CN104849452A - 一种pla2r抗体定量检测试纸条及制作、检测方法 - Google Patents

一种pla2r抗体定量检测试纸条及制作、检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104849452A
CN104849452A CN201510245210.1A CN201510245210A CN104849452A CN 104849452 A CN104849452 A CN 104849452A CN 201510245210 A CN201510245210 A CN 201510245210A CN 104849452 A CN104849452 A CN 104849452A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pla2r
antibody
quantum dot
human igg
test
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510245210.1A
Other languages
English (en)
Inventor
张永顶
马伟民
马新民
张大准
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHENZHEN CITY BOLAOTE BIOLOGICAL PRODUCTS CO Ltd
Original Assignee
SHENZHEN CITY BOLAOTE BIOLOGICAL PRODUCTS CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHENZHEN CITY BOLAOTE BIOLOGICAL PRODUCTS CO Ltd filed Critical SHENZHEN CITY BOLAOTE BIOLOGICAL PRODUCTS CO Ltd
Priority to CN201510245210.1A priority Critical patent/CN104849452A/zh
Publication of CN104849452A publication Critical patent/CN104849452A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/588—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with semiconductor nanocrystal label, e.g. quantum dots
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6402—Atomic fluorescence; Laser induced fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种PLA2R抗体定量检测试纸条及制作、检测方法。该试纸条利用间接法测抗体的原理，分别将PLA2R包被在硝酸纤维素膜上，量子点偶联的抗人IgG抗体喷涂在结合物垫上，再将粘性PVC底板上依次搭接样本垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，并裁切成一定宽度的试纸条装成检测卡，可由荧光分析仪测出抗体浓度值，用于定量检测样本中的PLA2R抗体。利用量子点免疫层析法，可非创伤、低风险、安全、廉价、精确和快速的定量检测血清、血浆和全血中的PLA2R抗体含量，能为特发性膜性肾病的初筛和病情监测提供辅助作用。

Description

一种PLA2R抗体定量检测试纸条及制作、检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种PLA2R抗体定量检测试纸条及制作、检测方法。
背景技术
膜性肾病按发病原因可分为特发性和继发性膜性肾病，其诊断上要依靠临床表现及肾脏穿刺术。肾脏穿刺术是一种侵入式的诊断方法，对病人有一定的伤害。国外研究发现约75％的特发性膜性肾病患者可以通过血清学检测检出抗PLA2R抗体，国内也有文献显示在国人中检测阳性率更高，达到82％，而继发性膜性肾病及其他类型肾小球疾病患者的检出率很低，健康人群均为阴性。血清学PLA2R抗体的定量检测可以为特发性膜性肾病的初筛和病情监测提供辅助作用。因此，开发非创伤、低风险、安全、廉价、精确和快速的PLA2R定量测定试剂盒有极其重要的意义。
免疫层析技术以多种膜材组合为固定相，作为液相的样品通过毛细流原理从加样一端泳流至标记物垫上，与固定在标记物垫上的抗原或抗体标记物(如胶体金、荧光稀土元素等)反应形成免疫复合物，该带有标记的免疫复合物继续通过涌流到达反应膜上固定的检测线，与检测线上的抗原或抗体发生免疫反应从而被截留富集显色，达到快速检测的目的。免疫层析技术最常见的标记物是胶体金，应用非常广泛，也非常成功。由于胶体金标记是通过静电吸附的原理，在流体中不稳定，标记的分子容易脱落，且只有胶体金颗粒富集到一定肉眼可见的量的时候才能判读，同时，胶体金免疫层析技术只可对被检物定性分析。目前，通过胶体金免疫层析技术来快速检测磷脂酶A2受体(PLA2R)抗体的只有在公布号为CN102159951A中国专利申请中提到，但如上所述，不能定量且胶体金稳定性差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种PLA2R抗体定量检测试纸条及制作、检测方法，能够准确、快速、灵敏、定量的检测人血中的PLA2R抗体。
本发明解决其技术问题，所采用的技术方案是提供一种PLA2R抗体定量检测试纸条及制作、检测方法。具体的，包括一个检测试剂盒，所述检测试剂盒包括PLA2R抗体检测卡及样品缓冲液，PLA2R抗体检测卡内装有PLA2R抗体检测试纸条。检测卡可由荧光分析仪测出PLA2R抗体浓度值。所述试纸条包括在粘性底板上依次搭接的样本垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述的结合物垫上喷涂有抗人IgG抗体偶联的量子点，所述的硝酸纤维素膜上包被有PLA2R抗原作为检测线，硝酸纤维素膜上还包被有抗抗体作为质控线，所述抗抗体为抗量子点偶联抗体的抗体。检测卡是以间接法模式检测PLA2R抗体。
所述PLA2R，可以是天然纯化的PLA2R，也可以是基因重组获得的PLA2R或PLA2R片段；PLA2R抗体是由PLA2R免疫动物所得到的PLA2R抗体，可以是诸如兔源、羊源或其他哺乳动物来源的多克隆抗体，也可以是鼠源单克隆抗体。
量子点偶联的抗人IgG抗体，可以是抗人不同IgG亚型的抗体，如鼠抗人IgG4抗体。该抗人IgG抗体可以是诸如兔源、羊源或其他哺乳动物来源的多克隆抗体，也可以是鼠源单克隆抗体。质控线上的抗抗体是抗量子点偶联抗体的抗体。例如若量子点偶联的抗体是鼠抗人IgG4抗体，那么该抗抗体必须是抗鼠的抗体；又如若量子点偶联的抗体是羊抗人IgG抗体，那么该抗抗体必须是抗羊的抗体；
所述量子点为包括ⅠB、ⅡB、ⅢA、ⅣA、ⅤA、ⅥA族中的两种以上元素组成的单个晶核结构，如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、InP、InAs、HgCdTe等，或是核壳结构，如CdSe/ZnS、ZnCdS/ZnS、MnSe/ZnSe/ZnS、CuInZnS/ZnS等。
量子点由以上元素构成外，还具有表面修饰基团，如-COOH、-NH2、-SH、-CHO等基团，可以通过一些化学试剂如戊二醛、碳二亚胺等偶联生物大分子，如蛋白质、核酸及其他有机分子。
所述量子点的粒径范围为2～1000nm，激发光波长范围为200～600nm，发射光波长为400～800nm。
一种PLA2R抗体检测试纸条的制作方法，包括以下步骤：
a.用量子点偶联抗人IgG抗体得到量子点-抗人IgG抗体复合物，并将其喷涂在结合物垫上；
b.分别将PLA2R包被到硝酸纤维素膜上作为检测线，将抗抗体包被到硝酸纤维素膜上作为质控线，检测线和质控线间的距离为3～10mm。
c.在粘性底板上依次搭接样本垫、喷涂有量子点-抗人IgG抗体复合物的结合物垫、设置有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸，并裁切成所需宽度即为PLA2R抗体检测试纸条。
检测线和质控线的制备方法为：分别用0.005-0.2M，pH6.0-pH9.0的包被缓冲液稀释PLA2R和抗抗体至0.1-5mg/ml，所述包被缓冲液为磷酸盐、硼砂、碳酸盐、可含糖、醇类中的一种；用划膜仪或喷膜仪分别将PLA2R和抗抗体包被到硝酸纤维素膜上，包被浓度为0.4-2μl/cm；喷涂完毕后，放置在环境湿度为30％以下，温度在16℃-45℃的环境中，烘干1h以上，封存。
抗人IgG抗体偶联量子点的方法：将抗人IgG抗体加入到量子点溶液中或是将量子点加入到抗人IgG抗体溶液中偶联得到量子点-抗人IgG抗体复合物；所述量子点可在适当的溶液中活化，活化试剂可以为EDC、NHS或戊二醛或其他交联剂等，将量子点与活化剂结合即的量子点溶液。
结合物垫上喷涂量子点-抗人IgG抗体复合物的条件是：将量子点-抗人IgG抗体复合物稀释稀释5-200倍，用喷膜仪按2-100μl/cm的量喷涂到结合物垫上，在环境湿度小于30％，温度在35-37℃的环境下烘烤1-5h，干燥后封存。
所述PLA2R抗体检测卡，包括上壳体和下壳体，所述上壳体与下壳体间放置有PLA2R抗体检测试纸条，所述上壳体上设置有加样孔、观察窗和信息区，所述加样孔与PLA2R抗体检测试纸条上的样本垫对应，观察窗与硝酸纤维素膜上的检测线和质控线对应；所述信息区上喷涂有用于识别病人ID的二维码、条形码或磁卡；所述PLA2R抗体检测卡同样品缓冲液一起装在试剂盒内，试剂盒上设置有标定芯片。
本发明还提供了一种PLA2R抗体的检测方法：包括以下步骤：
1)先用试剂盒上的标定芯片标定荧光分析仪，保存标定数据；
2)取10微升血清或血浆样品，或15微升全血样品加入样品缓冲液，混合后10秒钟，加入检测卡加样孔；
3)将检测卡插入荧光分析仪的检测孔，放置3-4分钟，荧光分析仪即可读出PLA2R的浓度值。
有益效果：将量子点和免疫层析技术相结合，可使试纸条既具有稳定性高的优点，同时，又可对PLA2R抗体进行定量检测，且检测又灵敏度高；该检测方法还具有检测时间短，效率高的特点。相对于传统的胶体金和有机荧光染料，量子点具有稳定、可定量的优点，因此，可以很好的检测出PLA2R抗体的存量。本发明利用量子点免疫层析法，非创伤、低风险、安全、廉价、精确和快速的定量检测血清、血浆和全血中的PLA2R抗体含量，可以为特发性膜性肾病的初筛和病情监测提供辅助作用。
具体实施方式
一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括PLA2R抗体检测卡及样品缓冲液，PLA2R抗体检测卡内装有PLA2R抗体检测试纸条。所述试纸条包括在粘性底板上依次搭接的样本垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸。所述的结合物垫上喷涂有抗人IGG抗体偶联的量子点，所述的硝酸纤维素膜上包被有PLA2R抗原作为检测线，硝酸纤维素膜上还包被有抗抗体作为质控线，所述抗抗体为抗量子点偶联抗体的抗体。检测卡是以间接法模式检测PLA2R抗体。。
所述PLA2R，可以是天然纯化的PLA2R，也可以是基因重组获得的PLA2R或PLA2R片段；PLA2R抗体是由PLA2R免疫动物所得到的PLA2R抗体，可以是诸如兔源、羊源或其他哺乳动物来源的多克隆抗体，也可以是鼠源单克隆抗体。
量子点偶联的抗人IgG抗体，可以是抗人不同IgG亚型的抗体，如鼠抗人IgG4抗体。该抗人IgG抗体可以是诸如兔源、羊源或其他哺乳动物来源的多克隆抗体，也可以是鼠源单克隆抗体。质控线上的抗抗体是抗量子点偶联抗体的抗体。例如若量子点偶联的抗体是鼠抗人IgG4抗体，那么该抗抗体必须是抗鼠的抗体；又如若量子点偶联的抗体是羊抗人IgG抗体，那么该抗抗体必须是抗羊的抗体。
所述量子点为包括ⅠB、ⅡB、ⅢA、ⅣA、ⅤA、ⅥA族中的两种以上元素组成的单个晶核结构，如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、InP、InAs、HgCdTe等，或是核壳结构，如CdSe/ZnS、ZnCdS/ZnS、MnSe/ZnSe/ZnS、CuInZnS/ZnS等。
量子点由以上元素构成外，还具有表面修饰基团，如-COOH、-NH2、-SH、-CHO等基团，可以通过一些化学试剂如戊二醛、碳二亚胺等偶联生物大分子，如蛋白质、核酸及其他有机分子。
所述量子点的粒径范围为2～1000nm，激发光波长范围为200～600nm，发射光波长为400～800nm。
所述PLA2R抗体检测卡，包括上壳体和下壳体，所述上壳体与下壳体间放置有PLA2R抗体检测试纸条，所述上壳体上设置有加样孔、观察窗和信息区，所述加样孔与PLA2R抗体检测试纸条上的样本垫对应，观察窗与硝酸纤维素膜上的检测线和质控线对应；所述信息区上喷涂有用于识别病人ID的二维码、条形码或磁卡；所述PLA2R抗体检测卡同样品缓冲液一起装在试剂盒内，试剂盒上设置有标定芯片。
本发明还提供了一种PLA2R抗体的检测方法：包括以下步骤：
1)先用试剂盒上的标定芯片标定荧光分析仪，保存标定数据；
2)取10微升血清或血浆样品，或15微升全血样品加入样品缓冲液，混合后10秒钟，取混合液80微升加入检测卡加样孔；
3)将检测卡插入荧光分析仪的检测孔，放置3-4分钟，荧光分析仪即可读出PLA2R的浓度值。
实施例1：
一种PLA2R抗体检测试纸条的制作方法，包括以下步骤：
a.用量子点偶联鼠抗人IgG4抗体得到量子点-鼠抗人IgG4抗体复合物，并将其喷涂在结合物垫上；
b.分别将PLA2R包被到硝酸纤维素膜上作为检测线，将抗抗体包被到硝酸纤维素膜上作为质控线，检测线和质控线间的距离为5mm。
c.在粘性底板上依次搭接样本垫、喷涂有量子点-鼠抗人IgG4抗体复合物的结合物垫、设置有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸，各个膜材之间相互重叠1mm，粘好后裁切成4mm的宽度的试纸条即为PLA2R抗体检测试纸条。
抗人IgG抗体偶联量子点制备量子点-鼠抗人IgG4抗体复合物的方法：
取0.1ml由CdSe，表面基团为-COOH组成的量子点(激发波长365nm，发射波长620nm)溶液置于1ml浓度为0.1mol/L PH5.0的MES缓冲液中，同时加入0.02ml浓度50mg/ml 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和0.08ml浓度20mg/ml的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，室温孵育20min后，离心处理(23000rpm，30min)，弃上清，洗涤，相同条件下离心，弃上清，重复一次，加入0.5mg的鼠抗人IgG4抗体，室温孵育2h，加入1％BSA(牛血清白蛋白)，室温孵育0.5h，相同条件下离心，弃上清，重复一次，加入0.1ml保存液即得到量子点-鼠抗人IgG4复合物，所得的量子点-抗人IgG抗体复合物放置于4℃的环境中保存待用。
量子点结合物垫的具体制备方法：
结合物垫预处理：取一条型号为8975的玻璃纤维素膜，用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(内含1％牛血清白蛋白，0.5％的吐温20)浸泡30min后取出，在37℃的条件下烘干。将上述标记好的量子点-鼠抗人IgG4复合物用量子点工作缓冲液(内含1％牛血清白蛋白，0.5％的吐温20，0.05％Proclin300的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液)按1：200稀释后，用喷膜仪按20μl/cm的量喷涂到上述预处理的玻璃纤维膜上，在环境湿度小于30％，37℃的环境下烘烤5h，干燥，即得量子点结合物垫，放入干燥剂封存。
检测线和质控线的具体制备方法：
取一条型号为M180的硝酸纤维素膜，在室温，相对湿度为55％的环境条件下平衡30min后，用0.02M、pH7.0的磷酸盐缓冲液稀释PLA2R至0.5mg/ml后在硝酸纤维素膜上划线，划膜参数为2μl/cm，作为检测线；用0.02M、pH7.0的磷酸盐缓冲液稀释羊抗鼠IgG至1mg/ml在硝酸纤维素膜上划线，划膜浓度为2μl/cm，作为质控线；检测线和质控线之间相距5mm。在环境湿度在30％以下，温度在37℃，烘干2h以上，封存。
对上述所得试剂盒分别进行精密性检测、准确性检测及与金标准对比，来判定该试剂盒的精度和准确性。具体方法为：
临界值的确定
临界值即医学决定水平，是一些限值，通过观察测定值是否高于或低于这些限值，可在疾病诊断中起排除或确认的作用，或对某些疾病进行分级或分类，或对预后作出估计，以提示医师在临床上应采取何种处理方式，如进一步进行某一方面的检查，或决定采取某种治疗措施等。
通过检测200份正常人血清，抗PLA2R抗体浓度的平均值为13.4RU/ml和标准差为1.51RU/ml，以平均值加3倍标准差之和作为临界值，则临界值为17.93RU/ml。
精密性检测
选取高、中、低值3份质控血清，在同次试验内每份重复测定10次，分别计算平均值、标准差，计算试验内变异系数CV(％)；每天测定1次，连续测定10天，计算试验间CV(％)值。计算公式为：CV(％)＝标准差/平均值×100％
表1.试验内与试验间的CV值结果
注：试验内是指在一次试验中，对相同试验反复测试多次；试验间指相同试验在不同时间内重复测试；
准确性检测：
选择抗PLA2R抗体浓度分别为34和236RU/ml的2份血清，此低值血清和高值血清分别以1：4、1：1和9：1比例混合成3份不同浓度的血清，
理论值分别为195.6、135和54.2RU/ml。通过试剂盒检测，计算检测值与理论值的一致性，即回收率。计算公式为:回收率＝测试值/理论值×100％
表2.回收率计算结果
回收率在93％-109％之间,平均回收率为99.4％。
与金标准对比：
选取通过肾脏穿刺术确诊为特发性膜性肾病患者血清108份，非特发性膜性肾病患者血清26份，以肾脏穿刺术为金标准，用四格表统计如下：
特异性＝真阴性/阴性总数×100％
敏感性＝真阳性/阳性总数×100％
阳性预测值＝真阳性/(真阳性+假阳性)×100％
阴性预测值＝真阴性/(真阴性+假阴性)×100％
表3.四格表统计结果
因此本试剂盒的特异性为96.2％，敏感性为89.8％，阳性预测值为98.9％，阴性预测值为69.4％。
实施例2：
一种PLA2R抗体检测试纸条的制作方法，包括以下步骤：
a.用量子点偶联鼠抗人IgG4抗体得到量子点-鼠抗人IgG4抗体复合物，并将其喷涂在结合物垫上；
b.分别将PLA2R包被到硝酸纤维素膜上作为检测线，将抗抗体包被到硝酸纤维素膜上作为质控线，检测线和质控线间的距离为3mm。
c.在粘性底板上依次搭接样本垫、喷涂有量子点-鼠抗人IgG4抗体复合物的结合物垫、设置有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸，各个膜材之间相互重叠1mm，粘好后裁切成4mm的宽度的试纸条即为PLA2R抗体检测试纸条。
抗人IgG抗体偶联量子点制备量子点-鼠抗人IgG4抗体复合物的方法：
取0.1ml由CdSe/ZnS，表面基团为-COOH组成的量子点(激发波长365nm，发射波长620nm)溶液置于1ml浓度为0.1mol/L,PH5.0的MES缓冲液中，同时加入0.02ml浓度50mg/ml 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和0.08ml浓度20mg/ml的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，室温孵育20min后，离心(18000rpm，30min)，弃上清，洗涤，相同条件下离心，弃上清，重复一次，加入0.5mg的鼠抗人IgG4抗体，室温孵育2h，加入1％BSA，室温孵育0.5h，相同条件下离心，弃上清，重复一次，加入0.1ml保存液即得到量子点-鼠抗人IgG4复合物，所得的量子点-抗人IgG抗体复合物放置于4℃的环境中保存待用。
量子点结合物垫的具体制备方法：
结合物垫预处理：取一条型号为8975的玻璃纤维素膜，用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(内含1％牛血清白蛋白，0.5％的吐温20)浸泡30min后取出，在37℃的条件下烘干。将上述标记好的量子点-鼠抗人IgG4复合物用量子点工作缓冲液(内含1％牛血清白蛋白，0.05％吐温20，0.05％Proclin300的0.01mol/L磷酸盐缓冲液)按1：200稀释后，用喷膜仪按20μl/cm的量喷涂到上述预处理的玻璃纤维膜上，在环境湿度小于30％，37℃的环境下烘烤5h，干燥，即得量子点结合物垫，放入干燥剂封存。
检测线和质控线的具体制备方法：
取一条型号为M180的硝酸纤维素膜，在室温，相对湿度为55％的环境条件下平衡30min后，用0.02M、pH7.0的磷酸盐缓冲液稀释PLA2R至0.5mg/ml后在硝酸纤维素膜上划线，划膜参数为2μl/cm，作为检测线；用0.02M、pH7.0的磷酸盐缓冲液稀释羊抗鼠IgG至1mg/ml在硝酸纤维素膜上划线，划膜浓度为2μl/cm，作为质控线；检测线和质控线之间相距3mm。在环境湿度在30％以下，温度在37℃，烘干2h以上，封存。
对上述所得试剂盒分别进行精密性检测、准确性检测及与金标准对比，来判定该试剂盒的精度和准确性。具体方法为：
临界值的确定
通过检测200份正常人血清，抗PLA2R抗体浓度的平均值为13.4RU/ml和标准差为1.51RU/ml，以平均值加3倍标准差之和作为临界值，则临界值为17.93RU/ml。
精密性检测
选取高、中、低值3份质控血清，在同次试验内每份重复测定10次，分别计算平均值、标准差，计算试验内变异系数CV(％)；每天测定1次，连续测定10天，计算试验间CV(％)值。计算公式为：CV(％)＝标准差/平均值×100％
表1.试验内与试验间的CV值结果
准确性检测：
选择抗PLA2R抗体浓度分别为34和236RU/ml的2份血清，此低值血清和高值血清分别以1：4、1：1和9：1比例混合成3份不同浓度的血清，理论值分别为195.6、135和54.2RU/ml。通过试剂盒检测，计算检测值与理论值的一致性，即回收率。计算公式为:回收率＝测试值/理论值×100％
表2.回收率计算结果
回收率在95％-107％之间,平均回收率为101.5％。
与金标准对比：
选取通过肾脏穿刺术确诊为特发性膜性肾病患者血清108份，非特发性膜性肾病患者血清26份，以肾脏穿刺术为金标准，用四格表统计如下：
特异性＝真阴性/阴性总数×100％
敏感性＝真阳性/阳性总数×100％
阳性预测值＝真阳性/(真阳性+假阳性)×100％
阴性预测值＝真阴性/(真阴性+假阴性)×100％
表3.四格表统计结果
因此本试剂盒的特异性为84.6％，敏感性为82.4％，阳性预测值为93.7％，阴性预测值为56.4％。
实施例3：
一种PLA2R抗体检测试纸条的制作方法，包括以下步骤：
a.用量子点偶联鼠抗人IgG4抗体得到量子点-鼠抗人IgG4抗体复合物，并将其喷涂在结合物垫上；
b.分别将PLA2R包被到硝酸纤维素膜上作为检测线，将抗抗体包被到硝酸纤维素膜上作为质控线，检测线和质控线间的距离为10mm。
c.在粘性底板上依次搭接样本垫、喷涂有量子点-鼠抗人IgG4抗体复合物的结合物垫、设置有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸，各个膜材之间相互重叠1mm，粘好后裁切成4mm的宽度的试纸条即为PLA2R抗体检测试纸条。
抗人IgG抗体偶联量子点制备量子点-鼠抗人IgG4抗体复合物的方法：
取0.1ml由CdSe/ZnS，表面基团为-NH2组成的量子点(激发波长365nm，发射波长620nm)溶液置于1ml含5％戊二醛的0.05mol/L PH9.0的碳酸盐缓冲液中，置水浴箱中,37℃水浴结合2h后，离心(18000rpm，30min)，弃上清，洗涤，相同条件下离心，弃上清，重复一次，加入0.5mg的鼠抗人IgG4抗体，室温孵育2h，加入1％BSA，室温孵育0.5h，相同条件下离心，弃上清，重复一次，加入0.1ml保存液即得到量子点-鼠抗人IgG4复合物，所得的量子点-抗人IgG抗体复合物放置于4℃的环境中保存待用。
量子点结合物垫的具体制备方法：
结合物垫预处理：取一条型号为8975的玻璃纤维素膜，用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(内含1％牛血清白蛋白，0.5％的吐温20)浸泡30min后取出，在37℃的条件下烘干。将上述标记好的量子点-鼠抗人IgG4复合物用量子点工作缓冲液(内含1％BSA,0.05％吐温20,0.05％Proclin300的0.01mol/L磷酸盐缓冲液)按1：200稀释后，用喷膜仪按20μl/cm的量喷涂到上述预处理的玻璃纤维膜上，在环境湿度小于30％，37℃的环境下烘烤5h，干燥，即得量子点结合物垫，放入干燥剂封存。
检测线和质控线的具体制备方法：
取一条型号为M180的硝酸纤维素膜，在室温，相对湿度为55％的环境条件下平衡30min后，用0.02M、pH7.0的磷酸盐缓冲液稀释PLA2R至0.5mg/ml后在硝酸纤维素膜上划线，划膜参数为2μl/cm，作为检测线；用0.02M、pH7.0的磷酸盐缓冲液稀释羊抗鼠IgG至1mg/ml在硝酸纤维素膜上划线，划膜浓度为2μl/cm，作为质控线；检测线和质控线之间相距10mm。在环境湿度在30％以下，温度在37℃，烘干2h以上，封存。
对上述所得试剂盒分别进行精密性检测、准确性检测及与金标准对比，来判定该试剂盒的精度和准确性。具体方法为：
临界值的确定
通过检测200份正常人血清，抗PLA2R抗体浓度的平均值为13.4RU/ml和标准差为1.51RU/ml，以平均值加3倍标准差之和作为临界值，则临界值为17.93RU/ml。
精密性检测
选取高、中、低值3份质控血清，在同次试验内每份重复测定10次，分别计算平均值、标准差，计算试验内变异系数CV(％)；每天测定1次，连续测定10天，计算试验间CV(％)值。计算公式为：CV(％)＝标准差/平均值×100％
表1.试验内与试验间的CV值结果
准确性检测：
选择抗PLA2R抗体浓度分别为34和236RU/ml的2份血清，此低值血清和高值血清分别以1：4、1：1和9：1比例混合成3份不同浓度的血清，理论值分别为195.6、135和54.2RU/ml。通过试剂盒检测，计算检测值与理论值的一致性，即回收率。计算公式为:回收率＝测试值/理论值×100％
表2.回收率计算结果
测 低值血清(μl) 高值血清(μl) 理论值 测试值 回收率
试 (RU/ml) (RU/ml) (％)
1 2 8 195.6 189.9 97.1
2 5 5 135 142 105.2
3 9 1 54.2 51.5 95.0
回收率在95％-105％之间,平均回收率为99.1％。
与金标准对比：
选取通过肾脏穿刺术确诊为特发性膜性肾病患者血清108份，非特发性膜性肾病患者血清26份，以肾脏穿刺术为金标准，用四格表统计如下：
特异性＝真阴性/阴性总数×100％
敏感性＝真阳性/阳性总数×100％
阳性预测值＝真阳性/(真阳性+假阳性)×100％
阴性预测值＝真阴性/(真阴性+假阴性)×100％
表3.四格表统计结果
因此本试剂盒的特异性为88.5％，敏感性为88.0％，阳性预测值为96.9％，阴性预测值为63.8％。
综上试验分析可以得出，通过本试剂盒及其方法检测PLA2R抗体的准确性高，稳定性好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种PLA2R抗体定量检测试纸条，包括在粘性底板上依次搭接的样本垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；其特征在于：所述的结合物垫上喷涂有抗人IgG抗体偶联的量子点，所述的硝酸纤维素膜上包被有PLA2R抗原作为检测线，硝酸纤维素膜上还包被有抗抗体作为质控线，所述抗抗体为抗量子点偶联抗体的抗体。
2.根据权利要求1所述的PLA2R抗体定量检测试纸条，其特征在于：所述量子点为包括ⅠB、ⅡB、ⅢA、ⅣA、ⅤA、ⅥA族中的两种以上元素组成的单个晶核结构或是核壳结构。
3.根据权利要求2所述的PLA2R抗体定量检测试纸条，其特征在于：所述量子点表面还设置有表面修饰基团。
4.根据权利要求3所述的PLA2R抗体定量检测试纸条，其特征在于：所述表面修饰基团为-COOH、-NH2、-SH或-CHO。
5.根据权利要求1至4任意一项所述的PLA2R抗体定量检测试纸条，其特征在于：所述量子点的粒径范围为2～1000nm，激发光波长范围为200～600nm，发射光波长为400～800nm。
6.一种PLA2R抗体定量检测试纸条的制作方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.用量子点偶联抗人IgG抗体得到量子点-抗人IgG抗体复合物，并将其喷涂在结合物垫上；
b.分别将PLA2R包被到硝酸纤维素膜上作为检测线，将抗抗体包被到硝酸纤维素膜上作为质控线，检测线和质控线间的距离为3～10mm；
c.在粘性底板上依次搭接样本垫、喷涂有量子点-抗人IgG抗体复合物的结合物垫、设置有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸，并裁切成所需宽度即为PLA2R抗体检测试纸条。
7.根据权利要求6所述PLA2R抗体定量检测试纸条的制作方法，其特征在于：所述步骤b的具体制作方法为：分别用0.005-0.2M，pH6.0-pH9.0的包被缓冲液稀释PLA2R和抗抗体至0.1-5mg/ml，所述包被缓冲液为磷酸盐、硼砂、碳酸盐、可含糖、醇类中的一种；用划膜仪或喷膜仪分别将PLA2R和抗抗体包被到硝酸纤维素膜上，包被浓度为0.4-2μl/cm；喷涂完毕后，放置在环境湿度为30％以下，温度在16℃-45℃的环境中，烘干1h以上，封存。
8.根据权利要求6所述PLA2R抗体定量检测试纸条的制作方法，其特征在于：所述步骤a的具体制作方法为：将抗人IgG抗体加入到量子点溶液中或是将量子点加入到抗人IgG抗体溶液中偶联得到量子点-抗人IgG抗体复合物；
将量子点-抗人IgG抗体复合物稀释5-200倍，用喷膜仪按2-100μl/cm的量喷涂到结合物垫上，在环境湿度小于30％，温度在35-37℃的环境下烘烤1-5h，干燥后封存。
9.一种PLA2R抗体检测试剂盒，包括设置在试剂盒内的检测卡和样品缓冲液，其特征在于：所述检测卡包括上壳体和下壳体，所述上壳体与下壳体间放置有PLA2R抗体检测试纸条，所述上壳体上设置有加样孔、观察窗和信息区，所述加样孔与PLA2R抗体检测试纸条上的样本垫对应，观察窗与硝酸纤维素膜上的检测线和质控线对应；所述信息区上喷涂有用于识别病人ID的二维码、条形码或磁卡；所述试剂盒上还设置有标定芯片。
10.一种PLA2R抗体的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)先用试剂盒上的标定芯片标定荧光分析仪，保存标定数据；
2)取10微升血清或血浆样品，或15微升全血样品加入样品缓冲液，混合后10秒钟，加入检测卡加样孔；
3)将检测卡插入荧光分析仪的检测孔，放置3-4分钟，荧光分析仪即可读出PLA2R的浓度值。
CN201510245210.1A 2015-05-14 2015-05-14 一种pla2r抗体定量检测试纸条及制作、检测方法 Pending CN104849452A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510245210.1A CN104849452A (zh) 2015-05-14 2015-05-14 一种pla2r抗体定量检测试纸条及制作、检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510245210.1A CN104849452A (zh) 2015-05-14 2015-05-14 一种pla2r抗体定量检测试纸条及制作、检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104849452A true CN104849452A (zh) 2015-08-19

Family

ID=53849250

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510245210.1A Pending CN104849452A (zh) 2015-05-14 2015-05-14 一种pla2r抗体定量检测试纸条及制作、检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104849452A (zh)

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105467117A (zh) * 2015-12-04 2016-04-06 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种pgii快速定量检测试剂盒及其制作、检测方法
CN105606796A (zh) * 2016-02-01 2016-05-25 苏州东尼生物技术有限公司 一种应用于胶体金免疫层析的硝酸纤维素膜预处理方法
CN108362874A (zh) * 2018-01-24 2018-08-03 天津市协和医药科技集团有限公司 检测人血液ZnT8A的量子点荧光层析免疫分析试剂
CN108414478A (zh) * 2018-01-19 2018-08-17 祝胜郎 一种生物样品的检测方法
CN108414741A (zh) * 2018-01-19 2018-08-17 苏庆宁 一种免疫组合物在制备膜性肾病无创检测用试剂中的用途
CN108761076A (zh) * 2018-05-24 2018-11-06 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 乳汁中pedv免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用
CN109061159A (zh) * 2018-05-24 2018-12-21 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 Pedv免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用
CN109725154A (zh) * 2018-10-08 2019-05-07 杭州康知生物科技有限公司 一种IgG4荧光免疫层析测定试剂盒及测定方法
CN109891245A (zh) * 2016-08-12 2019-06-14 美国创新免疫科技有限公司 自身免疫疾病的诊断、预防和/或治疗
CN109884293A (zh) * 2019-03-29 2019-06-14 中国海洋大学 一种基于量子点荧光的食品过敏原快速检测方法
CN111413506A (zh) * 2018-01-30 2020-07-14 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种检测试纸条在制备检测pla2r抗体的试剂盒中的应用
CN113075409A (zh) * 2021-03-26 2021-07-06 重庆新赛亚生物科技有限公司 一种γ干扰素试剂条、制备方法及其制备装置
CN114441766A (zh) * 2021-12-27 2022-05-06 迪亚莱博（张家港）生物科技有限公司 一种定量检测抗pla2r抗体的荧光免疫层析试纸条及其制备方法
CN115184620A (zh) * 2022-09-14 2022-10-14 山东子峰生物技术有限公司 一种pla2r抗体的量子点荧光检测试纸条、试剂盒及其应用
CN116925230A (zh) * 2023-09-19 2023-10-24 四川省医学科学院·四川省人民医院 一种抗人pla2r的抗体及其抗原结合片段及其应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050250141A1 (en) * 2004-03-30 2005-11-10 Lambert James L Diagnostic assays including multiplexed lateral flow immunoassays with quantum dots
CN101339196A (zh) * 2008-07-29 2009-01-07 上海师范大学 量子点标记免疫层析试纸快速检测膀胱癌方法
CN102159951A (zh) * 2008-07-18 2011-08-17 波士顿医疗中心有限公司 膜性肾病的诊断
CN102520165A (zh) * 2011-12-29 2012-06-27 北京康美天鸿生物科技有限公司 一种量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法
CN103018456A (zh) * 2012-11-29 2013-04-03 深圳市伯劳特生物制品有限公司 降钙素原检测试纸条及其制备方法
CN103048460A (zh) * 2012-12-15 2013-04-17 武汉珈源生物医学工程有限公司 一种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法
CN103364550A (zh) * 2013-07-16 2013-10-23 天津大学 用量子点标记的免疫层析试纸条快速定量检测肿瘤标志物的方法及装置
WO2014176753A1 (zh) * 2013-04-30 2014-11-06 成都领御生物技术有限公司 量子点免疫层析试条检测系统及其应用
CN204374215U (zh) * 2014-11-20 2015-06-03 江苏省原子医学研究所 一种检测m型磷脂酶a2受体自身抗体的试纸条及其检测卡

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050250141A1 (en) * 2004-03-30 2005-11-10 Lambert James L Diagnostic assays including multiplexed lateral flow immunoassays with quantum dots
CN102159951A (zh) * 2008-07-18 2011-08-17 波士顿医疗中心有限公司 膜性肾病的诊断
CN101339196A (zh) * 2008-07-29 2009-01-07 上海师范大学 量子点标记免疫层析试纸快速检测膀胱癌方法
CN102520165A (zh) * 2011-12-29 2012-06-27 北京康美天鸿生物科技有限公司 一种量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法
CN103018456A (zh) * 2012-11-29 2013-04-03 深圳市伯劳特生物制品有限公司 降钙素原检测试纸条及其制备方法
CN103048460A (zh) * 2012-12-15 2013-04-17 武汉珈源生物医学工程有限公司 一种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法
WO2014176753A1 (zh) * 2013-04-30 2014-11-06 成都领御生物技术有限公司 量子点免疫层析试条检测系统及其应用
CN103364550A (zh) * 2013-07-16 2013-10-23 天津大学 用量子点标记的免疫层析试纸条快速定量检测肿瘤标志物的方法及装置
CN204374215U (zh) * 2014-11-20 2015-06-03 江苏省原子医学研究所 一种检测m型磷脂酶a2受体自身抗体的试纸条及其检测卡

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONGJIN PYO,JISUN YOO: "New trends in fluorescence immunochromatography", 《JOURNAL OF IMMUNOASSAY AND IMMUNOCHEMISTRY》 *
唐秋艳 等人主编: "《免疫诊断试剂实用技术》", 31 August 2009 *
康熙雄主编: "《免疫胶体金技术临床应用》", 31 August 2010 *
郭勤: "基于量子点标记的层析试纸条与配套分析仪的研制", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *
陈启凡: "《量子点生物荧光探针的制备及应用》", 30 June 2007 *

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105467117A (zh) * 2015-12-04 2016-04-06 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种pgii快速定量检测试剂盒及其制作、检测方法
CN105606796A (zh) * 2016-02-01 2016-05-25 苏州东尼生物技术有限公司 一种应用于胶体金免疫层析的硝酸纤维素膜预处理方法
CN109891245A (zh) * 2016-08-12 2019-06-14 美国创新免疫科技有限公司 自身免疫疾病的诊断、预防和/或治疗
CN108414741A (zh) * 2018-01-19 2018-08-17 苏庆宁 一种免疫组合物在制备膜性肾病无创检测用试剂中的用途
CN108414478A (zh) * 2018-01-19 2018-08-17 祝胜郎 一种生物样品的检测方法
CN108362874A (zh) * 2018-01-24 2018-08-03 天津市协和医药科技集团有限公司 检测人血液ZnT8A的量子点荧光层析免疫分析试剂
CN111413506A (zh) * 2018-01-30 2020-07-14 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种检测试纸条在制备检测pla2r抗体的试剂盒中的应用
CN108761076A (zh) * 2018-05-24 2018-11-06 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 乳汁中pedv免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用
CN109061159A (zh) * 2018-05-24 2018-12-21 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 Pedv免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用
CN109725154A (zh) * 2018-10-08 2019-05-07 杭州康知生物科技有限公司 一种IgG4荧光免疫层析测定试剂盒及测定方法
CN109884293A (zh) * 2019-03-29 2019-06-14 中国海洋大学 一种基于量子点荧光的食品过敏原快速检测方法
CN113075409A (zh) * 2021-03-26 2021-07-06 重庆新赛亚生物科技有限公司 一种γ干扰素试剂条、制备方法及其制备装置
CN114441766A (zh) * 2021-12-27 2022-05-06 迪亚莱博（张家港）生物科技有限公司 一种定量检测抗pla2r抗体的荧光免疫层析试纸条及其制备方法
CN114441766B (zh) * 2021-12-27 2023-12-29 迪亚莱博（张家港）生物科技有限公司 一种定量检测抗pla2r抗体的荧光免疫层析试纸条及其制备方法
CN115184620A (zh) * 2022-09-14 2022-10-14 山东子峰生物技术有限公司 一种pla2r抗体的量子点荧光检测试纸条、试剂盒及其应用
CN116925230A (zh) * 2023-09-19 2023-10-24 四川省医学科学院·四川省人民医院 一种抗人pla2r的抗体及其抗原结合片段及其应用
CN116925230B (zh) * 2023-09-19 2024-02-20 四川省医学科学院·四川省人民医院 一种抗人pla2r的抗体及其抗原结合片段及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104849452A (zh) 一种pla2r抗体定量检测试纸条及制作、检测方法
CN104880560B (zh) 一种pla2r抗体检测试纸条及制作、检测方法
Fang et al. Barcode lateral flow immunochromatographic strip for prostate acid phosphatase determination
CN105842451B (zh) 基于量子点荧光免疫检测dnmt1的方法
WO2018120854A1 (zh) 检测ck-mb的时间分辨荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法
CN102680692A (zh) 基于近红外荧光标记物的免疫层析定量检测试剂
CN101339196A (zh) 量子点标记免疫层析试纸快速检测膀胱癌方法
US20180364249A1 (en) Method of quantitative determination of sarcosine in a biological sample
WO2021159703A1 (zh) 一种快速检测新型冠状病毒n蛋白的免疫层析试剂盒及其制备方法和应用
CN109580946A (zh) 一种同时检测甲型和乙型流感病毒的试纸条及制备方法
CN105467117A (zh) 一种pgii快速定量检测试剂盒及其制作、检测方法
Song et al. Rapid and quantitative detection of SARS-CoV-2 IgG antibody in serum using optofluidic point-of-care testing fluorescence biosensor
CN105467116A (zh) 一种便捷式降钙素原检测试剂盒
Berlina et al. Quantum-dot-based immunochromatographic assay for total IgE in human serum
CN102680689A (zh) 检测肌酸激酶同功酶的试剂盒及其制备和使用方法
CN111398593A (zh) 一种快速联合检测卡及其制备方法和应用
CN105793707A (zh) 免疫层析辅助的检测方法
CN109580933A (zh) 一种检测流感病毒的试纸条及制备方法
CN105548556A (zh) 一种pgi快速定量检测试剂盒及其制作、检测方法
CN106680508A (zh) 定量联合检测pa与crp的方法、试剂盒及其制备方法和应用
CN104849443B (zh) 基于pH计的酶联免疫吸附测定方法
CN106645745A (zh) 一种快速定量检测微量白蛋白的均相荧光免疫试剂及制备与检测方法
KR20160120675A (ko) 래피드 정량 진단 키트
CN105181661A (zh) 荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒
CN101377498A (zh) 前列腺特异性抗原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C53 Correction of patent of invention or patent application
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Xiong Zuying

Inventor after: Zhang Yongding

Inventor after: Ma Weimin

Inventor after: Zhang Dazhun

Inventor before: Zhang Yongding

Inventor before: Ma Weimin

Inventor before: Ma Xinmin

Inventor before: Zhang Dazhun

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: ZHANG YONGDING MA WEIMIN MA XINMIN ZHANG DAZHUN TO: XIONG ZUYING ZHANG YONGDING MA WEIMIN ZHANG DAZHUN

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150819