CN105181661A

CN105181661A - 荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒

Info

Publication number: CN105181661A
Application number: CN201510487338.9A
Authority: CN
Inventors: 李奎; 李静辉; 陶占领; 王菁; 付青山; 刘功成; 付光宇; 吴学炜
Original assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Current assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority date: 2015-08-11
Filing date: 2015-08-11
Publication date: 2015-12-23

Abstract

本发明公开了一种荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒，包括试纸条、量子点标记液；试纸条由按次序粘贴在衬板上的吸水纸、硝酸纤维素膜和样品垫构成，硝酸纤维素膜检测线T₁和检测线T₂上分别包被有弓形虫抗原，质控线C上包被有羊抗鼠IgG多抗；量子点标记液是量子点标记的鼠抗人IgG抗体及量子点标记的鼠抗人IgM(μ链)抗体的混合溶液。本发明采用免疫层析荧光定量检测技术，可以有效区分弓形虫既往感染和/或近期感染状态，弥补了我国对弓形虫IgG、IgM抗体的快速定量检测，满足了基层医院、社区医疗服务站、临床科室、门诊等对弓形虫IgG、IgM抗体的即时检测。

Description

荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫分析领域，尤其是涉及一种荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒。

背景技术

弓形虫(Toxoplasmagondii，TOX)是寄生于人和哺乳动物组织细胞内的机会性致病原虫，它引起的弓形体病（toxoplasmpsis）是一种人畜共患病，广泛流行于世界各地。人感染弓形虫后可侵犯多种脏器，其临床表现因侵犯脏器不同而异，孕妇感染弓形虫可能会对胎儿造成严重后果。一般在怀孕的前3个月胎儿的感染率较低（约17%），最常见的是流产，很少对胎儿造成严重伤害，第4-6个月感染会对胎儿造成中级或严重的伤害，妊娠后期感染时弓形虫易于通过胎盘，感染率较高（约64%），但此时胎儿抵抗力较高，损害则较轻。感染婴儿有的出生时症状并不明显，以后才逐渐出现，先天性患者以中枢神经系统和眼症状为多见。另外当机体出现免疫抑制后，潜伏期感染会被激活，在艾滋病人群中，弓形虫脑炎已成为最关键的、也是最终的致死病因。

直接取患者的体液或组织样本做瑞氏或姬氏染色镜检可找到弓形虫滋养体或包囊，但阳性率不高，也可作直接免疫荧光法检查组织内弓形虫。循环抗原（CAg）为弓形虫在宿主内增殖过程中的代谢和裂解物，在弓形虫感染早期、急性期或活动期的血清及体液中有较高的含量，因此，CAg抗原的检测可作为弓形虫现症感染的辅助诊断方法，但是弓形虫病的虫血症短暂，所以检测抗原血症的实用性有待研究。相比之下IgM和IgG抗体的检测是目前普及的主要方法，IgM抗体一般在感染1周后出现，4～8周逐渐消失，是近期感染的指标，IgG抗体一般在感染2周后出现，可持续多年，是既往感染的指标。

目前，弓形虫IgG、IgM抗体检测有免疫荧光法、ELISA法、胶体金法等技术。免疫荧光法需要荧光显微镜，检测价格昂贵、费时；ELISA法需要专用设备，反应时间比较长，检测步骤繁杂；胶体金法灵敏度和特异性较低，应用受到限制。量子点是一种直径在1~100nm之间，能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒，具有宽激发、窄发射、发射峰可调以及荧光寿命长等优良特性。近年来，在医学、生物学领域，人们集中研究用量子点代替传统的化学荧光标记物用于免疫学检测。根据量子点的这些光学特点，以其标记单克隆抗体建立免疫吸附技术来定量检测病原体，将大大提高检测方法的灵敏度和特异性，比较适合基层医院、社区医疗服务站、临床科室、门诊等即时检测。但截至目前，利用荧光量子点标记技术针对弓形虫IgG、IgM抗体进行快速定量检测的试剂盒在我国还是空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测灵敏度高、特异性好且检测过程快速简单、不需要复杂仪器的荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒，包括试纸条、量子点标记液；所述试纸条由按次序粘贴在衬板上的吸水纸、硝酸纤维素膜和样品垫构成，所述硝酸纤维素膜检测线T₁和检测线T₂上分别包被有弓形虫抗原，质控线C上包被有羊抗鼠IgG多抗；所述量子点标记液是量子点标记的鼠抗人IgG抗体及量子点标记的鼠抗人IgM(μ链)抗体的混合溶液。

所述硝酸纤维素膜检测线T₁和检测线T₂上包被的为弓形虫抗原SAG1和SAG2，其浓度为0.5～0.8mg/ml、包被量为1.0μl/cm。

所述硝酸纤维素膜质控线C上包被的羊抗鼠IgG多抗的浓度为1.0～1.5mg/ml、包被量1.0μl/cm。

所述量子点为5～20nm的微球，量子点表面的活性基团为-COOH或-NH2，激发波长300～330nm，发射峰位400～620nm。

所述的量子点标记液采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC)与N-羟基丁二酰亚胺（NHS）共价交联方式标记鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM(μ链)抗体的混合溶液。

所述量子点标记的鼠抗人IgG抗体标记浓度为5～10μg/ml。

所述量子点标记的鼠抗人IgM(μ链)抗体标记浓度为5～10μg/ml。

本发明采用免疫层析荧光定量检测技术，利用量子点标记的鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM(μ链)抗体与样本中弓形虫IgG抗体、IgM抗体充分结合，然后再分别与硝酸纤维素膜检测线T₁和检测线T₂包被的分别被不同位点的弓形虫抗原发生特异性结合（SAG1被弓形虫IgG抗体特异性识别、SAG2被IgM抗体特异性识别），可以有效区分弓形虫既往感染和/或近期感染状态，弥补了我国对弓形虫IgG、IgM抗体的快速定量检测，满足了基层医院、社区医疗服务站、临床科室、门诊等对弓形虫IgG、IgM抗体的即时检测。

附图说明

图1是本发明试剂盒中试纸条的结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做更加详细的阐述。

本发明所述的荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒，包括试纸条、量子点标记液；如图1所示，试纸条由按次序粘贴在PVC衬板1上的吸水纸2、硝酸纤维素膜3和样品垫4构成，硝酸纤维素膜检测线T₁5和检测线T₂6上分别包被有弓形虫抗原，质控线C7上包被有羊抗鼠IgG多抗；量子点标记液是量子点标记的鼠抗人IgG抗体及量子点标记的鼠抗人IgM(μ链)抗体的混合溶液。

一、本发明试剂盒的制备方法为：

1、硝酸纤维素膜检测线T₁、检测线T₂和质控线C包被

将弓形虫抗原SAG1用pH8.0、0.01M的TBS缓冲液稀释至0.5～0.8mg/ml，作为检测线T₁的包被液，将弓形虫抗原SAG2用pH8.0、0.01M的TBS缓冲液稀释至0.5～0.8mg/ml，作为检测线T₂的包被液，羊抗鼠IgG多抗用pH7.5、0.01M的PBS缓冲液稀释至1.0～1.5mg/ml，作为质控线C的包被液；使用试纸条专用三线划膜仪将检测线T1、T₂的包被液和质控线C的包被液分别包被到贴在PVC衬板上的硝酸纤维素膜上，置于恒温干燥箱37℃干燥2h以上；

2、量子点标记液的制备

量子点的活化：取-COOH活性基团的量子点0.5mg放入到10ml玻璃瓶中，加入0.01mol/mLPBS缓冲液5mL，震荡均匀，加入20mg/mLEDC溶液（pH7.0）和20mg/mLNHS溶液（pH7.0）各50μL活化量子点，置于振荡器上，反应30min～1h，放置于2～8℃备用；

量子点标记鼠抗人IgG抗体的制备：将活化后的量子点在50赫兹条件下超声5min，然后加入8ug/mL鼠抗人IgG抗体，置于振荡器上反应1～2h，用低温高速离心机10000rpm离心20min，弃去上清，将沉淀用含有1%牛血清白蛋白的量子点保存液2mL在50赫兹条件下超声5min，封闭量子点表面的-COOH，置于振荡器上混匀30min，用低温高速离心机10000rpm离心20min，弃去上清，最后加入3ml量子点保存液保存，置于2～8℃备用；

量子点标记鼠抗人IgM(μ链)抗体的制备：将活化后的量子点在50赫兹条件下超声5min，然后加入8ug/mL鼠抗人IgM(μ链)抗体，置于振荡器上反应1～2h，用低温高速离心机10000rpm离心20min，弃去上清，将沉淀用含有1%牛血清白蛋白的量子点保存液2mL在50赫兹条件下超声5min，封闭量子点表面的-COOH，置于振荡器上混匀30min，用低温高速离心机10000rpm离心20min，弃去上清，最后加入3ml量子点保存液保存，置于2～8℃备用；

量子点标记液混合：标记好的量子点鼠抗人IgG抗体和量子点标记鼠抗人IgM(μ链)抗体按照1:1体积比混合，分装于棕色塑料滴瓶中，200μl/瓶。

3、试纸条组装

将吸水纸2、样品垫4按图1中顺序粘贴在贴有硝酸纤维素膜3的PVC衬板1上，相邻部位连接处重叠2mm宽，便于免疫层析反应的进行，组装好的试纸条用切条机切割成4.0mm宽的试纸条，然后装入检测卡中扣紧即可。

二、本发明试剂盒联合检测弓形虫IgG、IgM抗体的方法为（本发明试剂盒针对的标本为人全血、血清和血浆）：

用移液器向装有量子点标记液的棕色塑料滴瓶加入10μL样品，缓慢混匀30s～1min，然后滴加2滴到加样窗中，不要带气泡，开始层析反应；待层析反应进行15分钟后，用免疫荧光检测仪读取测试结果。样本测试时，免疫荧光检测仪将检测线T₁的荧光信号值与质控线C荧光信号值的比值(T₁/C)与仪器中内置的校准品浓度的半对数直线方程式做曲线拟合并进行样本浓度的运算，将检测线T₂荧光信号值与质控线C荧光信号值的比值(T₂/C)与仪器中内置的校准品浓度的半对数直线方程式做曲线拟合并进行样本浓度的运算，免疫荧光检测仪自动显示弓形虫IgG、IgM抗体检测数值。

检测结果解释：

。

三、本发明试剂盒性能指标

本发明结合了量子点定量技术和免疫层析技术，可对样本进行精确定量。

现将该试剂盒主要性能指标归纳如下：

。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒，其特征在于：包括试纸条、量子点标记液；所述试纸条由按次序粘贴在衬板上的吸水纸、硝酸纤维素膜和样品垫构成，所述硝酸纤维素膜检测线T₁和检测线T₂上分别包被有弓形虫抗原，质控线C上包被有羊抗鼠IgG多抗；所述量子点标记液是量子点标记的鼠抗人IgG抗体及量子点标记的鼠抗人IgM抗体的混合溶液。

2.根据权利要求1所述的荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒，其特征在于：所述硝酸纤维素膜检测线T₁和检测线T₂上包被的弓形虫抗原SAG1和SAG2，其浓度为0.5～0.8mg/ml、包被量为1.0μl/cm。

3.根据权利要求1所述的荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒，其特征在于：所述硝酸纤维素膜质控线C上包被的羊抗鼠IgG多抗的浓度为1.0～1.5mg/ml、包被量1.0μl/cm。

4.根据权利要求1所述的荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒，其特征在于：所述量子点为5～20nm的微球，量子点表面的活性基团为-COOH或-NH2，激发波长300～330nm，发射峰位400～620nm。

5.根据权利要求1所述的荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒，其特征在于：所述的量子点标记液采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基丁二酰亚胺共价交联方式标记鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体的混合溶液。

6.根据权利要求1所述的荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒，其特征在于：所述量子点标记的鼠抗人IgG抗体标记浓度为5～10μg/ml。

7.根据权利要求1所述的荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒，其特征在于：所述量子点标记的鼠抗人IgM抗体标记浓度为5～10μg/ml。