CN112979792B - 抗新型冠状病毒的抗体、编码核酸、载体、宿主细胞、衍生物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗新型冠状病毒的抗体、编码核酸、载体、宿主细胞、衍生物及其应用。本发明还提供公开了用于检测新型冠状病毒的抗体衍生物以及检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及抗抗新型冠状病毒的抗体、编码核酸、载体、宿主细胞、衍生物及其应用。
背景技术
国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2，世界卫生组织将感染此病毒引起的肺炎称为COVID-19。此病毒传染性强，传播途径广。该病毒能迅速适应人体环境，感染后在潜伏期即具有传播能力，同时还有一些无症状感染者报道，甚至在多种动物体内也检测到病毒核酸。这些因素使得对该病毒的防控变的非常复杂，而且目前没有有效治疗药物及疫苗上市。
SARS-CoV-2属于冠状病毒属，为单股正链RNA病毒，大小约30kb，与 SARS-CoV相似性为79％，与蝙蝠体内分离的冠状病毒(Coronavirus，CoV)相似性最高约88％。SARS-CoV-2具有典型的冠状病毒特征，病毒包膜上有典型的棘突，形似日冕。核衣壳为螺旋对称型，主要结构蛋白是核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)，NP全长420个氨基酸。NP在病毒结构蛋白中含量最多，在宿主感染早期大量表达，且免疫原性较强，能引起宿主强烈的免疫应答。因此，NP可作为SARS-CoV-2感染血清学诊断的主要靶标抗原。
由于特异性治疗药物及有效疫苗尚未研发成功，早期诊断成为防控疫情重要的措施，早期核酸诊断及临床诊断为确诊重要依据。虽然核酸诊断速度快，受采样的质量的影响大，存在假阳性和假阴性，影响防控措施的落实。部分无症状感染者在病程晚期核酸检测也呈阴性，单凭核酸检测很容易出现漏诊。血清学诊断是检测病原感染后机体的免疫反应，持续时间长，免疫反应稳定，且免疫反应随着病程进展呈动态变化趋势。因此，血清学诊断同样也是早期诊断和感染现状评价的的重要手段。
发明内容
本发明的一个特征是提供一种抗新型冠状病毒的抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一个特征是提供包含能够预防、抑制或治疗新型冠状病毒感染的抗体或其抗原结合片段的药物。
本发明的另外的特征和优点部分将在以下说明中阐明，并且部分从该说明可显而易见，或者可以通过实施本发明而认识到。根据说明书和所附的权利要求书中特别指出的要素和组合，本发明的目的和其它优点将被实现和获得。
本发明的解决方案
本发明提供了一种抗新型冠状病毒的抗体或其抗原结合片段，其包含：SEQ IDNO.1所示的重链CDR1、SEQ ID NO.2所示的重链CDR2、SEQ ID NO.3所示的重链CDR3、SEQ IDNO.5所示的轻链CDR1、SEQ ID NO.6所示的轻链CDR2、 SEQ ID NO.7所示的轻链CDR3中的至少一个。
优选地，所述抗体包含：SEQ ID NO.1所示的重链CDR1、SEQ ID NO.2所示的重链CDR2、SEQ ID NO.3所示的重链CDR3、SEQ ID NO.5所示的轻链CDR1、 SEQ ID NO.6所示的轻链CDR2和SEQ ID NO.7所示的轻链CDR3。
本发明的所述抗体，其包含：
1)重链可变结构域，其含有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
2)轻链可变结构域，其含有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
自然产生的抗体结构单元通常包含四聚体。每个这样的四聚体都可由两对相同的多肽链组成，每对多肽链具有一条全长“轻”链(如：约25000道尔顿分子量 (25kDa))和一条全长“重”链(如：约50000～70000道尔顿分子量(50～ 70kDa))。每条链的氨基末端部分通常包含大约100～110个或更多氨基酸的可变区，其通常负责抗原识别。每条链的羧基末端部分通常限定可能负责效应子功能的恒定区。人轻链通常被归类为K和λ轻链。
重链通常被归类为μ，δ，γ，α或ε，并分别限定抗体的同种型为IgM、 IgD、IgG、IgA和IgE。IgG有几个亚类，包括但不限于：IgG1、IgG2、IgG3和 IgG4。IgM有亚类，包括但不限于：IgM1和IgM2。相似地，IgA细分为亚类，包括但不限于：IgA1和IgA2。在轻链和重链内，可变区和恒定区可通过约12个或更多氨基酸的“J”区连接，且重链还包括约10个或更多氨基酸的“D”区。参见，例如Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.RavenPress,N.Y.(1989))(为所有的目的通过援引将其全部内容并入)。每条轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。
可变区通常显示相同的基本结构，由三个超变区(也称为互补决定区或CDR) 连接相对保守的框架区(FR)。通常，来自每一对的两条链的CDRs由框架区对齐，其能结合特异性表位。从氨基端到羧基端，轻链和重链的可变区通常都包含FRl、 CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4结构域。通常根据Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and1991))；或
Chothia&Lesk J.MoI.Biol.196:901-917(1987)；Chothia 等,Nature342:878-883(1989)中的限定将氨基酸分配到每个结构域。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，如：完整抗体的抗原结合部分或可变区。抗原结合部分的例子包括：Fab、Fab1、F(ab')2和Fv片段；双价抗体；线性抗体(Zapata等,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段都有一个单个抗原结合位点，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了其易于结晶的性能。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，它具有两个抗原结合位点且还能够交联抗原。“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的抗体片段。该区包括紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体。单个可变结构域(或仅包含对抗原特异性的三个CDRs的Fv的一半) 能够识别和结合抗原。“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中，这些结构域存在于单个多肽链。Fv多肽还可包含VH和VL结构域之间的多肽接头，能够使得sFv形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述，参见 Pluckthun,The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和 Moore eds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。
本发明还提供了前面所述的抗体衍生物，所述抗体衍生物包括本发明的抗体或其抗原结合部分偶联到官能剂上形成的免疫偶联物。
官能剂可以是细胞毒素剂如化学治疗剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)、或放射性同位素(即放射性偶联物)、抗生素、溶核酶、或它们的任意组合。化学治疗剂可以用于产生免疫偶联物，例如，甲氨喋呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vinca alkaloid)(长春新碱 (vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))、阿霉素(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂、酶、和/或它们的片段，如溶核酶、抗生素、和毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体，以及以下公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括：例如，白喉A链(diphtheria A chain)、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(exotoxin A chain)(来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链(ricin A chain)、相思豆毒素A链(abrin A chain)、蒴莲根毒素A链(modeccin A chain)，α-八叠球菌(alpha-sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)蛋白，石竹素蛋白(dianthin protein)，美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、石碱草(saponaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝裂蛋白(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)、和单端孢霉烯族毒素类(tricotheeenes)。本领域已知或可用的任何合适的放射性核苷酸或放射性试剂均可用于产生放射性偶联的抗体。
所述抗体衍生物还可以包括将本发明的抗体或其抗原结合部分直接或间接偶联至可检测标记物形成的复合物。
可检测标记物是一种例如通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测的试剂。有用的可检测标记物包括，但不限于，荧光染料、化学发光化合物、放射性同位素、电子密集试剂、酶、有色颗粒、生物素或地高辛(dioxigenin)。可检测标记物往往会产生可测量的信号，如放射性、荧光、颜色或酶活性。与可检测试剂偶联的抗体可用于诊断或治疗目的。可检测试剂的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子发射断层摄影术的正电子发射金属、和非放射性顺磁金属离子。可检测物质可以采用本领域已知技术直接地与抗体、或间接地通过中间体如本领域已知的接头，连接或偶联。参见，美国专利第4,741,900号，记载了金属离子与抗体的偶联用于诊断。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪氨(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；发光材料的一个实例包括发光氨；生物发光材料的实例包括虫荧光素和发光蛋白质。
本发明的抗体包括嵌合抗体。施用的抗体可包括嵌合抗体。施用的抗体可包括人源化抗体。施用的抗体可包括完全人源化抗体。该抗体可以是人源化的或部分人源化的。非人抗体可以使用本领域中已知的任何适用的方法进行人源化。人源化抗体可使用免疫系统已经被部分或完全人源化的转基因动物来制备。本发明的任何抗体或其片段可以是部分或完全人源化的。嵌合抗体可以使用本领域中任何已知的技术来制备
施用的抗体可包括单克隆抗体，单克隆抗体也可以通过使用重组DNA方法，例如美国专利第4816567号所述的那些方法进行制备。可用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离并测序编码本发明的单克隆抗体的DNA。本发明的杂交瘤细胞可作为此类 DNA的优选来源。一旦分离，所述DNA可置于表达载体中，然后将该载体转染到不会以其它方式产生免疫球蛋白的宿主细胞如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。也可通过，例如，用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列，或者通过将免疫球蛋白编码序列共价结合于非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列来对DNA 进行修饰。此类非免疫球蛋白多肽可替代本发明抗体的恒定结构域，或可替代本发明抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体。采用重组 DNA方法例如噬菌粒展示方法(phagemid display method)制备抗体可使用市售的试剂盒来完成，例如，从Pharmacia(Uppsala,Sweden)可得的重组噬菌粒抗体体系，或SurfZAPTM噬菌体展示系统(StratageneInc.,LaJolla,Califorinia)。
该抗体可以是双价抗体。术语“双价抗体(diabody)”是指含有两个抗原结合位点的小抗体片段，片段包含一条与同一多肽链中的轻链可变结构域(VL)相连的重链可变结构域(VH)(Vn-VL)。通过使用太短的连接物以致无法允许相同链上的两个结构域之间进行配对，能够迫使结构域与另一条链上的互补结构域配对，形成两个抗原结合位点。例如在欧洲专利EP 404,097、W093/11161和Hollinger 等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中对双价抗体有更为全面的论述。
施用的抗体可包括单链抗体。该抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法是本领域熟知的。例如，一种方法涉及重组表达免疫球蛋白轻链和修饰重链。一般来说，可在Fc区的任何一点将重链截断，以防止重链交联。或者，以另一氨基酸残基替代相关的半胱氨酸残基或去掉相关的半胱氨酸残基以防止交联。体外方法也是合适用于产生单价抗体。可使用本领域已知常规技术来实现抗体消化，以产生抗体片段，特别是Fab片段。
抗体可以是双特异性的。双特异性抗体(bispecific antibody)特异性结合一个蛋白质，并特异性结合与病理和/或治疗相关的其它抗原，可使用文献中记载的标准程序制备、分离和测试双特异性抗体。(参见：例如，Pluckthun和Pack,Immunotec hnology,3:83-105(1997)；Carter 等,J.Hematotherapy,4:463-470(1995)；Renner和Pfreundschuh,Immunological Reviews,1995,No.145,pp.179-209；Pfreundschuh的美国专利第5643759号；Segal 等,J.Hematotherapy,4:377-382(1995)；Segal 等,Immunobiology,185:390-402(1992)；和Bolhuis等,Cancer Immunol.Immunother.,34:1-8(1991))。
本文公开的抗体可构建为免疫脂质体。包含抗体的脂质体可用本领域已知的方法制备，如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980)以及美国专利第4,485,045和4,544,545 号所描述的。美国专利第5,013,556号公开了循环时间延长的脂质体。可利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法制备特别有用的脂质体。可以通过确定孔径的滤膜挤出以得到具有理想直径的脂质体。本发明抗体的Fab'片段可通过二硫化物互换反应偶联到脂质体上，如Martin等，J.Biol.Chem.257:286-288(1982)所述。可选地，化学治疗剂 (如阿霉素(Doxorubicin))可以包裹到脂质体内。参见，Gabizon，J.National Cancer Inst.,81(19):1484(1989)。
本发明提供了一种抑制或治疗新型冠状病毒感染的方法，包括：将有效治疗量的本发明的抗新型冠状病毒抗体或其抗原结合部分给药予受试者。该方法还包括：诊断感染新型冠状病毒的患者。可在诊断患者感染病毒之前、当中、和/或之后施用本发明的抗体或其抗原结合部分。
该方法还包括：监测至少一种新型冠状病毒感染症状的减轻。
本发明提供了一种检测新型冠状病毒的方法，包括：将来自受试者的样品与本发明的抗体或其抗原结合部分接触。该方法还可包括：根据抗体是否结合新型冠状病毒，检测受试者中存在或不存在新型冠状病毒。
本发明还提供了一种用于新型冠状病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包含本发明前面所述的抗体或其抗原结合部分。
所述试剂盒还可包含第二种抗体或其抗原结合部分，所述第二种抗体或其抗原结合部分包含：SEQ ID NO.9所示的重链CDR1、SEQ ID NO.10所示的重链 CDR2、SEQ ID NO.11所示的重链CDR3、SEQ ID NO.13所示的轻链CDR1、SEQ ID NO.14所示的轻链CDR2、SEQ IDNO.15所示的轻链CDR3中的至少一个；
优选地，所述抗体或其抗原结合部分包含：SEQ ID NO.9所示的重链CDR1、 SEQ IDNO.10所示的重链CDR2、SEQ ID NO.11所示的重链CDR3、SEQ ID NO.13所示的轻链CDR1、SEQID NO.14所示的轻链CDR2和SEQ ID NO.15所示的轻链CDR3；
更优选地，所述第二种抗体或其抗原结合部分包含重链可变结构域，其含有 SEQID NO.12所示的氨基酸序列；轻链可变结构域，其含有SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。
本发明还提供了编码前面所述的抗体或其抗原结合部分的核酸分子。
本发明还提供了包含所述核酸分子的载体。
本发明还提供了包含所述载体的宿主细胞。
本发明还提供了前面所述的抗体或其抗原结合部分在制备新型冠状病毒检测产品中的应用。
本发明还提供了前面所述的抗体或其抗原结合部分在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用。
本发明还提供了前面所述的抗体或其抗原结合部分在制备抗体衍生物中的应用。所述抗体衍生物的限定同前面所述。
本发明还提供了前面所述的抗体衍生物在制备新型冠状病毒检测产品中的应用。
本发明还提供了前面所述的抗体衍生物在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用。
附图说明
图1显示本发明的重组SARS-CoV2 NP蛋白的SDS-PAGE图；
图2显示利用间接ELISA检测抗体滴度的结果图；
图3显示利用WB检测抗体与抗原结合的结果图；
图4显示利用SPR检测JS01的亲和活性结果图；
图5显示利用SPR检测JS02的亲和活性结果图；
图6显示利用SPR检测JS03的亲和活性结果图；
图7显示利用SPR检测JS04的亲和活性结果图；
图8显示利用SPR检测JS05的亲和活性结果图；
图9显示利用SPR检测JS06的亲和活性结果图；
图10显示利用SPR检测JS07的亲和活性结果图；
图11显示利用SPR检测JS08的亲和活性结果图；
图12显示利用SPR检测JS09的亲和活性结果图；
图13显示利用SPR检测JS10的亲和活性结果图；
图14显示利用SPR检测JS11的亲和活性结果图；
图15显示利用SPR检测JS12的亲和活性结果图；
图16显示利用SPR检测JS13的亲和活性结果图；
图17显示利用SPR检测JS14的亲和活性结果图；
图18显示利用SPR检测JS15的亲和活性结果图；
图19显示利用SPR检测JS16的亲和活性结果图；
图20显示利用双抗体夹心法检测抗体包被浓度的结果图；
图21显示利用双抗体夹心法检测抗体检测灵敏度的结果图；
图22显示本发明的抗原检测层析条的检测效果图。
具体实施方式
下面通过附图和实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1抗体筛选
一、重组SARS-CoV2核蛋白(NP)表达
1.1主要试剂
SARS-CoV2 NP基因序列(GenBank序列号:MT066176.1)以及相关引物合成和测序均由通用生物系统(安徽)有限公司完成；E.coli DH5α，BL21(DE3)感受态细胞购自通用生物系统(安徽)有限公司；BamHⅠ和NotⅠ核酸内切酶购自 New England Biolabs(NEB)公司；EX Taq酶购自TaKaRa公司；HRP标记抗人Fc 抗体购自Sigma公司；其他化学试剂均为国产分析纯试剂；感染2019-nCoV患者血清由本中心收集及保存，全部为江苏病例。
1.2原核表达质粒构建
设计NP基因原核表达引物，上游引物带BamHⅠ酶切位点，下游引物带Not Ⅰ酶切位点。引物序列为： Cov2-NP-F:CGGGATCCTCTGATAATGGACCCCAAAATC；Cov2-NP-R: ATAAGAATGCGGCCGCAGGCCTGAGTTGAGTCAGCAC。使用EX Taq酶扩增 NP基因，PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s,58℃30s,72℃80s，共30 个循环；72℃10min。PCR产物经胶回收约1 300bp目的片段，然后经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后连接pET28a载体，转化E.coli DH5α感受态细胞。次日挑选单菌落测序正确后，提质粒转化原核表达菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞。
1.3 NP表达及纯化
将NP表达菌培养至OD600＝0.6后，加入终浓度0.5mmol/L的IPTG，16℃诱导 6h，收集菌体，超声破碎后离心收集包涵体。将包涵体溶于8mol/L尿素中，然后用镍柱亲和层析纯化包涵体蛋白。纯化后梯度减少尿素含量，使蛋白透析复性至PBS中，最后经SDS-PAGE检测蛋白表达及纯化效果。小量表达成功以后即上 100L发酵罐进行大量发酵，发酵培养基为TB培养基(1％甘油)，发酵参数为280 rpm，通气比为0.5vvm(15L/min)，pH控制在6.8～7.2，罐压0.06MPa～0.1MPa，发酵温度为16℃，培养24h。
SDS-PAGE结果显示：NP全长加上载体中的His tag及其他附带氨基酸，预计蛋白相对分子质量约50×103。表达菌经IPTG诱导后，发现在50×103左右出现明显的条带，与预计分子量大小一致(图1A)。包涵体溶解后，过镍柱纯化，在150 mmol/L咪唑时有明显的洗脱峰。蛋白经透析复性后，经SDS-PAGE发现在同样的位置出现单一蛋白条带(图1B)。此说明NP被成功诱导表达并且纯化后纯度较高。注：图中M：蛋白Makers；1：未诱导的pET28a-NP表达菌；2：IPTG诱导后pET28a-NP重组表达菌；3：纯化后重组核衣壳蛋白。
二、噬菌体文库构建
1、采集COVID-19患者恢复期外周血，从外周血中分离单个核细胞(PBMC)
本项目于2020年2月14日，经过知情同意，采集5位COVID-19确诊患者出院前外周血各20ml。使用GE的Ficoll-Paque PLUS，经密度梯度离心法，分离20ml肝素抗凝血中的单个核细胞(PBMC)。
2、PBMC中RNA的提取和cDNA的合成
使用QIAGEN的RNeasy Mini Kit提取PBMC细胞RNA，然后使用罗氏公司的第一链合成试剂盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，Roche， Cat No.：04896866001)将RNA反转录成cDNA。
3、PCR扩增VK，VL和VH(EX Taq，Takara,Cat No.:DRR001A)
(1)扩增VK&VL体系如表1所示。
表1扩增VK&VL体系
| 溶液或组分 | 体积(μL) |
| cDNA | 1 |
| EX Buffer(10x) | 5 |
| dNTPs(10mM each) | 4 |
| P1(10μM) | 2 |
| P2(10μM) | 2 |
| EX Taq 1U/μl | 0.3 |
| dH<sub>2</sub>O | 35.7 |
(2)扩增重链Fd段体系如表2所示。
表2扩增重链Fd段体系
| 溶液或组分 | 体积(μL) |
| cDNA | 2 |
| EX Buffer(10x) | 10 |
| dNTPs(10mM each) | 8 |
| P1(10μM) | 2 |
| P2(10μM) | 2 |
| EX Taq 1U/μl | 0.6 |
| dH<sub>2</sub>O | 75.4 |
(3)反应程序如表3所示。
表3反应程序
PCR产物过2％琼脂糖凝胶电泳，回收750bp左右的片段。
4、轻链克隆(将VK和VL克隆入pComb3H载体)
VK和VL经XbaⅠ和SacⅠ酶切后与同样经XbaⅠ和SacⅠ酶切的pComb3H 载体连接后，回收连接产物，然后电转XL1-Blue感受态细胞。
电击菌液涂15cm大平皿，次日刮菌，提质粒即为轻链库。此时重组质粒为pComb3H-VK和pComb3H-VL。
5、重链克隆(将VH基因克隆入pComb3H-VK和pComb3H-VL轻链库中)
将轻链库pComb3-L和Fd片段分别经XhoI和SpeI双酶切，与同样经XhoI 和SpeI双酶切的pComb3H-VK和pComb3H-VL连接，然后电转即得到抗体文库。
6、抗体库的包装
(1)从-80℃冰箱取出抗体库，冰上融化后取1ml加入10ml A+(20μg/ml)2YT 培养基中，37℃200rpm摇1小时；
(2)加100ml A+(100μg/ml)，T+(20μg/ml)2YT培养基，200rpm摇1小时；
(3)加1012pfu的VCSM13辅助噬菌体，37℃静置20min，200rpm摇2小时；
(4)加终浓度70μg/ml卡那30℃200rpm摇过夜；
(5)次日6000rpm离心20min，倒出上清，加入4％PEG8000(4g)和3％ NaCl(3g)，混匀，置于冰上30min以上；
(6)分装于50ml离心管中9000rpm离心25min，弃去上清，控干，沉淀用 1ml PBS重悬即为包装文库。
三、噬菌体文库筛选
1、将重组SARS-CoV2核蛋白(NP)包被于免疫管中，按50μg/管包被3 管，于4℃放置过夜，次日用2％脱脂牛奶封闭免疫管1h。
2、向免疫管中加1.75ml含2％脱脂牛奶的PBS和250μl噬菌体文库，37℃摇1h，再37℃静置1h。
3、倒去噬菌体文库，用PBST洗20次，每次摇5min。
4、用1ml pH＝2.2的Gly-HCl洗脱免疫管，室温静置5min，再37℃摇5min，然后吸至1.5ml EP管中，加入57μl 2M Tris中和至pH＝7。
5、将洗脱液转移至一个新的50ml离心管中，立即加入10ml OD＝1的新鲜 XL1-Blue，混匀后37℃孵育30min，加入10ml 2YT(Amp 100μg/ml，Tet 20μg/ml)。
6、取10μl菌液用来测洗脱库容量，剩下20ml培养基倒入500ml三角瓶， 230rpm摇1h。
7、加入130ml 2YT(Amp 100ug/ml，Tet 20μg/ml)，230rpm摇1h。
8、加入MOI＝20的辅助噬菌体，37℃静置孵育30min。
9、3000g 10min离心，重悬沉淀至150ml 2YT(Amp 100μg/ml，Tet 20μg/ml) 中，37℃，230rpm摇2h。
10、加入110μl 70mg/ml卡那霉素，30℃230rpm过夜。次日再加1/5体积的PEG-NaCl(40ml)，混匀后冰浴至少1h，然后10000g 4℃离心20min，沉淀重悬于2-3ml PBS中，瞬时离心去除杂菌，过0.45μm滤器后用于下一轮筛选。
11、重复上述筛选步骤3次，以达到对噬菌体文库富集筛选的目的。
12、第三轮富集完以后，挑选2*96个克隆。经IPTG诱导后，次日进行ELSA 检测。
四、ELISA检测2*96个克隆的结合特异性
1、分别包被2块抗人Fab抗体(1:3000)和2块NP蛋白(2μg/ml)，于4℃包被过夜。
2、次日用3％脱脂牛奶封闭1h，然后加入50μl诱导上清和50μl脱脂牛奶， 37℃孵育1h，PBST洗涤。
3、4块板均加入HRP标记的抗人Fab抗体(1:3000)，37℃孵育1h，PBST 洗涤后，TMB显色。
经筛选共获得178株能与NP特异性结合的噬菌体抗体片段，该片段为人源的Fab段，包括轻链全长及重链的Fd段。将178个单菌落扩增后送测序，共获得159株轻重链齐全的合格序列。
实施例2全抗体的表达及相关功能验证
从获得的159株抗体中最终选定16株抗体用于全抗体的表达及相关功能验证，将此16株抗体命名为JS01～JS16。
其中，JS09抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核酸序列如SEQ ID NO.17 所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，核酸序列如SEQ ID NO.18 所示。
JS08抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.16所示。
1、全抗体表达
将上述16株人源抗体，构建成IgG形式人源全分子抗体，并在293F细胞中表达，用Protein A纯化后备用。
2、ELISA检测16株抗体与重组NP结合特异性
将重组NP用PBS按1μg/ml浓度包被ELISA板，将所有抗体浓度稀释到1mg/ml，然后从1:10000开始倍比稀释，37℃孵育30min。然后PBST洗3次，加入HRP标记的抗人IgG(1:5000)，37℃孵育30min后PBST洗3次，然后TMB 显色，终止后读取OD450吸光度值。
采用间接ELISA检测16株NP抗体的稀释滴度，阴性对照的平均OD值为 0.119，标准差为0.132，因此将cutoff值定义为
由此判断16株抗体的检测滴度为1:80000～1:1280000之间(图2)。
3、16株抗体与纯化NP的Western Blot结果
将1μg重组NP经SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜中，用上述16种抗体(0.5μg/ml)37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，然后用HRP标记的抗人IgG(1:5000) 孵育30min，PBST洗涤3次，然后用DAB之间在膜上显色。
WB实验结果显示16株抗体均能特异性结合重组表达的核蛋白(NP)，并在50kDa处出现明显的显色带，此提示该组抗体全部为线性表位的抗体(图3)。
4、抗体亲和活性检测
抗体亲和力测定由Biacore T200工作站完成，具体按以下步骤进行：首先使用氨基偶联活化剂NHS和EDC以10μl/min 300s活化CM5芯片，然后用10mM 醋酸钠缓冲液(pH5.5)将重组表达的SARS-CoV-2NP稀释到1ug/mL，以10μl/min 流经芯片30s使响应值(Responseunits,RUs)达到600左右，最后设置10μl/min、 420s，进样乙醇胺对芯片表面剩余活化位点进行封闭。系列稀释的抗体，在25℃时以30μl/min流速依次进样，每测定一次浓度以后用pH2.0的甘氨酸-盐酸再生 CM5芯片，然后进行下个浓度检测。实验结束后，利用Biacore T200Evaluation Software软件全局拟合曲线来获得结合亲和力。
实验结果如图4-19所示，JS01-JS16可高效结合SARS-CoV-2NP蛋白，亲和活性相关参数见表4。
表4抗体亲和力参数
5、抗体配对实验
5.1抗体包被浓度的确定
(1)将100μl JS12抗体从5μg/ml开始倍比稀释到0.0024μg/ml共稀释12个稀释度，然后包被于ELISA板中。4℃包被过夜，次日用1％BSA封闭2h，PBST 洗3次。
(2)向每个包被浓度的第一孔加入50ng的重组NP，然后倍比稀释到0.39ng/ 孔，共8个稀释度，37℃孵育1h，PBST洗3次。
(3)加入1:1000稀释HRP标记的JS08，37℃孵育1h，PBST洗3次，TMB 显色后读取OD450nm吸光度值。
由图20的曲线可以看出，包被抗体的量对检测灵敏性有影响，从5μg/ml到0.00245μg/ml的包被量看来，影响不大，检测NP抗原的灵敏性看小于3.9ng/ml。因此，后续配对实验，我们均选择2μg/ml浓度作为抗体包被量，用1:4000作为酶标抗体的稀释度。
5.2双抗夹心法检测NP
(1)将16株NP抗体JS01～JS16按2μg/ml浓度包被ELISA板，于4℃包被过夜，次日用1％BSA封闭2h，PBST洗3次。
(2)加入0.1μg/ml重组NP蛋白，然后倍比稀释至0.78ng/ml，共8个稀释度，37℃孵育1h，PBST洗3次。
(3)加入HRP标记的JS08(1:1000)，37℃孵育1h，PBST洗3次，TMB 显色，读取OD450nm吸光度值。
由图21可见，酶标的JS08不能与JS06，JS11和JS08自身配对，而与其他 13株NP抗体均可配对用于双抗夹心法检测NP。其中JS08与JS16配对效果最好，其检测限可达0.78ng/ml以下，其他配对抗体检测限在12.5-1.56ng/ml之间。
6、双抗体夹心免疫层析法检测重组NP的灵敏度
将抗JS08单抗包被在硝酸纤维素膜上形成T线，抗人IgG抗体标记至C线处。NP蛋白系列稀释后加50μL于样本孔中，样本孔下的结合垫上的标有色微球的JS01～JS16抗体与NP形成免疫复合物，然后通过层析作用迁移至T线处，与此处标记抗体结合固定，形成有色T线。多余的人源单抗再继续迁移至C线处，与抗人抗体结合，形成C线。以此来测定对NP的结合灵敏度。
采用有色微球标记JS08抗体与13株抗体分别配对，制成抗原检测层析条。用2ng/ml的重组NP验证试纸条，从结果可见全部层析条均可见明显的检测T 线，而质控C线也非常明显(图22)。这说明13对抗体组合均可用于检测新冠状病毒的核蛋白，且检测限小于2ng/ml。
虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省疾病预防控制中心（江苏省公共卫生研究院）
<120> 抗新型冠状病毒的抗体、编码核酸、载体、宿主细胞、衍生物及其应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr Ala
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Arg Glu Trp Phe Gly Glu Thr Trp Glu Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 4
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Trp Phe Gly Glu Thr Trp Glu Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Ser Val Ser Ser Tyr
1 5
<210> 6
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ala Ser
1
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Gln Arg Ser Asn Pro Ile Thr
1 5
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Pro Ile Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ala Arg Glu Gln Phe Ser Gly Gly Asp Tyr Glu Gly Phe Asp Phe
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Glu Gln Phe Ser Gly Gly Asp Tyr Glu Gly Phe Asp Phe Trp Gly
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp
1 5
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gly Asn Ser
1
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Trp Val
1 5 10
<210> 16
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Ser Val Leu Thr Gln Glu Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 17
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaggtgcagc tgctcgagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt ttctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagggagtgg 300
ttcggggaga catgggaagg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 18
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gagaatgtgc tcacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaacc cgatcacctt cggccaaggg 300
acacgactgg agattaaa 318
Claims (14)
1.一种抗新型冠状病毒的抗体或其抗原结合部分，其包含：SEQ ID NO.1所示的重链CDR1、SEQ ID NO.2所示的重链CDR2、SEQ ID NO.3所示的重链CDR3、SEQ ID NO.5所示的轻链CDR1、SEQ ID NO.6所示的轻链CDR2和SEQ ID NO.7所示的轻链CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其包含：
1）重链可变结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
2）轻链可变结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体还包含抗体恒定区。
4.一种分离的核酸，其包含编码权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的序列。
5.一种载体，其包含权利要求4所述的核酸。
6.一种宿主细胞，包含权利要求5所述的载体。
7.一种试剂盒，其包含权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含第二种抗体或其抗原结合部分，所述第二种抗体或其抗原结合部分包含：SEQ ID NO.9所示的重链CDR1、SEQ IDNO.10所示的重链CDR2、SEQ ID NO.11所示的重链CDR3、SEQ ID NO.13所示的轻链CDR1、SEQID NO.14所示的轻链CDR2和SEQ ID NO.15所示的轻链CDR3。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述第二种抗体或其抗原结合部分包含：重链可变结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；轻链可变结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
10.一种抗体衍生物，所述抗体衍生物包括权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
11.一种非诊断目的的检测生物样品中新型冠状病毒的方法，所述方法包括使用权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
12.权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分在制备新型冠状病毒检测产品或诊断产品中的应用。
13.权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分在制备抗体衍生物中的应用。
14.权利要求10所述的抗体衍生物在制备新型冠状病毒检测产品或诊断产品中的应用。
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