抗体、量子点标记的乙型流感病毒抗体和量子点标记的副流感病毒抗体混合物中量子点标记的量子点标记的甲型流感病毒抗体、量子点标记的乙型流感病毒抗体和量子点标记的副流感病毒抗体的质量比也为1：1：1。
所述量子点为硒化镉或硫化镉量子点。
所述硝酸纤维素膜上设置的检测线1与检测线2之间、检测线2与检测线3之间、检测线1与控制线之间的间隔均不小于5mm。
上述九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
第一、制备第一试纸条：
1)原材料的制备：
A：制备玻璃纤维素膜：将量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体、量子点标记的Q热立克次体抗体混合包被在玻璃纤维素膜上，干燥，备用；
B：制备硝酸纤维素膜：取硝酸纤维素膜，间隔划分出检测线1、检测线2、检测线3和控制线，然后将嗜肺军团菌血清1型抗原、肺炎支原体抗原、Q热立克次体抗原、羊抗鼠lgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上，之后将包被后的硝酸纤维素膜放入封闭液中封闭，干燥，备用；
2)组装：在塑料板上放置步骤1)制备的玻璃纤维素膜，然后在步骤1)制备的玻璃纤维素膜上放置步骤1)制备的硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素的一端放置样品垫，对应的另一端放置吸水垫，干燥，即得第一试纸条
第二、按照上述第一试纸条同样的制备方法制备第二试纸条和第三试纸条；
第三、将制备的第一试纸条、第二试纸条和第三试纸条放置在具有三个检测视窗的壳体内，即完成。
步骤A中还包括首先制备量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体、量子点标记的Q热立克次体抗体的混合物，具体方法包括以下操作步骤：
a：在胶乳颗粒悬浊液中加入改性环糊精，混匀24小时，纯化，得改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；
b：在步骤a制备的改性环糊精-胶乳复合物悬浊液中加入量子点，混匀24小时，纯化，得量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；
c：在步骤b制备的量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液中加入活化剂，活化15分钟，纯化，之后加入嗜肺军团菌血清1型抗体，混匀2～4小时后，离心得沉淀物颗粒，将沉淀物颗粒用封闭液重悬，室温混匀1小时，之后再进行纯化，即得量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体；
d：按照上述步骤a～c同样的方法制备量子点标记的肺炎支原体、Q热立克次体抗体，然后将量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体和量子点标记的Q热立克次体抗体混合，备用；
所述改性环糊精为羧甲基化改性环糊精或氨基化改性环糊精。
所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
所述步骤c中量子点-羧基化改性环糊精-胶乳复合物与活化剂质量比1：10
步骤B中所用的封闭液为牛血清白蛋白溶液。
步骤c中所用的封闭液为牛血清白蛋白溶液。
步骤a中所述改性环糊精与胶乳颗粒的质量比为20：1；步骤b中所述量子点与环糊精-乳胶复合物的质量比为10：1；步骤c中所述嗜肺军团菌血清I型抗体与量子点-改性环糊精-胶乳复合物的质量比为1：20。
步骤a中胶乳颗粒使用前进行纯化处理，所述纯化处理的具体方法为：取胶乳颗粒加入第一缓冲液中，离心分离，弃去上清，再用第一缓冲液重悬沉淀物颗粒，然后再离心分离，弃去上清，再用第一缓冲液重悬沉淀物颗粒，4℃保存备用。
上述纯化后的胶乳颗粒在使用时取胶乳颗粒，采用第二缓冲液将胶乳颗粒稀释成浓度为10mg/ml。
上述步骤b中还包括首先将步骤a中制备的改性环糊精-胶乳复合物悬浊液，采用第二缓冲液稀释成浓度为10mg/ml的悬浊液，然后再加入量子点。
上述步骤c中还包括首先将步骤b中制备的量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液，采用第二缓冲液稀释成浓度为10mg/ml的悬浊液，然后再加入活化剂活化。
步骤c中所述封闭后进行纯化的具体方法为：8000rpm条件下离心15min，弃去上清，沉淀复溶于分散液中。
步骤A中将量子点标记的嗜肺军团菌血清1型、量子点标记的肺炎支原体、量子点标记的Q热立克次体抗体混合包被在玻璃纤维素膜上的具体方法为：将将量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体、量子点标记的Q热立克次体抗体混合物均匀喷涂于玻璃纤维素膜上。
步骤a和步骤b中所述纯化的具体方法为：8000rpm条件下离心，弃去上清，沉淀用第一缓冲液进行重悬，之后在8000rpm条件下离心，弃去上清，沉淀复溶于第一缓冲液中。
步骤c中活化后纯化的具体方法为：8000rpm条件下离心弃去上清，沉淀用第一缓冲液进行重悬。
步骤B中将嗜肺军团菌血清1型抗原、肺炎支原体抗原、Q热立克次体抗原、羊抗鼠lgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上的具体方法为：分别取浓度均为1mg/ml的嗜肺军团菌血清1型抗原、肺炎支原体抗原、Q热立克次体抗原和羊抗鼠IgG，以1ul/cm，10cm/秒的速度分别喷涂到硝酸纤维的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上。
步骤1)和步骤2)中所述的干燥为37℃干燥3～5小时。
上述第一缓冲液为0.02M，pH7.4的PB缓冲液。上述第二缓冲液为0.02M，pH6.1的MES缓冲液。
上述九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒在使用时，将待测样品加入试剂盒的样品垫上，在第一试纸条玻璃纤维素膜上的量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体、量子点标记的Q热立克次体抗体混合物首先特异性的捕捉到待测样品中的肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体，然后在达到检测线3时，量子点标记的Q热立克次体抗体-Q热立克次体结合物与检测线3上的Q热立克次体抗原特异性结合；在检测线2时，量子点标记的肺炎支原体抗体-肺炎支原体结合物与检测线2上的肺炎支原体抗原特异性结合；在检测线1时，量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体-肺军团菌血清1型结合物与检测线1上的嗜肺军团菌血清1型抗原特异性结合；之后通过检测检测线1、检测线2和检测线3上是否存在量子点荧光效应，判断待测样品中嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体的阳性率。第二试纸条和第三试纸条按照的原理判断待测样品中肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1、2、3型的阳性率。综合这九项呼吸道感染病原体IgM抗体的阳性率，对患者的病因做出综合准确的诊断。
本发明九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒，以量子化标记肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体、量子点标记的Q热立克次体抗体、量子点标记的肺炎衣原体抗体、量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的呼吸道合胞病毒抗体、量子点标记的甲型流感病毒抗体、量子点标记的乙型流感病毒抗体和量子点标记的副流感病毒1、2、3型抗体包被在玻璃纤维素膜上，作为检测探针，利用间接法原理结合量子点的荧光特性实现了采用荧光免疫层析的方法对九项呼吸道感染病原体IgM抗体进行快速、特异、简便、灵敏的联合检测。本发明九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒检测线宽，检测灵敏度高。
本发明九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒的制备方法，操作简便，易于控制，适于工业化推广应用。
进一步优选的，本发明制备方法中，创新量子点标记技术，采用羧基化或氨基化改性的环糊精修饰量子点，然后将九项呼吸道感染病原体抗体分别结合在改性环糊精的羧基基团或氨基基团上，实现制备获得量子点标记的九项呼吸道感染病原体抗体。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
以下以嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体为例
实施例1
一种九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒，包括具有三个视窗壳体，所述壳体内放置第一试纸条、第二试纸条和第三试纸条，所述第一试纸条、第二试纸条和第三试纸条均包括塑料板、设置在塑料板上的玻璃纤维素膜、设置在玻璃纤维素膜上的硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上一端设有样本垫，对应的另一端设有吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线1、检测线2、检测线3和控制线；所述第一试纸条的玻璃纤维塑模上包被有质量比为1：1：1的量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体和量子点标记的Q热立克次体抗体的混合物；所述第一试纸条的检测线1上包被有嗜肺军团菌血清1型抗原，检测线2上包被有肺炎支原体抗原，检测线3上包被有Q热立克次体抗原；所述第二试纸条的玻璃纤维素膜上包被有质量比为1：1：1的量子点标记的肺炎衣原体抗体、量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的呼吸道合胞病毒抗体的混合物；所述第二试纸条的检测线1上包被有肺炎衣原体抗原，检测线2上包被有腺病毒抗原，检测线3上包被有呼吸道合胞病毒抗原；所述第三试纸条的玻璃纤维素膜上包被有质量比为1：1：1的量子点标记的甲型流感病毒抗体、量子点标记的乙型流感病毒抗体和量子点标记的副流感病毒抗体的混合物；所述第三试纸条检测线1上包被有甲型流感病毒抗原，检测线2上包被有乙型流感病毒抗原，检测线3上包被有副流感病毒抗原；所述第一试纸条、第二试纸条和第三试纸条的控制线上均包被有羊抗鼠IgG。所述量子点为硒化镉量子点。
本实施例九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒的制备方法，具体操作步骤为：
第一、制备第一试纸条：
1)制备玻璃纤维素膜：
a：取1ml未标记胶乳颗粒加入10ml，0.02M，pH7.4PB缓冲液中；离心机10000rpm离心20min；去掉上清液，再用10ml，0.02M，pH7.4PB缓冲液重悬沉淀颗粒物；之后再离心机10000rpm离心20min，去掉上清并用5ml0.02M，pH7.4，PB缓冲液重悬沉淀颗粒物，4℃保存待用；
b：取步骤a制备的胶乳颗粒用0.02M，pH6.1的MES缓冲液将胶乳颗粒稀释至10mg/ml，取0.05ml稀释后的胶乳颗粒悬浊液加入10mg羧基化改性环糊精，混匀24小时后，离心机8000rpm离心，弃去上清，并用0.02M，pH7.4的PB缓冲液重悬沉淀颗粒物，之后再次离心机8000rpm离心，弃去上清，沉淀颗粒物复溶于0.02M，pH7.4的PB缓冲液中，得羧基化改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；
c：取步骤b制备的羧基化改性环糊精-胶乳复合物悬浊液，用0.02M，pH6.1的MES缓冲液将其稀释至10mg/ml，取20ml稀释后的羧基化改性环糊精-胶乳复合悬浊液，加入20mg硒化镉量子点，混匀24小时，离心机8000rpm离心，弃去上清，并用0.02M，pH7.4的PB缓冲液重悬沉淀颗粒物，之后再次离心机8000rpm离心，弃去上清，沉淀颗粒物复溶于0.02M，pH7.4的PB缓冲液中，得量子点-羧基化改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；
d：取步骤c制备的量子点-羧基化改性环糊精-胶乳复合物悬浊液，用0.02M，pH6.1的MES缓冲液将其稀释至10mg/ml，然后按照量子点-羧基化改性环糊精-胶乳复合物与活化剂质量比1：10，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化15分钟后，8000rpm离心，弃去上清，并用0.02M，pH7.4的PB缓冲液重悬沉淀物颗粒，之后按照嗜肺军团菌血清1型抗体：量子点-羧基化改性环糊精-胶乳复合物＝1：20的比例加入嗜肺军团菌血清1型抗体，混匀3小时后，8000rpm离心15分钟，将沉淀物颗粒用封闭液重悬，室温混匀1小时，之后8000rpm离心15min，沉淀颗粒物复溶于分散液，即得量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体；
e：按照上述步骤a～c同样的方法制备量子点标记的肺炎支原体抗体、量子点标记的Q热立克次体抗体，然后将量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体、量子点标记的Q热立克次体抗体混合物，喷涂于玻璃纤维素模上，37℃干燥4小时，即得量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体、量子点标记的Q热立克次体抗体混合物标记的玻璃纤维素膜；
2)制备硝酸纤维素膜：取硝酸纤维素膜，间隔6mm依次划分检测线3、检测线2、检测线1和控制线，之后取浓度均为1mg/ml的嗜肺军团菌血清1型抗原、肺炎支原体抗原、Q热立克次体抗原、羊抗鼠IgG，以1ul/cm，10cm/秒的速度分别喷涂到硝酸纤维膜的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上，之后将硝酸纤维素膜放入牛血清白蛋白溶液中封闭，37℃干燥3小时，即得所述的硝酸纤维素膜；
3)组装：在塑料板上放置步骤1)制备的玻璃纤维素模，在步骤1)制备的玻璃纤维素膜上放置步骤2)制备的硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素的一端放置样品垫，对应的另一端放置吸水垫，37℃干燥5小时，即得所述的第一试纸条；
第二、按照上述第一试纸条同样的制备方法，制备第二试纸条和第三试纸条；
第三、将制备的第一试纸条、第二试纸条和第三试纸条对应的放入具有三个检视窗口的壳体内，每个试纸条的检测线对于在检视窗口的位置，用于荧光分析检测，即完成。
实施例2
本实施例九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒，与实施例1不同的地方在于，采用的量子点为硫化镉量子点，采用的改性环糊精为氨基化干性环糊精，制备量子化标记肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体、量子点标记的Q热立克次体抗体、量子点标记的肺炎衣原体抗体、量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的呼吸道合胞病毒抗体、量子点标记的甲型流感病毒抗体、量子点标记的乙型流感病毒抗体和量子点标记的副流感病毒1、2、3型抗体的过程中，在活化的量子点-改性环糊精-胶乳悬浊液中加入抗体或抗原的混匀时间为2小时，其他同实施例1。
实施例3
本实施例九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒，与实施例不同的地方在于，制备量子化标记肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体、量子点标记的Q热立克次体抗体、量子点标记的肺炎衣原体抗体、量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的呼吸道合胞病毒抗体、量子点标记的甲型流感病毒抗体、量子点标记的乙型流感病毒抗体和量子点标记的副流感病毒1、2、3型抗体的过程中，在活化的量子点-改性环糊精-胶乳悬浊液中加入抗体或抗原的混匀时间为4小时，其他同实施例1。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒的制备方法，其特征在于，该试剂盒包括具有三个视窗的壳体，所述壳体内放置第一试纸条、第二试纸条和第三试纸条，所述第一试纸条、第二试纸条和第三试纸条均包括塑料板、设置在塑料板上的玻璃纤维素膜、设置在玻璃纤维素膜上的硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上一端设有样本垫，对应的另一端设有吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线1、检测线2、检测线3和控制线；所述第一试纸条的玻璃纤维素膜上包被有量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体和量子点标记的Q热立克次体抗体的混合物；所述第一试纸条的检测线1上包被有嗜肺军团菌血清1型抗原，检测线2上包被有肺炎支原体抗原，检测线3上包被有Q热立克次体抗原；所述第二试纸条的玻璃纤维素膜上包被有量子点标记的肺炎衣原体抗体、量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的呼吸道合胞病毒抗体的混合物；所述第二试纸条的检测线1上包被有肺炎衣原体抗原，检测线2上包被有腺病毒抗原，检测线3上包被有呼吸道合胞病毒抗原；所述第三试纸条的玻璃纤维素膜上包被有量子点标记的甲型流感病毒抗体、量子点标记的乙型流感病毒抗体和量子点标记的副流感病毒抗体的混合物；所述第三试纸条检测线1上包被有甲型流感病毒抗原，检测线2上包被有乙型流感病毒抗原，检测线3上包被有副流感病毒抗原；所述第一试纸条、第二试纸条和第三试纸条的控制线上均包被有羊抗鼠IgG；
其制备方法包括以下操作步骤：
第一、制备第一试纸条：
1)原材料的制备：
A：制备玻璃纤维素膜：将量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体、量子点标记的Q热立克次体抗体混合包被在玻璃纤维素膜上，干燥，备用；
B：制备硝酸纤维素膜：取硝酸纤维素膜，间隔划分出检测线1、检测线2、检测线3和控制线，然后将嗜肺军团菌血清1型抗原、肺炎支原体抗原、Q热立克次体抗原、羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上，之后将包被后的硝酸纤维素膜放入封闭液中封闭，干燥，备用；
2)组装：在塑料板上放置步骤1)制备的玻璃纤维素膜，然后在步骤1)制备的玻璃纤维素膜上放置步骤1)制备的硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素的一端放置样品垫，对应的另一端放置吸水垫，干燥，即得第一试纸条；
第二、按照上述第一试纸条同样的制备方法制备第二试纸条和第三试纸条；
第三、将制备的第一试纸条、第二试纸条和第三试纸条放置在具有三个检测视窗的壳体内，即完成；
步骤A中还包括首先制备量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体、量子点标记的Q热立克次体抗体的混合物，具体方法包括以下操作步骤：
a：在胶乳颗粒悬浊液中加入改性环糊精，混匀24小时，纯化，得改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；
b：在步骤a制备的改性环糊精-胶乳复合物悬浊液中加入量子点，混匀24小时，纯化，得量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；
c：在步骤b制备的量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液中加入活化剂，活化15分钟，纯化，之后加入嗜肺军团菌血清1型抗体，混匀2～4小时后，离心得沉淀物颗粒，将沉淀物颗粒用封闭液重悬，室温混匀1小时，之后再进行纯化，即得量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体；
d：按照上述步骤a～c同样的方法制备量子点标记的肺炎支原体抗体、量子点标记的Q热立克次体抗体，然后将量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体和量子点标记的Q热立克次体抗体混合，备用。
2.如权利要求1所述的九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒的制备方法，其特征在于，所述改性环糊精为羧甲基化改性环糊精或氨基化改性环糊精。
3.如权利要求1所述的九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤a中所述改性环糊精与胶乳颗粒的质量比为20：1；步骤b中所述量子点与改性环糊精-乳胶复合物的质量比为10：1；步骤c中所述嗜肺军团菌血清1型抗体与量子点-改性环糊精-胶乳复合物的质量比为1：20。
4.如权利要求1所述的九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤A中将量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体、量子点标记的Q热立克次体抗体的混合物包被在玻璃纤维素膜上的具体方法为：将量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体和量子点标记的Q热立克次体抗体的混合物均匀喷涂于玻璃纤维素膜上。
5.如权利要求1所述的九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤B中将嗜肺军团菌血清1型抗原、肺炎支原体抗原、Q热立克次体抗原、羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上的具体方法为：分别取浓度均为1mg/ml的嗜肺军团菌血清1型抗原、肺炎支原体抗原、Q热立克次体抗原和羊抗鼠IgG，以1μl/cm，10cm/秒的速度分别喷涂到硝酸纤维素膜的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上。
6.一种九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒，其特征在于，由如权利要求1～5任一项所述的方法制备而成。
7.如权利要求6所述的九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒，其特征在于，所述量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体、量子点标记的Q热立克次体抗体的混合物中量子点标记的嗜肺军团菌血清1型抗体、量子点标记的肺炎支原体抗体、量子点标记的Q热立克次体抗体的质量比为1：1：1；所述量子点标记的肺炎衣原体抗体、量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的呼吸道合胞病毒抗体混合物中量子点标记的肺炎衣原体抗体、量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的呼吸道合胞病毒抗体的质量比也为1：1：1；所述量子点标记的甲型流感病毒抗体、量子点标记的乙型流感病毒抗体和量子点标记的副流感病毒抗体混合物中量子点标记的甲型流感病毒抗体、量子点标记的乙型流感病毒抗体和量子点标记的副流感病毒抗体的质量比也为1：1：1。
8.如权利要求6所述的九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒，其特征在于，所述量子点为硒化镉或硫化镉量子点。
9.如权利要求6所述的九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上设置的检测线1与检测线2之间、检测线2与检测线3之间、检测线1与控制线之间的间隔均不小于5mm。
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