WO2021159703A1

WO2021159703A1 - 一种快速检测新型冠状病毒n蛋白的免疫层析试剂盒及其制备方法和应用

Info

Publication number: WO2021159703A1
Application number: PCT/CN2020/114511
Authority: WO
Inventors: 林斯
Original assignee: 北京华科泰生物技术股份有限公司
Priority date: 2020-02-13
Filing date: 2020-09-10
Publication date: 2021-08-19

Abstract

一种快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒及其制备方法和应用，该免疫层析试剂盒包括：（1）能够结合新型冠状病毒N蛋白的一株抗体；（2）当新型冠状病毒N蛋白能够结合于（1）中限定抗体时，能够结合于新型冠状病毒N蛋白的标记物标记的另一株抗体。该试剂盒的使用方法通过检测个体样本中新型冠状病毒N蛋白的水平来确定是否患有新型冠状病毒肺炎。该免疫层析试剂盒可进行鼻咽拭子、口咽拭子、肺泡灌洗液、口腔拭子或唾液样本中新型冠状病毒N蛋白的检测，用于新型冠状病毒肺炎的诊断。

Description

一种快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒及其制备方法和应用

本申请基于申请号为202010092002.3、申请日为2020年02月13日的中国专利申请、申请号为202010092001.9、申请日为2020年02月13日的中国专利申请、申请号为202010136117.8、申请日为2020年03月02日的中国专利申请和申请号为202010136153.4、申请日为2020年03月02日的中国专利申请提出，并要求该些中国专利申请的优先权，该些中国专利申请的全部内容引入本申请作为参考。

技术领域

本发明属于体外诊断领域，涉及一种快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，因2019年出现病毒性肺炎病例而被发现，2020年1月12日被世界卫生组织命名。人感染冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。1月26日，国家药品监督管理局应急审批通过华大基因等4家企业4个新型冠状病毒检测产品，但目前已审批的新型冠状病毒核酸检测试剂均基于核酸检测方式，单个样品采用核酸荧光PCR法需要3个小时给出检测结果，采用核酸测序法需要6个小时给出检测结果，更重要的是由于基因扩增对实验室环境要求极高导致检测通量称为最大制约因素，是极大制约了新型冠状病毒快速检测服务的供给能力，不足以全面满足疫情防控需要。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，包括：

(1)能够结合新型冠状病毒N蛋白的一株抗体；

(2)当新型冠状病毒N蛋白能够结合于(1)中限定抗体时，能够结合于新型冠状病毒N蛋白的标记物标记的另一株抗体。

在本发明的一个具体方案中，其中所述新型冠状病毒N蛋白来源于由新型冠状病毒感染引起的肺炎患者的样本。

在本发明的一个具体方案中，其中所述样本选自鼻咽拭子、口咽拭子、肺泡灌洗液、血液、痰液、口腔拭子或唾液。

鼻咽拭子也可以叫作鼻拭子，鼻拭子为鼻腔内取样；口咽拭子也可以叫作咽拭子，咽拭子为咽喉部位取样；口腔拭子为口腔内部取样。

在本发明的一个具体方案中，其中所述样本选自血液。

在本发明的一个具体方案中，其中所述血液选自血清、血浆或全血。

在本发明的一个具体方案中，其中所述鼻咽拭子、口咽拭子、痰液、口腔拭子或唾液采用样本保存液进行处理。

鼻咽拭子也可以叫作鼻拭子，鼻拭子为鼻腔内取样；口咽拭子也可以叫作咽拭子，咽拭子为咽喉部位取样；口咽拭子为口腔内取样。

在本发明的一个具体方案中，其中所述样本保存液为Tris-HCl缓冲液、PB缓冲液或巴比妥钠-盐酸缓冲液。

在本发明的一个具体方案中，其中所述标记物选自过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、荧光微球、胶体金、三联吡啶钌、吖啶酯或含金属离子物质。

在本发明的一个具体方案中，其中所述能够结合新型冠状病毒N蛋白的一株抗体分别固定在不同载体上，所述载体选自微孔板、样品杯、试剂杯、试纸条、纤维素膜、乳胶微球、磁性微球或二氧化硅微球中的一种。

在本发明的一个具体方案中，其中所述样本中新型冠状病毒N蛋白的水平检测通过免疫层析、ELISA、化学发光、磁微粒化学发光、电化学免疫分析或质谱免疫分析实施。

一种上述的检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒的使用方法，所述使用方法通过检测个体样本中新型冠状病毒N蛋白的水平来确定是否患有新型冠状病毒肺炎；

所述试剂盒包括：(1)能够结合新型冠状病毒N蛋白的一株抗体；(2)当新型冠状病毒N蛋白能够结合于(1)中限定抗体时，能够结合于新型冠状病毒N蛋白的标记物标记的另一株抗体。

一种快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，包括试纸条，所述试纸条包括检测线及质控线，所述检测线上包被有一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗兔多克隆抗体。

在本发明的一个具体方案中，其中所述试纸条还包括PVC板，所述PVC板上固定有依次连接的样品垫、标记物垫、包被垫及吸水垫，所述包被垫上依次设有检测线及质控线，所述样品垫和标记物垫连接为一体。

在本发明的一个具体方案中，其中所述包被垫靠近检测线的一端连接有标记物垫，靠近质控线的一端连接有吸水垫。

在本发明的一个具体方案中，其中所述标记物垫上包被有标记物标记的另一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和标记物标记的兔IgG，所述标记物标记的另一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和标记物标记的兔IgG的摩尔比为1:0.2～4。

在本发明的一个具体方案中，其中所述抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体为鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体或羊抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，优选为鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体。

在本发明的一个具体方案中，其中所述标记物为荧光微球、胶体金、胶体硒、彩色乳胶或磁性微球。

在本发明的一个具体方案中，其中所述快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒还包括用于卡设试纸条的卡壳。

在本发明的一个具体方案中，其中所述卡壳包括：

底槽，其连接于所述PVC板；

上盖，其连接于所述底槽，所述上盖上设置有用于向所述样品垫上加样的加样孔；

观察窗，其设置于上盖上并用于检测线和质控线的数据采集。

一种快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)包被垫的制备：将一株抗新型冠状病毒N蛋白抗体和羊抗兔多克隆抗体分别包被到硝酸纤维素膜上，干燥备用；

2)标记物垫的制备：将标记物标记的一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和标记物标记的兔IgG混合后，喷涂在玻璃纤维素膜上，干燥备用；

3)组装试纸条：在PVC板上粘接包被垫，并在靠近该包被垫上的质控线的一端搭接吸水垫，在靠近该包被垫上的检测线的一端搭接标记物垫及其连接的样品垫；然后将其切成所需宽度的试纸条，之后将该试剂条放入卡壳。

在本发明的一个具体方案中，其中所述标记物标记的另一株鼠抗冠状病毒N蛋白单克隆抗体和标记物标记的兔IgG的摩尔比为1:0.5～4。

一种用于快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒的使用方法，所述方法所用的样本为选自鼻咽拭子、口咽拭子、肺泡灌洗液、口腔拭子或唾液。

在本发明的一个具体方案中，其中所述使用方法，包括以下步骤：

包括以下步骤：

将所采取的样本经样本保存液进行样本前处理，随后取30～100μL处理好的待测样本滴加到试剂盒的加样孔处，静置15min，然后插入荧光免疫分析仪进行检测或者在紫外光下观察，即时可获得检测结果。

将所采取的样本经样本保存液进行样本前处理，随后取60μL处理好的待测样本滴加到试剂盒的加样孔处，静置15min，然后插入荧光免疫分析仪进行检测或者在紫外光下观察，即时可获得检测结果。

在本发明的一个具体方案中，其中所述样本前处理的方式为：在塑料软管中加入0.5mL样本保存液，随后将采集样本后的棉棒浸在样本保存液中并搅拌；用手指挤压塑料软管外侧数次，使样本保存液充分浸透棉棒，然后拔出棉棒，绞出的液体即为待测样本。

试剂盒也可以叫做检测卡。

本发明的有益效果：

1、本发明所提供的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其可通过可通过采用免疫层析、ELISA、化学发光、磁微粒化学发光、电化学免疫分析或质谱免疫分析尤其是采用双抗夹心法检测新型冠状病毒核衣壳(N)蛋白，能够进行鼻咽拭子、口咽拭子、肺泡灌洗液、口腔拭子或唾液等样本进行检测，检测速度快，15min出检测结果，配合荧光免疫层析仪使用，操作简单，适用于基层医疗机构。

2、本发明所提供的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其能够改善PCR对仪器操作、人员、环境等的专业性要求限制，以及检测抗体无法在早期进行筛查的缺陷，能够加速疫情一线疑似病例筛查，快速进行确诊人员隔离，有效降低社会恐慌情绪。

3、本发明所提供的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其可进行鼻咽拭子、口咽拭子、肺泡灌洗液标本、口腔拭子或唾液样本中冠状病毒核衣壳(N)蛋白的检测，以用于新型冠状病毒肺炎的诊断。

附图说明

图1为本发明所提供的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试纸条示意图；

图2A为本发明所提供的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析检测卡中一种上盖的内部结构示意图；

图2B为本发明所提供的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析检测卡中一种底槽的内部结构示意图；

图3为本发明的实施例1所述的待测样本中的抗原结合部位的预测结果图。

其中，1-PVC板，2-包被垫，3-标记物垫，4-吸水垫，5-检测线，6-质控线，7-标记物结合处，8-样本，9-样品垫，11-上盖，12-底槽，13-加样孔，14-观察窗，15-试纸条放置区域，16-定位柱，17-定位孔，18-第一限定部，19-第二限定部，20-第三限定部。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体产品的情况做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

以下材料或试剂，除非特别说明，均为市售。

本发明提供了一种检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，包括：

(1)能够结合新型冠状病毒N蛋白的一株抗体；

上述新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，具体使用时通过检测个体样本中新型冠状病毒N蛋白的水平来确定是否患有新型冠状病毒肺炎。新型冠状病毒N蛋白也可以叫作新型冠状病毒核衣壳(N)蛋白。

上述样本选自鼻咽拭子、口咽拭子、肺泡灌洗液、血液、痰液、口腔拭子或唾液，优选为血液，所述血液选自血清、血浆或全血，通过静脉抽血进行血样检测，过程安全，减少采样时感染人员呼吸或打喷嚏对医护人员的造成的感染。

上述鼻咽拭子或口咽拭子采用样本保存液进行处理；所述样本保存液为Tris-HCl缓冲液或PB缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液。

上述标记物选自过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、荧光微球、胶体金、吖啶酯或含金属离子物质。

上述能够结合新型冠状病毒N蛋白的一株抗体分别固定在不同载体上，所述载体选自微孔板、样品杯、试剂杯、试纸条、纤维素膜、乳胶微球、磁性微球或二氧化硅微球中的一种。

上述样本中新型冠状病毒N蛋白的水平检测通过免疫层析、ELISA、化学发光、磁微粒化学发光、电化学免疫分析或质谱免疫分析实施。

本发明还提供了一种快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，包括试纸条，所述试纸条包括检测线及质控线，所述检测线上包被有一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗兔多克隆抗体。

上述试纸条还包括PVC板，所述PVC板上固定有依次连接的样品垫、标记物垫、包被垫及吸水垫，所述包被垫上依次设有检测线及质控线，所述样品垫和标记物垫连接为一体。

上述包被垫靠近检测线的一端连接有标记物垫，靠近质控线的一端连接有吸水垫。

上述标记物垫上包被有标记物标记的另一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和标记物标记的兔IgG，所述标记物标记的另一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和标记物标记的兔IgG的摩尔比为1:0.2～4。

上述标记物为荧光微球、胶体金、胶体硒、彩色乳胶或磁性微球。

上述快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒还包括用于卡设试纸条的卡壳。

上述卡壳包括：

底槽，其连接于所述PVC板；

上述快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

上述快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法所用的样本为选自鼻咽拭子、口咽拭子、肺泡灌洗液、口腔拭子或唾液。

上述使用方法包括以下步骤：

将所采取的样本经样本保存液进行样本前处理，随后取30～100μL处理好的待测样本滴加到试剂盒的加样孔处，静置15min，然后插入荧光免疫分析仪进行检测，或者在紫外光下观察，即时可获得检测结果。

具体地，

将所采取的样本经样本保存液进行样本前处理，随后取60μL处理好的待测样本滴加到试剂盒的加样孔处，静置5～20min，然后插入荧光免疫分析仪进行检测，或者在紫外光下观察，即时可获得检测结果。

上述样本前处理的方式为：在塑料软管中加入0.5mL样本保存液，随后将采集样本后的棉棒浸在样本保存液中并搅拌；用手指挤压塑料软管外侧数次，使样本保存液充分浸透棉棒，然后拔出棉棒，绞出的液体即为待测样本。

以下通过免疫层析法对本发明的检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒进行举例说明。

实施例1：

1.新型冠状病毒N蛋白免疫层析检测试剂盒的制备

1)采用荧光微球标记另一株鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体

取0.5mL荧光微球加入1mg碳化二亚胺(EDC)，1mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，于室温，120r/min的转速下搅拌3h，然后加入100μL另一株鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，于室温，120r/min的转速下搅拌1h，再加入10mg BSA封闭液，继续以 120r/min的转速搅拌1h。在2～8℃下，按照12000r/min的转速离心20min，除去上清液。最后，用0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将离心后获得的固体沉淀物复溶至1mL，再加入1μL的Proclin300在4℃下保存待用。

2)采用荧光微球标记兔IgG多克隆抗体

取0.5mL荧光微球加入1mg碳化二亚胺(EDC)，1mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，于室温，120r/min的转速下搅拌3h，然后加入100μL mg羊兔IgG多克隆抗体，于室温，120r/min的转速下搅拌1h，再加入10mg BSA封闭液，继续以120r/min的转速搅拌1h。在2～8℃下，按照11000r/min的转速离心30min，除去上清液。最后，用0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将固体沉淀物复溶至1mL，再加入1μL的Proclin300在4℃下保存待用。

3)包被垫的制备

将一株鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体分别用0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)稀释成1mg/mL，用划膜喷金仪在硝酸纤维素膜(NC膜)上进行划膜。含有一株鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的作为检测线(T线)5，含有羊抗兔多克隆抗体的作为质控线(C线)6，然后在37℃，湿度<30％的环境下干燥4h制成包被垫2。

4)标记物垫的制备

①将玻璃纤维素膜在0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中浸泡6h，然后在35℃下干燥8h，备用。

②将摩尔比为1:1的荧光微球标记的一株鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG标记的荧光微球混合均匀后，按照10μL/cm的速度喷涂在玻璃纤维素膜上，然后放置在45℃下干燥2h制成标记物垫3。标记物垫3上包被有荧光微球标记的一株鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG的地方叫做标记物结合处7。

5)免疫层析检测试剂盒的组装

首先在PVC板1上粘接硝酸纤维膜2，然后在靠近硝酸纤维膜2上的质控线6的一端搭接吸水垫4，在靠近硝酸纤维膜2的检测线5的一端搭接标记物垫3及其连接的样品垫9，用切条机切成4mm±0.1mm的试纸条(见图1)，将试纸条放入卡壳中制备成新型冠状病毒N蛋白免疫层析检测试剂盒。

试剂盒也可以叫做检测卡。

所述卡壳选自现有技术，例如，所述卡壳(如图2所示)可以包括：底槽12，其连接于所述PVC板1；上盖11，其连接于所述底槽12，所述上盖11上设置有用于向所述样品垫9上加样的加样孔13；观察窗14，其设置于上盖11上，用于检测线5和质控线6的数据采集。

如图2B所示，所述底槽12包括：位于其内表面的对称分布的多个定位孔17，多个所述定位孔17之间设有多个用于限定试纸条横向移动的第一限定部18以及用于限定试纸条纵向移动的第二限定部19；对称设置的所述第一限定部18与所述第二限定部19围设成纸条放置区域15(虚线区域)，用于放置试纸条；

如图2A所示，所述上盖11包括：与多个所述定位孔17相配合的多个定位柱16，这样配合使用以将上盖11和底槽12固定在一起；所述上盖11还包括用于限定试纸条的上下移动的第三限定部20。

所述包被垫2的上方设有用于数据采集的观察窗14，以露出全部所述检测线5和质控线6，用于收集其检测结果；且所述观察窗14开设于所述上盖11上与试纸条放置区域15的中部相对应的位置。所述上盖11在与所述样品垫9相对应的位置处开设有加样孔，以用于样品垫9上滴加样本8。所述检测线距离加样孔15-25mm。

2.检测

取60μL的待测样本，通过加样孔向标记物垫上滴加标准品或待测样本，室温静置15min，抗原就会与标记物混合反应并沿着硝酸纤维素膜层析，分别与测试线和质控线反应，然后插入荧光免疫层析分析仪进行检测，仪器自动计算出样本T/C值，通过与正常值范围判断阴阳性。另外当在紫外光照射下呈现出两条荧光条带时，即为阳性。

紫外光也可以叫作紫外线，可以具体使用紫外线灯。

3.性能评价

1)精密度

用3个不同批号的试剂盒分别检测配置浓度为(300±75)ng/mL和(100±25)ng/mL两个样本，每个批号重复检测10次，计算30次测量浓度值结果的平均值M和标准差SD，计算变异系数CV。检测结果如下表1所示。

表1

从表1的数据可以看出，批间变异系数均小于10.92％，说明本发明的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒的精密度较高。

2)灵敏度

以新型冠状病毒N蛋白合成的多肽片段配置，浓度为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL。检测结果如下表2所示。

表2

病毒研究委托中国科学院武汉病毒研究所进行，用含0.2wt％BSA的PB缓冲液将SARS-CoV-2病毒稀释到2000TCID ₅₀/mL，1000TCID ₅₀/mL，750TCID ₅₀/mL，每个水平的病毒重复检测20次。要求病毒水平1000(TCID ₅₀/mL)阳性检出率大于95％。检测结果如下表3所示。

表3

从表3的检测结果中可以看出，在病毒水平为1000TCID ₅₀/mL时病毒稀释液的阳性检出率大于95％。

从表2、表3的检测结果中可以看出，本发明的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒符合灵敏度的要求。

实施例2：

鼻/口咽拭子样本检测

所采取的样本类型包括鼻咽拭子、口咽拭子。

鼻/口咽拭子样本采集后经样本保存液(组成见表4)进行样本前处理，处理方式：在塑料软管中加入0.5mL样本保存液，随后将采集样本后的棉棒浸在样本保存液中并搅拌。用手指挤压塑料软管外侧数次，使样本保存液充分浸透棉棒，然后拔出棉棒，绞出(即将棉棒上采集的样本混合到样本保存液中)的液体即为待测样本。随后取60μL处理好的待测样本滴加到检测卡的加样孔处，静置15min，然后插入荧光免疫层析分析仪进行检测，仪器自动计算出样本T/C值，通过与正常值范围判断阴阳性。另外当在紫外光照射下呈现出两条荧光条带时，即为阳性。临床检测结果如下表5所示。

表4样本保存液的组成

表5

从表5的临床检测数据可以看出，30例阴性样本全部检测为阴性，与临床诊断一致；9例阳性口咽拭子中8例检测为阳性，21例阳性鼻咽拭子中19例检测为阳性，阳性总符合率为90％，检测结果的准确度较高。

实施例3：

口腔拭子/唾液检测

所采取的样本类型包括口腔拭子、唾液。

口腔拭子/唾液样本采集后经样本保存液(组成见表6)进行样本前处理，处理方式：在塑料软管中加入0.5mL样本保存液，随后将采集样本后的棉棒浸在样本保存液中并搅拌。用手指挤压塑料软管外侧数次，使样本保存液充分浸透棉棒，然后拔出棉棒，绞出(即将棉棒上采集的样本混合到样本保存液中)的液体即为待测样本。随后取60μL处理好的待测样本滴加到检测卡的加样孔处，静置15min，然后插入荧光免疫层析分析仪进行检测，仪器自动计算出样本T/C值，通过与正常值范围判断阴阳性。另外当在紫外光照射下呈现出两条荧光条带时，即为阳性。临床检测结果如下表7所示。

表6样本保存液(P.B缓冲液)

表7

从表7的临床检测数据可以看出，口腔拭子样本检测结果，8例阳性样本4例检测为阳性，阳性检出率为50％，12例阴性样本全部检测为阴性，与临床诊断一致；唾液样本检测结果，9例阳性样本4例检测为阳性，阳性检出率为44.4％，11例阴性样本全部检测为阴性，与临床诊断结果一致。

实施例4血清/血浆/全血样本检测

所采取的样本类型包括血清/血浆/全血。

血清/血浆/全血样本采集后可不进行样本前处理，直接将待测样本滴加到检测卡的进样口处静置15min，然后插入荧光免疫层析分析仪进行检测，仪器自动计算出样本T/C值，通过与正常值范围判断阴阳性。另外当在紫外光照射下呈现出两条荧光条带时，即为阳性。临床检测结果如下表8所示。

表8

从表8的临床检测数据可以看出，20例阴性样本全部检测为阴性，与临床诊断一致；20例阳性样本检测全部为阳性，阳性总符合率为100％，检测结果的准确度较高。

实施例5抗原结合位点检测结果

将实施例1的待测样本中的抗原的B细胞线性表位采用IEDB分析资源软件进行筛选和分析，结果如下表9所示。

表9实施例1的标准品或待测样本中的抗原结合位点具体细节表

结合图3与表9可以说明，图3中表示的是抗原结合位点与结合程度的关系，二者存在正相关，对应位点的峰值越大说明与抗原结合的程度越高。从表9中可得出，位点1-51的结合区域为N末端结合，58-154结合区域为RNA-binding结合，164-216为接头区域结合，232-405为C端结合，不同位点结合的多肽序列及片段长度见表3。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

一种检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，其特征在于，包括：

(1)能够结合新型冠状病毒N蛋白的一株抗体；

(2)当新型冠状病毒N蛋白能够结合于(1)中限定抗体时，能够结合于新型冠状病毒N蛋白的标记物标记的另一株抗体。
如权利要求1所述的检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，其特征在于，所述新型冠状病毒N蛋白来源于由新型冠状病毒感染引起的肺炎患者的样本。
如权利要求2所述的检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，其特征在于，所述样本选自鼻咽拭子、口咽拭子、肺泡灌洗液、血液、痰液、口腔拭子或唾液。
如权利要求3所述的检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，其特征在于，所述样本选自血液。
如权利要求4所述的检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，其特征在于，所述血液选自血清、血浆或全血。
如权利要求3所述的检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，其特征在于，所述鼻咽拭子、口咽拭子、痰液、口腔拭子或唾液采用样本保存液进行处理。
如权利要求6所述的检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，其特征在于，所述样本保存液为Tris-HCl缓冲液、PB缓冲液或巴比妥钠-盐酸缓冲液。
如权利要求1所述的检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，其特征在于，所述标记物选自过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、荧光微球、胶体金、三联吡啶钌、吖啶酯或含金属离子物质。
如权利要求1所述的检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，其特征在于，所述能够结合新型冠状病毒N蛋白的一株抗体固定在载体上，所述载体选自微孔板、样品杯、试剂杯、试纸条、纤维素膜、乳胶微球、磁性微球或二氧化硅微球中的一种。
如权利要求1所述的检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，其特征在于，所述样本中新型冠状病毒N蛋白的水平检测通过免疫层析、ELISA、化学发光、磁微粒化学发光、电化学免疫分析或质谱免疫分析实施。
一种检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法通过使用试剂盒检测个体样本中新型冠状病毒N蛋白的水平来确定是否患有新型冠状病毒肺炎；

所述试剂盒包括：(1)能够结合新型冠状病毒N蛋白的一株抗体；(2)当新型冠状病毒N蛋白能够结合于(1)中限定抗体时，能够结合于新型冠状病毒N蛋白的标记物标记的另一株抗体。
如权利要求11所述的检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述样本选自鼻咽拭子、口咽拭子、肺泡灌洗液、血液、痰液、口腔拭子或唾液。
如权利要求11所述的检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述样本中新型冠状病毒N蛋白的水平检测通过免疫层析、ELISA、化学发光、磁微粒化学发光、电化学免疫分析或质谱免疫分析实施。
一种快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其特征在于，包括试纸条，所述试纸条包括检测线及质控线，所述检测线上包被有一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗兔多克隆抗体。
如权利要求14所述的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述试纸条还包括PVC板，所述PVC板上固定有依次连接的样品垫、标记物垫、包被垫及吸水垫，所述包被垫上依次设有检测线及质控线，所述样品垫和标记物垫连接为一体。
如权利要求15所述的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述包被垫靠近检测线的一端连接有标记物垫，靠近质控线的一端连接有吸水垫。
如权利要求16所述的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述标记物垫上包被有标记物标记的另一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和标记物标记的兔IgG，所述标记物标记的另一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和标记物标记的兔IgG的摩尔比为1:0.2～4。
如权利要求17所述的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述标记物为荧光微球、胶体金、胶体硒、彩色乳胶或磁性微球。
如权利要求18所述的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒还包括用于卡设试纸条的卡壳。
如权利要求19所述的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述卡壳包括：

底槽，其连接于所述PVC板；

上盖，其连接于所述底槽，所述上盖上设置有用于向所述样品垫上加样的加样孔；

观察窗，其设置于上盖上并用于检测线和质控线的数据采集。
一种权利要求14-20任一项所述的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)包被垫的制备：将一株抗新型冠状病毒N蛋白抗体和羊抗兔多克隆抗体分别包被到硝酸纤维素膜上，干燥备用；

2)标记物垫的制备：将标记物标记的一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和标记物标记的兔IgG混合后，喷涂在玻璃纤维素膜上，干燥备用；

3)组装试纸条：在PVC板上粘接包被垫，并在靠近该包被垫上的质控线的一端搭接吸水垫，在靠近该包被垫上的检测线的一端搭接标记物垫及其连接的样品垫；然后将其切成所需宽度的试纸条，之后将该试剂条放入卡壳。
一种权利要求14-20任一项所述的用于快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法所用的样本为选自鼻咽拭子、口咽拭子、肺泡灌洗液、口腔拭子或唾液。
如权利要求22所述的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所采取的样本经样本保存液进行样本前处理，随后取30～100μL处理好的待测样本滴加到试剂盒的加样孔处，静置15min，然后插入荧光免疫分析仪进行检测，或者在紫外光下观察，即时可获得检测结果。
如权利要求23所述的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所采取的样本经样本保存液进行样本前处理，随后取60μL处理好的待测样本滴加到试剂盒的加样孔处，静置15min，然后插入荧光免疫分析仪进行检测，或者在紫外光下观察，即时可获得检测结果。
如权利要求24所述的使用方法，其特征在于，所述样本前处理的方式为：在塑料软管中加入0.5mL样本保存液，随后将采集样本后的棉棒浸在样本保存液中并搅拌；用手指挤压塑料软管外侧数次，使样本保存液充分浸透棉棒，然后拔出棉棒，绞出的液体即为待测样本。