CN111089962B - 联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒及其制备方法，涉及生物医药领域，采用抗原抗体夹心法和胶体金免疫层析法原理定性检测人血清或血浆中是否存在抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体，运用胶体金标记含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白形成金标N蛋白后吸附在金标垫上，以含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白作为指示标记物，在NC膜的IgM检测线上包被鼠抗人u链单抗、在IgG检测线上包被鼠抗人IgG单抗及在NC膜的质控线上包被鼠抗6×His单抗，实现对抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM/IgG抗体定性检测，具有使用方便、灵敏度高、检测时间短的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒及其制备方法，具体地说是一种应用夹心法原理的胶体金免疫层析法实现联合对血液中抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体进行定性检测的试剂盒。
背景技术
2019年12月以来，出现了新型冠状病毒（2019-nCoV）疫情。其常见体征有发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，而部分患者病症状轻微，甚至存在无临床症状的无症状患者。具备人传人的特点，一般潜伏期1-14天，且潜伏期具有传染性，而无症状感染者也可能成为传染源，其主要通过呼吸道飞沫和密切接触传染传播，人群普遍易感。
疫情发展至今，仍有不少疑似病例因为检测效率不足等原因尚未确诊，如何大规模快速筛查疑似病例，供临床医生快速判断是否为新型冠状病毒肺炎，以便于快速隔离免于传染给更多的人，是亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、简单、可靠、成本低廉、灵敏度高的联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法。
本发明提供技术方案如下：一种联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，包括盒体、位于所述盒体内的粘贴支架，所述粘贴支架上延长度方向依次粘贴有样本垫、金标垫、NC膜、吸样垫，所述NC膜上靠近所述金标垫侧设有IgM检测线和IgG检测线，所述NC膜上靠近所述吸样垫侧设有质控线，所述金标垫含有金标N蛋白，所述金标N蛋白为由胶体金标记的含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白；
所述IgM检测线上包被有鼠抗人u链单抗；
所述IgG检测线上包被有鼠抗人IgG单抗；
所述质控线上包被有鼠抗6×His单抗。
作为本发明的进一步改进，所述金标N蛋白的制备方法包括以下步骤：
S101、胶体金制备：取2mL1wt%氯金酸加入100mL水溶液中，加热至沸腾，再加入2-5mL1wt%柠檬酸三钠混匀，煮沸待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却；
S102、金标液制备：取1mL胶体金加入100μL0.1M、pH7.2的PB，混匀后加入0.1MNaOH溶液调节pH值至7.2-7.6，加入15-25μg含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白充分混匀，再加入100μL10vol%的牛血清白蛋白混匀；
S103、金标液纯化：将金标液和金标液混合离心后弃去上清，加入含有20wt%蔗糖的金标复溶液溶解，即得。
作为本发明的进一步改进，所述金标N蛋白中胶体金的粒径为15-30nm。
作为本发明的进一步改进，所述质控线上鼠抗6×His单抗的包被浓度为0.75-1mg/ml，所述IgM检测线上鼠抗人u链单抗包被浓度为1.0－1.5mg/ml，所述IgG检测线上鼠抗人IgG单抗包被浓度为1.0－1.5mg/ml。
作为本发明的进一步改进，所述金标N蛋白中胶体金与含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白在蛋白质的等电点附近进行抗体交联。
作为本发明的进一步改进，所述金标垫上含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白含量高于所述IgM检测线上鼠抗人u链单抗含量和所述IgG检测线上鼠抗人IgG单抗含量的总量。
作为本发明的进一步改进，所述的样本垫材质为玻璃纤维膜，经过含Tris、酪蛋白钠盐、PVP-10的处理液进行处理过夜。
作为本发明的进一步改进，所述的金标垫材质为玻璃纤维膜，经过含Tris、S-17、牛血清白蛋白的处理液处理。
一种联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、金标垫的制备：采用胶体金标记含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白制得金标N蛋白，并将金标N蛋白喷涂在玻璃纤维膜上，干燥得到金标垫；
S2、NC膜的制备：将鼠抗人u链单抗包被在硝酸纤维素膜上形成IgM检测线，将鼠抗人IgG单抗包被在硝酸纤维素膜上形成IgG检测线，将鼠抗6×His单抗包被在硝酸纤维素膜上形成质控线；
S3、切割装配：在粘贴支架的长度方向上依次粘贴样本垫、步骤S1制得的金标垫、步骤S2制得的NC膜以及吸样垫，切割成3.5mm±0.5mm宽的试纸条，装入盒体，即得。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中，所述金标垫（3）上金标N蛋白的喷涂量为1.4-2.0μL/cm。
本申请主要材料：
样本垫：材质为玻璃纤维膜，经过样本垫处理液（主要含Tris、酪蛋白钠盐、PVP-10）处理过夜，样本垫用于去除样品中的大颗粒及缓冲检测系统以保障环境体系中抗原与特异性抗体交联；
金标垫：经过专用处理液（含Tris、S-17、牛血清白蛋白等）处理过的玻璃纤维膜，含有金标N蛋白；胶体金标记抗体的确切点样量需要严格测试，以适合IgM检测线显色检测抗新型冠状病毒IgM抗体以及IgG检测线显色检测抗新型冠状病毒IgG抗体，金标N蛋白能分别与抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体和抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体特异性结合形成金标复合物，还要使多余胶体金标记抗体进入质控线而显现颜色，金标N蛋白上胶体金标记含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白不足时质控线颜色将不会显示，成为失效条，因此金标垫上含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白含量要高于IgM检测线上鼠抗人u链单抗含量和所述IgG检测线上鼠抗人IgG单抗含量的总量，而过量的金标N蛋白到达T区可出现假阳性，本申请金标垫上金标N蛋白的喷涂量为适宜的1.4-2.0μL/cm；
NC膜（硝酸纤维素膜）：在硝酸纤维素膜划线的第一个区是IgM检测线区，在硝酸纤维素膜划线的第二个区是IgG检测线区，在硝酸纤维素膜划线的第三个区是质控线区，IgM检测线、IgG检测线和质控线在此膜包被成线状，IgM检测线包被有鼠抗人u链单抗、IgG检测线包被有鼠抗人IgG单抗，用以捕获胶体金交联复合物，质控线包被鼠抗6×His单抗，当交联复合物从交联垫以毛细运动到达质控线时，该复合物将被鼠抗6×His单抗捕获，而形成可见的酒红色条带，质控线为控制线，以便检验检测系统的有效性，如质控线不出线，表明检验无效；
吸样垫：为Whatman滤纸，促进样本层析经过样本垫、胶体金-抗体结合物垫、硝酸纤维素膜，到达吸样垫区，以吸收多余的样本而完成检测；
黏贴支架：为PVC支持垫，由薄PVC塑料制成以支撑上述组件。
本申请的检测原理：检测时，把待测的血清或血浆样本滴在样品垫上，通过毛细效应下层析向前移动到金标垫，由于未感染的正常人血液中是不存在着抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体的（IgM抗体是在急性感染期出现的抗体，患者发病后3天左右就可以阳性，在感染发生后的1到2个月即会消失；IgG是感染中、后期产生的抗体，阳性提示患者处于恢复期或是既往感染；同时检测IgM与IgG抗体可动态监测患者感染的过程），而感染新型冠状病毒患者血液存在抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体，如被检样本中含有抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体时，金标N蛋白可以与抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体特异地结合形成IgM金标复合物，在层析过程中与固定在IgM检测线的鼠抗人u链单抗结合形成“Au-含6×HIS标记的N蛋白－抗IgM抗体－鼠抗人u链单抗”的夹心抗原抗体复合物，聚集在IgM检测线上形成酒红色条带，继而通过目测可检测血液中的新型冠状病毒IgM抗体，IgM检测线区不出现酒红色条带则表示样本中没有抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体，如被检样本中含有抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体时，金标N蛋白可以与抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体特异地结合形成IgG金标复合物，在层析过程中与固定在IgG检测线的鼠抗人IgG单抗结合形成“Au-含6×HIS标记的N蛋白－抗IgG抗体－鼠抗人IgG单抗”的夹心抗原抗体复合物，聚集在IgG检测线上形成酒红色条带，继而通过目测可检测血液中的新型冠状病毒IgG抗体，IgG检测线区）不出现酒红色条带则表示样本中没有抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体，无论被检样本中是否存在抗体，复合物都会继续向上层析至质控线，与鼠抗6×His单抗反应出现一条酒红色带，质控线所呈现的酒红色条带是判断层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。
本发明相对于现有技术，有以下优点：
本发明一种联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，采用抗原抗体夹心法和胶体金免疫层析法原理定性检测人血清或血浆中是否存在抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体，运用胶体金分别标记含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白以结合形成金标N蛋白后吸附在金标垫上，以含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白作为指示标记物，在NC膜的IgM检测线上包被鼠抗人u链单抗、在IgG检测线上包被鼠抗人IgG单抗以及在NC膜的质控线上包被鼠抗6×His单抗，以夹心法这一技术来实现对血液中抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体的定性检测，本发明是一种家用或诊所用动态监测装置，能方便快速地检测血液中是否存在抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体，同时本发明成本低、使用方便、检测灵敏度高、抗干扰能力强、检测时间短，以供临床医生快速判断是否确诊新型冠状病毒，以及同时检测IgM与IgG抗体可动态监测患者感染的过程，同时本发明检测时间短、检测灵敏度高、抗干扰能力强、成本低、使用简便、，适用于大规模快速筛查新型冠状病毒疑似患者以及动态监测患者感染的过程。
本发明一种联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法，制备工艺简单，产品使用简便，成本低廉，适合推广。
附图说明
图1是本发明联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的结构示意图。
图2为本申请的测试准备1.2.2段落不同pH值的溶液中胶体金与含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白的吸收值。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式说明本发明的具体技术方案。
本申请的测试准备：
1、金标N蛋白的制备条件筛选
1.1、胶体金颗粒大小的确定
1.1材料与方法
制备原理：柠檬酸三钠还原法生产胶体金，金颗粒大小受柠檬酸三钠浓度等因素影响很大，改变柠檬酸三钠浓度，便可生产出不同颗粒大小的胶体金。
测试方法：取2mL1wt%氯金酸（HAuCl4）溶液，加入到100mL水中，加热至沸，再加入1～8mL1wt%柠檬酸三钠，混合煮沸5分钟，直到颜色不发生变化。
不同粒径的胶体金颗粒标记效果实验：通过上述方法制得不同直径大小的金颗粒，标记含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白的混合抗体，制作成试剂，以最低检出量质控品（Cut-Off，10拷贝病毒/毫升），要求2分钟内出现检测线，下同）及阴性血清加样（要求20分钟内不出现测线），比较不同颗粒大小金标结合物的生物活性，结果如下表1所示。
实验结果与分析：
表1：不同大小金颗粒标记的效果比较：
| 柠檬酸三钠的量 | 金颗粒直径 | Cut-Off结果 | 阴性血清结果 | 稳定性 |
| 8mL | 18nm | 3分钟内有出线（＋） | ― | 一般 |
| 4mL | 25nm | 3分钟内有出线（＋） | ― | 好 |
| 1mL | 50nm | 3分钟内未出线（－） | ― | 差 |
（注：“－”表示阴性结果，即质检线出现一条紫红色条带，检测线不出现一条紫红色条带；“＋”表示阳性结果，即质检线和检测线各出现一条紫红色条带。）
从实验结果我们可以看出，18nm和25nm的胶体金能同时满足最低检出量质控品和阴性血清的检出时间和检测结果的要求。因此选择15-30nm的胶体金用于标记，确定胶体金颗粒的制备工艺：2mL1wt%氯金酸加入100mL水溶液加热至沸腾，加入1wt%柠檬酸三钠2-5mL混匀，煮沸5分钟，待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却备用。据此工艺生产的胶体金颗粒满足试剂的检测要求。
1.2、胶体金标记含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白的条件优化
1.2.1、含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白与胶体金结合浓度的确定
材料与测试方法：在1mL的胶体金溶液中，调节pH值在7.0左右，分别加入0μg、5μg、10μg、15μg、20μg、25μg含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白，分别标记为1#、2#、3#、4#、5#、6#，静置10min后，加入10wt%的NaCl100μL，混匀，静置2h后，观察其结果。（含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白为达瑞生物技术股份有限公司产品）
结果与分析：胶体金是一种带负电的疏水性颗粒，未加蛋白、抗原或当加入的抗原量不足以吸附完全的胶体金时，由于盐离子效应，加入NaCl时，会改变胶体的性质，出现由红变蓝的聚沉现象。我们观察结果看到4#、5#和6#管颜色不变，1#和2#管变蓝，3#管颜色基本不变，因此稳定1mL的胶体金所需要的蛋白量为15-25μg。
1.2.2、胶体金与含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白结合时pH值范围的确定
材料与检测方法：在1mL体积的胶体金溶液（已加入100μL的0.1M、pH7.2的PB）中，加入1MNaOH溶液调节pH值分别至7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0，然后加入20μg的含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白，混匀静置5分钟，再加入100μL10wt%的NaCl液，静置10分钟后，测其在520nm和580nm处的吸收值。以差异吸光度（A520－A580）为纵坐标，pH值为横坐标绘制成图，测试结果如图2所示。
结果与分析：如图2所示，在不同pH值的溶液中标记胶体金，分析结果如图2所示。pH在7.2-7.6之间，A520－A580差值达到顶点，这表示在这个pH范围内胶体金和蛋白的吸附较好，因而选择pH值在7.2之间作为胶体金标记含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白时的pH范围。
1.3、金标N蛋白喷涂量的确定
原理：金标垫上的金标量在很大程度上影响着最终试剂的灵敏度。
材料与测试方法：在金标垫上按每1cm分别喷涂1.0μL、1.2μL、1.4μL、1.6μL、1.8μL和2.0μL的金标N蛋白溶液，干燥后制作成试剂，用Cut-Off和阴性血清进行检测并观察结果，详见表2。
结果与分析
表2：不同涂布量的测试结果
| 喷涂量（μL/cm） | Cut-Off结果 | 阴性血清结果 |
| 1 | 2分钟内未出线（－） | － |
| 1.2 | 2分钟内未出线（－） | － |
| 1.4 | 2分钟内有出线（＋） | － |
| 1.6 | 2分钟内有出线（＋） | － |
| 1.8 | 2分钟内有出线（＋） | － |
| 2 | 2分钟内有出线（＋） | － |
（注：“－”表示阴性结果，即质检线出现一条紫红色条带，检测线不出现一条紫红色条带；“＋”表示阳性结果，即质检线和检测线各出现一条紫红色条带。）
从实验结果我们可以看出，当金标N蛋白的喷涂量为1.4-2.0μL/cm时，Cut-Off和阴性血清的检测结果符合设计要求。
2、NC膜质控线包被鼠抗6×His单抗浓度的确定
主要材料：鼠抗6×His单抗：美国Metammune公司产品；NC膜：MilliporeHF135NC膜；包被液配制：PBS+0.5wt%BSA+3wt%蔗糖，pH7.4。
测试方法：将鼠抗6×His单抗以PBS稀释成1.5mg/ml、1mg/ml、0.75mg/ml、0.65mg/ml，包被在NC膜上作为质控线，用金标鼠抗人IgG单抗，干燥后组成测试条，用PBS作为样品测试，12分钟内观察质控线的出线情况，实验结果见表3。
结果与分析
表3不同浓度鼠抗6×His单抗包被的检测结果
| 浓度（mg/ml） | 1.5 | 1 | 0.75 | 0.65 |
| 结果 | 红褐色、线条模糊、致密 | 鲜红色、线条均匀、致密 | 鲜红色、线条均匀、致密 | 浅红色、线条模糊 |
实验结果显示，鼠抗6×His单抗的浓度以0.75-1mg/ml浓度包被时，色带明显、粗细合适、均匀、致密。
3、NC膜上IgM检测线包被鼠抗人u链单抗浓度的确定
主要材料：鼠抗人u链单抗：为美国Metammune公司或北京爱必信生物技术公司产品；NC膜：Sartoris140膜或MilliporeHF135膜；包被液配制：PBS+0.5wt%BSA+3wt%蔗糖，pH7.4；质控品：2019-nCoV病人血清为质控品，从广东省疾病控制中心获得，56℃30分钟灭活后，配制成相应的浓度。
测试方法：用PBS将鼠抗人u链单抗稀释至不同浓度2mg/ml、1.5mg/ml、1mg/ml、0.75mg/ml，调整好参数包被在NC膜上同时包被质控线，用病人血清的内控品进行测试，观察结果，如表4所示。
结果与分析
表4不同浓度鼠抗人u链单抗包被的检测结果
| 浓度（mg/ml） | 2 | 1.5 | 1 | 0.75 |
| 低丰度血清 | ＋＋ | ＋ | ＋/－ | ＋/－ |
| 50ng/mlCRP | － | － | － | － |
| 1IU/lIL-6 | ＋/－ | － | － | － |
| 60ng/ml降钙素（calcitonin） | － | － | － | － |
结果显示，包被蛋白浓度为1.0－1.5mg/ml时检测的灵敏度和特异性良好，包被浓度过高时特异性下降，浓度较低时灵敏度下降。
4、NC膜上IgG检测线包被鼠抗人IgG单抗浓度的确定
主要材料：鼠抗人IgG单抗：为美国Metammune公司或北京爱必信生物技术公司产品；NC膜：Sartoris140膜；包被液配制：PBS+0.5wt%BSA+3wt%蔗糖，pH7.4；质控品：2019-nCoV病人血清为质控品，从广东省疾病控制中心获得，56℃30分钟灭活后，配制成相应的浓度。
测试方法：用PBS将鼠抗人IgG单抗稀释至不同浓度2mg/ml、1.5mg/ml、1mg/ml、0.75mg/ml，调整好参数包被在NC膜上同时包被质控线，用病人血清的内控品进行测试，观察结果，如表5所示。
结果与分析：
表5 不同浓度鼠抗人IgG单抗包被的检测结果
| 浓度（mg/ml） | 2 | 1.5 | 1 | 0.75 |
| 低丰度血清 | ＋＋ | ＋ | ＋/－ | ＋/－ |
| 50ng/mlCRP | － | － | － | － |
| 1IU/lIL-6 | ＋/－ | － | － | － |
| 60ng/ml降钙素（calcitonin） | － | － | － | － |
结果显示，包被蛋白浓度为1.0－1.5mg/ml时检测的灵敏度和特异性良好，包被浓度过高时特异性下降，浓度较低时灵敏度下降。
测试结果总结：
经上述测试准备对主要生产工艺及反应体系的研究确定了本试剂盒工艺参数为：胶体金采用氯金酸-柠檬酸三钠法制备胶体金粒径为15-30nm的胶体金溶液；标记量为15-25μg含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白每毫升胶体金，胶体金标记含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白时的pH范围为7.2-7.6；金标N蛋白的喷涂量为1.4-2.0μL/cm；NC膜质控线包被鼠抗6×His单抗浓度为0.75-1mg/ml；NC膜上IgM检测线包被鼠抗人u链单抗浓度为1.0－1.5mg/ml；NC膜上IgG检测线包被鼠抗人IgG单抗浓度为1.0－1.5mg/ml。
实施例1、联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法：
S1：金结合物:3的制作：取2mL1wt%氯金酸加入100mL水溶液中，加热至沸腾，再加入2mL1wt%柠檬酸三钠混匀，煮沸待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却得胶体金；取1mL胶体金加入100μL0.1M、pH7.2的PB，混匀后加入0.1MNaOH溶液调节pH值至7.4，加入20μg含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白充分混匀，再加入100μL10vol%的牛血清白蛋白混匀，得金标液；将金标液离心后弃去上清，加入含有20wt%蔗糖的金标复溶液（0.01MPB＋1wt%BSA）溶解，得金标N蛋白；将金标N蛋白以2.0μL/cm涂布量涂布在金标垫3上，干燥环境下干燥16h；
S2、NC膜4的制备：将鼠抗人u链单抗以1.25mg/ml浓度包被在硝酸纤维素膜4上形成IgM检测线41，将鼠抗人IgG单抗以1.25mg/ml浓度包被在硝酸纤维素膜4上形成IgG检测线42，将鼠抗6×His单抗以1mg/ml包被在硝酸纤维素膜上形成质控线43，干燥环境下干燥12h；
S3、切割装配：如图1所示，在干燥环境下（温度35℃，湿度＜30%)取粘贴支架1，在粘贴支架1中央贴上包被好抗体的NC膜4，吸样垫5紧贴粘贴支架1叠压NC膜4上缘，NC膜4下缘粘贴金标垫3，金标垫3下缘粘贴上样品垫2，完成试剂大板的组装；用切割机将贴好的粘贴支架1切成适当宽度3.5mm宽的试纸条；将裁切好的试纸条正确放在盒体（图中未画出）内。
实施例2、联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法：
S1、金结合物/3的制作：取2mL1wt%氯金酸加入100mL水溶液中，加热至沸腾，再加入2.5mL1wt%柠檬酸三钠混匀，煮沸待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却得胶体金；取1mL胶体金加入100μL0.1M、pH7.2的PB，混匀后加入0.1MNaOH溶液调节pH值至7.2，加入25μg含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白充分混匀，再加入100μL10vol%的牛血清白蛋白混匀，得金标液；将金标液离心后弃去上清，加入含有20wt%蔗糖的金标复溶液（0.01MPB＋1wt%BSA）溶解，得金标N蛋白；将金标N蛋白以1.8μL/cm涂布量涂布在金标垫3上，干燥环境下干燥8h；
S2、NC膜4的制备：将鼠抗人u链单抗以1.5mg/ml浓度包被在硝酸纤维素膜上形成IgM检测线41，将鼠抗人IgG单抗以1.5mg/ml浓度包被在硝酸纤维素膜上形成IgG检测线42，将鼠抗6×His单抗以0.75mg/ml包被在硝酸纤维素膜上形成质线43，干燥环境下干燥16h；
S3、切割装配：如图1所示，在干燥环境下（温度35℃，湿度＜30%)取粘贴支架1，在粘贴支架1中央贴上包被好抗体的NC膜4，吸样垫5紧贴粘贴支架1叠压NC膜4上缘，NC膜4下缘粘贴金标垫3，金标垫3下缘粘贴上样品垫2，完成试剂大板的组装；用切割机将贴好的粘贴支架1切成适当宽度3.5mm宽的试纸条；将裁切好的试纸条正确放在盒体（图中未画出）内。
实施例3、联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法：
S1、金标垫3的制作：取2mL1wt%氯金酸加入100mL水溶液中，加热至沸腾，再加入5mL1wt%柠檬酸三钠混匀，煮沸待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却得胶体金；取1mL胶体金加入100μL0.1M、pH7.2的PB，混匀后加入0.1MNaOH溶液调节pH值至7.6，加入15μg含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白充分混匀，再加入100μL10vol%的牛血清白蛋白混匀，得金标液；将金标液离心后弃去上清，加入含有20wt%蔗糖的金标复溶液（0.01MPB＋1wt%BSA）溶解，得金标N蛋白；将金标N蛋白以2.0μL/cm涂布量涂布在金标垫3上，干燥环境下干燥12h；
S2、NC膜4的制备：将鼠抗人u链单抗以1mg/ml浓度包被在硝酸纤维素膜上形成IgM检测线41，将鼠抗人IgG单抗以1mg/ml浓度包被在硝酸纤维素膜上形成IgG检测线42，将鼠抗6×His单抗以0.85mg/ml包被硝酸纤维素膜上形成质控线43，干燥环境下干燥8h；
S3、切割装配：如图1所示，在干燥环境下（温度35℃，湿度＜30%)取粘贴支架1，在粘贴支架1中央贴上包被好抗体的NC膜4，吸样垫5紧贴粘贴支架1叠压NC膜4上缘，NC膜4下缘粘贴金标垫3，金标垫3下缘粘贴上样品垫2，完成试剂大板的组装；用切割机将贴好的粘贴支架1切成适当宽度3.5mm宽的试纸条；将裁切好的试纸条正确放在盒体（图中未画出）内。
对上述实施例1-3所制备的试剂盒进行临床前自测试验
测试样品：
（1）实验样品：新型冠状病毒弱阳性血清和新型冠状病毒强阳性血清（由广东省疾病控制中心提供样本，其中弱阳性血清为标注有IgM抗体检测量，强阳性血清为标注有IgG抗体检测量）；正常人的阴性血清，其中弱阳性血清、强阳性血清和阴性血清样本各10份，56℃30分钟灭活病毒；
（2）干扰样品：CRP、IL-6、calcitonin，分别由北京爱必信生物技术有限公司、以色列ProSpec公司、美国Fitzgerald公司和美国Metammune公司提供试剂，分别配制成相应的浓度加入正常人血清中。
测试方法：
（1）用加样枪加100uL或用滴定管加3滴样本到样本垫上；
（2）用定时器计时，平放静置2-15分钟；
（3）观察并记录试剂盒的显色结果，检测结果如表6、表7所示。
表6：临床前自测试验弱阳性血清、强阳性血清的检测结果
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |||||||
| 测试样品 | 测试结果 | IgM检测线显色时间 | IgG检测线显色时间 | 测试结果 | IgM检测线显色时间 | IgG检测线显色时间 | 测试结果 | IgM检测线显色时间 | IgG检测线显色时间 |
| 弱阳性样本1 | ＋ | 2'48" | 0 | ＋ | 3'22" | 0 | ＋ | 2'43" | 0 |
| 弱阳性样本2 | ＋ | 2'44" | 0 | ＋ | 2'51" | 0 | ＋ | 2'17" | 0 |
| 弱阳性样本3 | ＋ | 3'30" | 0 | ＋ | 3'14" | 0 | ＋ | 3'31" | 0 |
| 弱阳性样本4 | ＋ | 2'33" | 0 | ＋ | 3'42" | 0 | ＋ | 2'28" | 0 |
| 弱阳性样本5 | ＋ | 2'23" | 0 | ＋ | 2'23" | 0 | ＋ | 2'42" | 0 |
| 弱阳性样本6 | ＋ | 3'32" | 0 | ＋ | 2'55" | 0 | ＋ | 2'34" | 0 |
| 弱阳性样本7 | ＋ | 2'58" | 0 | ＋ | 2'45" | 0 | ＋ | 2'57" | 0 |
| 弱阳性样本8 | ＋ | 3'11" | 0 | ＋ | 2'41" | 0 | ＋ | 2'51" | 0 |
| 弱阳性样本9 | ＋ | 3'29" | 0 | ＋ | 3'16" | 0 | ＋ | 3'03" | 0 |
| 弱阳性样本10 | ＋ | 2'55" | 0 | ＋ | 2'24" | 0 | ＋ | 2'35" | 0 |
| 强阳性样本1 | ＋ | 0 | 2'13" | ＋ | 0 | 2'12" | ＋ | 0 | 2'48" |
| 强阳性样本2 | ＋ | 0 | 2'52" | ＋ | 0 | 2'54" | ＋ | 0 | 3'14" |
| 强阳性样本3 | ＋ | 0 | 2'51" | ＋ | 0 | 2'41" | ＋ | 0 | 3'24" |
| 强阳性样本4 | ＋ | 0 | 2'14" | ＋ | 0 | 2'02" | ＋ | 0 | 2'51" |
| 强阳性样本5 | ＋ | 0 | 2'52" | ＋ | 0 | 2'21" | ＋ | 0 | 2'41" |
| 强阳性样本6 | ＋ | 0 | 2'37" | ＋ | 0 | 2'48" | ＋ | 0 | 2'13" |
| 强阳性样本7 | ＋ | 0 | 2'35" | ＋ | 0 | 2'21" | ＋ | 0 | 2'14" |
| 强阳性样本8 | ＋ | 0 | 3'13" | ＋ | 0 | 3'01" | ＋ | 0 | 3'50" |
| 强阳性样本9 | ＋ | 0 | 3'21" | ＋ | 0 | 2'54" | ＋ | 0 | 2'14" |
| 强阳性样本10 | ＋ | 0 | 2'42" | ＋ | 0 | 2'31" | ＋ | 0 | 2'55" |
（注：“－”表示阴性结果，即质检线出现一条紫红色条带，检测线不出现一条紫红色条带；“＋”表示阳性结果，即质检线和任一检测线各出现一条紫红色条带。）
表7：临床前自测试验阴性血清、干扰样本的检测结果
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |||||||
| 测试样品 | 测试结果 | IgM检测线显色时间 | IgG检测线显色时间 | 测试结果 | IgM检测线显色时间 | IgG检测线显色时间 | 测试结果 | IgM检测线显色时间 | IgG检测线显色时间 |
| 阴性样本1 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 |
| 阴性样本2 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 |
| 阴性样本3 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 |
| 阴性样本4 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 |
| 阴性样本5 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 |
| 阴性样本6 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 |
| 阴性样本7 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 |
| 阴性样本8 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 |
| 阴性样本9 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 |
| 阴性样本10 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 |
| 50ng/mlCRP/正常人血清 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 |
| 1000mIU/lIL-6/正常人血清 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 |
| 60ng/mlCalcitonin/正常人血清 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 |
| 10ng/mlKatacalcin/正常人血清 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 | － | 0 | 0 |
从表6、表7的检测结果可以看出，本申请实施例1-3所制备的试剂盒进行临床前自测试验，对弱阳性IgM抗体血清样本检出率达到100%，可以准确检测出样本中含有新型冠状病毒IgM抗体，对强阳性IgG血清样本的检出率达到100%，可以准确检测出样本中含有新型冠状病毒IgG抗体，而正常人的阴性样本全部未检测，表明本申请的灵敏度高达100%，同时本申请以CRP、IL-6、calcitonin作为特异性干扰样品验证试剂盒的抗干扰能力，加入正常人血清后检测，结果显示：C-反应蛋白、白介素-6、降钙素处理的正常人血清对测试结果无影响，与正常人血清测试结果一致抗干扰率达到100%，符合内部质控品检测符合标准，说明研制试剂盒的性能符合要求，且本申请对弱阳性样本的检出时间为2'17"到3'42"，强阳性样本的检出时间为2'02"到3'50"，说明本申请检测时间短，可以快速检测出血液中是否存在抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体，适用于大规模快速筛查新型冠状病毒疑似病例。
IgM检测线的颜色反映样本中抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体的浓度，样本中抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体含量少，到达IgM检测线区的结合胶体金-抗体也就会少，它们可以结合位于检测线的新型冠状病毒核衣壳蛋白会越少，因此在IgM检测线区形成胶体金酒红色条带的颜色越浅，反映样本中抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体越少，同样抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体越少，IgG检测线区的结合胶体金-抗体也就会少，它们可以结合位于检测线的新型冠状病毒核衣壳蛋白会越少，因此在IgG检测线区形成胶体金酒红色条带的颜色越浅，反映样本中抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体；反之，在IgM检测线区形成胶体金酒红色条带的颜色越深，反映样本中抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体量就越多，在IgG检测线区形成胶体金酒红色条带的颜色越深，反映样本中抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体量就越多。因此，样本中是否存在抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体量，可以通过比较测试T线的颜色来确定。
Claims (7)
1.联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，包括盒体、位于所述盒体内的粘贴支架（1），所述粘贴支架（1）上延长度方向依次粘贴有样本垫（2）、金标垫（3）、NC膜（4）、吸样垫（5），所述NC膜（4）上靠近所述金标垫（3）侧设有IgM检测线（41）和IgG检测线（42），所述NC膜（4）上靠近所述吸样垫（5）侧设有质控线（43），其特征在于：所述金标垫（3）含有金标N蛋白，所述金标N蛋白为由胶体金标记的含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白；所述IgM检测线（41）上包被有鼠抗人u链单抗；所述IgG检测线（42）上包被有鼠抗人IgG单抗；所述质控线（43）上包被有鼠抗6×His单抗；所述质控线（43）上鼠抗6×His单抗的包被浓度为0.75-1mg/ml，所述IgM检测线（41）上鼠抗人u链单抗包被浓度为1.0－1.5mg/ml，所述IgG检测线（42）上鼠抗人IgG单抗包被浓度为1.0－1.5mg/ml；所述金标N蛋白中胶体金的粒径为15-30nm，所述金标垫（3）上金标N蛋白的喷涂量为1.4-2.0μL/cm；
所述金标N蛋白的制备方法包括以下步骤：
S101、胶体金制备：取2mL1wt%氯金酸加入100mL水溶液中，加热至沸腾，再加入2-5mL1wt%柠檬酸三钠混匀，煮沸待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却；
S102、金标液制备：取1mL胶体金加入100μL 0.1M、pH7.2的PB，混匀后加入0.1MNaOH溶液调节pH值至7.2-7.6，加入15-25μg含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白充分混匀，再加入100μL10vol%的牛血清白蛋白混匀；
S103、金标液纯化：将金标液离心后弃去上清，加入含有20wt%蔗糖的金标复溶液溶解，即得。
2.根据权利要求1所述的联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，其特征在于：所述金标N蛋白中胶体金与含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白在蛋白质的等电点附近进行抗体交联。
3.根据权利要求1所述的联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，其特征在于：所述金标垫（3）上含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白含量高于所述IgM检测线（41）上鼠抗人u链单抗含量和所述IgG检测线（42）上鼠抗人IgG单抗含量的总量。
4.根据权利要求1所述的联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，其特征在于：所述的样本垫（2）材质为玻璃纤维膜，经过含Tris、酪蛋白钠盐、PVP-10的处理液进行处理过夜。
5.根据权利要求1所述的联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，其特征在于：所述的金标垫（3）材质为玻璃纤维膜，经过含Tris、S-17、牛血清白蛋白的处理液处理。
6.一种根据权利要求1-5任一项所述的联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、金标垫（3）的制备：采用胶体金标记含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白制得金标N蛋白，并将金标N蛋白喷涂在玻璃纤维膜上，干燥得到金标垫（3）；
S2、NC膜（4）的制备：将鼠抗人u链单抗包被在硝酸纤维素膜上形成IgM检测线（41），将鼠抗人IgG单抗包被在硝酸纤维素膜上形成IgG检测线（42），将鼠抗6×His单抗包被在硝酸纤维素膜上形成质控线（43）；
S3、切割装配：在粘贴支架（1）的长度方向上依次粘贴样本垫（2）、步骤S1制得的金标垫（3）、步骤S2制得的NC膜（4）以及吸样垫（5），切割成3.5mm±0.5mm宽的试纸条，装入盒体，即得。
7.根据权利要求6所述的联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述金标垫（3）上金标N蛋白的喷涂量为1.4-2.0μL/cm。
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