CN111579782B - 一种智能化荧光多标记物的生物医学检测方法 - Google Patents

一种智能化荧光多标记物的生物医学检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种智能化荧光多标记物的非诊断目的生物医学检测方法，包括以下步骤：制备量子点免疫荧光层析检测卡，检测卡包括底板，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫，结合垫上设有荧光微球标记的抗原蛋白，硝酸纤维膜设有一条包被单克隆抗体的质控C线，及两条包被抗IgM、IgG抗体的检测T1、T2线，将制备的量子点免疫层析检测卡安装在检测装置中，蓝牙模块负责采集所述的检测模块的多光谱数据，经过数字滤波、快速傅里叶变换、特征量提取、浓度反演等运算后将结果显示在OLED显示模块上；本发明采用不同发射波长的量子点荧光标记技术结合智能化的荧光检测和蓝牙传输技术，具有低成本、小型化、数字显示、蓝牙传输等优点。

Description

一种智能化荧光多标记物的生物医学检测方法
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，具体为一种智能化荧光多标记物的生物医学检测方法。
背景技术
免疫层析膜条检测技术是一种快速方便的检测技术。通过肉眼观察膜条上的显色条带实现对待测物的定性或定量分析。目前多选用胶体金标记方法，但无论从灵敏度、量化检测还是多标志物联检方面还存在一定的限制。从发光标记物的差别上讲，量子点作为荧光标记物与传统的胶体金染料分子相比具有多种优势。量子点作为无机微晶体能够承受多次激发光而发射不同波长的信号；而且量子点具有丰富的颜色，可以用同一激发光激发而产生多种可辨别的信号。与传统胶体金试纸相比，量子点荧光免疫层析试膜条在具备更高定量检测灵敏度优势的同时，对定量仪器要求也较低。
目前，基于免疫荧光的生物医学检测法存在以下不足：
1)采用单独的试纸条外加各种荧光读取装置来实现检测，每一次检测都需要插入到相应的高昂的试纸阅读器(检测仪器)中进行扫描或者拍照检测，最后生成检测结果；
2)目前大多数的生物医学检测，特别是用于检测新冠病毒(COVID-19)、严重急性呼吸综合征(SARS)、埃博拉、季节性流感等病毒抗体(不限于此)的产品均为单一标志物检测，不能满足在不同病毒抗体进行甄别性的检测需求，只能采用多种试纸和多种阅读器进行繁琐和复杂的检测。
3)成本高，智能化程度低，不易于网络化和信息化的管理
基于此，本发明设计了一种智能化荧光多标记物的生物医学检测方法，以解决上述提到的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种智能化荧光多标记物的生物医学检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种智能化荧光多标记物的生物医学检测方法，包括以下步骤：
S1，制备量子点免疫荧光层析检测卡，检测卡包括底板，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫，结合垫上设有荧光微球标记的抗原蛋白，硝酸纤维膜设有一条包被单克隆抗体的质控C线，及两条包被抗IgM、IgG抗体的检测T1、T2线；
S11，样品垫的制备方法为：
(1)配制样品垫处理液：硼酸盐100mM，Triton X1001.0％，PVP40k 0.2％，pH9.2，
(2)将样品垫浸泡于步骤(1)中制备的样本垫处理液中60min，然后取出晾干；
S12，结合垫的制备方法为：
(1)配制结合垫处理液：BSA 0.5％(w/v)，PVP10，000 0.25％(w/v)，Triton X1000.1％(v/v)，pH 8.0，
(2)将结合垫浸泡于步骤(1)中制备的处理液中60min，拿出后室温晾干，
(3)将荧光微球标记的抗原蛋白溶液用结合垫处理液稀释5倍，
(4)将结合垫浸泡在步骤(3)溶液中60min，取出后室温晾干；
S13，硝酸纤维膜的制备方法为：
用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将COVID-19抗体稀释到0.6mg/mL，即为C质控线工作液，
用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将抗IgM单克隆抗体稀释到0.6mg/mL，即为T1检测线工作液，
用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将抗IgG单克隆抗体稀释到0.6mg/mL，即为T2检测线工作液，
在底板上粘贴硝酸纤维膜，在硝酸纤维膜上划T1、T2线和C线，划线浓度均为1μL/cm，完成后将片材放置在37℃干燥箱中干燥过夜；
S14，荧光微球标记的抗原蛋白制备方法为：
稀释荧光微球：取一离心管，加入1mL标记缓冲液0.1M MES缓冲液，加入荧光微球1mg，涡旋混匀，
微球的活化：在步骤(1)离心管中加入20μL-50μL标记活化剂A和20μL-50μL标记活化剂B，旋转培养器上反应30min，
清洗：将活化后的荧光微球加入到超滤离心管中，3500rmp离心10min，弃滤液，加入1.8mL清洗液A到超滤离心管中，3500rmp离心10min，弃滤液，重复用清洗液A重复两次，
抗体的标记：将超滤离心管收集的量子点加入150μL重悬液重悬，加入50μL抗体溶液，旋转培养器上反应120min，
清洗：将标记完抗体的微球加入到超滤离心管(100kd)中，3500rmp离心10min，弃滤液，加入1.8mL清洗液B到超滤离心管中，3500rmp离心10min，弃滤液，重复用清洗液B重复俩次，
封闭：加入200μL标记封闭液，超声2s，间歇5s，重复3次，超声完成后置于旋转培养器上反应60min；
S2，制备量子点免疫荧光层析检测卡安装在检测装置中，标定好特征量比值参量与浓度曲线关系，并将标的系数存于内部Flash中，求解待检测卡的抗原或抗体浓度；
S3，滴入待测样本待反应一定时间后，打开电源，启动检测，蓝牙模块中CPU信号产生调制信号驱动激发光源驱动模块，调制后的出射光信号入射到荧光免疫层析检测试剂条的C线、T1线和T2线，量子点标记物后被激发光源激发后，辐射出荧光信号被多光谱探测模块转换为数字信号，最后由CPU读取到内部进行运算；量子点免疫荧光试纸条采用三种不同荧光光谱波长进行标记，其中将固定在C线和T1和T2线上的荧光波长为465nm作为参考波长，而将发射波长为525nm和615nm的量子点作为抗原或抗体标记物；
S4，首先将CPU获取到的多光谱信号通过通信接口方式将数据传输至计算机中，利用MATLAB软件采用小波滤波算法对多光谱信号进行模拟软阈值滤波处理，优化滤波器好参数后，将系数保存在CPU的内部，其次，将获取得到的多光谱信号与优化好的小波滤波系数做分块卷积运算，得到滤波后多光谱数据，小波滤波算法可以有效去除光源噪声和探测器噪声，提高探测灵敏度；
S5，对经过滤波后的多光谱信号进行数字解调，即采用快速傅里叶变换求得多光谱信号的频谱，提取基频、三次谐波成分、五次谐波成分及七次谐波成分的幅度值作为特征量，将465nm波长信号作为参考波长，求得测量波长525nm及615nm与参考波长的特征量比值参量；
S6，将实际测量特征量比值参量代入标定系数，并将各谐波结果进行求平均，分别得到C线和T线强度参量，根据试纸条C线与T线关系IT/IC＝常数，其中IC为C线的平均强度，IT为T线的平均强度，得到荧光免疫层析定量检测最后结果；
S7，CPU将结果传送至所述的OLED显示模块上，同时将测量结果通过蓝牙接口传输至移动设备。
优选的，所述标记活化剂A为含50mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺的0.05M的MES缓冲液，所述标记活化剂B为含50mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的0.05M MES缓冲液。
优选的，所述清洗液A为0.05M的MES缓冲液，所述清洗液B为0.01M的PBS缓冲液。
优选的，所述标记封闭液为含0.1％人血清白蛋白的0.2M甘氨酸缓冲液，所述重悬液为0.01M的PBS缓冲液。
优选的，所述检测装置包括包括量子点免疫荧光层析检测卡、荧光检测模块、纽扣电池、OLED显示模块和蓝牙模块。
优选的，所述荧光检测模块包括紫外LED光源、光学装置和低成本多光谱传感器，所述纽扣电池为可拆卸3.3V锂电池或碱性电池，负责为荧光测测模块、OLED显示模块、蓝牙模块提供电源。
优选的，所述蓝牙模块为低功耗集成CPU和蓝牙协议栈的单芯片BLUENRG2构成，负责采集所述的检测模块的多光谱数据，并在CPU内部经过数字滤波、快速傅里叶变换、特征量提取、浓度反演等运算后将结果显示在所述的OLED显示模块上，同时将测量结果通过蓝牙接口传输至移动设备。
优选的，所述荧光检测模块出射光采用PWM调制方式，利用PWM的频率对光源进行信号调制，利用占空比控制出射光的强度，出射光通过光学装置垂直入射到C、T1线和T2线上，被反射后的光通过与入射成一定角度的导光孔入射到低成本的低成本多光谱传感器。
优选的，所述低成本多光谱传感器由具有多种不同波长增透特性的光电探测器阵列构成，采用中心波长分别为465nm、525nm及615nm，带宽为20nm的滤波片构成的CCD探测阵列，为了提高探测效率，采用每个波长通道均由3个像元构成，多光谱探测为3个以上窄带探测光谱区域。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明操作步骤简单，对样品不需要预处理，只需要采人类全血直接滴入，加入三滴展开液即可检测，检测速度快，10分钟出结果。
2、本发明通过对样品垫处理液和标记荧光微球稀释液的优化，相比传统工艺，灵敏度明显高，最低检测限(LOD)可达到0.88mg/L，线性更好，线性曲线的决定系数大于0.99；重复性好，低中高三个水平质控，变异系数均低于10％(8.4％、8.2％和6.3％)。
3、本发明对结合垫、硝酸纤维膜制备过程严格考究、优化，进一步提高了检测卡的精密度与可靠性。
4、本发明不仅可实现多标志物检测，而且还集成了低成本、数字化的荧光检测功能，并且检测结果可通过蓝牙方式发送至移动设备端的APP进行显示和存储。
5、本发明具备荧光层析试纸条和检测为一体，不需要额外的专用量子点荧光层析检测仪器就可实现采样、反应、检测、数字化结果显示及无线通信功能，还具备低成本、一次性或者通过更换内部试纸进行多次检测优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明检测试剂卡示意图；
图2为本发明检测卡原理图；
图3为本发明探测器模型示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种智能化荧光多标记物的生物医学检测方法技术方案：包括以下步骤：
S1，制备量子点免疫荧光层析检测卡，检测卡包括底板，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫，结合垫上设有荧光微球标记的抗原蛋白，硝酸纤维膜设有一条包被单克隆抗体的质控C线，及两条包被抗IgM、IgG抗体的检测T1、T2线；
S11，样品垫的制备方法为：
(1)配制样品垫处理液：硼酸盐100mM，Triton X100 1.0％，PVP40k 0.2％，pH9.2，
(2)将样品垫浸泡于步骤(1)中制备的样本垫处理液中60min，然后取出晾干；
S12，结合垫的制备方法为：
(1)配制结合垫处理液：BSA 0.5％(w/v)，PVP10，000 0.25％(w/v)，Triton X1000.1％(v/v)，pH 8.0，
(2)将结合垫浸泡于步骤(1)中制备的处理液中60min，拿出后室温晾干，
(3)将荧光微球标记的抗原蛋白溶液用结合垫处理液稀释5倍，
(4)将结合垫浸泡在步骤(3)溶液中60min，取出后室温晾干；
S13，硝酸纤维膜的制备方法为：
用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将COVID-19抗体稀释到0.6mg/mL，即为C质控线工作液，
用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将抗IgM单克隆抗体稀释到0.6mg/mL，即为T1检测线工作液，
用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将抗IgG单克隆抗体稀释到0.6mg/mL，即为T2检测线工作液，
在底板上粘贴硝酸纤维膜，在硝酸纤维膜上划T1、T2线和C线，划线浓度均为1μL/cm，完成后将片材放置在37℃干燥箱中干燥过夜；
S14，荧光微球标记的抗原蛋白制备方法为：
稀释荧光微球：取一离心管，加入1mL标记缓冲液0.1M MES缓冲液，加入荧光微球1mg，涡旋混匀，
微球的活化：在步骤(1)离心管中加入20μL-50μL标记活化剂A和20μL-50μL标记活化剂B，旋转培养器上反应30min，
清洗：将活化后的荧光微球加入到超滤离心管中，3500rmp离心10min，弃滤液，加入1.8mL清洗液A到超滤离心管中，3500rmp离心10min，弃滤液，重复用清洗液A重复两次，
抗体的标记：将超滤离心管收集的量子点加入150μL重悬液重悬，加入50μL抗体溶液，旋转培养器上反应120min，
清洗：将标记完抗体的微球加入到超滤离心管(100kd)中，3500rmp离心10min，弃滤液，加入1.8mL清洗液B到超滤离心管中，3500rmp离心10min，弃滤液，重复用清洗液B重复俩次，
封闭：加入200μL标记封闭液，超声2s，间歇5s，重复3次，超声完成后置于旋转培养器上反应60min；
S2，制备量子点免疫荧光层析检测卡安装在检测装置中，标定好特征量比值参量与浓度曲线关系，并将标的系数存于内部Flash中，求解待检测卡的抗原或抗体浓度；
S3，滴入待测样本待反应一定时间后，打开电源，启动检测，蓝牙模块中CPU信号产生调制信号驱动激发光源驱动模块，调制后的出射光信号入射到检测试剂条的C线、T1和T2线，量子点标记物后被激发光源激发后，辐射出荧光信号被多光谱探测模块转换为数字信号，最后由CPU读取到内部进行运算；量子点免疫荧光试纸条采用三种不同荧光光谱波长进行标记，其中将固定在C线和T1和T2线上的荧光波长为465nm作为参考波长，而将发射波长为525nm和615nm的量子点作为抗原或抗体标记物；
S4，首先将CPU获取到的多光谱信号通过通信接口方式将数据传输至计算机中，利用MATLAB软件采用小波滤波算法对多光谱信号进行模拟软阈值滤波处理，优化滤波器好参数后，将系数保存在CPU的内部，其次，将获取得到的多光谱信号与优化好的小波滤波系数做分块卷积运算，得到滤波后多光谱数据，小波滤波算法可以有效去除光源噪声和探测器噪声，提高探测灵敏度；
S5，对经过滤波后的多光谱信号进行数字解调，即采用快速傅里叶变换求得多光谱信号的频谱，提取基频、三次谐波成分、五次谐波成分及七次谐波成分的幅度值作为特征量，将465nm波长信号作为参考波长，求得测量波长525nm及615nm与参考波长的特征量比值参量；
S6，将实际测量特征量比值参量代入标定系数，并将各谐波结果进行求平均，分别得到C线和T线强度参量，根据试纸条C线与T线关系：IT/IC＝常数，其中IC为C线的平均强度，IT为T线的平均强度，得到荧光免疫层析定量检测最后结果(检测线T1和T2计算方法类似)；
S7，CPU将结果传送至所述的OLED显示模块上，同时将测量结果通过蓝牙接口传输至移动设备。
其中，所述标记活化剂A为含50mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺的0.05M的MES缓冲液，所述标记活化剂B为含50mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的0.05M MES缓冲液；所述清洗液A为0.05M的MES缓冲液，所述清洗液B为0.01M的PBS缓冲液；所述标记封闭液为含0.1％人血清白蛋白的0.2M甘氨酸缓冲液，所述重悬液为0.01M的PBS缓冲液。
其中，所述检测装置包括包括量子点免疫荧光层析检测卡、荧光检测模块、纽扣电池、OLED显示模块和蓝牙模块，所述荧光检测模块包括紫外LED光源、光学装置和低成本多光谱传感器，所述纽扣电池为可拆卸3.3V锂电池或碱性电池，负责为荧光测测模块、OLED显示模块、蓝牙模块提供电源。
其中，所述蓝牙模块为低功耗集成CPU和蓝牙协议栈的单芯片BLUENRG2构成，负责采集所述的检测模块的多光谱数据，并在CPU内部经过数字滤波、快速傅里叶变换、特征量提取、浓度反演等运算后将结果显示在所述的OLED显示模块上，同时将测量结果通过蓝牙接口传输至移动设备。
其中，所述荧光检测模块出射光采用PWM调制方式，利用PWM的频率对光源进行信号调制，利用占空比控制出射光的强度，出射光通过光学装置垂直入射到C和T线上，被反射后的光通过与入射成一定角度的导光孔入射到低成本的低成本多光谱传感器。
其中，所述低成本多光谱传感器由具有多种不同波长增透特性的光电探测器阵列构成，采用中心波长分别为465nm、525nm及615nm，带宽为20nm的滤波片构成的CCD探测阵列，为了提高探测效率，采用每个通道均由2-3个像元构成，多光谱探测为3个以上窄带探测光谱区域。
实施例1
参阅图1-3，包括壳体7，壳体7内检测试纸条，试纸条包括底板，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫，结合垫上设有荧光微球标记的COVID-19抗原蛋白，硝酸纤维膜设有一条包被COVID-19单克隆抗体的质控C线，以及俩条包被抗IgM、IgG抗体的检测T1、T2线。壳体7上设有与样品垫相适配的加样孔72，与结合垫相适配的观察窗口71，壳体7上表面还设有防滑条73，方便试剂卡的取出与放入。检测卡匹配荧光检测模块(图3)，荧光检测模块包括紫外LED光源、光学装置、低成本多光谱传感器；纽扣电池为可拆卸3.3V锂电池或碱性电池，负责为荧光检测模块、OLED显示模块、蓝牙模块提供电源；OLED显示模块为检测结果提供数字化的检测结果显示；蓝牙模块负责采集荧光检测模块的多光谱数据，经过数字滤波、快速傅里叶变换、特征量提取、浓度反演等运算后将结果显示在OLED显示模块上，同时将测量结果通过蓝牙接口传输至移动设备。
检测方法：取10μL加入含有990μL样品稀释液(0.01M PBS(pH7.4)缓冲液)的样品管中，充分混匀；吸取稀释后的样本100μL。滴入待测样本待反应10min，在此之前打开电源，启动检测，所述的蓝牙模块中CPU信号处理模块产生调制信号驱动所述的激发光源驱动模块，调制后的出射光信号入射到荧光免疫层析试剂条的C线和T线后，量子点标记物后被激发光源激发后，辐射出荧光信号被多光谱探测模块转换为数字信号，最后由CPU读取到内部进行运算。
实施例2
参阅图1-3，在温度18-26℃、湿度≤30％的环境下进行装配，在底板上依次衔接有硝酸纤维膜、吸水垫、结合垫和样品垫；将粘贴好的大板切成4.0mm宽的试纸条，装入塑料卡壳7内，即检测卡；一个检测卡配一个探测器，将每一检测卡置于铝膜袋中，加入干燥剂1包，热合封口备用。
检测方法：采用紫外灯照射，用手持式紫外线灯照射观察窗口，当质控线和检测线T1都有量荧光出现时，说明样品中IgM抗体阳性；当质控线和检测线T2都有量荧光出现时，说明样品中IgG抗体阳性；当质控线和检测线T1、T2都有量荧光出现时，说明样品中IgM、IgG抗体阳性；当只有质控线有量荧光出现时，说明样品中IgM、IgG抗体阴性，当质控线未出现荧光，则代表操作有误或检测结果无效，需重复试验。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (5)

1.一种智能化荧光多标记物的非诊断目的生物医学检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1，制备量子点免疫荧光层析检测卡，检测卡包括底板，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫，结合垫上设有荧光微球标记的抗原蛋白，硝酸纤维膜设有一条包被单克隆抗体的质控C线，及两条包被抗IgM、IgG抗体的检测T1、T2线；
S11，样品垫的制备方法为：
(1)配制样品垫处理液：硼酸盐100mM，Triton X1001.0％，PVP40k 0.2％，pH9.2，
(2)将样品垫浸泡于步骤(1)中制备的样本垫处理液中60min，然后取出晾干；
S12，结合垫的制备方法为：
(1)配制结合垫处理液：BSA 0.5％，PVP100000.25％，Triton X1000.1％，pH 8.0，
(2)将结合垫浸泡于步骤(1)中制备的处理液中60min，拿出后室温晾干，
(3)将荧光微球标记的抗原蛋白溶液用结合垫处理液稀释5倍，
(4)将结合垫浸泡在步骤(3)溶液中60min，取出后室温晾干；
S13，硝酸纤维膜的制备方法为：
(1)用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将COVID-19抗体稀释到0.6mg/mL，即为C质控线工作液，
(2)用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将抗IgM单克隆抗体稀释到0.6mg/mL，即为T1检测线工作液，
(3)用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将抗IgG单克隆抗体稀释到0.6mg/mL，即为T2检测线工作液，
(4)在底板上粘贴硝酸纤维膜，在硝酸纤维膜上划T1、T2线和C线，划线浓度均为1μL/cm，完成后将片材放置在37℃干燥箱中干燥过夜；
S14，荧光微球标记的抗原蛋白制备方法为：
(1)稀释荧光微球：取一离心管，加入1mL标记缓冲液0.1MMES缓冲液，加入荧光微球1mg，涡旋混匀，
(2)微球的活化：在步骤(1)离心管中加入20μL-50μL标记活化剂A和20μL-50μL标记活化剂B，旋转培养器上反应30min，
(3)清洗：将活化后的荧光微球加入到超滤离心管中，3500rmp离心10min，弃滤液，加入1.8mL清洗液A到超滤离心管中，3500rmp离心10min，弃滤液，重复用清洗液A重复两次，
(4)抗体的标记：将超滤离心管收集的量子点加入150μL重悬液重悬，加入50μL抗体溶液，旋转培养器上反应120min，
(5)清洗：将标记完抗体的微球加入到超滤离心管中，3500rmp离心10min，弃滤液，加入1.8mL清洗液B到超滤离心管中，3500rmp离心10min，弃滤液，重复用清洗液B重复两次，
(6)封闭：加入200μL标记封闭液，超声2s，间歇5s，重复3次，超声完成后置于旋转培养器上反应60min；
S2，制备量子点免疫荧光层析检测卡安装在检测装置中，标定好特征量比值参量与浓度曲线关系，并将标的系数存于内部Flash中，求解待检测卡的抗体浓度；
所述检测装置包括量子点免疫荧光层析检测卡、荧光检测模块、纽扣电池、OLED显示模块和蓝牙模块；
所述荧光检测模块包括紫外LED光源、光学装置和低成本多光谱传感器，所述纽扣电池为可拆卸3.3V锂电池或碱性电池，负责为荧光检测模块、OLED显示模块、蓝牙模块提供电源；
所述蓝牙模块为低功耗集成CPU和蓝牙协议栈的单芯片BLUENRG2构成，负责采集检测模块的多光谱数据，并在CPU内部经运算后将结果显示在OLED显示模块上，同时将测量结果通过蓝牙接口传输至移动设备；
所述荧光检测模块出射光采用PWM调制方式，利用PWM的频率对光源进行信号调制，利用占空比控制出射光的强度，出射光通过光学装置垂直入射到C、T1和T2线上，被反射后的光通过与入射成一定角度的导光孔入射到低成本的低成本多光谱传感器；
S3，滴入待测样本待反应一定时间后，打开电源，启动检测，蓝牙模块中CPU信号产生调制信号驱动激发光源驱动模块，调制后的出射光信号入射到检测试剂条的C线、T1线和T2线，量子点标记物后被激发光源激发后，辐射出荧光信号被多光谱探测模块转换为数字信号，最后由CPU读取到内部进行运算；量子点免疫荧光试纸条采用三种不同荧光光谱波长进行标记，其中将固定在C线和T1和T2线上的荧光波长为465nm作为参考波长，而将发射波长为525nm和615nm的量子点作为抗体标记物；
S4，首先将CPU获取到的多光谱信号通过通信接口方式将数据传输至计算机中，利用MATLAB软件采用小波滤波算法对多光谱信号进行模拟软阈值滤波处理，优化滤波器参数后，将系数保存在CPU的内部，其次，将获取得到的多光谱信号与优化好的小波滤波系数做分块卷积运算，得到滤波后多光谱数据，小波滤波算法可以有效去除光源噪声和探测器噪声，提高探测灵敏度；
S5，对经过滤波后的多光谱信号进行数字解调，即采用快速傅里叶变换求得多光谱信号的频谱，提取基频、三次谐波成分、五次谐波成分及七次谐波成分的幅度值作为特征量，将465nm波长信号作为参考波长，求得测量波长525nm及615nm与参考波长的特征量比值参量；
S6，将实际测量特征量比值参量代入标定系数，并将各谐波结果进行求平均，分别得到C线和T线强度参量，根据试纸条C线与T线关系IT/IC＝常数，其中IC为C线的平均强度，IT为T线的平均强度，得到荧光免疫层析定量检测最后结果；
S7，CPU将结果传送至OLED显示模块上，同时将测量结果通过蓝牙接口传输至移动设备。
2.根据权利要求1所述的一种智能化荧光多标记物的非诊断目的生物医学检测方法，其特征在于：所述标记活化剂A为含50mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺的0.05M的MES缓冲液，所述标记活化剂B为含50mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的0.05M MES缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种智能化荧光多标记物的非诊断目的生物医学检测方法，其特征在于：所述清洗液A为0.05M的MES缓冲液，所述清洗液B为0.01M的PBS缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一种智能化荧光多标记物的非诊断目的生物医学检测方法，其特征在于：所述标记封闭液为含0.1％人血清白蛋白的0.2M甘氨酸缓冲液，所述重悬液为0.01M的PBS缓冲液。
5.根据权利要求1所述的一种智能化荧光多标记物的非诊断目的生物医学检测方法，其特征在于：所述低成本多光谱传感器由具有多种不同波长增透特性的光电探测器阵列构成，采用中心波长分别为465nm、525nm及615nm，带宽为20nm的滤波片构成的CCD探测阵列，为了提高探测效率，采用每个波长通道均由3个像元构成，多光谱探测为3个以上窄带探测光谱区域。
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