CN111060691A - 检测covid-19的荧光免疫层析装置及其使用方法 - Google Patents

检测covid-19的荧光免疫层析装置及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测新型冠状病毒COVID‑19的荧光免疫层析装置及其使用方法，本发明的荧光免疫层析装置实现了灵敏度高、特异性强，准确性高，检测灵敏度可达10pg/ml，而且检测速度快、操作简便，便于携带，对人员要求低，不需由专业人员操作，检测成本低，可应用于医院、机场、海关、疾控中心等多种场所的初步筛查，检测时间短（10‑15分钟），为疑似患者排查和无症状感染者筛查提供更简便、更快速的现场检测手段，从而及早预防疫情扩散。

Description

检测COVID-19的荧光免疫层析装置及其使用方法
技术领域
本发明涉及了生物检测技术领域，特别是涉及了一种检测新型冠状病毒COVID-19的荧光免疫层析装置及其使用方法。
背景技术
2019年12月中旬，在中国武汉首次发现了病因不明的非典型肺炎(atypicalpneumonia)，科学研究表明，其是由一种新型冠状病毒COVID-19引发的。新型冠状病毒COVID-19感染的肺炎以发热、乏力、干咳等为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状。重症病例多在1周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。迄今COVID-19还没有针对性的特效药。一些个案报道的治疗药物仍需更多的临床实践证明效果，相关疫苗的研发也在开展中，但距离临床应用尚需时间。当务之急是尽快研究有效的诊断试剂，早诊断、早隔离、切断传播途径，控制疫情蔓延。
目前针对新型冠状病毒COVID-19的检测主要是以PCR为基础的病毒核酸检测，检测原理就是以病毒独特的基因序列为检测靶标，通过PCR扩增，使我们选择的这段靶标DNA序列指数级增加，每一个扩增出来的DNA序列，都可与预先加入的一段荧光标记探针结合，产生荧光信号，扩增出来的靶基因越多，累积的荧光信号就越强。而没有病毒的样本中，由于没有靶基因扩增，因此就检测不到荧光信号增强。所以，核酸检测，其实就是通过检测荧光信号的累积来确定样本中是否有病毒核酸。
新型冠状病毒COVID-19核酸检测有较高的特异性和灵敏度，但是该检测方法对技术要求高，标本需要特殊处理，要求具备PCR扩增仪及凝胶电泳等专业的仪器设备，对新型冠状病毒的检测用时长，需专业技术人员操作和判断检测结果，无法应用于社区医院、海关、疾控中心等基层的早期初步筛查。
因此，亟需一种更早期、更灵敏、更快捷、更有效的检测新型冠状病毒COVID-19的诊断试剂，进行早期鉴别诊断。
发明内容
为了弥补已有技术的缺陷，本发明提供一种检测新型冠状病毒COVID-19的荧光免疫层析装置及其使用方法，实现了灵敏度高、特异性强，而且速度快、操作简便，可应用于社区医院、机场、海关、疾控中心等多种场所的初步筛查，能够在15分钟内判断结果，为疑似患者排查和无症状感染者筛查提供更简便、更快速的现场检测手段，从而及早预防疫情扩散。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
根据本发明的一方面，提供了一种检测新型冠状病毒COVID-19的荧光免疫层析装置，包括试纸条，所述试纸条包括依次相连的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；所述结合垫上包被有铕微球标记的新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和铕微球标记的兔IgG抗体，所述铕微球标记中所采用的铕微球的粒径为550-650nm，所述新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体之间的质量浓度之比为（1-3）：1；所述反应垫上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线上包被有新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体。
进一步地，所述反应垫为Millipore 180硝酸纤维素膜。
进一步地，所述试纸条还包括承载所述样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫的底板；所述样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫之间相互交叠连接；所述质控线上包被有羊抗兔IgG抗体。
进一步地，所述新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体为SARS冠状病毒NP蛋白单克隆抗体。
进一步地，所述荧光免疫层析装置还包括时间分辨荧光免疫分析仪。
进一步地，所述样品垫是经过样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜或无纺布或滤纸，所述样品垫处理液含有如下组分：Tween 20、Triton x-405、Casein、BSA、PEG-20000和NaCl。
进一步地，所述样品垫处理液含有如下质量分数的组分：0.05%-0.3% Tween 20、0.4%-0.6% Triton x-405、0.4%-0.6% Casein、0.4%-0.6% BSA、0.05%-0.2% PEG-20000和1%-3% NaCl。
进一步地，所述样品垫处理液的pH为8.4-8.6。
进一步地，所述荧光免疫层析装置还包括样品稀释液，所述样品稀释液为含有体积分数0.05%-0.2% Tween 20和体积分数0.4%-0.6%Casein 的0.1M PBS溶液。
根据本发明的另一方面，提供了上述荧光免疫层析装置的使用方法，包括如下步骤：
将样品加入到样品稀释液中进行处理，得到样品溶液；
将适量样品溶液添加到试纸条的样品垫上，用时间分辨荧光免疫分析仪进行检测。
进一步地，所述样品包括鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液、尿液中的至少一种。
进一步地，所述样品包括鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液、尿液中的至少两种。
本发明具有如下有益效果：
本发明中，通过在铕微球标记中采用粒径为550-650nm的铕微球，所述新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体之间的质量浓度之比为（1-3）：1，可以增加抗原抗体的结合效率，有效提高荧光免疫层析检测新型冠状病毒COVID-19的灵敏度，可实现新型冠状病毒COVID-19的现场快速鉴别。
本发明中，设计了样品垫处理液方案及样品稀释液方案，实现了对鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液、尿液等多种样品类型的检测；将各种样品分别用本申请特定的样品稀释液进行处理，同时样品垫采用本申请中特定样品垫处理液进行处理，可以使得滴加到试纸条上的各样品溶液成分相对一致，容易和试纸条的反应系统匹配，有效降低了样品对检测的干扰，实现同种试纸条检测多样本类型，可以让检测时间延长，可以有效检出3-10天发病的病人，可有助于提高新型冠状病毒的检出率，避免“假阴性”结果，进一步提升检查准确率。
本发明的荧光免疫层析装置实现了灵敏度高、特异性强，准确性高，检测灵敏度可达10pg/ml，而且检测速度快、操作简便，便于携带，对人员要求低，不需由专业人员操作，检测成本低，可应用于医院、机场、海关、疾控中心等多种场所的初步筛查，检测时间短（10-15分钟），为疑似患者排查和无症状感染者筛查提供更简便、更快速的现场检测手段，从而及早预防疫情扩散。
具体实施方式
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
如无特殊说明，本说明书中的术语的含义与本领域技术人员一般理解的含义相同，但如有冲突，则以本说明书中的定义为准。
本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“由…组成”和“基本上由…组成”。本发明的组合物和方法/工艺包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组分、步骤或限制项组成。
在说明书和权利要求书中使用的涉及组分量、工艺条件等的所有数值或表述在所有情形中均应理解被“约”修饰。涉及相同组分或性质的所有范围均包括端点，该端点可独立地组合。由于这些范围是连续的，因此它们包括在最小值与最大值之间的每一数值。还应理解的是，本申请引用的任何数值范围预期包括该范围内的所有子范围。
正如背景技术部分所介绍的，对于新型冠状病毒COVID-19的检测而言，核酸检测具有检测特异性好、检测灵敏度高等优点，但是耗时长，需专业技术人员操作和判断检测结果，无法应用于社区医院、海关等基层的早期初步筛查。亟需一种更早期、更灵敏、更快捷、更有效的检测新型冠状病毒COVID-19的诊断试剂，进行早期鉴别诊断。
基于此，本发明的第一目的是提供一种检测新型冠状病毒COVID-19的荧光免疫层析装置，实现了灵敏度高、特异性强，而且速度快、操作简便，可应用于医院、机场、海关、疾控中心等多种场所的初步筛查，能够在15分钟内判断结果，为疑似患者排查和无症状感染者筛查提供更简便、更快速的现场检测手段，从而及早预防疫情扩散。
本申请实施例中的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
一种检测新型冠状病毒COVID-19的荧光免疫层析装置，包括试纸条和样品稀释液；所述试纸条包括依次相连的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫，所述样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫之间相互交叠连接，所述样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫设于底板上。
具体的，所述样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫均设置在底板的上方，所述样品垫设置在底板的一端的边缘，结合垫设置在样品垫内侧并与样品垫部分重叠；结合垫上包被有铕微球标记的新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和铕微球标记的兔IgG抗体；所述吸水垫设置在底板的另一端，反应垫设置在结合垫与吸水垫之间并分别与两者部分重叠；所述反应垫上设有检测线和质控线，所述检测线设置在反应垫上靠近结合垫的一端，所述质控线喷涂在靠近吸水垫的一端。
结合垫
所述结合垫上包被有铕微球标记的新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和铕微球标记的兔IgG抗体，所述铕微球标记中所采用的铕微球的粒径为550-650nm，更优选地，所述铕微球标记中所采用的铕微球的粒径为600nm，所述新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体之间的质量浓度之比为（1-3）：1，更优选地，所述铕微球标记中所述新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体之间的质量浓度之比为2：1。
时间分辨荧光免疫分析技术(Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是近几年来发展起来的一种非同位素免疫分析技术，该技术操作简便、易实现自动化，可有效地排除非特异荧光的干扰，在分析灵敏度上有了很大的提高。但是目前国内关于时间分辨荧光免疫层析技术检测新型冠状病毒COVID-19的研究报道较少，市面上还没有新型冠状病毒COVID-19荧光免疫层析产品用于检测抗原，针对新型冠状病毒COVID-19这种新型抗原的检测，如何采用时间分辨荧光免疫层析技术提高检测新型冠状病毒COVID-19的灵敏度仍然是技术难题。发明人预料不到地发现，通过在铕微球标记中采用粒径为550-650nm的铕微球，所述新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体之间的质量浓度之比为（1-3）：1，可以增加抗原抗体的结合效率，有效提高荧光免疫层析检测新型冠状病毒COVID-19的灵敏度，可实现新型冠状病毒COVID-19的现场快速鉴别。
本申请实施例中，对所述结合垫的材料不作特别限定，可采用本领域技术人员熟知的材料即可，作为优选，所述结合垫为玻璃纤维膜。
上述试纸条中，所述结合垫上包被有铕微球标记的新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和铕微球标记的兔IgG抗体，该新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体可与新型冠状病毒COVID-19特异性结合。满足试纸条检测的灵敏度要求，同时也可满足与羊抗兔多抗结合的要求。
本发明中采用铕微球进行标记取代传统的胶体金颗粒，制备成免疫层析试纸条，结合时间分辨荧光免疫分析仪进行信号采集，灵敏度大大提高，且兼具胶体金检测操作简便、测定快速的优点，特别适合于现场快速定量检测和基层大规模筛选检测。
良好质量的铕微球是获得优良性能的荧光免疫层析试纸条的前提，适度大小的铕微球的选择，是荧光免疫层析试纸条制备的关键，必须综合考虑检测样品，选择合适粒径的铕微球颗粒。而本发明验证发现，铕微球的粒径为550-650nm时，新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和铕微球的结合性能更为理想，对于样品中新型冠状病毒COVID-19的吸收更为有效，可以大大提高荧光免疫层析检测新型冠状病毒COVID-19的灵敏度。
需要说明的是，本发明中对铕微球的具体的制备方法没有特别的限制，为本领域技术人员熟知的制备方法即可。
本申请中，铕微球标记的新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和铕微球标记的兔IgG抗体的制备是将新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体按照质量浓度之比为（1-3）：1混合后，再加入铕微球进行标记。
本发明中，对具体的标记过程不作特别限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。
根据中科院的最新研究文章“Evolution of the novel coronavirus from theongoing Wuhan outbreak and modeling of its spike protein for risk of humantransmission”，证实COVID-19与2003年“非典”SARS冠状病毒一样，同属于冠状病毒科、冠状病毒亚科、β属冠状病毒。通过基因序列比对，COVID-19与SARS-CoV有约70%相似性。类似其它的冠状病毒，COVID-19与SARS-CoV的基因编码结构蛋白包括膜刺突蛋白(spikeglycoprotein，S)、包膜小蛋白(smallenvelope，E)、膜蛋白(membrane，M)和核衣壳蛋白(nucleocapsidprotein，NP)。新型冠状病毒NP蛋白和SARS冠状病毒 NP蛋白的氨基酸同源性在90%左右。
本申请中，所述新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体为SARS冠状病毒NP蛋白单克隆抗体，由于新型冠状病毒NP蛋白和SARS冠状病毒 NP蛋白的氨基酸同源性高，SARS冠状病毒NP蛋白单克隆抗体可以用于新型冠状病毒的抗原诊断。
发明人发现，采用SARS冠状病毒NP蛋白单克隆抗体作为新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体，构建的荧光免疫试纸条特异性好、灵敏度高。
本申请中，对SARS冠状病毒NP蛋白单克隆抗体的来源不作特别限定，可以采用本领域技术人员熟知的符合上述要求的市售商品，也可按照本领域技术人员常用的方法制备得到符合上述要求的。作为举例，SARS冠状病毒NP蛋白单克隆抗体可以采用重组SARS NP蛋白通过动物免疫筛选得到，重组SARS NP蛋白制备按常规方法进行，动物免疫按照常规方法进行，详细地制备方法可参照使用手册。
反应垫
所述反应垫上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线上包被有新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体。
所述反应垫为Millipore 180硝酸纤维素膜。需要说明的是，180硝酸纤维素膜的层析速度是180s/4cm。在荧光免疫层析试纸条中，反应垫用作检测线和质控线的承载体，同时也是免疫反应的发生处，所以反应垫的种类对于检测结果的特异性、灵敏度、显色及背景颜色等方面均有显著的影响。为提升检测的特异性、灵敏度并便于观察，本发明对多种不同种类的反应垫进行了优化考察，结果发现，采用Millipore 180硝酸纤维素膜作为反应垫，无背景显色、检测线显色深、无非特异性显色，且可降低爬速，延长反应时间，可以大大提高检测的灵敏度。
所述质控线上包被有羊抗兔IgG抗体。选用羊抗兔二抗，该抗体效价优于羊抗鼠抗体，同时便于大量制备和纯化。
样品垫
所述样品垫是经过样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜或无纺布或滤纸，所述样品垫处理液含有如下组分：Tween 20、Triton x-405、Casein、BSA、PEG-20000和NaCl。
具体的，所述样品垫处理液中包括的各物质的质量分数分别是0.05%-0.3% Tween20、0.4%-0.6% Triton x-405、0.4%-0.6% Casein、0.4%-0.6% BSA、0.05%-0.2% PEG-20000和1%-3% NaCl，所述样品垫处理液的pH为8.4-8.6；更优选地，所述样品垫处理液中包括的各物质的质量分数分别是0.1% Tween 20、0.5% Triton x-405、0.5% Casein、0.5% BSA、0.1% PEG-20000和1.5% NaCl。
不同组成的样品垫处理液对荧光免疫层析试纸条的反应速度、反应垫的背景颜色、特异性和灵敏度等方面均有影响，尤其在荧光免疫层析试纸条用于多种样品的联合检测时，由于样品基质不同，对试纸条的反应系统要求也不一样。本申请人通过深入研究发现，含有Tween 20、Triton x 405、Casein、BSA、PEG-20000和NaCl的样品垫处理液抗基质干扰效果好，具有最佳的检测效果，有助于荧光免疫层析装置实现多种样品中联合检测新型冠状病毒COVID-19，有助于提高新冠病毒检出率。
样品稀释液
所述样品稀释液为含有体积分数0.05%-0.2% Tween 20和体积分数0.4%-0.6%Casein的0.1M PBS溶液，更优选地，所述样品稀释液为含有体积分数0.1% Tween 20和体积分数0.5%Casein 的0.1M PBS溶液。
需要说明的是，所述荧光免疫层析装置包括样品稀释液试剂瓶，用于存放样品稀释液。
现有技术中，检测新型冠状病毒COVID-19的样品通常包括鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液、尿液等，不同类型的样品中的新型冠状病毒COVID-19抗原出现时间不太一致。本发明人经过研究发现，采用同种试纸条分别单独检测几种样品，通过几种样品类型的组合检测，可以让检测时间延长，可以有效检出3-10天发病的病人，可有助于提高新型冠状病毒的检出率，避免“假阴性”结果，进一步提升检查准确率。
但是因为样品的类型不同，样品中相关成分不太一样，包括了PH、蛋白、离子强度等均不太一样，其对试纸条的反应系统要求也不一样，将不同类型的样品采用同种试纸条组合检测时，样品基质干扰性大。为了解决上述问题，发明人经过深入研究后发现，将各种样品分别用本申请特定的样品稀释液进行处理，同时样品垫采用本申请中特定样品垫处理液进行处理，可以使得滴加到试纸条上的各样品溶液成分相对一致，容易和试纸条的反应系统匹配，有效降低了样品对检测的干扰，实现同种试纸条检测多样本类型，可以让检测时间延长，可以有效检出3-10天发病的病人，可有助于提高新型冠状病毒的检出率，避免“假阴性”结果，进一步提升检查准确率。
吸水垫
所述吸水垫可以用任何能吸收液体的材料制成，但吸收能力应足够大。可使用的材料包括但不局限于脱脂棉吸水垫、硅胶吸水垫或海绵吸水垫。
底板
所述底板用于承载所述样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；所述底板可以是各种不吸水的具有支撑作用的薄片，作为举例，所述底板可以为PVC板、PP板、PE板或PU板，优选为PVC板。
需要说明的是，本发明的荧光免疫层析装置还包括壳体，所述试纸条放置在所述壳体内形成检测卡，所述壳体上设置有加样孔和观察窗，所述加样孔与所述试纸条上的样品垫对应，所述观察窗与所述反应垫上的检测线和质控线对应。
本发明的试纸条的检测原理为：试纸条根据双抗体夹心法原理检测样品中是否含有新型冠状病毒COVID-19抗原。在试纸条的样品垫上滴加样品后，在层析作用下，样品溶液向结合垫移动，流经结合垫时，铕微球标记的抗体将被溶解。当样品中含有新型冠状病毒COVID-19抗原时，新型冠状病毒COVID-19抗原将和铕微球标记的抗体结合，形成铕微球标抗体-抗原复合物，由于层析作用反应复合物移至反应垫的检测线时形成铕微球标抗体-抗原-抗体复合物，铕微球标记抗体被固定下来，铕微球在时间分辨荧光免疫分析仪中的激发灯源下发出荧光条带，呈阳性反应，多余的铕微球标记抗体移至质控线被羊抗兔IgG捕获；当样品中不含有新型冠状病毒COVID-19抗原时，检测区不出现荧光条带，呈阴性反应。
第二方面，本发明提供了上述荧光免疫层析装置的使用方法，包括如下步骤：
将样品加入到样品稀释液中进行处理，得到样品溶液；
需要说明的是，将样品加入到样品稀释液中进行处理是将采集的样品加入样品稀释液中进行混匀。
将适量样品溶液添加到试纸条的样品垫上，用时间分辨荧光免疫分析仪进行检测来评定样品的阴、阳性。
需要说明的是，本申请实施例中，优选吸入100μL的样品溶液添加到试纸条的样品垫上，注意不要吸入气泡。
需要说明的是，用时间分辨荧光免疫分析仪进行检测包括两种方式；一种方式为标准测试，是指将适量样品溶液添加到试纸条的样品垫上后立即将试纸条放入时间分辨荧光免疫分析仪中，时间分辨荧光免疫分析仪自动进行计数，反应倒计时8-15分钟结束后，时间分辨荧光免疫分析仪自动进行检测，并记录、读取和打印检测结果；另一种方式为即时测试，是指将适量样品溶液添加到试纸条的样品垫上，反应8-15分钟后，将试纸条放入时间分辨荧光免疫分析仪进行检测，并记录、读取和打印检测结果。
采用时间分辨荧光免疫分析仪进行检测可以是定性检测，也可以是定量检测。
定性检测时，铕微球在时间分辨荧光免疫分析仪中激发灯源下，发出强烈的荧光条带；当样品中含有新型冠状病毒COVID-19抗原时，检测线和质控线上均出现一条荧光条带，检测样品即为阳性；当样品中不含有新型冠状病毒COVID-19抗原时，检测线无荧光条带，质控线有一条荧光条带，检测样品即为阴性；质控线、检测线均不呈现荧光条带，说明试纸条失效。
定量检测时，以新型冠状病毒COVID-19系列标准品作为被检测样品，采用所述的时间分辨荧光免疫分析仪进行检测，用时间分辨荧光免疫分析仪进行结果显示，绘制标准曲线；然后将上述样品溶液作为被检测样品，采用所述的时间分辨荧光免疫分析仪进行检测，用时间分辨荧光免疫分析仪进行结果显示，并结合标准曲线进行定量分析。
所述样品包括鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液、尿液中的至少一种，更优选地，所述样品包括鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液、尿液中的至少两种，将所述样品分别单独进行检测。
为了更好的理解上述技术方案，下面将结合具体的实施例对上述技术方案进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。
实施例1
一种检测新型冠状病毒COVID-19的荧光免疫层析装置，包括试纸条。
所述试纸条包括底板和设于底板上方的依次相连的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；所述结合垫上包被有铕微球标记的新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和铕微球标记的兔IgG抗体，所述铕微球标记中所采用的铕微球的粒径为610nm；所述新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体之间的质量浓度之比为1.5：1；所述反应垫上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线上包被有新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗兔IgG抗体。
所述新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体为SARS冠状病毒NP蛋白单克隆抗体。所述反应垫为Millipore 180硝酸纤维素膜；所述样品垫是玻璃纤维膜或无纺布或滤纸。
上述荧光免疫层析装置的使用方法，包括如下步骤：
将样品和样品稀释液进行混匀，得到样品溶液；其中，所述样品为鼻咽拭子。
将适量样品溶液添加到试纸条的样品垫上，反应10分钟后，将试纸条放入时间分辨荧光免疫分析仪进行检测来评定样品的阴、阳性。
实施例2
一种检测新型冠状病毒COVID-19的荧光免疫层析装置，包括试纸条和样品稀释液。
所述试纸条包括底板和设于底板上方的依次相连的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；所述结合垫上包被有铕微球标记的新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和铕微球标记的兔IgG抗体，所述铕微球标记中所采用的铕微球的粒径为600nm，所述新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体之间的质量浓度之比为2：1；所述反应垫上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线上包被有新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗兔IgG抗体。
所述新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体为SARS冠状病毒NP蛋白单克隆抗体。所述反应垫为Millipore 180硝酸纤维素膜。
所述样品垫是经过样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜或无纺布或滤纸，所述样品垫处理液含有如下质量分数的组分：0.1% Tween 20、0.5% Triton x-405、0.5% Casein、0.5% BSA、0.1% PEG-20000和1.5% NaCl，所述样品垫处理液的pH为8.4-8.6。
所述样品稀释液为含有体积分数0.1% Tween 20和体积分数0.5%Casein 的0.1MPBS溶液。
上述荧光免疫层析装置的使用方法，包括如下步骤：
将样品和样品稀释液进行混匀，得到样品溶液；其中，所述样品为鼻咽拭子、痰液和肺泡灌洗液；
将适量样品溶液添加到试纸条的样品垫上后，立即将试纸条放入时间分辨荧光免疫分析仪中，时间分辨荧光免疫分析仪自动进行计数，反应倒计时10分钟结束后，时间分辨荧光免疫分析仪自动进行检测。
实施例3
一种检测新型冠状病毒COVID-19的荧光免疫层析装置，包括试纸条和样品稀释液。
所述试纸条包括底板和设于底板上方的依次相连的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；所述结合垫上包被有铕微球标记的新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和铕微球标记的兔IgG抗体，所述铕微球标记中所采用的铕微球的粒径为550nm，所述新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体之间的质量浓度之比为1：1；所述反应垫上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线上包被有新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗兔IgG抗体。
所述新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体为SARS冠状病毒NP蛋白单克隆抗体。所述反应垫为Millipore 180硝酸纤维素膜。
所述样品垫是经过样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜或无纺布或滤纸，所述样品垫处理液含有如下质量分数的组分：0.05% Tween 20、0.4% Triton x-405、0.4%Casein、0.4% BSA、0.05% PEG-20000和1% NaCl，所述样品垫处理液的pH为8.4-8.6。
所述样品稀释液为含有体积分数0.05% Tween 20和体积分数0.4%%Casein 的0.1M PBS溶液。
上述荧光免疫层析装置的使用方法，包括如下步骤：
将样品和样品稀释液进行混匀，得到样品溶液；其中，所述样品为鼻咽拭子和尿液；
将适量样品溶液添加到试纸条的样品垫上，反应10分钟后，将试纸条放入时间分辨荧光免疫分析仪进行检测来评定样品的阴、阳性。
实施例4
一种检测新型冠状病毒COVID-19的荧光免疫层析装置，包括试纸条和样品稀释液。
所述试纸条包括底板和设于底板上方的依次相连的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；所述结合垫上包被有铕微球标记的新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和铕微球标记的兔IgG抗体，所述铕微球标记中所采用的铕微球的粒径为650nm，所述新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体之间的质量浓度之比为3：1；所述反应垫上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线上包被有新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗兔IgG抗体。
所述新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体为SARS冠状病毒NP蛋白单克隆抗体。所述反应垫为Millipore 180硝酸纤维素膜。
所述样品垫是经过样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜或无纺布或滤纸，所述样品垫处理液含有如下质量分数的组分：0.3% Tween 20、0.6% Triton x-405、0.6% Casein、0.6% BSA、0.2% PEG-20000和3% NaCl，所述样品垫处理液的pH为8.4-8.6。
所述样品稀释液为含有体积分数0.2% Tween 20和体积分数0.6%Casein 的0.1MPBS溶液。
上述荧光免疫层析装置的使用方法，包括如下步骤：
将样品和样品稀释液进行混匀，得到样品溶液；其中，其中，所述样品为痰液、肺泡灌洗液和血液；
将适量样品溶液添加到试纸条的样品垫上后，立即将试纸条放入时间分辨荧光免疫分析仪中，时间分辨荧光免疫分析仪自动进行计数，反应倒计时10分钟结束后，时间分辨荧光免疫分析仪自动进行检测。
新型冠状病毒COVID-19的荧光免疫层析装置性能评价
（1）灵敏度检测
用本发明的检测新型冠状病毒COVID-19的荧光免疫层析装置对不同浓度的新型冠状病毒COVID-19进行检测。检测，本荧光免疫层析装置对新型冠状病毒COVID-19的灵敏度为10pg/ml。
（2）特异性检测
用本发明的荧光免疫层析装置对流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒进行检测，检测，对流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒的检测结果均为阴性。说明本发明的试纸条可对新型冠状病毒COVID-19进行特异性检测，而对其它成分无特异性反应。
（3）稳定性测试；
将用本发明方法制作好的试纸条装入密封袋内，内置干燥剂，置于45℃烘箱内保存，分别于7天、14天、21天、28天、35天取出，检测试纸条的稳定性。检测，45℃保存7天、14天、21天、28天、35天检测结果均无明显变化。
（4）临床样品检测一
开展的临床样品数是100例，其中包括10例确诊病例，这10例确诊病例核酸检测结果是阳性，我们的检测装置检测结果也是阳性，一致率达到100%；其中22例为疑似病例，具体试验结果参见表1。
Figure 191464DEST_PATH_IMAGE001
续表1
Figure 639763DEST_PATH_IMAGE002
续表1
Figure 340871DEST_PATH_IMAGE003
续表1
Figure 142605DEST_PATH_IMAGE004
（5）临床样品检测二
检测样品为鼻咽拭子，临床样品数是194例，临床试验结果如表2：
Figure 409507DEST_PATH_IMAGE005
关于符合率
根据核酸检测结果，将研究对象分为病例组和对照组，将考核试剂检测结果与此结果进行比较，符合率计算结果如下：
阳性符合率＝135/（135+14）×100%=90.60% ；
阴性符合率＝44/（1+44）×100%=97.78% ；
总符合率＝（135+44）/（135+1+14+44）×100%=92.27%。
关于95%置信区间：
（阳性）95%置信区间= =（86.49%，94.71%）
（阴性）95%置信区间= =（95.71%；99.85%）
（总符合率）95%置信区间= =（88.51%，96.03%）
关于Kappa一致性检验
经SPSS软件进行Kappa一致性检验，一致性系数Kappa=0.803>0.75，Z=11.350，P=0.000（p＜0.001），说明考核试剂和核酸检测结果一致性好，统计结果表3。
Figure 169653DEST_PATH_IMAGE006
关于和PCR CT值比对分析
和PCR试剂CT值比对，可得出，其中CT 36的 19例检出12例，CT35的39例检出33例，CT34的9例检出8例，CT19-33的82例全部检出。本装置CT33以上标本可有效检出。
以上结果表明深圳市易瑞生物技术股份有限公司生产的检测COVID-19的荧光免疫层析装置的检测结果与核酸检测结果一致性较好，在新型冠状病毒抗原检测功能上能满足临床应用的需要。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种检测新型冠状病毒COVID-19的荧光免疫层析装置，包括试纸条，所述试纸条包括依次相连的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；其特征在于，所述结合垫上包被有铕微球标记的新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和铕微球标记的兔IgG抗体，所述铕微球标记中所采用的铕微球的粒径为550-650nm，所述新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体之间的质量浓度之比为（1-3）：1；所述反应垫上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线上包被有新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体；所述新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体为SARS冠状病毒NP蛋白单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的荧光免疫层析装置，其特征在于，所述反应垫为Millipore 180硝酸纤维素膜。
3.如权利要求1所述的荧光免疫层析装置，其特征在于，所述试纸条还包括承载所述样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫的底板；所述样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫之间相互交叠连接；所述质控线上包被有羊抗兔IgG抗体。
4.如权利要求1所述的荧光免疫层析装置，其特征在于，所述荧光免疫层析装置还包括时间分辨荧光免疫分析仪。
5.如权利要求1所述的荧光免疫层析装置，其特征在于，所述样品垫是经过样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜或无纺布或滤纸，所述样品垫处理液含有如下组分：Tween 20、Triton x-405、Casein、BSA、PEG-20000和NaCl。
6.如权利要求5所述的荧光免疫层析装置，其特征在于，所述样品垫处理液含有如下质量分数的组分：0.05%-0.3% Tween 20、0.4%-0.6% Triton x-405、0.4%-0.6% Casein、0.4%-0.6% BSA、0.05%-0.2% PEG-20000和1%-3% NaCl；所述样品垫处理液的pH为8.4-8.6。
7.如权利要求1所述的荧光免疫层析装置，其特征在于，所述荧光免疫层析装置还包括样品稀释液，所述样品稀释液为含有体积分数0.05%-0.2% Tween 20和体积分数0.4%-0.6%Casein 的0.1M PBS溶液。
8.如权利要求1-7任一项所述荧光免疫层析装置的使用方法，包括如下步骤：
将样品加入到样品稀释液中进行处理，得到样品溶液；
将适量样品溶液添加到试纸条的样品垫上，用时间分辨荧光免疫分析仪进行检测。
9.如权利要求8所述荧光免疫层析装置的使用方法，其特征在于，所述样品包括鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液、尿液中的至少一种。
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