CN113092778B - 一种新冠病毒胶体金检测试纸及其制备方法和应用 - Google Patents

一种新冠病毒胶体金检测试纸及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113092778B
CN113092778B CN202110332403.6A CN202110332403A CN113092778B CN 113092778 B CN113092778 B CN 113092778B CN 202110332403 A CN202110332403 A CN 202110332403A CN 113092778 B CN113092778 B CN 113092778B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gold
labeled
protein
conjugate pad
colloidal gold
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110332403.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113092778A (zh
Inventor
魏鹏海
朱兆奎
梁权
赵百慧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Berger Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Berger Medical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Berger Medical Technology Co ltd filed Critical Shanghai Berger Medical Technology Co ltd
Priority to CN202110332403.6A priority Critical patent/CN113092778B/zh
Publication of CN113092778A publication Critical patent/CN113092778A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113092778B publication Critical patent/CN113092778B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供一种新冠病毒胶体金检测试纸及其制备方法和应用，本发明的试剂盒检测阳性符合率高。金标记结合物垫分别采用新冠病毒的S蛋白和N蛋白进行标记，可同时识别样本中针对新冠病毒S蛋白的IgM抗体和IgG抗体，以及新冠病毒N蛋白的IgM抗体和IgG抗体，同时本发明对S蛋白金标记PH值为7.5±0.5，且金标记S蛋白是均匀的铺在结合物垫上；对N蛋白金标记PH值为9.5±0.5，且金标记N蛋白采用喷金划膜仪喷在结合物垫上；以及通过对S蛋白和N蛋白进行差异化的金标记和处理方式和采用球形瓶与数显夹套式磁力搅拌器进行胶体金颗粒的烧制、并在缓冲溶液1、缓冲溶液2中加入表面活性剂月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠能够大幅提高检测灵敏度，使得整体的检测效率提高。

Description

一种新冠病毒胶体金检测试纸及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于新冠病毒检测技术领域，具体来说是一种新冠病毒胶体金检测试纸及其制备方法和应用。
背景技术
严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)属于冠状病毒(Coronavirus)，是引起2019冠状病毒病疫情的病原体。冠状病毒是一类在动物与人类之间传播的人畜共患的单链RNA病毒，冠状病毒可感染哺乳动物、鸟类，引起牛和猪的消化道疾病或鸡的上呼吸道疾病。在SARS-CoV-2发现之前，自然界常见，已知可感染人类的冠状病毒共有六种，低危型的有4种，主要引起感冒症状，它们分别是人类冠状病毒229E(HCoV-229E)、人类冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人类冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、人类冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)；高危型有2种，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合症冠状病毒(MERS-CoV)。目前较多的试剂盒基于新型冠状病毒、甲型和乙流流感病毒抗体检测，但人体产生特异性抗体需要7-14天，抗体检测相对于抗原检测具有时间滞后性，不能及时发现、及时隔离和治疗；基于病毒核酸检测的试剂盒，操作相对繁琐、耗时较长，而且需要使用扩增仪且需要专业人员操作等缺点，现有的金标试纸在使用的过程中检测的阳性符合率低。
发明内容
本发明的目的在于解决现有的一种新冠病毒胶体金检测试纸及其制备方法和应用，以解决新冠病毒IgM和IgG抗体胶体金检测试纸检测时的阳性符合率低的问题。
为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
一种新冠病毒IgM和IgG抗体胶体金检测试纸的制备方法，包括如下步骤：
S10、利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液；
S20、制备金标记S蛋白和N蛋白：利用碳酸钾分别将制备好的胶体金溶液调节PH至7.5±0.5和9.5±0.5，以分别形成胶体金溶液A和胶体金溶液B，分别再用双蒸水稀释标记S蛋白和N蛋白至浓度为0.5-2mg/ml，然后将S蛋白逐滴加入搅拌的胶体金A溶液中，N蛋白逐滴加入搅拌的胶体金B溶液中，保持搅拌20-30min，分别胶体金A溶液和胶体金B溶液中加10％BSA至终浓度为0.2％-0.5％，封闭裸露金颗粒，4℃下继续搅拌20-30min，并以6000r/min离心20-30min，浓缩备用；
S30、利用缓冲溶液1稀释浓缩S20中的金标记S蛋白，并均匀铺在金标结合物垫上以形成金标S蛋白结合物垫；利用缓冲溶液2处理金标结合物垫后并将S20中的金标记N蛋白喷于处理好的金标结合物垫上以形成金标N蛋白结合物垫；
S40、将抗人IgM、抗人IgG和羊抗兔分别用缓冲溶液3稀释，然后将抗人IgM、抗人IgG和羊抗兔包被于硝酸纤维素膜上以分别形成第一检测线、第二检测线和质控线，37℃干燥16小时备用；
S50、利用缓冲溶液4浸泡样品垫，在室温、湿度＜20％的条件下过夜干燥，切割备用；
S60、按样品垫、金标S蛋白结合物垫、金标N蛋白结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺序粘附于支撑底板上组装试纸，并切割包装。。
优选地，步骤S10中采用球形瓶、悬臂式磁力搅拌桨配合数显夹套式磁力搅拌器烧制颗粒均一的直径为35-45nm的胶体金颗粒，分光光度计测其最高峰在530±5nm，OD值在1.0±0.1。
优选地，所述S30中缓冲溶液1由Tris-Hcl、蔗糖、海藻糖、BSA、PEG20000、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠、吐温-20组成，其中，所述Tris-Hcl摩尔浓度为10-100mM，蔗糖质量终浓度为3％-10％，海藻糖质量终浓度为1％-5％，BSA质量终浓度为1％-3％，PEG20000质量终浓度为0.05％-0.5％，月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠质量终浓度为0.1％-1.0％，吐温-20质量终浓度为0.1％-0.5％。
优选地，所述S30中缓冲溶液2由Tris-Hcl、蔗糖、BSA、酪蛋白和月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠组成，其中，所述Tris-Hcl摩尔浓度为10-100mM，蔗糖质量终浓度为3％-10％，BSA质量终浓度为0.5％-3％，酪蛋白质量终浓度为0.1％-1.0％，月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠质量终浓度为0.1％-1.0％。
优选地，所述S40中缓冲溶液3由PBS和蔗糖组成，其中PBS摩尔浓度为10-100mM，蔗糖质量终浓度为1％-5％。
优选地，所述S50中缓冲溶液4由Tris-Hcl、BSA、酪蛋白、PEG20000和吐温-20组成，其中Tris-Hcl摩尔浓度为10-100mM，BSA质量终浓度为0.5％-5％，酪蛋白质量终浓度为0.1％-2％，PEG20000质量终浓度为0.1％-1.0％，吐温-20质量终浓度为0.1％-0.5％。
优选地，所述S40中的新冠病毒IgM和IgG抗体为人全血、血清和血浆中的新冠病毒IgM和IgG抗体；
和/或；
所述的金标结合物垫和样品垫由玻璃纤维制备而成；
和/或；
所述第一检测线与所述第二检测线之间的距离以及所述第二检测现场与质控线两两之间的距离为3-8mm；
和/或；
在所述S30和S40之间还包括S31，所述S31分别对所述S30中的金标S蛋白和金标N蛋白结合物垫真空冷冻干燥备用。
本发明还提供一种新冠病毒IgM和IgG抗体胶体金检测试纸，采用上述所述的制备方法制备而成。
优选地，所述样品垫一端位于所述金标S蛋白结合物垫一端上，且与所述金标S蛋白结合物垫交错重叠1-2mm；
所述所述金标S蛋白结合物垫的另一端位于金标N蛋白结合物垫一端上，且所述金标S蛋白结合物垫与所述金标N蛋白结合物垫交错重叠1-2mm；
所述金标N蛋白结合物垫的另一端位于硝酸纤维素膜一端上，且所述金标N蛋白结合物垫与所述硝酸纤维素膜交错重叠1-2mm；
所述吸水垫位于所述硝酸纤维素的另一端上，且所述吸水垫与所述硝酸纤维素交错重叠2-3mm。
本发明还提供一种新冠病毒IgM和IgG抗体胶体金检测试纸在检测人全血、血清和血浆中的新冠病毒IgM和IgG
与现有技术相比，本发明提供的一种新冠病毒胶体金检测试纸及其制备方法和应用具有以下有益效果：
1、本发明的试剂盒检测阳性符合率高。金标记结合物垫分别采用新冠病毒的S蛋白和N蛋白进行标记，可同时识别样本中针对新冠病毒S蛋白的IgM抗体和IgG抗体，以及新冠病毒N蛋白的IgM抗体和IgG抗体，同时本发明对S蛋白金标记PH值为7.5±0.5，且金标记S蛋白是均匀的铺在结合物垫上；对N蛋白金标记PH值为9.5±0.5，且金标记N蛋白采用喷金划膜仪喷在结合物垫上。
2、本发明通过对S蛋白和N蛋白进行差异化的金标记和处理方式，从而使两者之间不产生交叉干扰。S蛋白与N蛋白使用的不同缓冲溶液配方对两者之间不产生交叉干扰有重要作用，大大提高了试剂盒检测阳性符合率。
3、本发明专利采用球形瓶与数显夹套式磁力搅拌器使得金烧制过程中溶液温度保持一致，烧制的金颗粒大小均一性好；且悬臂式磁力搅拌桨不与球形瓶直接接触，不存在摩擦，烧制的金溶液质量好。本发明烧制的高质量金溶液提高了试剂盒检测阴性符合率。
4、本发明通过在缓冲溶液1、缓冲溶液2中加入表面活性剂月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠能够大幅提高检测灵敏度。其次，本发明对于金标S蛋白结合物垫和金标N蛋白结合物垫采用真空干燥箱进行干燥处理，有效的保护蛋白活性，提高检测灵敏度。
5、本发明的试剂盒检测时间短。本发明在针对S蛋白和N蛋白本身不同的蛋白特性，采用不同的标记参数、缓冲溶液配方以及不同的金标结合物垫制备工艺，使得蛋白本身的活性能够更好的发挥，提高了结合效率，确定检测时间5-15min，此方法加快了反应速度，缩短了检测时间。
附图说明
图1为新冠病毒IgM和IgG抗体胶体金检测试纸部分结构示意图
图2为新冠病毒IgM和IgG抗体胶体金检测试纸外观结构示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述，附图中给出了本发明的若干实施例，但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例，相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
本发明提供的一种新冠病毒胶体金检测试纸，下面结合图一、图二所示，本发明的一种新冠病毒IgM和IgG抗体胶体金检测试纸包括CT盒13、胶体金免疫层析试纸条12和样本缓冲液，其中，CT盒13为胶体金免疫层析试纸条的外部壳结构，CT盒13包括加样孔10和观察窗11。
胶体金免疫层析试纸条包括样品垫1；金标S蛋白结合物垫2；金标N蛋白结合物垫3；吸水垫7；支撑底板8(即PVC背板)；和硝酸纤维素膜9。其中，样品垫1一端位于金标S蛋白结合物垫2一端上，且与金标S蛋白结合物垫2交错重叠1-2mm；金标S蛋白结合物垫2的另一端位于金标N蛋白结合物垫3一端上，且金标S蛋白结合物垫2与金标N蛋白结合物垫3交错重叠1-2mm；金标N蛋白结合物垫3的另一端位于硝酸纤维素膜9一端上，且金标N蛋白结合物垫4与硝酸纤维素膜9交错重叠1-2mm；吸水垫7位于硝酸纤维素膜9的另一端上，且吸水垫7与硝酸纤维素膜9交错重叠2-3mm。上述结构全部搭载在PVC背板8上。样品垫1位于加样孔10的下方，硝酸纤维素膜9上固定有一条IgM检测线4、IgG检测线5以及一条质控线6，相邻检测线和质控线两两之间距离优选为3mm～8mm，并位于观察窗11的下方；
本发明提供的一种新冠病毒胶体金检测试纸的制备方法，其中，一种新冠病毒胶体金检测试纸的制备方法包括如下步骤：
S10、胶体金溶液的制备
利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液；制备的胶体金溶液中的胶体金颗粒粒径为35-45nm，具体的方法如下：
(1)于球形瓶中加入1000ml0.01％的氯金酸溶液，使用数显夹套式磁力搅拌器、悬臂式磁力搅拌器带搅拌桨250r/min搅拌加热至沸腾；
在烧制的胶体金颗粒大小一致性，有无杂质等因素对产品特异性有较大影响，大小不一，有杂质的金颗粒容易产生假阳性结果。现有的胶体金试纸条通常采用锥形瓶、磁力加热搅拌器和磁力转子进行胶体金的烧制。此过程中由于磁力加热搅拌器只能加热锥形瓶底部，使得整个溶液温度存在底部高，顶部低的差异，烧制的金颗粒大小存在区别。且磁力转子在旋转过程中与锥形瓶存在摩擦，会产生杂质，影响金溶液质量，而本发明中采用球形瓶、悬臂式磁力搅拌桨配合数显夹套式磁力搅拌器烧制颗粒均一的直径为35-45nm的胶体金颗粒，分光光度计测其最高峰在530±5nm，OD值在1.0±0.1，本发明烧制的金颗粒大小均一性好；且悬臂式磁力搅拌桨不与球形瓶直接接触，不存在摩擦，烧制的金溶液质量好。
(2)保持沸腾1-5min；
(3)快速加入20％柠檬酸三钠0.5-0.8ml。；
(4)继续沸腾10min，停止加热，继续搅拌冷却；
(5)使用双蒸水定容至1000ml；
(6)利用分光光度计测量，最高吸收峰在530±5nm，OD值在1.0±0.1。
S20、制备金标记S蛋白和N蛋白
制备金标记S蛋白：
(1)取20ml制备好的40nm左右的胶体金溶液于玻璃小烧杯中，利用碳酸钾调其PH至7.5±0.05；
(2)逐滴缓慢加入利用双蒸水稀释好的S蛋白100ug，搅拌20-30min；
(3)加入10％牛血清白蛋白(BSA)400uL，使其终浓度为0.2％，继续搅拌20-30min；
(4)4℃，6000r/min，离心30min，弃上清，收集沉淀。
制备金标记N蛋白：
(1)取20ml制备好的40nm左右的胶体金溶液于玻璃小烧杯中，利用碳酸钾调其PH至9.5±0.05；
(2)逐滴缓慢加入利用双蒸水稀释好的N蛋白100ug，搅拌20-30min；
(3)加入10％牛血清白蛋白(BSA)400uL，使其终浓度为0.2％，继续搅拌20-30min；
(4)4℃，6000r/min，离心30min，弃上清，收集沉淀。
S30、金标S蛋白结合物垫的制备
(1)利用缓冲溶液1将金标记S蛋白重悬沉淀为原体积的20％-50％；
(2)将稀释好的金标记S蛋白均匀的铺在玻璃纤维垫上，真空冷冻干燥过夜；
(3)将整张干燥的金标S蛋白结合物垫切割为宽6mm的金标S蛋白结合物垫，于铝箔袋干燥密封保存备用。
金标N蛋白结合物垫的制备
(1)利用缓冲溶液2处理金标结合物垫，在室温、湿度＜20％的条件下过夜干燥备用；
(2)利用缓冲溶液2重悬沉淀为原体积的5％-10％；
(3)使用喷金划膜仪以1.0ul/cm的喷量将金标记N蛋白喷于处理好的金标结合物垫上，真空冷冻干燥过夜；
(4)将干燥的金标N蛋白结合物垫于铝箔袋干燥密封保存备用。
S40、包被硝酸纤维素膜
将抗人IgM、抗人IgG和羊抗兔分别用缓冲溶液3稀释，使用划膜仪以1.0ul/cm的喷量，分别划于硝酸纤维素膜上，检测线和质控线相距4-8mm；其中抗人IgM的包被浓度为0.3-0.6mg/ml，抗人IgG的包被浓度为0.8-1.5mg/ml，羊抗鼠的包被浓度为1-3mg/ml；37℃烘箱干燥16h，密封于铝箔袋干燥保存备用。
S50、样品垫的处理
(1)利用缓冲溶液4以50ml/张的量处理整张玻璃纤维(玻纤规格为30cm×25cm)；
(2)在室温、湿度＜20％的条件下过夜干燥，将整张玻纤切割为宽16mm，密封于铝箔袋中干燥备用。
S60、试纸条的组装、切割
按样品垫、金标N蛋白结合物垫、金标S蛋白结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺序粘附于支撑底板上组装试纸；将组装好的试纸切割为宽3-4mm/条的试纸条，装入塑料CT盒压紧，加干燥剂密封于铝箔袋干燥备用。
在本实施例中，按如下配方配制本发明检测试纸制备涉及的缓冲体系溶液：
缓冲溶液1：Tris-Hcl摩尔浓度为10-100mM，蔗糖质量终浓度为3％-10％，海藻糖质量终浓度为1％-5％，BSA质量终浓度为1％-3％，PEG20000质量终浓度为0.05％-0.5％，月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠质量终浓度为0.1％-1.0％，吐温-20质量终浓度为0.1％-0.5％。
缓冲溶液2：Tris-Hcl摩尔浓度为10-100mM，蔗糖质量终浓度为3％-10％，BSA质量终浓度为0.5％-3％，酪蛋白质量终浓度为0.1％-1.0％，月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠质量终浓度为0.1％-1.0％。
缓冲溶液3：PBS摩尔浓度为10-100mM，蔗糖质量终浓度为1％-5％。
缓冲溶液4：Tris-Hcl摩尔浓度为10-100mM，BSA质量终浓度为0.5％-5％，酪蛋白质量终浓度为0.1％-2％，PEG20000质量终浓度为0.1％-1.0％，吐温-20质量终浓度为0.1％-0.5％。
检测阳性检出率
制备金标记N蛋白时，分别调节PH值7、8、9、10、11，制备5种不同的金标记N蛋白结合物垫，并以此制备5种不同的检测试纸，利用不同浓度质控品水平分别测试，结果见表1。
表1不同PH值金标记N蛋白对检测灵敏度的影响
IgG抗体浓度 1μg/mL 5μg/mL 10μg/mL 20μg/mL 40μg/mL 80μg/mL 160μg/mL 320μg/mL
PH值7 - - - - - + + ++
PH值8 - - - + + ++ ++ ++
PH值9 + + + ++ ++ ++ +++ +++
PH值10 + + + ++ ++ ++ +++ +++
PH值11 - + + ++ ++ ++ +++ +++
IgM抗体浓度 1μg/mL 5μg/mL 10μg/mL 20μg/mL 40μg/mL 80μg/mL 160μg/mL 320μg/mL
PH值7 - - - - - + + +
PH值8 - - - - + + + ++
PH值9 - + + ++ ++ ++ +++ +++
PH值10 - + + ++ ++ ++ +++ +++
PH值11 - - ± + + ++ ++ +++
注：“-”表示阴性，“±”表示灰区，“+”表示弱阳性，“++”表示中阳性，“+++”表示强阳性。
利用按照上述制备方法制备的试纸(同时使用金标N蛋白结合物垫、金标S蛋白结合物垫)和单独使用金标N蛋白结合物垫、金标S蛋白结合物垫的试纸对比，同时检测10份新冠阳性患者血浆样本，结果见表2。
表2同时使用S蛋白和N蛋白，与单独使用其中一种蛋白对阳性检出率的影响
Figure BDA0002996685720000101
注：“-”表示阴性，“±”表示灰区，“+”表示弱阳性，“++”表示中阳性，“+++”表示强阳性。
结论：本发明通过对S蛋白和N蛋白进行差异化的金标记和处理方式，从而使两者之间不产生交叉干扰。本发明试纸同时使用金标N蛋白结合物垫、金标S蛋白结合物垫，可同时识别样本中针对新冠病毒S蛋白的IgM抗体和IgG抗体，以及新冠病毒N蛋白的IgM抗体和IgG抗体，提高了试剂盒检测阳性检出率。
检测阴性检出率
使用球形瓶、数显夹套式磁力搅拌器和悬臂式磁力搅拌桨烧制的40nm胶体金；锥形瓶和磁力加热搅拌器烧制的40nm胶体金分别制备新冠病毒IgM和IgG抗体胶体金检测试纸，检测20份阴性血清样本，结果见表3。
表3不同烧制工艺制备的胶体金对阴性检出率的影响。
Figure BDA0002996685720000111
注：“－”表示阴性，“±”表示灰区，“+”表示弱阳性，“++”表示中阳性，“+++”表示强阳性。
结论：本发明专利采用球形瓶与数显夹套式磁力搅拌器使得金烧制过程中溶液温度保持一致，烧制的金颗粒大小均一性好；且悬臂式磁力搅拌桨不与球形瓶直接接触，不存在摩擦，烧制的金溶液质量好。可以减少层析中的非特异性吸附等现象，提高了阴性检出率。
检测灵敏度
分别配制三种不同的缓冲溶液1和缓冲溶液2：①、②和③，①加入质量浓度0.5％表面活性剂月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠，②不加表面活性剂月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠，③加入0.5％表面活性剂月桂醇醚磷酸酯钾，制备三种不同金标S蛋白结合物垫和金标N蛋白结合物垫；利用不同浓度质控品水平分别测试三种不同的检测试纸，结果见表4。
表4不同组分缓冲溶液1和缓冲溶液2对检测灵敏度的影响
Figure BDA0002996685720000121
注：“－”表示阴性，“±”表示灰区，“+”表示弱阳性，“++”表示中阳性，“+++”表示强阳性。
已上市口碑较好的现有产品A同样采用胶体金层析技术，产品A对重组新冠S蛋白进行胶体金标记并制备金标S蛋白结合物垫，硝酸纤维素膜上包被鼠抗人IgM以及鼠抗人IgG，对样本中的新冠抗体进行捕获显色。
利用按照上述制备方法制备的试纸，和已上市口碑较好的现有产品A对检测灵敏度作比对，结果见表5。
表5本发明试纸与现有产品A检测灵敏度比对结果
IgG抗体浓度 1μg/mL 5μg/mL 10μg/mL 20μg/mL 40μg/mL 80μg/mL 160μg/mL 320μg/mL
BJ + + + ++ ++ ++ +++ +++
A - ± + + ++ ++ +++ +++
IgM抗体浓度 1μg/mL 5μg/mL 10μg/mL 20μg/mL 40μg/mL 80μg/mL 160μg/mL 320μg/mL
BJ - + + ++ ++ ++ +++ +++
A ± + + ++ ++ +++ +++
注：“-”表示阴性，“±”表示灰区，“+”表示弱阳性，“++”表示中阳性，“+++”表示强阳性。
结论：首先，本发明通过对大量的表面活性剂进行筛选比对，在缓冲溶液1、缓冲溶液2中加入月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠能够大幅提高检测灵敏度。其次，本发明对于金标S蛋白结合物垫和金标N蛋白结合物垫采用真空干燥箱进行干燥处理，有效的保护蛋白活性，提高检测灵敏度。
检测时间
利用按照上述制备方法制备的试纸，和已上市口碑较好的现有产品A对检测时间作比对，结果见表6。
表6本发明试纸与现有产品A检测时间比对结果
Figure BDA0002996685720000131
注：“-”表示阴性，“±”表示灰区，“+”表示弱阳性，“++”表示中阳性，“+++”表示强阳性。
结论：本发明在针对S蛋白和N蛋白本身不同的蛋白特性，采用不同的标记参数、缓冲溶液配方以及不同的金标结合物垫制备工艺，使得蛋白本身的活性能够更好的发挥，提高了结合效率，确定检测时间5-15min，并与同类现有产品对比分析，此方法加快了反应速度，缩短了检测时间。
本发明通过上述方法制备的一种新冠病毒胶体金检测试纸在检测人全血、血清和血浆中的新冠病毒IgM和IgG抗体的应用，能够快速高效的检测出结果。
以上所述实施例仅表达了本发明的某种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围；因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种新冠病毒胶体金检测试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S10、利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液；
S20、制备金标记S蛋白和N蛋白：利用碳酸钾分别将制备好的胶体金溶液调节PH至7.5±0.5和9.5±0.5，以分别形成胶体金溶液A和胶体金溶液B，分别再用双蒸水稀释标记S蛋白和N蛋白至浓度为0.5-2mg/ml，然后将S蛋白逐滴加入搅拌的胶体金A溶液中，N蛋白逐滴加入搅拌的胶体金B溶液中，保持搅拌20-30min，分别胶体金A溶液和胶体金B溶液中加10％BSA至终浓度为0.2％-0.5%，封闭裸露金颗粒， 4℃下继续搅拌20-30min，并以6000r/min离心20-30min，浓缩备用；
S30、利用缓冲溶液1稀释S20中的金标记S蛋白，并均匀铺在金标结合物垫上以形成金标S蛋白结合物垫；利用缓冲溶液2处理金标结合物垫后并将S20中的金标记N蛋白喷于处理好的金标结合物垫上以形成金标N蛋白结合物垫；
S40、将抗人IgM、抗人IgG和羊抗兔分别用缓冲溶液3稀释，然后将抗人IgM、抗人IgG和羊抗兔包被于硝酸纤维素膜上以分别形成第一检测线、第二检测线和质控线，37-45℃干燥12-18小时备用；
S50、利用缓冲溶液4浸泡样品垫，在室温、湿度＜20％的条件下过夜干燥，切割备用；
S60、按样品垫、金标S蛋白结合物垫、金标N蛋白结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺序粘附于支撑底板上组装试纸，并切割包装；
其中，步骤S10中采用球形瓶、悬臂式磁力搅拌桨配合数显夹套式磁力搅拌器烧制颗粒均一的直径为35-45nm的胶体金颗粒，分光光度计测其最高峰在530±5nm，OD值在1.0±0.1；
所述S30中缓冲溶液1由Tris-Hcl、蔗糖、海藻糖、BSA、PEG20000、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠、吐温-20组成，其中，所述Tris-Hcl摩尔浓度为10-100mM，蔗糖质量终浓度为3％-10％，海藻糖质量终浓度为1％-5％，BSA质量终浓度为1％-3％，PEG20000质量终浓度为0.05％-0.5％，月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠质量终浓度为0.1％-1.0％，吐温-20质量终浓度为0.1％-0.5％；
所述S30中缓冲溶液2由Tris-Hcl、蔗糖、BSA、酪蛋白和月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠组成，其中，所述Tris-Hcl摩尔浓度为10-100mM，蔗糖质量终浓度为3％-10％，BSA质量终浓度为0.5％-3％，酪蛋白质量终浓度为0.1％-1.0％，月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠质量终浓度为0.1％-1.0％。
2.根据权利要求1所述的一种新冠病毒胶体金检测试纸的制备方法，其特征在于：所述S40中缓冲溶液3由 PBS和蔗糖组成，其中PBS摩尔浓度为10-100mM，蔗糖质量终浓度为1％-5％。
3.根据权利要求1所述的一种新冠病毒胶体金检测试纸的制备方法，其特征在于：所述S50中缓冲溶液4由Tris-Hcl、BSA、酪蛋白、 PEG20000和吐温-20组成，其中Tris-Hcl摩尔浓度为10-100mM，BSA质量终浓度为0.5％-5％，酪蛋白质量终浓度为0.1％-2％，PEG20000质量终浓度为0.1％-1.0％，吐温-20质量终浓度为0.1％-0.5％。
4.根据权利要求1所述的一种新冠病毒胶体金检测试纸的制备方法，其特征在于：
所述新冠病毒胶体金检测试纸用于检测人全血、血清和血浆中的新冠病毒IgM和IgG抗体；
和/或；
所述的金标结合物垫和样品垫由玻璃纤维制备而成；
和/或；
所述第一检测线与所述第二检测线之间的距离以及所述第二检测线与质控线两两之间的距离为3-8mm；
和/或；
在所述S30和S40之间还包括S31，所述S31分别对所述S30中的金标S蛋白结合物垫和金标N蛋白结合物垫真空冷冻干燥备用。
5.一种新冠病毒胶体金检测试纸，其特征在于：采用如权利要求1-4任一所述的制备方法制备而成。
6.根据权利要求5所述的一种新冠病毒胶体金检测试纸，其特征在于：
所述样品垫一端位于所述金标S蛋白结合物垫一端上，且与所述金标S蛋白结合物垫交错重叠1-2mm；
所述所述金标S蛋白结合物垫的另一端位于金标N蛋白结合物垫一端上，且所述金标S蛋白结合物垫与所述金标N蛋白结合物垫交错重叠1-2mm；
所述金标N蛋白结合物垫的另一端位于硝酸纤维素膜一端上，且所述金标N蛋白结合物垫与所述硝酸纤维素膜交错重叠1-2mm；
所述吸水垫位于所述硝酸纤维素的另一端上，且所述吸水垫与所述硝酸纤维素交错重叠2-3mm。
7.一种如权利要求5或6所述的一种新冠病毒胶体金检测试纸非诊断方式在检测新冠病毒IgM和IgG抗体的应用。
CN202110332403.6A 2021-03-29 2021-03-29 一种新冠病毒胶体金检测试纸及其制备方法和应用 Active CN113092778B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110332403.6A CN113092778B (zh) 2021-03-29 2021-03-29 一种新冠病毒胶体金检测试纸及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110332403.6A CN113092778B (zh) 2021-03-29 2021-03-29 一种新冠病毒胶体金检测试纸及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113092778A CN113092778A (zh) 2021-07-09
CN113092778B true CN113092778B (zh) 2022-03-04

Family

ID=76670267

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110332403.6A Active CN113092778B (zh) 2021-03-29 2021-03-29 一种新冠病毒胶体金检测试纸及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113092778B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113533721B (zh) * 2021-07-15 2022-05-10 上海伯杰医疗科技股份有限公司北京分公司 甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试纸条及其制备方法
CN114062673A (zh) * 2021-11-23 2022-02-18 济南百博生物技术股份有限公司 一种高灵敏度新冠抗原检测试剂条及制备方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN212142656U (zh) * 2020-02-21 2020-12-15 南京岚煜生物科技有限公司 一种封闭式微流控芯片
CN111089962B (zh) * 2020-03-25 2020-07-17 中山生物工程有限公司 联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒及制备方法
CN111366728A (zh) * 2020-03-27 2020-07-03 重庆探生科技有限公司 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的免疫层析试剂盒
CN111337689A (zh) * 2020-04-03 2020-06-26 山西医科大学 一种新型冠状病毒检测试剂盒
CN111751527A (zh) * 2020-06-29 2020-10-09 丹娜(天津)生物科技股份有限公司 新型冠状病毒IgG和IgM抗体检测试剂盒及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113092778A (zh) 2021-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113092778B (zh) 一种新冠病毒胶体金检测试纸及其制备方法和应用
Di Teodoro et al. SARS-CoV-2 replicates in respiratory ex vivo organ cultures of domestic ruminant species
CN111122879B (zh) 新型冠状病毒重组抗原的包被液、预处理方法及应用和产品
JP3473700B2 (ja) Ｓｉｒｓワクチンおよびｓｉｒｓ診断方法
CN113009153B (zh) 一种基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒及其应用
CN112415201A (zh) 一种新型冠状病毒s蛋白和n蛋白联合检测胶体金试纸条及其制备方法和用途
WO2010103583A1 (ja) 高病原性鳥インフルエンザh5n1亜型ウイルスの検出キット
CN113702643B (zh) 一种联合检测新型冠状病毒中和抗体及核衣壳蛋白抗体的装置
CN112305218A (zh) 一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法及其应用
WO2023284476A1 (zh) 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体检测试纸条
CN111426830A (zh) 联合诊断covid-19和肺炎支原体的胶体金免疫层析检测试纸及其制备方法
KR101922234B1 (ko) 돼지열병바이러스에 대한 항체 검출용 키트, 및 이를 이용하여 돼지열병바이러스에 대한 항체 유무 및/또는 항체 역가를 측정하는 방법
Schwegler et al. Epithelial neoplasms of the skin, the cutaneous mucosa and the transitional epithelium in dogs: an immunolocalization study for papillomavirus antigen
CN115993451A (zh) 一种甲型流感病毒和腺病毒抗原定量检测试剂盒、制备方法及定量检测方法
CN114460287A (zh) 一种中和抗体的检测方法和试剂盒
CN108101968B (zh) 一种小反刍兽疫疫苗株和野毒株差异性合成肽及其应用
Iwasaki et al. An immunofluorescent study of generalized Coxsackie virus B3 infection in a newborn infant
CN111562367A (zh) 尿液新型冠状病毒快速检测试剂盒、制备方法及使用方法
CN114371286A (zh) 一种检测新冠病毒中和抗体的试剂盒及其制备方法
WO2022160377A1 (zh) 一种新型冠状病毒中和抗体检测试纸
CN114062677A (zh) 一种检测新冠病毒中和抗体的试剂盒及其制备方法
Todd et al. Antigenically important proteins of Aujeszky's disease (pseudorabies) virus identified by immunoblotting
CN113219171A (zh) 检测冠状病毒中和抗体的试剂盒、冠状病毒中和抗体的检测方法
CN110501493A (zh) 一种人副流感病毒3型IgM抗体的检测试剂盒
TWI783341B (zh) 檢測多種待測物的檢驗套組

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 201415 rooms 1302, 1303, 1304, 1305, 1306, 1307 and 1309, building 3, 1588, Huhang Road, Fengxian District, Shanghai

Applicant after: Shanghai Berger Medical Technology Co.,Ltd.

Address before: 201415 rooms 1302, 1303, 1304, 1305, 1306, 1307 and 1309, building 3, 1588, Huhang Road, Fengxian District, Shanghai

Applicant before: SHANGHAI BOJIE MEDICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant