CN111748032B - 抗新型冠状病毒的抗体和使用该抗体的免疫检测 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗新型冠状病毒的抗体和使用该抗体的免疫检测。本发明还公开了所述抗体的功能性片段，其含有SEQ ID NO.1‑3的氨基酸序列的重链可变区，以及含有SEQ ID NO.5‑7的氨基酸序列的轻链可变区。所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
Description
技术领域
本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及抗新型冠状病毒的抗体和使用该抗体的免疫检测。
背景技术
国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2，世界卫生组织将感染此病毒引起的肺炎称为COVID-19。此病毒传染性强，传播途径广。该病毒能迅速适应人体环境，感染后在潜伏期即具有传播能力，同时还有一些无症状感染者报道，甚至在多种动物体内也检测到病毒核酸。这些因素使得对该病毒的防控变的非常复杂，而且目前没有有效治疗药物及疫苗上市。SARS-CoV-2属于冠状病毒属，为单股正链RNA病毒，大小约30kb，与SARS-CoV相似性为79％，与蝙蝠体内分离的冠状病毒(Coronavirus，CoV)相似性最高约88％。SARS-CoV-2具有典型的冠状病毒特征，病毒包膜上有典型的棘突，形似日冕。核衣壳为螺旋对称型，主要结构蛋白是核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)，NP全长420个氨基酸。NP在病毒结构蛋白中含量最多，在宿主感染早期大量表达，且免疫原性较强，能引起宿主强烈的免疫应答。因此，NP可作为SARS-CoV-2感染血清学诊断的主要靶标抗原。
由于特异性治疗药物及有效疫苗尚未研发成功，早期诊断成为防控疫情重要的措施，早期核酸诊断及临床诊断为确诊重要依据。虽然核酸诊断速度快，受采样的质量的影响大，存在假阳性和假阴性，影响防控措施的落实。部分无症状感染者在病程晚期核酸检测也呈阴性，单凭核酸检测很容易出现漏诊。血清学诊断是检测病原感染后机体的免疫反应，持续时间长，免疫反应稳定，且免疫反应随着病程进展呈动态变化趋势。因此，血清学诊断同样也是早期诊断和感染现状评价的的重要手段。
发明内容
本发明所要解决的问题
本发明的一个要解决的问题是提供一种特异性结合新型冠状病毒的单克隆抗体。
本发明的另一个要解决的问题是提供一种含有所述单克隆抗体的免疫诊断用的组合物。
解决技术问题的技术方案
为了简便且高灵敏度地测定新型冠状病毒并提高诊断的精度，本发明制作了多种抗新型冠状病毒的单克隆抗体用于根据利用免疫测定法测定，选择特别适于免疫测定法的单克隆抗体，确定重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列和碱基序列，而且分析了6个CDR序列。通过使用本发明所开发的两种抗体，确认到能够以高灵敏度测定生物样品中的新型冠状病毒。
即，本发明如下所述：
本发明提供了一种特异性结合新型冠状病毒的单克隆抗体或其功能性片段，其含有：
(1)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的重链CDRH1；
(2)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的重链CDRH2；
(3)由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的重链CDRH3；
(4)由SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列组成的轻链CDRL1；
(5)由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的轻链CDRL2；
(6)由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成的轻链CDRL3。
在本发明具体实施例中，所述单克隆抗体或其功能性片段含有由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的重链可变区，以及由SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
在本发明具体实施例中，所述单克隆抗体或其功能性片段含有由与SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列具有95％以上序列同一性的氨基酸序列组成的重链可变区，以及由与SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列具有95％以上序列同一性的氨基酸序列组成的轻链可变区。
本发明还提供了单克隆抗体或其功能性片段的组合，所述组合包括前面所述的单克隆抗体或其功能性片段，还包括第二单克隆抗体或其功能性片段；其中，第二单克隆抗体或其功能性片段含有：
(1)由SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列组成的重链CDRH1；
(2)由SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列组成的重链CDRH2；
(3)由SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列组成的重链CDRH3；
(4)由SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列组成的轻链CDRL1；
(5)由SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列组成的轻链CDRL2；
(6)由SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列组成的轻链CDRL3；
在本发明具体实施例中，第二单克隆抗体或其功能性片段含有由SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列组成的重链可变区，以及由SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
在本发明具体实施例中，第二单克隆抗体或其功能性片段含有由与SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列具有95％以上序列同一性的氨基酸序列组成的重链可变区，以及由与SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列具有95％以上序列同一性的氨基酸序列组成的轻链可变区。
进一步，所述组合用于生物样品中新型冠状病毒的检测或测定方法。
本发明还提供了一种利用免疫测定法特异性检测生物样品中新型冠状病毒的方法，所述方法包括使用前面所述的单克隆抗体或其功能性片段，或使用前面所述的组合。
优选地，所述免疫测定法为ELISA。
本发明还提供了一种用于测定新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包含前面所述的单克隆抗体或其功能性片段，或前面所述的组合。
本发明还提供了编码前面所述的单克隆抗体或其功能性片段的核酸分子。
本发明还提供了包含前面所述的核酸分子的载体。
本发明还提供了包含前面所述的载体的宿主细胞。
本发明还提供了一种应用，其包含以下任一项所述的应用：
(1)前面所述的单克隆抗体或其功能性片段在制备新型冠状病毒检测产品中的应用；
(2)前面所述的单克隆抗体或其功能性片段在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用；
(3)前面所述的组合在制备检测新型冠状病毒的产品中的应用。
附图说明
图1显示本发明的重组SARS-CoV2 NP蛋白的SDS-PAGE图；
图2显示利用间接ELISA检测抗体滴度的结果图；
图3显示利用WB检测抗体与抗原结合的结果图；
图4显示利用SPR检测JS01的亲和活性结果图；
图5显示利用SPR检测JS02的亲和活性结果图；
图6显示利用SPR检测JS03的亲和活性结果图；
图7显示利用SPR检测JS04的亲和活性结果图；
图8显示利用SPR检测JS05的亲和活性结果图；
图9显示利用SPR检测JS06的亲和活性结果图；
图10显示利用SPR检测JS07的亲和活性结果图；
图11显示利用SPR检测JS08的亲和活性结果图；
图12显示利用SPR检测JS09的亲和活性结果图；
图13显示利用SPR检测JS10的亲和活性结果图；
图14显示利用SPR检测JS11的亲和活性结果图；
图15显示利用SPR检测JS12的亲和活性结果图；
图16显示利用SPR检测JS13的亲和活性结果图；
图17显示利用SPR检测JS14的亲和活性结果图；
图18显示利用SPR检测JS15的亲和活性结果图；
图19显示利用SPR检测JS16的亲和活性结果图；
图20显示利用双抗体夹心法检测抗体包被浓度的结果图；
图21显示利用双抗体夹心法检测抗体检测灵敏度的结果图；
图22显示本发明的抗原检测层析条的检测效果图。
具体实施方式
下面通过附图和实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1抗体筛选
一、重组SARS-CoV2核蛋白(NP)表达
1.1主要试剂
SARS-CoV2 NP基因序列(GenBank序列号:MT066176.1)以及相关引物合成和测序均由通用生物系统(安徽)有限公司完成；E.coli DH5α，BL21(DE3)感受态细胞购自通用生物系统(安徽)有限公司；BamHⅠ和NotⅠ核酸内切酶购自New England Biolabs(NEB)公司；EXTaq酶购自TaKaRa公司；HRP标记抗人Fc抗体购自Sigma公司；其他化学试剂均为国产分析纯试剂；感染2019-nCoV患者血清由本中心收集及保存，全部为江苏病例。
1.2原核表达质粒构建
设计NP基因原核表达引物，上游引物带BamHⅠ酶切位点，下游引物带Not Ⅰ酶切位点。引物序列为：Cov2-NP-F:CGGGATCCTCTGATAATGGACCCCAAAATC；Cov2-NP-R:ATAAGAATGCGGCCGCAGGCCTGAGTTGAGTCAGCAC。使用EX Taq酶扩增NP基因，PCR反应程序为：94℃ 3min；94℃ 30s,58℃ 30s,72℃ 80s，共30个循环；72℃ 10min。PCR产物经胶回收约1 300bp目的片段，然后经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后连接pET28a载体，转化E.coli DH5α感受态细胞。次日挑选单菌落测序正确后，提质粒转化原核表达菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞。
1.3NP表达及纯化
将NP表达菌培养至OD600＝0.6后，加入终浓度0.5mmol/L的IPTG，16℃诱导6h，收集菌体，超声破碎后离心收集包涵体。将包涵体溶于8mol/L尿素中，然后用镍柱亲和层析纯化包涵体蛋白。纯化后梯度减少尿素含量，使蛋白透析复性至PBS中，最后经SDS-PAGE检测蛋白表达及纯化效果。小量表达成功以后即上100L发酵罐进行大量发酵，发酵培养基为TB培养基(1％甘油)，发酵参数为280rpm，通气比为0.5vvm(15L/min)，pH控制在6.8～7.2，罐压0.06MPa～0.1MPa，发酵温度为16℃，培养24h。
SDS-PAGE结果显示：NP全长加上载体中的His tag及其他附带氨基酸，预计蛋白相对分子质量约50×103。表达菌经IPTG诱导后，发现在50×103左右出现明显的条带，与预计分子量大小一致(图1A)。包涵体溶解后，过镍柱纯化，在150mmol/L咪唑时有明显的洗脱峰。蛋白经透析复性后，经SDS-PAGE发现在同样的位置出现单一蛋白条带(图1B)。此说明NP被成功诱导表达并且纯化后纯度较高。注：图中M：蛋白Makers；1：未诱导的pET28a-NP表达菌；2：IPTG诱导后pET28a-NP重组表达菌；3：纯化后重组核衣壳蛋白。
二、噬菌体文库构建
1、采集COVID-19患者恢复期外周血，从外周血中分离单个核细胞(PBMC)
本项目于2020年2月14日，经过知情同意，采集5位COVID-19确诊患者出院前外周血各20ml。使用GE的Ficoll-Paque PLUS，经密度梯度离心法，分离20ml肝素抗凝血中的单个核细胞(PBMC)。
2、PBMC中RNA的提取和cDNA的合成
使用QIAGEN的RNeasy Mini Kit提取PBMC细胞RNA，然后使用罗氏公司的第一链合成试剂盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，Roche，Cat No.：04896866001)将RNA反转录成cDNA。
3、PCR扩增VK，VL和VH(EX Taq，Takara,Cat No.:DRR001A)
(1)扩增VK&VL体系如表1所示。
表1扩增VK&VL体系
(2)扩增重链Fd段体系如表2所示。
表2扩增重链Fd段体系
| 溶液或组分 | 体积(μL) |
| cDNA | 2 |
| EX Buffer(10x) | 10 |
| dNTPs(10mM each) | 8 |
| P1(10μM) | 2 |
| P2(10μM) | 2 |
| EX Taq 1U/μl | 0.6 |
| dH<sub>2</sub>O | 75.4 |
(3)反应程序如表3所示。
表3反应程序
PCR产物过2％琼脂糖凝胶电泳，回收750bp左右的片段。
4、轻链克隆(将VK和VL克隆入pComb3H载体)
VK和VL经XbaⅠ和SacⅠ酶切后与同样经XbaⅠ和SacⅠ酶切的pComb3H载体连接后，回收连接产物，然后电转XL1-Blue感受态细胞。
电击菌液涂15cm大平皿，次日刮菌，提质粒即为轻链库。此时重组质粒为pComb3H-VK和pComb3H-VL。
5、重链克隆(将VH基因克隆入pComb3H-VK和pComb3H-VL轻链库中)
将轻链库pComb3-L和Fd片段分别经XhoI和SpeI双酶切，与同样经XhoI和SpeI双酶切的pComb3H-VK和pComb3H-VL连接，然后电转即得到抗体文库。
6、抗体库的包装
(1)从-80℃冰箱取出抗体库，冰上融化后取1ml加入10ml A+(20μg/ml)2YT培养基中，37℃200rpm摇1小时；
(2)加100ml A+(100μg/ml)，T+(20μg/ml)2YT培养基，200rpm摇1小时；
(3)加1012pfu的VCSM13辅助噬菌体，37℃静置20min，200rpm摇2小时；
(4)加终浓度70μg/ml卡那30℃200rpm摇过夜；
(5)次日6000rpm离心20min，倒出上清，加入4％PEG8000(4g)和3％NaCl(3g)，混匀，置于冰上30min以上；
(6)分装于50ml离心管中9000rpm离心25min，弃去上清，控干，沉淀用1ml PBS重悬即为包装文库。
三、噬菌体文库筛选
1、将重组SARS-CoV2核蛋白(NP)包被于免疫管中，按50μg/管包被3管，于4℃放置过夜，次日用2％脱脂牛奶封闭免疫管1h。
2、向免疫管中加1.75ml含2％脱脂牛奶的PBS和250μl噬菌体文库，37℃摇1h，再37℃静置1h。
3、倒去噬菌体文库，用PBST洗20次，每次摇5min。
4、用1ml pH＝2.2的Gly-HCl洗脱免疫管，室温静置5min，再37℃摇5min，然后吸至1.5ml EP管中，加入57μl 2M Tris中和至pH＝7。
5、将洗脱液转移至一个新的50ml离心管中，立即加入10ml OD＝1的新鲜XL1-Blue，混匀后37℃孵育30min，加入10ml 2YT(Amp 100μg/ml，Tet 20μg/ml)。
6、取10μl菌液用来测洗脱库容量，剩下20ml培养基倒入500ml三角瓶，230rpm摇1h。
7、加入130ml 2YT(Amp 100ug/ml，Tet 20μg/ml)，230rpm摇1h。
8、加入MOI＝20的辅助噬菌体，37℃静置孵育30min。
9、3000g 10min离心，重悬沉淀至150ml 2YT(Amp 100μg/ml，Tet 20μg/ml)中，37℃，230rpm摇2h。
10、加入110μl 70mg/ml卡那霉素，30℃230rpm过夜。次日再加1/5体积的PEG-NaCl(40ml)，混匀后冰浴至少1h，然后10000g 4℃离心20min，沉淀重悬于2-3ml PBS中，瞬时离心去除杂菌，过0.45μm滤器后用于下一轮筛选。
11、重复上述筛选步骤3次，以达到对噬菌体文库富集筛选的目的。
12、第三轮富集完以后，挑选2*96个克隆。经IPTG诱导后，次日进行ELSA检测。
四、ELISA检测2*96个克隆的结合特异性
1、分别包被2块抗人Fab抗体(1:3000)和2块NP蛋白(2μg/ml)，于4℃包被过夜。
2、次日用3％脱脂牛奶封闭1h，然后加入50μl诱导上清和50μl脱脂牛奶，37℃孵育1h，PBST洗涤。
3、4块板均加入HRP标记的抗人Fab抗体(1:3000)，37℃孵育1h，PBST洗涤后，TMB显色。
经筛选共获得178株能与NP特异性结合的噬菌体抗体片段，该片段为人源的Fab段，包括轻链全长及重链的Fd段。将178个单菌落扩增后送测序，共获得159株轻重链齐全的合格序列。
实施例2全抗体的表达及相关功能验证
从获得的159株抗体中最终选定16株抗体用于全抗体的表达及相关功能验证，将此16株抗体命名为JS01～JS16。
其中，JS07抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核酸序列如SEQ ID NO.17所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，核酸序列如SEQ ID NO.18所示。
JS08抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.16所示。
1、全抗体表达
将上述16株人源抗体，构建成IgG形式人源全分子抗体，并在293F细胞中表达，用Protein A纯化后备用。
2、ELISA检测16株抗体与重组NP结合特异性
将重组NP用PBS按1μg/ml浓度包被ELISA板，将所有抗体浓度稀释到1mg/ml，然后从1:10000开始倍比稀释，37℃孵育30min。然后PBST洗3次，加入HRP标记的抗人IgG(1:5000)，37℃孵育30min后PBST洗3次，然后TMB显色，终止后读取OD450吸光度值。
采用间接ELISA检测16株NP抗体的稀释滴度，阴性对照的平均OD值为0.119，标准差为0.132，因此将cutoff值定义为
由此判断16株抗体的检测滴度为1:80000～1:1280000之间(图2)。
3、16株抗体与纯化NP的Western Blot结果
将1μg重组NP经SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜中，用上述16种抗体(0.5μg/ml)37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，然后用HRP标记的抗人IgG(1:5000)孵育30min，PBST洗涤3次，然后用DAB之间在膜上显色。
WB实验结果显示16株抗体均能特异性结合重组表达的核蛋白(NP)，并在50kDa处出现明显的显色带，此提示该组抗体全部为线性表位的抗体(图3)。
4、抗体亲和活性检测
抗体亲和力测定由Biacore T200工作站完成，具体按以下步骤进行：首先使用氨基偶联活化剂NHS和EDC以10μl/min 300s活化CM5芯片，然后用10mM醋酸钠缓冲液(pH5.5)将重组表达的SARS-CoV-2NP稀释到1ug/mL，以10μl/min流经芯片30s使响应值(Responseunits,RUs)达到600左右，最后设置10μl/min、420s，进样乙醇胺对芯片表面剩余活化位点进行封闭。系列稀释的抗体，在25℃时以30μl/min流速依次进样，每测定一次浓度以后用pH2.0的甘氨酸-盐酸再生CM5芯片，然后进行下个浓度检测。实验结束后，利用Biacore T200Evaluation Software软件全局拟合曲线来获得结合亲和力。
实验结果如图4-19所示，JS01-JS16可高效结合SARS-CoV-2NP蛋白，亲和活性相关参数见表4。
表4抗体亲和力参数
5、抗体配对实验
5.1抗体包被浓度的确定
(1)将100μl JS12抗体从5μg/ml开始倍比稀释到0.0024μg/ml共稀释12个稀释度，然后包被于ELISA板中。4℃包被过夜，次日用1％BSA封闭2h，PBST洗3次。
(2)向每个包被浓度的第一孔加入50ng的重组NP，然后倍比稀释到0.39ng/孔，共8个稀释度，37℃孵育1h，PBST洗3次。
(3)加入1:1000稀释HRP标记的JS08，37℃孵育1h，PBST洗3次，TMB显色后读取OD450nm吸光度值。
由图20的曲线可以看出，包被抗体的量对检测灵敏性有影响，从5μg/ml到0.00245μg/ml的包被量看来，影响不大，检测NP抗原的灵敏性看小于3.9ng/ml。因此，后续配对实验，我们均选择2μg/ml浓度作为抗体包被量，用1:4000作为酶标抗体的稀释度。
5.2双抗夹心法检测NP
(1)将16株NP抗体JS01～JS16按2μg/ml浓度包被ELISA板，于4℃包被过夜，次日用1％BSA封闭2h，PBST洗3次。
(2)加入0.1μg/ml重组NP蛋白，然后倍比稀释至0.78ng/ml，共8个稀释度，37℃孵育1h，PBST洗3次。
(3)加入HRP标记的JS08(1:1000)，37℃孵育1h，PBST洗3次，TMB显色，读取OD450nm吸光度值。
由图21可见，酶标的JS08不能与JS06，JS11和JS08自身配对，而与其他13株NP抗体均可配对用于双抗夹心法检测NP。其中JS08与JS16配对效果最好，其检测限可达0.78ng/ml以下，其他配对抗体检测限在12.5-1.56ng/ml之间。
6、双抗体夹心免疫层析法检测重组NP的灵敏度
将抗JS08单抗包被在硝酸纤维素膜上形成T线，抗人IgG抗体标记至C线处。NP蛋白系列稀释后加50μL于样本孔中，样本孔下的结合垫上的标有色微球的JS01～JS16抗体与NP形成免疫复合物，然后通过层析作用迁移至T线处，与此处标记抗体结合固定，形成有色T线。多余的人源单抗再继续迁移至C线处，与抗人抗体结合，形成C线。以此来测定对NP的结合灵敏度。
采用有色微球标记JS08抗体与13株抗体分别配对，制成抗原检测层析条。用2ng/ml的重组NP验证试纸条，从结果可见全部层析条均可见明显的检测T线，而质控C线也非常明显(图22)。这说明13对抗体组合均可用于检测新冠状病毒的核蛋白，且检测限小于2ng/ml。
虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省疾病预防控制中心（江苏省公共卫生研究院）
<120> 抗新型冠状病毒的抗体和使用该抗体的免疫检测
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr Ala
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala
1 5
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Arg Ala Gly Trp Ser Val Ser Pro Leu Lys Tyr Asn Trp Phe Asp
1 5 10 15
Pro
<210> 4
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Gly Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Trp Ser Val Ser Pro Leu Lys Tyr Asn Trp Phe Asp
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Thr Ser Ser Ile Gly Arg Asn Thr
1 5
<210> 6
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Arg Asp Asn
1
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ser Ala Trp His Asp Thr Leu Asn Gly Val Val
1 5 10
<210> 8
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Ser Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Ser Ile Gly Arg Asn
20 25 30
Thr Val Ser Trp Phe Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp His Asp Thr Leu
85 90 95
Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ala Arg Glu Gln Phe Ser Gly Gly Asp Tyr Glu Gly Phe Asp Phe
1 5 10 15
<210> 12
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Gln Phe Ser Gly Gly Asp Tyr Glu Gly Phe Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp
1 5
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gly Asn Ser
1
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Trp Val
1 5 10
<210> 16
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Ser Val Leu Thr Gln Glu Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 17
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc aactatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggcac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctgg gcagcctgag atctgaggac acggccgttt attactgtgc gagagcaggg 300
tggagtgtga gccccctaaa gtacaactgg ttcgacccct ggggccaggg aaccctggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 18
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cagagcgtgc tcacgcagcc gccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtctccatc 60
tcttgttctg gaagtacctc cagcatcgga aggaatactg taagctggtt ccaacaactc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agagataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tctgaggatg aggctgagta ttactgttca gcatggcatg acaccctgaa tggtgtcgtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
Claims (11)
1.一种特异性结合新型冠状病毒的单克隆抗体，其含有：
（1）由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的重链CDRH1；
（2）由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的重链CDRH2；
（3）由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的重链CDRH3；
（4）由SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列组成的轻链CDRL1；
（5）由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的轻链CDRL2；
（6）由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成的轻链CDRL3。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其含有由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的重链可变区，以及由SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
3.单克隆抗体的组合，所述组合包括权利要求1或2所述的单克隆抗体或，还包括第二单克隆抗体；其中，第二单克隆抗体含有：
（1）由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的重链CDRH1；
（2）由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的重链CDRH2；
（3）由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的重链CDRH3；
（4）由SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列组成的轻链CDRL1；
（5）由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的轻链CDRL2；
（6）由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成的轻链CDRL3。
4.根据权利要求3所述的组合，所述第二单克隆抗体含有由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的重链可变区，以及由SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
5.一种非诊断目的的利用免疫测定法特异性检测生物样品中新型冠状病毒的方法，所述方法包括使用权利要求1或2所述的单克隆抗体，或使用权利要求3或4所述的组合。
6.根据权利要求5所述的方法，所述免疫测定法为ELISA。
7.一种用于测定新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的单克隆抗体，或权利要求3或4所述的组合。
8.编码权利要求1或2所述的单克隆抗体的核酸分子。
9.包含权利要求8所述的核酸分子的载体。
10.包含权利要求9所述的载体的宿主细胞。
11.一种应用，其包含以下任一项所述的应用：
（1）权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备新型冠状病毒检测产品中的应用；
（2 ）权利要求3或4所述的组合在制备检测新型冠状病毒的产品中的应用。
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