CN113004396A - 抗新型冠状病毒的单克隆抗体及抗体组合以及其在该病毒抗原检测中的应用 - Google Patents
抗新型冠状病毒的单克隆抗体及抗体组合以及其在该病毒抗原检测中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明总体涉及抗新型冠状病毒的单克隆抗体及抗体组合以及其在该病毒抗原检测中的应用，本发明还涉及抗体的抗原结合部分、编码核酸分子、载体和宿主细胞。
Description
技术领域
本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及抗新型冠状病毒的单克隆抗体及抗体组合以及其在该病毒抗原检测中的应用。
背景技术
国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2，世界卫生组织将感染此病毒引起的肺炎称为COVID-19。此病毒传染性强，传播途径广。该病毒能迅速适应人体环境，感染后在潜伏期即具有传播能力，同时还有一些无症状感染者报道，甚至在多种动物体内也检测到病毒核酸。这些因素使得对该病毒的防控变的非常复杂，而且目前没有有效治疗药物及疫苗上市。
SARS-CoV-2属于冠状病毒属，为单股正链RNA病毒，大小约30kb，与 SARS-CoV相似性为79％，与蝙蝠体内分离的冠状病毒(Coronavirus，CoV) 相似性最高约88％。SARS-CoV-2具有典型的冠状病毒特征，病毒包膜上有典型的棘突，形似日冕。核衣壳为螺旋对称型，主要结构蛋白是核衣壳蛋白 (Nucleocapsid protein,NP)，NP全长420个氨基酸。NP在病毒结构蛋白中含量最多，在宿主感染早期大量表达，且免疫原性较强，能引起宿主强烈的免疫应答。因此，NP可作为SARS-CoV-2感染血清学诊断的主要靶标抗原。
由于特异性治疗药物及有效疫苗尚未研发成功，早期诊断成为防控疫情重要的措施，早期核酸诊断及临床诊断为确诊重要依据。虽然核酸诊断速度快，受采样的质量的影响大，存在假阳性和假阴性，影响防控措施的落实。部分无症状感染者在病程晚期核酸检测也呈阴性，单凭核酸检测很容易出现漏诊。血清学诊断是检测病原感染后机体的免疫反应，持续时间长，免疫反应稳定，且免疫反应随着病程进展呈动态变化趋势。因此，血清学诊断同样也是早期诊断和感染现状评价的的重要手段。
发明内容
本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合新型冠状病毒 NP蛋白。
在一些实施方案中，所述抗体包括特异性结合新型冠状病毒NP蛋白的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，结合新型冠状病毒NP蛋白的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、结构域抗体、单链、Fab片段、F(ab’)2片段、scFv、 scAb、dAb、单一结构域重链抗体或单一结构域轻链抗体。在一些实施方案中，此类结合新型冠状病毒NP蛋白的抗体或其抗原结合片段是小鼠、其他啮齿动物、嵌合、人源化或全人单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含VH CDR1、VH CDR2、 VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3；其中，
VH CDR1含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
VH CDR2含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
VH CDR3含有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
VL CDR1含有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；
VL CDR2含有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；
VL CDR3含有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含VH CDR1、VH CDR2、 VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3；其中，
VH CDR1含有与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
VH CDR2含有与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
VH CDR3含有与SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
VL CDR1含有与SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
VL CDR2含有与SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
VL CDR3含有与SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含VH、VL；其中，VH 含有SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列，VL含有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含VH、VL；其中，VH含有与SEQID NO.4所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，VL含有与SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
本发明还提供了包含前面所述的抗体或其抗原结合片段的缀合物。
进一步，所述缀合物还包含可检测部分。可检测部分包括例如标记或标记物。一些实施方案中，可检测标记包括成像剂、造影剂、酶、荧光标记、发色团、染料、一种或多种金属离子或基于配体的标记。成像剂包括放射性同位素，造影剂包括碘、钆或氧化铁。酶包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。一些实施方案中，荧光标记包含黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、修饰的红色荧光蛋白(mRFP)、红色荧光蛋白tdimer2(RFP tdimer2)、 HCRED或铕衍生物。一些实施方案中，发光标记包含N-甲基吖啶鎓 (methylacrydium)衍生物。一些实施方案中，标记包含Alexa
标记，诸如Alex
680或Alexa
750。一些实施方案中，基于配体的标记包含生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或一种或多种半抗原。
本发明还提供了包含前面所述的抗体或其抗原结合片段的试剂盒。
本发明还提供了包含前面所述的缀合物的试剂盒。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括第二种抗体，所述第二种抗体包含VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3；其中，
VH CDR1含有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；
VH CDR2含有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；
VH CDR3含有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列；
VL CDR1含有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列；
VL CDR2含有SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列；
VL CDR3含有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括第二种抗体，所述第二种抗体包含VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3；其中，
VH CDR1含有与SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
VH CDR2含有与SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
VH CDR3含有与SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
VL CDR1含有与SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
VL CDR2含有与SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
VL CDR3含有与SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第二种抗体包含VH、VL；其中，VH含有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，VL含有SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第二种抗体包含VH、VL；其中，VH含有与SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，VL含有与SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
本发明还提供了分离的核酸分子，其编码前面所述的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO.17、18所示的序列。
本发明的编码前面所述的抗体或其抗原结合片段的核酸分子包括具有上述优选的核苷酸序列的保守核苷酸序列变体的核酸分子。所谓的保守核苷酸序列变体源于遗传密码简并和沉默的变体，核苷酸的替代、缺失和增加也包含在内。
本发明还提供了一种载体，所述载体包含前面所述的核酸分子，此外，还包括与所述核酸分子序列操作性相连的表达调控序列。
本发明中“载体”一词指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或 P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞导入了前面所述的载体。
本发明中“宿主细胞”一词指的是导入载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa 细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。
本发明还提供了一种制备抗体的方法，所述方法包含培养前面所述的宿主细胞。
本发明还提供了一种通过上述方法产生的抗体或抗原结合片段。
本发明还提供了一种非诊断目的的检测新型冠状病毒或其NP蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取含有新型冠状病毒或其NP蛋白的样品；
(2)将步骤(1)获取的样品与前面所述的抗体或其抗原结合片段接触；
(3)检测样品与抗体或其抗原结合片段的免疫反应。
本发明还提供了前面所述的抗体或其抗原结合片段在制备前面所述的缀合物中的应用。
本发明还提供了前面所述的抗体或其抗原结合片段在制备新型冠状病毒检测产品中的应用。
本发明还提供了前面所述的抗体或其抗原结合片段在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用。
本发明的抗体或其抗原结合部分可用于检测患者样品中的靶标因此可用作诊断剂。例如，本发明的抗体或其抗原结合部分用于体外测定法，例如，ELISA，以检测患者样品中的靶标水平。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分固定在固体支持物(例如，微量滴定板的孔)上。固定的抗体或其抗原结合部分用作测试样品中可存在的任何靶标的捕获抗体。将固定的抗体或其抗原结合部分与患者样品接触之前，将固体支持物清洗，和用封闭试剂诸如乳蛋白或白蛋白处理以防止分析物的非特异性吸附。
随后，将孔用疑似含有抗原的测试样品或用含有标准量的抗原的溶液处理。此样品是例如来自疑似具有被认为是病理诊断的循环抗原水平的主体的血清样品。在洗去测试样品或标准品后，固体支持物用可检测标记的第二抗体处理。标记的第二抗体用作检测抗体。测量可检测标记的水平，测试样品中靶抗原的浓度通过与自标准样品产生的标准曲线相比较来测定。
如根据本发明所用，除非另外说明，以下术语应理解具有以下含义：
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，含有特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”意指抗体与所需抗原的一个或多个抗原决定簇反应和不与其他多肽反应或以低得多的亲和力结合(Kd>10-6)。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、结构域抗体、单链、Fab和F(ab')2片段、scFv和Fab表达文库。
基础抗体结构单位已知包含四聚体。各四聚体由两个相同的多肽链对构成，每一对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。各链的氨基末端部分包括约100-110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。各链的羧基末端部分限定了恒定区，其主要负责效应子功能。通常，获得自人的抗体分子涉及类别IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任一类别，它们彼此不同之处在于分子中存在的重链的性质。某些类别还具有亚类，诸如IgG1、IgG2和其他。此外，在人中，轻链可以是κ链或λ链。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指仅含有一个分子种类的抗体分子的抗体分子群，所述抗体分子由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成。具体而言，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在所述群的所有分子中相同。mAb含有能够与抗原的特定表位起免疫反应的抗原结合位点，特征在于对其有独特的结合亲和力。
术语“抗原结合部分”是指免疫球蛋白分子的一部分，其涉及抗原结合。抗原结合位点由重(“H”)和轻(“L”)链的N-末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。在重链和轻链的V区内的三个高度不同的区段，被称为“高变区”，间插在称为“框架区”或“FR”的较保守的侧翼区段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白的高变区之间并与其邻近的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中彼此相对排列，以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合的抗原的三维表面互补，重链和轻链各自的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。氨基酸在各结构域中的分配根据Kabat Sequencesof Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md. (1987和1991))或Chothia&Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987),Chothia等人Nature 342:878-883(1989)中的定义来进行。
如本文所用的术语“分离的核酸分子”应意指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸，或其一些组合，根据其来源，“分离的核酸分子”(1)不缔合“分离的核酸分子”天然存在于其中的多核苷酸的全部或一部分，(2)与天然不与其连接的多核苷酸可操作连接，或(3)不作为较大序列的一部分天然存在。根据本发明的核酸分子包括编码本文所示的重链免疫球蛋白分子的核酸分子，和编码本文所示的轻链免疫球蛋白分子的核酸分子。
应用于多肽时，术语“基本同一性”意指，两个肽序列当诸如通过程序GAP 或BESTFIT使用默认的空位权重最佳比对时，共有至少80％的序列同一性，在一些实施方案中，共有至少90％的序列同一性，在一些实施方案中共有至少95％的序列同一性，和在一些实施方案中共有至少99％的序列同一性。
术语“试剂”在本文用于表示化合物、化合物的混合物、生物大分子或自生物材料制备的提取物。
如本文所用，术语“标记”或“标记的”是指并入可检测标记物，例如，通过并入放射性标记的氨基酸或与可通过标记的抗生物素蛋白(例如，含有可通过光学或量热方法检测的荧光标记或酶活性的链霉抗生物素蛋白)检测的生物素基部分的多肽连接。在某些情况下，标记或标记物也可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的且可被使用。用于多肽的标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如，FITC、若丹明、镧系元素磷光体)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、p-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基团、被第二报告分子识别的预定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔区臂连接以减少潜在的空间位阻。
附图说明
图1显示本发明的重组SARS-CoV2 NP蛋白的SDS-PAGE图；
图2显示利用间接ELISA检测抗体滴度的结果图；
图3显示利用WB检测抗体与抗原结合的结果图；
图4显示利用SPR检测JS01的亲和活性结果图；
图5显示利用SPR检测JS02的亲和活性结果图；
图6显示利用SPR检测JS03的亲和活性结果图；
图7显示利用SPR检测JS04的亲和活性结果图；
图8显示利用SPR检测JS05的亲和活性结果图；
图9显示利用SPR检测JS06的亲和活性结果图；
图10显示利用SPR检测JS07的亲和活性结果图；
图11显示利用SPR检测JS08的亲和活性结果图；
图12显示利用SPR检测JS09的亲和活性结果图；
图13显示利用SPR检测JS10的亲和活性结果图；
图14显示利用SPR检测JS11的亲和活性结果图；
图15显示利用SPR检测JS12的亲和活性结果图；
图16显示利用SPR检测JS13的亲和活性结果图；
图17显示利用SPR检测JS14的亲和活性结果图；
图18显示利用SPR检测JS15的亲和活性结果图；
图19显示利用SPR检测JS16的亲和活性结果图；
图20显示利用双抗体夹心法检测抗体包被浓度的结果图；
图21显示利用双抗体夹心法检测抗体检测灵敏度的结果图；
图22显示本发明的抗原检测层析条的检测效果图。
具体实施方式
下面通过附图和实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1抗体筛选
一、重组SARS-CoV2核蛋白(NP)表达
1.1主要试剂
SARS-CoV2 NP基因序列(GenBank序列号:MT066176.1)以及相关引物合成和测序均由通用生物系统(安徽)有限公司完成；E.coli DH5α，BL21(DE3)感受态细胞购自通用生物系统(安徽)有限公司；BamHⅠ和NotⅠ核酸内切酶购自New England Biolabs(NEB)公司；EXTaq酶购自TaKaRa公司；HRP标记抗人Fc抗体购自Sigma公司；其他化学试剂均为国产分析纯试剂；感染2019-nCoV患者血清由本中心收集及保存，全部为江苏病例。
1.2原核表达质粒构建
设计NP基因原核表达引物，上游引物带BamHⅠ酶切位点，下游引物带Not Ⅰ酶切位点。引物序列为：Cov2-NP- F:CGGGATCCTCTGATAATGGACCCCAAAATC；Cov2-NP-R: ATAAGAATGCGGCCGCAGGCCTGAGTTGAGTCAGCAC。使用EX Taq酶扩增 NP基因，PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃80s，共30 个循环；72℃10min。PCR产物经胶回收约1 300bp目的片段，然后经BamHⅠ和 NotⅠ双酶切后连接pET28a载体，转化E.coli DH5α感受态细胞。次日挑选单菌落测序正确后，提质粒转化原核表达菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞。
1.3 NP表达及纯化
将NP表达菌培养至OD600＝0.6后，加入终浓度0.5mmol/L的IPTG，16℃诱导 6h，收集菌体，超声破碎后离心收集包涵体。将包涵体溶于8mol/L尿素中，然后用镍柱亲和层析纯化包涵体蛋白。纯化后梯度减少尿素含量，使蛋白透析复性至PBS中，最后经SDS-PAGE检测蛋白表达及纯化效果。小量表达成功以后即上 100L发酵罐进行大量发酵，发酵培养基为TB培养基(1％甘油)，发酵参数为280 rpm，通气比为0.5vvm(15L/min)，pH控制在6.8～7.2，罐压0.06MPa～0.1MPa，发酵温度为16℃，培养24h。
SDS-PAGE结果显示：NP全长加上载体中的His tag及其他附带氨基酸，预计蛋白相对分子质量约50×103。表达菌经IPTG诱导后，发现在50×103左右出现明显的条带，与预计分子量大小一致(图1A)。包涵体溶解后，过镍柱纯化，在150 mmol/L咪唑时有明显的洗脱峰。蛋白经透析复性后，经SDS-PAGE发现在同样的位置出现单一蛋白条带(图1B)。此说明NP被成功诱导表达并且纯化后纯度较高。注：图中M：蛋白Makers；1：未诱导的pET28a-NP表达菌；2：IPTG诱导后 pET28a-NP重组表达菌；3：纯化后重组核衣壳蛋白。
二、噬菌体文库构建
1、采集COVID-19患者恢复期外周血，从外周血中分离单个核细胞(PBMC)
本项目于2020年2月14日，经过知情同意，从江苏省某市采集5位COVID- 19确诊患者出院前外周血各20ml。5位患者为同一传播链，5人均非重症，经过治疗后分别与2月15日-22日出院居家隔离。使用GE的Ficoll-Paque PLUS，经密度梯度离心法，分离20ml肝素抗凝血中的单个核细胞(PBMC)。
2、PBMC中RNA的提取和cDNA的合成
使用QIAGEN的RNeasy Mini Kit提取PBMC细胞RNA，然后使用罗氏公司的第一链合成试剂盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，Roche， Cat No.：04896866001)将RNA反转录成cDNA。
3、PCR扩增VK，VL和VH(EX Taq，Takara,Cat No.:DRR001A)
(1)扩增VK&VL体系如表1所示。
表1 扩增VK&VL体系
| 溶液或组分 | 体积(μL) |
| cDNA | 1 |
| EX Buffer(10x) | 5 |
| dNTPs(10mM each) | 4 |
| P1(10μM) | 2 |
| P2(10μM) | 2 |
| EX Taq 1U/μl | 0.3 |
| dH<sub>2</sub>O | 35.7 |
(2)扩增重链Fd段体系如表2所示。
表2 扩增重链Fd段体系
| 溶液或组分 | 体积(μL) |
| cDNA | 2 |
| EX Buffer(10x) | 10 |
| dNTPs(10mM each) | 8 |
| P1(10μM) | 2 |
| P2(10μM) | 2 |
| EX Taq 1U/μl | 0.6 |
| dH<sub>2</sub>O | 75.4 |
(3)反应程序如表3所示。
表3 反应程序
PCR产物过2％琼脂糖凝胶电泳，回收750bp左右的片段。
4、轻链克隆(将VK和VL克隆入pComb3H载体)
VK和VL经XbaⅠ和SacⅠ酶切后与同样经XbaⅠ和SacⅠ酶切的pComb3H 载体连接后，回收连接产物，然后电转XL1-Blue感受态细胞。
电击菌液涂15cm大平皿，次日刮菌，提质粒即为轻链库。此时重组质粒为pComb3H-VK和pComb3H-VL。
5、重链克隆(将VH基因克隆入pComb3H-VK和pComb3H-VL轻链库中)
将轻链库pComb3-L和Fd片段分别经XhoI和SpeI双酶切，与同样经XhoI 和SpeI双酶切的pComb3H-VK和pComb3H-VL连接，然后电转即得到抗体文库。
6、抗体库的包装
(1)从-80℃冰箱取出抗体库，冰上融化后取1ml加入10ml A+(20μg/ml) 2YT培养基中，37℃200rpm摇1小时；
(2)加100ml A+(100μg/ml)，T+(20μg/ml)2YT培养基，200rpm摇1小时；
(3)加1012pfu的VCSM13辅助噬菌体，37℃静置20min，200rpm摇2小时；
(4)加终浓度70μg/ml卡那30℃200rpm摇过夜；
(5)次日6000rpm离心20min，倒出上清，加入4％PEG8000(4g)和3％ NaCl(3g)，混匀，置于冰上30min以上；
(6)分装于50ml离心管中9000rpm离心25min，弃去上清，控干，沉淀用 1ml PBS重悬即为包装文库。
三、噬菌体文库筛选
1、将重组SARS-CoV2核蛋白(NP)包被于免疫管中，按50μg/管包被3 管，于4℃放置过夜，次日用2％脱脂牛奶封闭免疫管1h。
2、向免疫管中加1.75ml含2％脱脂牛奶的PBS和250μl噬菌体文库，37℃摇1h，再37℃静置1h。
3、倒去噬菌体文库，用PBST洗20次，每次摇5min。
4、用1ml pH＝2.2的Gly-HCl洗脱免疫管，室温静置5min，再37℃摇5min，然后吸至1.5ml EP管中，加入57μl 2M Tris中和至pH＝7。
5、将洗脱液转移至一个新的50ml离心管中，立即加入10ml OD＝1的新鲜 XL1-Blue，混匀后37℃孵育30min，加入10ml 2YT(Amp 100μg/ml，Tet 20μg/ml)。
6、取10μl菌液用来测洗脱库容量，剩下20ml培养基倒入500ml三角瓶， 230rpm摇1h。
7、加入130ml 2YT(Amp 100ug/ml，Tet 20μg/ml)，230rpm摇1h。
8、加入MOI＝20的辅助噬菌体，37℃静置孵育30min。
9、3000g 10min离心，重悬沉淀至150ml 2YT(Amp 100μg/ml，Tet 20μg/ml) 中，37℃，230rpm摇2h。
10、加入110μl 70mg/ml卡那霉素，30℃230rpm过夜。次日再加1/5体积的PEG-NaCl(40ml)，混匀后冰浴至少1h，然后10000g 4℃离心20min，沉淀重悬于2-3ml PBS中，瞬时离心去除杂菌，过0.45μm滤器后用于下一轮筛选。
11、重复上述筛选步骤3次，以达到对噬菌体文库富集筛选的目的。
12、第三轮富集完以后，挑选2*96个克隆。经IPTG诱导后，次日进行ELSA 检测。
四、ELISA检测2*96个克隆的结合特异性
1、分别包被2块抗人Fab抗体(1:3000)和2块NP蛋白(2μg/ml)，于4℃包被过夜。
2、次日用3％脱脂牛奶封闭1h，然后加入50μl诱导上清和50μl脱脂牛奶， 37℃孵育1h，PBST洗涤。
3、4块板均加入HRP标记的抗人Fab抗体(1:3000)，37℃孵育1h，PBST 洗涤后，TMB显色。
经筛选共获得178株能与NP特异性结合的噬菌体抗体片段，该片段为人源的Fab段，包括轻链全长及重链的Fd段。将178个单菌落扩增后送测序，共获得159株轻重链齐全的合格序列。
实施例2全抗体的表达及相关功能验证
从获得的159株抗体中最终选定16株抗体用于全抗体的表达及相关功能验证，将此16株抗体命名为JS01～JS16。
其中，JS10抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核酸序列如SEQ ID NO.17 所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，核酸序列如SEQ ID NO.18 所示。
JS08抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.16所示。
1、全抗体表达
将上述16株人源抗体，构建成IgG形式人源全分子抗体，并在293F细胞中表达，用Protein A纯化后备用。
2、ELISA检测16株抗体与重组NP结合特异性
将重组NP用PBS按1μg/ml浓度包被ELISA板，将所有抗体浓度稀释到1mg/ml，然后从1:10000开始倍比稀释，37℃孵育30min。然后PBST洗3次，加入HRP标记的抗人IgG(1:5000)，37℃孵育30min后PBST洗3次，然后TMB 显色，终止后读取OD450吸光度值。
采用间接ELISA检测16株NP抗体的稀释滴度，阴性对照的平均OD值为 0.119，标准差为0.132，因此将cutoff值定义为
由此判断16株抗体的检测滴度为1:80000～1:1280000之间(图2)。
3、16株抗体与纯化NP的Western Blot结果
将1μg重组NP经SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜中，用上述16种抗体(0.5μg/ml)37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，然后用HRP标记的抗人IgG(1:5000) 孵育30min，PBST洗涤3次，然后用DAB之间在膜上显色。
WB实验结果显示16株抗体均能特异性结合重组表达的核蛋白(NP)，并在 50kDa处出现明显的显色带，此提示该组抗体全部为线性表位的抗体(图3)。
4、抗体亲和活性检测
抗体亲和力测定由Biacore T200工作站完成，具体按以下步骤进行：首先使用氨基偶联活化剂NHS和EDC以10μl/min 300s活化CM5芯片，然后用10mM 醋酸钠缓冲液(pH5.5)将重组表达的SARS-CoV-2 NP稀释到1ug/mL，以10μl/min 流经芯片30s使响应值(Responseunits,RUs)达到600左右，最后设置10μl/min、 420s，进样乙醇胺对芯片表面剩余活化位点进行封闭。系列稀释的抗体，在25℃时以30μl/min流速依次进样，每测定一次浓度以后用pH2.0的甘氨酸-盐酸再生 CM5芯片，然后进行下个浓度检测。实验结束后，利用Biacore T200Evaluation Software软件全局拟合曲线来获得结合亲和力。
实验结果如图4-19所示，JS01-JS16可高效结合SARS-CoV-2 NP蛋白，亲和活性相关参数见表4。
表4 抗体亲和力参数
| 抗体名称 | 配体偶联量 | ka(1/Ms) | Kd(1/s) | KD(M) |
| JS01 | 102RU | 2.18E+06 | 4.79E-04 | 2.20E-10 |
| JS02 | 162RU | 9.12E+05 | 5.83E-05 | 6.39E-11 |
| JS03 | 102RU | 8.97E+05 | 2.12E-04 | 2.36E-10 |
| JS04 | 162RU | 7.15E+04 | 1.91E-04 | 2.67E-09 |
| JS05 | 162RU | 5.94E+05 | 2.43E-04 | 4.09E-10 |
| JS06 | 136RU | 1.61E+05 | 0.002576 | 1.61E-08 |
| JS07 | 110RU | 1.44E+06 | 1.78E-04 | 1.24E-10 |
| JS08 | 162RU | 3.03E+04 | 5.77E-06 | 1.90E-10 |
| JS09 | 129RU | 6.89E+05 | 4.79E-05 | 6.94E-11 |
| JS10 | 136RU | 1.47E+06 | 2.99E-04 | 2.04E-10 |
| JS11 | 110RU | 1.93E+05 | 5.62E-05 | 2.92E-10 |
| JS12 | 110RU | 4.88E+05 | 7.33E-05 | 1.50E-10 |
| JS13 | 110RU | 8.05E+05 | 9.66E-05 | 1.20E-10 |
| JS14 | 136RU | 1.24E+06 | 2.21E-04 | 1.78E-10 |
| JS15 | 110RU | 7.72E+04 | 1.22E-04 | 1.58E-09 |
| JS16 | 136RU | 2.68E+05 | 4.01E-05 | 1.50E-10 |
5、抗体配对实验
5.1抗体包被浓度的确定
(1)将100μl JS12抗体从5μg/ml开始倍比稀释到0.0024μg/ml共稀释12个稀释度，然后包被于ELISA板中。4℃包被过夜，次日用1％BSA封闭2h，PBST 洗3次。
(2)向每个包被浓度的第一孔加入50ng的重组NP，然后倍比稀释到0.39ng/ 孔，共8个稀释度，37℃孵育1h，PBST洗3次。
(3)加入1:1000稀释HRP标记的JS08，37℃孵育1h，PBST洗3次，TMB 显色后读取OD450nm吸光度值。
由图20的曲线可以看出，包被抗体的量对检测灵敏性有影响，从5μg/ml到0.00245μg/ml的包被量看来，影响不大，检测NP抗原的灵敏性看小于3.9ng/ml。因此，后续配对实验，我们均选择2μg/ml浓度作为抗体包被量，用1:4000作为酶标抗体的稀释度。
5.2双抗夹心法检测NP
(1)将16株NP抗体JS01～JS16按2μg/ml浓度包被ELISA板，于4℃包被过夜，次日用1％BSA封闭2h，PBST洗3次。
(2)加入0.1μg/ml重组NP蛋白，然后倍比稀释至0.78ng/ml，共8个稀释度，37℃孵育1h，PBST洗3次。
(3)加入HRP标记的JS08(1:1000)，37℃孵育1h，PBST洗3次，TMB显色，读取OD450nm吸光度值。
由图21可见，酶标的JS08不能与JS06，JS11和JS08自身配对，而与其他13株NP抗体均可配对用于双抗夹心法检测NP。其中JS08与JS16配对效果最好，其检测限可达0.78ng/ml以下，其他配对抗体检测限在12.5-1.56ng/ml 之间。
6、双抗体夹心免疫层析法检测重组NP的灵敏度
将抗JS08单抗包被在硝酸纤维素膜上形成T线，抗人IgG抗体标记至C 线处。NP蛋白系列稀释后加50μL于样本孔中，样本孔下的结合垫上的标有色微球的JS01～JS16抗体与NP形成免疫复合物，然后通过层析作用迁移至T线处，与此处标记抗体结合固定，形成有色T线。多余的人源单抗再继续迁移至 C线处，与抗人抗体结合，形成C线。以此来测定对NP的结合灵敏度。
采用有色微球标记JS08抗体与13株抗体分别配对，制成抗原检测层析条。用2ng/ml的重组NP验证试纸条，从结果可见全部层析条均可见明显的检测T线，而质控C线也非常明显(图22)。这说明13对抗体组合均可用于检测新冠状病毒的核蛋白，且检测限小于2ng/ml。
虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省疾病预防控制中心（江苏省公共卫生研究院）
<120> 抗新型冠状病毒的单克隆抗体及抗体组合以及其在该病毒抗原检测中的应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Arg Asp Gly Ser Pro Ser Gly Gly Trp Tyr Thr Leu Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 4
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Ser Pro Ser Gly Gly Trp Tyr Thr Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 6
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Ala Ser
1
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Arg Trp Thr
1 5
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Arg
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ala Arg Glu Gln Phe Ser Gly Gly Asp Tyr Glu Gly Phe Asp Phe
1 5 10 15
<210> 12
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Gln Phe Ser Gly Gly Asp Tyr Glu Gly Phe Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp
1 5
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gly Asn Ser
1
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Trp Val
1 5 10
<210> 16
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Ser Val Leu Thr Gln Glu Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 17
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaggtgcagc tgctcgagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cttgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatggg 300
tcgccatcgg ggggctggta tacccttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 18
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gagaatgtgc tcacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacggtg gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaa 324
Claims (10)
1.分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合新型冠状病毒NP蛋白。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3；其中，
VH CDR1含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
VH CDR2含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
VH CDR3含有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
VL CDR1含有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；
VL CDR2含有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；
VL CDR3含有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包含VH、VL；其中，VH含有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，VL含有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
4.包含权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的缀合物；优选地，所述缀合物还包含可检测部分。
5.包含权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的试剂盒；优选地，所述试剂盒还包括第二种抗体，所述第二种抗体包含VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VLCDR2、VL CDR3；其中，
VH CDR1含有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；
VH CDR2含有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；
VH CDR3含有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列；
VL CDR1含有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列；
VL CDR2含有SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列；
VL CDR3含有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；
更优选地，所述第二种抗体包含VH、VL；其中，VH含有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，VL含有SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。
6.分离的核酸分子，其编码权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO.17和18所示的序列。
7.载体，其包含权利要求6所述的核酸分子。
8.宿主细胞，其导入了权利要求7所述的载体。
9.一种制备抗体的方法，所述方法包含培养权利要求8所述的宿主细胞。
10.一种应用，其包含以下任一项所述的应用：
(1)权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备新型冠状病毒检测产品中的应用；
(2)权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用；
(3)权利要求4所述的缀合物在制备检测新型冠状病毒的产品中的应用。
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Applications Claiming Priority (1)
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2020
- 2020-05-27 CN CN202010463556.XA patent/CN113004396B/zh active Active
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