CN112415201A - 一种新型冠状病毒s蛋白和n蛋白联合检测胶体金试纸条及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种新型冠状病毒刺突糖蛋白S(S蛋白)和核蛋白N(N蛋白)联合检测胶体金试纸条,其从加样端开始依次形成有样本垫、金结合物垫、反应膜和吸收垫,所述金结合物垫上含有第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体和/或第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体,所述反应膜上含有等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体和/或等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体。本申请制备的S蛋白和N蛋白联合检测胶体金试纸条,除了可以在医院完成常规检测外,还可以带至家中自行完成检测,相比病毒的核酸检测,具有方便、快捷、经济、高效的特点。

Description

一种新型冠状病毒S蛋白和N蛋白联合检测胶体金试纸条及其 制备方法和用途
技术领域
本申请属于病毒蛋白标志物检测领域,具体地,本申请涉及用于联合检 测新型冠状病毒S蛋白和N蛋白的胶体金试纸条,及其制备方法和用途。
背景技术
冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属,是一类具有囊膜, 基因组为线性单股正链的RNA病毒,是自然界广泛存在的一大类病毒。病 毒基因组5′端具有甲基化的帽状结构,3′端具有多聚(A)尾,基因组全长27~ 32kb,是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒仅感染脊椎动 物,与人和动物的多种疾病有关,可引起人和动物呼吸系统、消化系统和神 经系统疾病。新型冠状病毒属于β属的新型冠状病毒,有包膜,颗粒呈圆形 或椭圆形,常为多形性,直径60~140nm。其基因特征与与SARS相关的冠 状病毒(SARSr-CoV)和与MERS相关的冠状病毒(MERSr-CoV)有明显区别。 目前研究显示与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性达85%以 上。体外分离培养时,SARS-CoV-2 96小时左右即可在人呼吸道上皮细胞内 发现,而在非洲绿猴肾细胞系(Vero E6)和人肝癌细胞系(Huh-7)中分离培养需 约6天。
冠状病毒是一大类病毒,已知会引起疾病,患者表现为从普通感冒到重 症肺部感染等不同临床症状,例如中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸 综合征(SARS)。在全球,10%~30%的上呼吸道感染由HCoV-229E、 HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1四类冠状病毒引起,在造成普通 感冒的病因中占第二位,仅次于鼻病毒。感染呈现季节性流行,每年春季和 冬季为疾病高发期。潜伏期为2~5天,人群普遍易感。迄今为止,除新型 冠状病毒外,共发现6种可感染人类的冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和MERS-CoV)。HCoV-229E和 HCoV-NL63属于α属冠状病毒,HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-HKU1 和MERS-CoV均为β属冠状病毒,其中,HCoV-OC43和HCoV-HKU1属于 A亚群,SARS-CoV属于B亚群,MERS-CoV属于C亚群。根据目前的证 据,可以确定新型冠状病毒可以持续人传人。目前已经确定的传播途径主要 是呼吸道飞沫传播(打喷嚏、咳嗽等)和接触传播(用接触过病毒的手挖鼻孔、 揉眼睛等)。
鉴于对病毒的来源、感染后排毒时间、发病机制等还不明确,为更好地 控制此次疫情,减少和降低疾病在国内和境外传播几率,进一步加强对病例 的早期发现、隔离和治疗,最大可能的减少医院感染发生,是当前控制传染 源、降低发病率的关键,提高救治能力,同时最大可能的减少医院感染发生。
有鉴于此,开发快速准确的病毒检测方法有助于疾病的鉴定及后期治 疗。目前已经有多家企业开发出了相应的检测试剂盒,主要基于核酸扩增技 术,如华大基因、圣湘生物等。目前对于新型冠状病毒肺炎(NCP)检测存在 三大问题:(1)病毒核酸检测存在较高的假阴性(造成漏检);(2)核酸检测速度 慢,需要数小时,且依赖实验室;(3)核酸样本易降解,导致检测假阴性(造 成漏检)。因此,我们需要开发“新型冠状病毒抗原快速检测”项目,此举可在 一定程度上弥补核酸检测造成的假阴性;其次,采用胶体金快速检测,操作 简单,大大缩短等待时。本项目意义重大,能够为国家解决当务之急,其重 要的经济效益是对新型冠状病毒感染检测阴性的人群可以解除隔离,回到生 产力大军中,为国家创造财富;更重要的社会意义是消除人们对新型冠状病 毒感染的恐慌,掌握和控制疫情,稳定社会局面。
冠状病毒(Coronaviruses,CoV)属于尼多病毒目冠状病毒科,为有包膜 的单股、正链RNA病毒,分为α,β和γ三个属。冠状病毒粒子呈球形或不 规则形,有囊膜,大小为80-120nm。其基因组的5'端带有帽子结构,其后 包含6-10个开放阅读框(Open readingframes,ORFs)。占据基因组2/3的第 一个阅读框编码复制酶,基因组的另1/3主要编码结构蛋白,一般包括刺突 糖蛋白(Spike glycoprotein,S glycoprotein,S蛋白)、小包膜蛋白(envelope,E 蛋白)、囊膜蛋白(membrance,M蛋白)、核蛋白(nucleocapsid,N蛋白)。E 蛋白和M蛋白主要参与病毒的装配过程,N蛋白包裹基因组形成核蛋白复 合体,冠状病毒主要通过刺突糖蛋白(S蛋白)与宿主细胞受体结合介导病毒 的入侵并决定病毒组织或宿主嗜性。S蛋白是一类很大的三聚体跨膜糖蛋白, 其在病毒表面形成特殊的花冠结构,冠状病毒因此而得名。S蛋白可识别宿 主细胞受体并介导膜融合,对于病毒颗粒进入细胞至关重要,是病毒感染宿 主细胞的关键因子。冠状病毒的N蛋白是与病毒RNA结合并构成核衣壳的 蛋白,在病毒组装和RNA转录中起着至关重要的作用,同时也参与宿主细 胞对病毒感染的反应。
发明内容
本申请要解决的技术问题是,目前新型冠状病毒的核酸检测技术具有: 核酸样本易降解,导致较高的假阴性,因而漏检;检测速度慢,需要数小时; 和依赖实验室等问题。目前,在临床检测领域尚无新型冠状病毒S蛋白和N 蛋白联合的检测方法。具有方便、快捷、经济、高效的特点。
因此,迫切需要研发一种检测新型冠状病毒的试纸条,具有能够快速进 行检测,且成本低、检测准确度高、结果重复性好、操作简单等特点,除可 以在各大医院科室应用外,亦可以在基层社区医院甚至家庭应用。同时该技 术可结合临床和其他实验室指标,用于新型冠状病毒引起的肺炎的辅助诊断 及治疗效果评价。
基于现有技术的不足,本申请的目的在于提供一种新型冠状病毒S蛋白 和N蛋白联合检测胶体金试纸条,本申请还提供了该试纸条的制备方法及 其在制备新型冠状病毒检测试剂盒中的用途。
具体来说,本申请涉及如下内容:
1.一种新型冠状病毒刺突糖蛋白S(S蛋白)和核蛋白N(N蛋白)联合检 测胶体金试纸条,其特征在于,在所述试纸条上,从加样端开始依次形成有 样本垫、金结合物垫、反应膜和吸收垫,所述金结合物垫上含有第一抗新型 冠状病毒S蛋白单克隆抗体和第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体,其反 应膜上含有等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗 体和等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体。
2.一种新型冠状病毒S蛋白和N蛋白联合检测胶体金试纸条,其特征 在于,所述试纸条包括S蛋白试纸条和N蛋白试纸条,在所述S蛋白试纸 条上,从加样端开始依次形成有样本垫、金结合物垫、反应膜和吸收垫,所 述金结合物垫上含有第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体,所述反应膜上 含有等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体;在所 述N蛋白试纸条上,从加样端开始依次形成有样本垫、金结合物垫、反应膜 和吸收垫,所述金结合物垫上含有第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体, 所述反应膜上含有等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单 克隆抗体。
3.如项1或2所述的试纸条,其特征在于,所述第一抗新型冠状病毒S 蛋白单克隆抗体为识别新型冠状病毒S蛋白的抗体,所述第二与第三抗新型 冠状病毒S蛋白单克隆抗体为识别新型冠状病毒S蛋白的、与所述第一抗新 型冠状病毒S蛋白单克隆抗体不同的另外两个抗体。
4.如项1-3中任一项所述的试纸条,其特征在于,所述第一抗新型冠状 病毒N蛋白单克隆抗体为识别新型冠状病毒N蛋白的抗体,所述第二与第 三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体为识别新型冠状病毒N蛋白的、与所 述第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体不同的另外两个抗体。
5.如项1-4中任一项所述的试纸条,其特征在于,所述金结合物垫上, 第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的含量为0.332-1.162μg/cm2,优选为 0.498-0.996μg/cm2,最优选为0.664-0.830μg/cm2
6.如项1-5中任一项所述的试纸条,其特征在于,所述金结合物垫上, 第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的含量为0.332-1.162μg/cm2,优选为 0.498-0.996μg/cm2,最优选为0.664-0.830μg/cm2
7.如项1-6中任一项所述的试纸条,其特征在于,所述反应膜上等质量 混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的含量为 5-20μg/cm2,优选为8-18μg/cm2,最优选为10-15μg/cm2
8.如项1-7中任一项所述的试纸条,其特征在于,所述反应膜上等质量 混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的含量为 10-25μg/cm2,优选为12-23μg/cm2,最优选为15-20μg/cm2
9.一种新型冠状病毒S蛋白和N蛋白联合检测胶体金试纸条的制备方 法,其特征在于,所述方法包括:
制备胶体金颗粒;
将胶体金颗粒与第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体和第一抗新型 冠状病毒N蛋白单克隆抗体结合,形成胶体金标记的第一抗新型冠状病毒S 蛋白单克隆抗体胶体金结合物和第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶 体金结合物;
将所述第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物和第一抗 新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合物等比例混匀后在玻璃纤维膜 上喷涂、干燥得到金结合物垫;
在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线,得到反应膜,其中分别将含有 等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体、等质量混 合包被的第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的溶液和含有羊抗 鼠IgG多克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上,形成S蛋白检测线、N蛋 白检测线和质控线;
将样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上,使样本 垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列,并使裁切得 到试纸条。
10.一种新型冠状病毒S蛋白和N蛋白联合检测胶体金试纸条的制备方 法,其特征在于,所述方法包括:
1)制备胶体金颗粒;
将胶体金颗粒与第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体结合,形成胶体 金标记的第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物;
将所述第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物在玻璃纤 维膜上喷涂、干燥得到金结合物垫;
在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线,得到反应膜,其中分别将含有 等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的溶液和 含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上,形成检测线和质 控线;
将样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上,使样本 垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列,并使裁切得 到S蛋白试纸条;
2)制备胶体金颗粒;
将胶体金颗粒与第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体结合,形成胶体 金标记的第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合物;
将所述第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合物在玻璃纤 维膜上喷涂、干燥得到金结合物垫;
在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线,得到反应膜,其中分别将含有 等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的溶液和 含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上,形成检测线和质 控线;
将样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上,使样本 垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列,并使裁切得 到N蛋白试纸条。
11.如项9或10所述的制备方法,其特征在于,所述第一抗新型冠状病 毒S蛋白单克隆抗体为识别新型冠状病毒S蛋白的抗体,所述第二与第三抗 新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体为识别新型冠状病毒S蛋白的、与所述第一 抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体不同的另外两个抗体。
12.如项9-11中任一项所述的制备方法,其特征在于,所述第一抗新型 冠状病毒N蛋白单克隆抗体为识别新型冠状病毒N蛋白的抗体,所述第二 与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体为识别新型冠状病毒N蛋白的、 与所述第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体不同的另外两个抗体。
13.如项9-12中任一项所述的制备方法,其特征在于,将所述胶体金颗 粒与第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体结合,所述胶体金颗粒与第一抗 新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的质量比为(8.6-30):1,优选为(10-20):1, 最优选为(12-15):1。
14.如项9-13中任一项所述的制备方法,其特征在于,将所述胶体金颗 粒与第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体结合,所述胶体金颗粒与第一抗 新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的质量比为(8.6-30):1,优选为(10-20):1, 最优选为(12-15):1。
15.如项9-14中任一项所述的制备方法,其特征在于,将所述第一抗新 型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物和所述第一抗新型冠状病毒N蛋 白单克隆抗体胶体金结合物等比例混合后在玻璃纤维素膜上喷涂,包括将所 述胶体金结合物用金结合物重悬液复溶,复溶后所述第一抗新型冠状病毒S 蛋白单克隆抗体的浓度为10-35μg/mL,优选为15-30μg/mL,最优选为 20-25μg/mL。
16.如项9-15中任一项所述的制备方法,其特征在于,将所述第一抗新 型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物和所述第一抗新型冠状病毒N蛋 白单克隆抗体胶体金结合物等比例混合后在玻璃纤维素膜上喷涂,包括将所 述胶体金结合物用金结合物重悬液复溶,复溶后所述第一抗新型冠状病毒N 蛋白单克隆抗体的浓度为10-35μg/mL,优选为15-30μg/mL,最优选为 20-25μg/mL。
17.如项9-16中任一项所述的制备方法,其特征在于,所述含有等质量 混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的溶液中混合抗 体的浓度为0.5-2.0mg/mL,优选为0.8-1.8mg/mL,最优选为1.0-1.5mg/mL。
18.如项9-18中任一项所述的制备方法,其特征在于,所述含有等质量 混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的溶液中混合抗 体的浓度为1.0-2.5mg/mL,优选为1.2-2.3mg/mL,最优选为1.5-2.0mg/mL。
19.如项1-10中任一项所述的试纸条的制备方法,其特征在于,所述方 法包括:
制备胶体金颗粒;
将胶体金颗粒与第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体和第一抗新型 冠状病毒N蛋白单克隆抗体结合,形成胶体金标记的第一抗新型冠状病毒S 蛋白单克隆抗体胶体金结合物和第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶 体金结合物;
将所述第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物和第一抗 新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合物等比例混匀后在玻璃纤维膜 上喷涂、干燥得到金结合物垫;
在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线,得到反应膜,其中分别将含有 等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体、等质量混 合包被的第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的溶液和含有羊抗 鼠IgG多克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上,形成S蛋白检测线、N蛋 白检测线和质控线;
将样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上,使样本 垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列,并使裁切得 到试纸条。
20.如项1-8中任一项所述的试纸条的制备方法,其特征在于,所述方 法包括:
1)制备胶体金颗粒;
将胶体金颗粒与第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体结合,形成胶体 金标记的第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物;
将所述第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物在玻璃纤 维膜上喷涂、干燥得到金结合物垫;
在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线,得到反应膜,其中分别将含有 等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的溶液和 含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上,形成检测线和质 控线;
将样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上,使样本 垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列,并使裁切得 到S蛋白试纸条;
2)制备胶体金颗粒;
将胶体金颗粒与第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体结合,形成胶体 金标记的第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合物;
将所述第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合物在玻璃纤 维膜上喷涂、干燥得到金结合物垫;
在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线,得到反应膜,其中分别将含有 等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的溶液和 含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上,形成检测线和质 控线;
将样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上,使样本 垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列,并使裁切得 到N蛋白试纸条。
21.如项1-8中任一项所述的试纸条在制备用于肺炎检测的试剂盒中的 用途,所述肺炎为新型冠状病毒引起的肺炎。
22.如项21所述的用途,其特征在于,所述试剂盒用于检测选自人咽喉 分泌物或人鼻腔分泌物的一种或两种样本。
23.如项21或22所述的用途,其特征在于,所述试剂盒利用下述步骤 来进行检测:
将一定量的检测样本滴加到试纸条的样本垫;
一段时间后,肉眼进行判读,根据判读标准得到检测结果。
24.如项23所述的用途,其特征在于,所述判读标准为:
①阴性:只在质控区出现一条红色条带,检测区无红色条带出现;
②阳性:在检测区与质控区均出现一条红色条带;
③可疑;质控区和检测区红色条带不清楚,可再次进行检测;
④无效:质控区和检测区均无红色条带出现,或只在检测区出现一条 红色条带。
25.如项23或24所述的用途,其特征在于,所述检测样本的用量为 80-120μL。
26.如项23-25中任一项所述的用途,其特征在于,所述一段时间为 8-10min。
27.一种试剂盒,所述试剂盒包含项1-8中任一项所述的试纸条或者利 用项9-18中任一项所述的方法制备的试纸条。
28.如项27所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒用于肺炎的检测, 所述肺炎为新型冠状病毒引起的肺炎。
29.如项27或28所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒用于检测选 自人咽喉分泌物或人鼻腔分泌物的一种或两种样本。
附图说明
图1本申请的胶体金试纸条的结构图(一)。
图2本申请的胶体金试纸条的结构图(二)。
附图标记
图1:
1样本垫 2金结合物垫 3反应膜 4吸收垫 311 S蛋白检测 线 312 N蛋白检测线 32质控线
图2:
11 S蛋白试纸条样本垫 21 S蛋白试纸条金结合物垫 31 S蛋白试 纸条反应膜41 S蛋白试纸条吸收垫 311 S蛋白检测线 321 S蛋白 质控线
12 N蛋白试纸条样本垫 22 N蛋白试纸条金结合物垫 32 N蛋白 试纸条反应膜42 N蛋白试纸条吸收垫 312 N蛋白检测线 322 N 蛋白质控线
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本申请,应当理解,实施例仅用于进一步 说明和阐释本申请,并非用于限制本申请。
除非另外定义,本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技 术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间 所述相似或相同的方法和材料,本文还是在下文中对材料和方法做了描 述。在相冲突的情况下,以本说明书包括其中定义为准,另外,材料、方 法和例子仅供说明,而不具限制性。以下结合具体实施例对本申请作进一 步的说明,但不用来限制本申请的范围。
如图1所示,在本申请的新型冠状病毒S蛋白和N蛋白联合检测胶体金 试纸条上,从加样端开始依次形成有样本垫1,金结合物垫2,反应膜3和 吸收垫4。其中反应膜3上有S蛋白检测线311、N蛋白检测线312和质控 线32。所述样本垫材质为玻璃纤维素膜,用于滴加检测样本。所述金结合物 垫材质为玻璃纤维素膜。所述反应膜3材质为硝酸纤维素膜。
具体的,金结合物垫2是在玻璃纤维素膜上喷点胶体金标记的第一抗新 型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物和第一抗新型冠状病毒N蛋白单 克隆抗体胶体金结合物形成的。金结合物垫2含第一抗新型冠状病毒S蛋白 单克隆抗体和第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体,第一抗新型冠状病毒 S蛋白单克隆抗体为识别新型冠状病毒S蛋白的抗体,含量为 0.332-1.162μg/cm2,优选为0.498-0.996μg/cm2,最优选为0.664-0.83μg/cm2; 第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体为识别人新型冠状病毒N蛋白的抗 体,含量为0.332-1.162μg/cm2,优选为0.498-0.996μg/cm2,最优选为 0.664-0.83μg/cm2。具体的,反应膜3上喷涂,含有等质量混合包被的第二与 第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的溶液,形成S蛋白检测线311,所 述反应膜上等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗 体的含量为5-20μg/cm2,优选为8-18μg/cm2,最优选为10-15μg/cm2;含有 等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的溶液,形 成N蛋白检测线312,所述反应膜上等质量混合包被的第二与第三抗新型冠 状病毒N蛋白单克隆抗体的含量为10-25μg/cm2,优选为12-23μg/cm2,最优 选为15-20μg/cm2;和含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液,形成质控线32, 其中S蛋白检测线311和N蛋白检测线312的位置可以互换。
如图2所示,在本申请的新型冠状病毒S蛋白和N蛋白联合检测胶体金 试纸条包括两条试纸条:S蛋白试纸条和N蛋白试纸条,在S蛋白试纸条上, 从加样端开始依次形成有S蛋白试纸条样本垫11,S蛋白试纸条金结合物 垫21,S蛋白试纸条反应膜31和S蛋白试纸条吸收垫41。其中S蛋白试 纸条反应膜31上有S蛋白检测线311和S蛋白质控线321。所述样本垫材 质为玻璃纤维素膜,用于滴加检测样本。所述金结合物垫材质为玻璃纤维素 膜。所述反应膜31材质为硝酸纤维素膜。在N蛋白试纸条上,从加样端开 始依次形成有N蛋白试纸条样本垫12,N蛋白试纸条金结合物垫22,N蛋 白试纸条反应膜32和N蛋白试纸条吸收垫42。其中N蛋白试纸条反应膜 32上有N蛋白检测线312和N蛋白质控线322。所述样本垫材质为玻璃纤 维素膜,用于滴加检测样本。所述金结合物垫材质为玻璃纤维素膜。所述反 应膜32材质为硝酸纤维素膜。
具体的,在S蛋白试纸条上,S蛋白试纸条金结合物垫21是在玻璃纤 维素膜上喷点胶体金标记的第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金 结合物形成的。S蛋白试纸条金结合物垫21含第一抗新型冠状病毒S蛋白 单克隆抗体,第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体为识别新型冠状病毒S 蛋白的抗体,含量为0.332-1.162μg/cm2,优选为0.498-0.996μg/cm2,最优选 为0.664-0.83μg/cm2。具体的,S蛋白试纸条反应膜31上喷涂,含有等质量 混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的溶液,形成S蛋 白检测线311,所述反应膜上等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒 S蛋白单克隆抗体的含量为5-20μg/cm2,优选为8-18μg/cm2,最优选为 10-15μg/cm2;和含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液,形成S蛋白质控线321。 具体的,在N蛋白试纸条上,N蛋白试纸条金结合物垫22是在玻璃纤维素 膜上喷点胶体金标记的第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合 物形成的。N蛋白试纸条金结合物垫22含第一抗新型冠状病毒N蛋白单克 隆抗体,第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体为识别人新型冠状病毒N 蛋白的抗体,含量为0.332-1.162μg/cm2,优选为0.498-0.996μg/cm2,最优选 为0.664-0.83μg/cm2。具体的,N蛋白试纸条反应膜32上喷涂,含有等质量 混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的溶液,形成N 蛋白检测线312,所述反应膜上等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病 毒N蛋白单克隆抗体的含量为10-25μg/cm2,优选为12-23μg/cm2,最优选为 15-20μg/cm2;和含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液,形成N蛋白质控线322。
在本文中使用的所述第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体为识别新 型冠状病毒S蛋白的抗体,所述第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗 体为识别新型冠状病毒S蛋白的、与所述第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆 抗体不同的另外两个抗体,也可以是识别新型冠状病毒S蛋的、与所述第一 抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体相同的两个抗体,优选为识别新型冠状病 毒S蛋白的、与所述第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体不同的另外两个 抗体。本领域技术人员可以理解具有这种功能的抗体均可以使用,例如,第 一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体可以是购自重庆探生科技有限公司的 由克隆株2C1的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体,第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体可以是分别购自重庆探生科技有限公司的由克隆株2A1的 杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与杭州贤至生物科技有限公司的由克隆株 29D8的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
在本文中使用的所述第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体为识别新 型冠状病毒N蛋白的抗体,所述第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆 抗体为识别新型冠状病毒N蛋白的、与所述第一抗新型冠状病毒N蛋白单 克隆抗体不同的另外两个抗体,也可以是识别人新型冠状病毒N蛋的、与所 述第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体相同的两个抗体。本领域技术人员 可以理解具有这种功能的抗体均可以使用,例如,第一抗新型冠状病毒N蛋 白单克隆抗体可以是购自北京博奥森生物技术有限公司的由克隆株7A7的 杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体,第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗 体可以是购自北京博奥森生物技术有限公司的分别由克隆株1C7和克隆株 6A8的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
本申请还提供了一种新型冠状病毒S蛋白和N蛋白联合检测胶体金试纸 条的制备方法,其特征在于,所述方法包括:制备胶体金颗粒;将胶体金颗 粒与第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体和第一抗新型冠状病毒N蛋白单 克隆抗体结合,形成胶体金标记的第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶 体金结合物和第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合物;将所述 第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物和第一抗新型冠状病 毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合物等比例混匀后在玻璃纤维膜上喷涂、干燥 得到金结合物垫;在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线,得到反应膜,其 中分别将含有第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体、第二与第三抗 新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的溶液和含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液 喷涂到硝酸纤维素膜上,形成S蛋白检测线、N蛋白检测线和质控线;将样 本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上,使样本垫、金结 合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列,并使裁切得到试纸条。 将所述胶体金颗粒与第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体结合,所述胶体 金颗粒与第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的质量比为(5-25):1,优选 为(10-20):1,最优选为(13-18):1。将所述胶体金颗粒与第一抗新型冠状病 毒N蛋白单克隆抗体结合,所述胶体金颗粒与第一抗新型冠状病毒N蛋白 单克隆抗体的质量比为(8.6-30):1,优选为(10-20):1,最优选为(12-15):1。将 所述第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物和第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合物在玻璃纤维膜上喷涂,包括将所述胶 体金结合物用金结合物重悬液复溶,复溶后所述第一抗新型冠状病毒S蛋白 单克隆抗体的浓度为10-35μg/mL,优选为15-30μg/mL,最优选为 20-25μg/mL。将所述第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物和 第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合物在玻璃纤维膜上喷涂, 包括将所述胶体金结合物用金结合物重悬液复溶,复溶后所述第一抗新型冠 状病毒N蛋白单克隆抗体的浓度为10-35μg/mL,优选为15-30μg/mL,最优 选为20-25μg/mL。所述含有第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体 的溶液中第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的浓度为 0.5-2.0mg/mL,优选为0.8-1.8mg/mL,最优选为1.0-1.5mg/mL。所述含有第 二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的溶液中第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的浓度为1.0-2.5mg/mL,优选为1.2-2.3mg/mL,最 优选为1.5-2.0mg/mL。
本申请还提供了一种新型冠状病毒S蛋白和N蛋白联合检测胶体金试纸 条的制备方法,其特征在于,所述方法包括:1)制备胶体金颗粒;将胶体金 颗粒与第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体结合,形成胶体金标记的第一 抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物;将所述第一抗新型冠状病 毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物在玻璃纤维膜上喷涂、干燥得到金结合物 垫;在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线,得到反应膜,其中将含有第二 与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的溶液和含有羊抗鼠IgG多克隆抗 体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上,形成S蛋白检测线和质控线;将样本垫、 金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上,使样本垫、金结合物垫、 反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列,并裁切得到S蛋白试纸条;2) 制备胶体金颗粒,将胶体金颗粒与第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体结 合,形成胶体金标记的第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合 物;将第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合物在玻璃纤维膜上 喷涂、干燥得到金结合物垫;在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线,得到 反应膜,其中将含有第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的溶液和 含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上,形成N蛋白检测 线和质控线;将样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上, 使样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列,并裁 切得到N蛋白试纸条。将所述胶体金颗粒与第一抗新型冠状病毒S蛋白单克 隆抗体结合,所述胶体金颗粒与第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的质 量比为(8.6-30):1,优选为(10-20):1,最优选为(12-15):1。将所述胶体金 颗粒与第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体结合,所述胶体金颗粒与第一 抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的质量比为(5-25):1,优选为(10-20):1, 最优选为(13-17):1。将所述第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金 结合物在玻璃纤维膜上喷涂,包括将所述胶体金结合物用金结合物重悬液复溶,复溶后所述第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的浓度为 10-35μg/mL,优选为15-30μg/mL,最优选为20-25μg/mL。将所述第一抗新 型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合物在玻璃纤维膜上喷涂,包括将所 述胶体金结合物用金结合物重悬液复溶,复溶后所述第一抗新型冠状病毒N 蛋白单克隆抗体的浓度为10-35μg/mL,优选为15-30μg/mL,最优选为20-25μg/mL。所述含有第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的溶液 中第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的浓度为0.5-2.0mg/mL,优 选为0.8-1.8mg/mL,最优选为1.0-1.5mg/mL。所述含有第二与第三抗新型冠 状病毒N蛋白单克隆抗体的溶液中第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克 隆抗体的浓度为1.0-2.5mg/mL,优选为1.2-2.3mg/mL,最优选为 1.5-2.0mg/mL。
本申请还提供了所述试纸条在制备用于肺炎检测的试剂盒中的用途, 所述肺炎为新型冠状病毒引起的肺炎。所述试剂盒用于检测选自人咽喉分 泌物或人鼻腔分泌物的一种或两种样本。所述新型冠状病毒检测试剂盒利 用下述步骤来进行检测:将一定量的检测样本滴加到试纸条的样本垫;一 段时间后,肉眼进行判读,根据判读标准得到检测结果。检测样本的用量 为80-120μL,例如可以是80μL,90μL,100μL,110μL,120μL。一段时 间为8-10min,例如可以是8min,8.5min,9min,9.5min,10min。
检测结果的判读标准如下:
①阴性:只在质控区出现一条红色条带,检测区无红色条带出现;
②阳性:在检测区与质控区均出现一条红色条带;
③可疑;质控区和检测区红色条带不清楚,可再次进行检测;
④无效:质控区和检测区均无红色条带出现,或只在检测区出现一条 红色条带。
本申请还提供了一种试剂盒,所述试剂盒包含上述试纸条或利用上述 方法制备的试纸条。所述试剂盒用于肺炎的检测,所述肺炎为新型冠状病 毒引起的肺炎。所述试剂盒用于检测选自人咽喉分泌物或人鼻腔分泌物的 一种或两种样本。本申请制备的试纸条检测时,需采集人咽喉分泌物或人 鼻腔分泌物。人咽喉分泌物采集是将拭子适度用力擦拭双侧咽扁桃体及咽 后壁来采集的,应避免触及舌部;人鼻腔分泌物采集是将拭子插入鼻孔分 泌物较多处,轻轻转动并推动拭子,直至鼻甲(离鼻孔约2.0cm~5.0cm)受 阻处,贴鼻壁旋转拭子三次来采集的。人咽喉分泌物或人鼻腔分泌物采样 后,将采样后的拭子插入保存管的保存液(1mL)中,紧靠保存管内壁旋转 约10次,使样本尽可能溶解在溶液中,折断咽拭子尾部(留棉签头),盖上 保存管的盖子,轻轻摇匀管内溶液。向试剂盒的加样孔中滴加入100μL(约 3滴)处理后的样本提取物后进行检测。
对于样本保存液,具体配制方法如下,依次准确称取氯化钠8.50g、 PC300 3.00g、SDS 1.00g、Tw20 2.00g、曲拉通1.00g、纯化水800.0mL, 充分搅拌溶解后,使用数显酸度计测量液体的pH值为7.30~7.50,充分搅 拌溶解后,使用纯化水定容至1000.0ml,调整pH值7.30~7.50,液体2~8℃ 保存备用。分装到保存管中,每支1mL。
本申请制备的试纸条和试剂盒能够有效的检测新型冠状病毒,并且具 有较高的灵敏性和特异性。其中,S蛋白试纸条灵敏性可以高达59%以上, 在优选的情况下可以高达77%以上;在正常人中的特异性可以高达86%以 上,在优选的情况下可以高达100%以上。N蛋白试纸条灵敏性可以高达 50%以上,在优选的情况下可以高达68%以上;在正常人中的特异性可以 高达86%以上,在优选的情况下可以高达95%以上。
在本文中,灵敏性是指患有明确临床疾病的患者的样本,其检测结果 呈阳性的比率。正常人中的特异性是指没有特定临床疾病的患者的样本, 其检测结果呈阴性的比率。
冠状病毒主要通过刺突糖蛋白(S蛋白)与宿主细胞受体结合介导病毒的 入侵。S蛋白可识别宿主细胞受体并介导膜融合,对于病毒颗粒进入细胞至 关重要,是病毒感染宿主细胞的关键因子。冠状病毒的N蛋白是与病毒RNA 结合并构成核衣壳的蛋白,在病毒组装和RNA转录中起着至关重要的作用, 同时也参与宿主细胞对病毒感染的反应。目前已有的产品基本是N蛋白检 测,少数是S蛋白检测,而单一的N蛋白或S蛋白检测漏检率大,灵敏度低,且早期检测和晚期检测不能兼容。而联检有效检测窗口期更长,可提高 检测灵敏度。因此,利用本申请的试纸条,对S蛋白和N蛋白同时进行检测, 可大大提高检测速度、检测准确度,且成本低、结果重复性好、操作简单, 除可以在各大医院科室应用外,亦可以在基层社区医院甚至家庭应用。同时 该技术可结合临床和其他实验室指标,用于新型冠状病毒引起的肺炎的辅助 诊断及治疗效果评价。
实施例
实施例1
在下述实施例中,除非另有说明,实施例中使用的物质均为市售的产品。
(1)制备胶体金颗粒
取氯金酸1.0g,平衡至室温,量取2.0mL纯化水,加入装有氯金酸的玻 璃瓶中,反复吹打至氯金酸完全溶解。将溶解的氯金酸倒入容器中,并用纯 化水反复冲洗氯金酸玻璃瓶5次,洗液倒回容器中。用纯化水将溶液定容至 10.0mL。盖紧瓶盖,充分摇晃15分钟,混合均匀,配制成10%的氯金酸溶 液。
量取10%氯金酸溶液0.3mL,加入到100.0mL纯化水中,边加热边搅拌 至沸腾。量取0.6mL的10%柠檬酸三钠溶液,迅速、一次性加入到沸腾的氯 金酸溶液中,继续加热煮沸2min,关掉热源用余热加热5min。冷却至室温 后加纯化水定容至100.0mL,得到含有胶体金颗粒的溶液。
(2)第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体和第二与第三抗新型冠状病毒S 蛋白单克隆抗体
在本实施例以及下述实施例中,使用了市售的抗体,其中第一抗新型冠 状病毒S蛋白单克隆抗体是购买自重庆探生科技有限公司的由克隆株2C1 的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体,第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆 抗体可以分别是购自重庆探生科技有限公司的由克隆株2A1的杂交瘤细胞 分泌的单克隆抗体与杭州贤至生物科技有限公司的由克隆株29D8的杂交瘤 细胞分泌的单克隆抗体。
(3)第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和第二与第三抗新型冠状病毒N 蛋白单克隆抗体
在本实施例以及下述实施例中,使用了市售的抗体,其中第一抗新型冠 状病毒N蛋白单克隆抗体是购买自北京博奥森生物技术有限公司的由克隆 株7A7的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体,第二与第三抗新型冠状病毒N蛋 白单克隆抗体可以是购自北京博奥森生物技术有限公司的分别由克隆株1C7 和克隆株6A8的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
(4)胶体金标记的胶体金结合物的制备
取100.0mL(0.03g)胶体金于三角瓶(三角瓶1)中,准确加入2.5mL 0.1M 的碳酸钾溶液,混匀,静置10分钟。取1.0mg步骤(2)中制备的第一抗新型 冠状病毒S蛋白单克隆抗体,在快速搅拌条件下,将第一抗新型冠状病毒 S蛋白单克隆抗体逐滴加入到三角瓶1,室温放置40分钟。取5mL的 10g/100mL酪蛋白钠溶液,在快速搅拌条件下,逐滴加入到三角瓶1中,室 温静置15分钟。得到胶体金标记的第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体 胶体金结合物。
取100.0mL(0.03g)胶体金于另一个三角瓶(三角瓶2)中,准确加入2.5mL 0.1M的碳酸钾溶液,混匀,静置10分钟。取1.0mg步骤(3)中制备的第一抗 新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体,在快速搅拌条件下,将第一抗新型冠状 病毒N蛋白单克隆抗体逐滴加入到三角瓶2中,室温放置40分钟。取1.5mL 的10g/100mL酪蛋白钠溶液,在快速搅拌条件下,逐滴加入到三角瓶中,室 温静置15分钟。得到胶体金标记的第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体 胶体金结合物。
(5)金结合物垫的制备
将上述第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物在 12000rpm,4℃离心40分钟,小心弃去上清液,加入胶体金结合物重悬液 至原体积(100.0mL),将胶体金结合物用胶体金重悬液复溶,使得复溶后第 一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的浓度为10μg/mL,将复溶液在一个 玻璃纤维膜上喷涂,喷涂量为0.033mL/cm2,喷涂完毕后置于干燥间干燥5 小时即得S蛋白试纸条金结合物垫21,之后于室温干燥器内保存。
将上述第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合物在 12000rpm,4℃离心40分钟,小心弃去上清液,加入胶体金结合物重悬液 至原体积(100.0mL),将胶体金结合物用胶体金重悬液复溶,使得复溶后第 一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的浓度为10μg/mL,将复溶液在另一 个玻璃纤维膜上喷涂,喷涂量为0.033mL/cm2,喷涂完毕后置于干燥间干燥 5小时即得N蛋白试纸条金结合物垫22,之后于室温干燥器内保存。
其中,胶体金结合物重悬液的制备如下:
将硼酸0.124g,硼砂0.762g,蔗糖150.0g,牛血清白蛋白7.0g,酪蛋白 钠1.0g,吐温20 5g,聚乙烯吡咯烷酮K30 5g,聚乙二醇-20000 1g,加纯化 水700.0mL,搅拌使充分溶解后,加入浓盐酸适量,搅拌均匀,调节pH至 7.4。充分搅拌溶解后定容至1000mL。
(6)在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线,得到反应膜
取步骤(2)中的第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体等质量 混合总重量为5mg(其中第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体分 别为2.5mg)、第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体等质量混合 总重量为10mg(其中第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体分别 为5mg),分别加入到5.0mL 0.05M PBS中,充分混匀后均用0.05MPBS 缓冲液定容至终体积10.0mL,使第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克 隆抗体的终浓度为0.5mg/mL,并将含有第二与第三抗新型冠状病毒S蛋 白单克隆抗体的溶液喷涂到一条硝酸纤维素膜上,使第二与第三抗新型冠 状病毒N蛋白单克隆抗体的终浓度为1.0mg/mL,并将含有第二与第三抗 新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的溶液喷涂到另一条硝酸纤维素膜上,喷 涂量均为10.0μL/cm2,在一条硝酸纤维素膜上形成S蛋白检测线311和在 另一条硝酸纤维素膜上形成N蛋白检测线312。
取羊抗鼠IgG多克隆抗体(来源于洛阳佰泰科生物技术有限公 司)20.00mg,加入到5.0mL 0.05M PBS缓冲液中,充分混匀后用0.05M PBS 缓冲液定容至终体积10.0mL,使羊抗鼠IgG多克隆抗体的终浓度为 2.00mg/mL。将含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液按照喷涂量10.0μL/cm2分别喷涂到上述两条硝酸纤维素膜上,形成S蛋白检质控线321和N蛋白 质控线322。将包被完毕检测线和质控线的反应膜31和32放入干燥车间 干燥5h。
(7)将S蛋白试纸条样本垫11、S蛋白试纸条金结合物垫21、S蛋白试纸条 反应膜31、S蛋白试纸条吸收垫41粘贴在PVC胶板上,使样本垫、金结合 物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列,并使裁切得到S蛋白试 纸条;将N蛋白试纸条样本垫12、N蛋白试纸条金结合物垫22、N蛋白试 纸条反应膜32、N蛋白试纸条吸收垫42粘贴在另一PVC胶板上,使样本 垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列,并使裁切得 到N蛋白试纸条。
经计算,制备得到的S蛋白试纸条上,金结合物垫上第一抗新型冠状病 毒S蛋白单克隆抗体的含量为0.332μg/cm2,反应膜上第二与第三抗新型冠 状病毒S蛋白单克隆抗体的含量为5μg/cm2;N蛋白试纸条上,金结合物垫 上第一抗新型冠状病核糖蛋白N单克隆抗体的含量为0.332μg/cm2,反应膜 上第二与第三抗新型冠状病核糖蛋白N单克隆抗体的含量为10.00μg/cm2
实施例2
(1)制备胶体金颗粒
制备步骤与实施例1相同。
(2)第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体和第二与第三抗新型冠状病毒S 蛋白单克隆抗体
使用的抗体与实施例1相同。
(3)第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和第二与第三抗新型冠状病毒 N蛋白单克隆抗体
使用的抗体与实施例1相同。
(4)胶体金标记的胶体金结合物的制备
与实施例1中的区别在于,取2.0mg步骤(2)中的第一抗新型冠状病毒S 蛋白单克隆抗体,取2.0mg步骤(3)中的第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆 抗体。其它反应条件与实施例1相同。
(5)金结合物垫的制备
与实施例1中的区别在于,使得复溶后第一抗新型冠状病毒S蛋白单 克隆抗体的浓度为20μg/mL,使得复溶后第一抗新型冠状病毒N蛋白单克 隆抗体的浓度为20μg/mL,喷涂完毕后置于干燥间干燥6小时即得金结合物 垫。其它反应条件与实施例1相同。
(6)在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线,得到反应膜
与实施例1中的区别在于,使第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克 隆抗体等质量混合后的终浓度为1.0mg/mL,使第二与第三抗新型冠状病核 糖蛋白N单克隆抗体等质量混合后的终浓度为1.50mg/mL。其它反应条件 与实施例1相同。
(7)与实施例1中的步骤相同
经计算,制备得到的S蛋白试纸条上,金结合物垫上第一抗新型冠状病 毒S蛋白单克隆抗体的含量为0.664μg/cm2,反应膜上的第二与第三抗新型 冠状病毒S蛋白单克隆抗体的含量为10μg/cm2。制备得到的N蛋白试纸条 上,金结合物垫上第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的含量为 0.664μg/cm2,反应膜上第二与第三抗新型冠状病核糖蛋白N单克隆抗体的 含量为15μg/cm2
实施例3
(1)制备胶体金颗粒
制备步骤与实施例1相同。
(2)第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体和第二与第三抗新型冠状病毒S 蛋白单克隆抗体
使用的抗体与实施例1相同。
(3)第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和第二与第三抗新型冠状病毒 N蛋白单克隆抗体
使用的抗体与实施例1相同。
(4)胶体金标记的胶体金结合物的制备
与实施例1中的区别在于,取2.5mg步骤(2)中的第一抗新型冠状病毒S 蛋白单克隆抗体,取2.5mg步骤(3)中的第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆 抗体。其它反应条件与实施例1相同。
(5)金结合物垫的制备
与实施例1中的区别在于,使得复溶后第一抗新型冠状病毒S蛋白单 克隆抗体的浓度为25μg/mL,使得复溶后第一抗新型冠状病毒N蛋白单克 隆抗体的浓度为25μg/mL,喷涂完毕后置于干燥间干燥6小时即得金结合物 垫。其它反应条件与实施例1相同。
(6)在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线,得到反应膜
与实施例1中的区别在于,使第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克 隆抗体的终浓度为1.5mg/mL,使第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克 隆抗体的终浓度为2.0mg/mL。其它反应条件与实施例1相同。
(7)与实施例1中的步骤相同
经计算,制备得到的S蛋白试纸条上,金结合物垫上第一抗新型冠状病 毒S蛋白单克隆抗体的含量为0.83μg/cm2,反应膜上的第二与第三抗新型 冠状病毒S蛋白单克隆抗体的含量为15μg/cm2。制备得到的N蛋白试纸条 上,金结合物垫上第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的含量为 0.83μg/cm2,反应膜上的第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的 含量为20μg/cm2
实施例4
(1)制备胶体金颗粒
制备步骤与实施例1相同。
(2)第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体和第二与第三抗新型冠状病毒S 蛋白单克隆抗体
使用的抗体与实施例1相同。
(3)第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和第二与第三抗新型冠状病毒 N蛋白单克隆抗体
使用的抗体与实施例1相同。
(4)胶体金标记的胶体金结合物的制备
与实施例1中的区别在于,取3.5mg步骤(2)中的第一抗新型冠状病毒S 蛋白单克隆抗体,取3.5mg步骤(3)中的第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆 抗体。其它反应条件与实施例1相同。
(5)金结合物垫的制备
与实施例1中的区别在于,使得复溶后第一抗新型冠状病毒S蛋白单 克隆抗体的浓度为35μg/mL,使得复溶后第一抗新型冠状病毒N蛋白单克 隆抗体的浓度为35μg/mL,喷涂完毕后置于干燥间干燥6小时即得金结合物 垫。其它反应条件与实施例1相同。
(6)在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线,得到反应膜
与实施例1中的区别在于,使第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克 隆抗体的终浓度为2.0mg/mL,使第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克 隆抗体的终浓度为2.5mg/mL。其它反应条件与实施例1相同。
(7)与实施例1中的步骤相同
经计算,制备得到的S蛋白试纸条上,金结合物垫上第一抗新型冠状病 毒S蛋白单克隆抗体的含量为1.162μg/cm2,反应膜上的第二与第三抗新型 冠状病毒S蛋白单克隆抗体的含量为20μg/cm2。制备得到的N蛋白试纸条 上,金结合物垫上第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的含量为 1.162μg/cm2,反应膜上的第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的 含量为25μg/cm2
实施例5
(1)制备胶体金颗粒
制备步骤与实施例1相同。
(2)第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体和第二与第三抗新型冠状病毒S 蛋白单克隆抗体
使用的抗体与实施例1相同。
(3)第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和第二与第三抗新型冠状病毒 N蛋白单克隆抗体
使用的抗体与实施例1相同。
(4)胶体金标记的胶体金结合物的制备
金结合物的制备与实施例3相同。
(5)金结合物垫的制备
将上述胶体金结合物在12000rpm,4℃离心40min,小心弃去上清液, 各加入胶体金结合物重悬液至1/2体积(50.0mL),使得复溶后第一抗新型 冠状病毒S蛋白单克隆抗体的含量为50μg/mL、第一抗新型冠状病毒N蛋 白单克隆抗体的含量为50μg/mL,二者等比例混匀后将复溶液在玻璃纤维素 膜上喷涂,喷涂量为0.033mL/cm2,喷涂完毕后置于干燥间干燥5h即得金 结合物垫,之后于室温干燥器内保存。
其中,胶体金结合物重悬液的制备如下:
将硼酸0.124g,硼砂0.762g,蔗糖150.0g,牛血清白蛋白7.0g,酪蛋白 钠1.0g,吐温20 5g,聚乙烯吡咯烷酮K30 5g,聚乙二醇-20000 1g,加纯化 水700.0mL,搅拌使充分溶解后,加入浓盐酸适量,搅拌均匀,调节pH至 7.4。充分搅拌溶解后定容至1000mL。
(6)在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线,得到反应膜
取步骤(2)中的第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体等质量 混合总重量为15mg(其中第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体 分别为7.5mg)、第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体等质量混 合总重量为20mg(其中第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体分 别为10mg),分别加入到5.0mL 0.05M PBS中,充分混匀后均用0.05MPBS 缓冲液定容至终体积10mL,使第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆 抗体的终浓度为1.5mg/mL,使第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆 抗体的终浓度为2.0mg/mL。将含有第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单 克隆抗体的溶液、含有第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的溶 液按照喷涂量10μL/cm2喷涂到一条硝酸纤维素膜上,分别形成S蛋白检测 线311和N蛋白检测线312。
取羊抗鼠IgG多克隆抗体(来源于洛阳佰泰科生物技术有限公 司)20.00mg,加入到5.0mL 0.05M PBS缓冲液中,充分混匀后用0.05MPBS 缓冲液定容至终体积10.0mL,使羊抗鼠IgG多克隆抗体的终浓度为 2.00mg/mL。将含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液按照喷涂量10.0μL/cm2喷涂到硝酸纤维素膜上,形成质控线。将包被完毕检测线和质控线的反应 膜放入干燥车间干燥5h。
(7)将样本垫1、金结合物垫2、反应膜3、吸收垫4粘贴在PVC胶板上,使 样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列,并使裁 切得到试纸条。
经计算,制备得到的试纸条上,金结合物垫上第一抗新型冠状病毒S 蛋白单克隆抗体的含量为0.83μg/cm2、第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆 抗体的含量为0.83μg/cm2,反应膜上第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单 克隆抗体的含量为15μg/cm2、第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗 体的的含量为20μg/cm2
上述5个实施例制备试纸条的具体的反应条件如表1所示。
表1.不同实施例制备试纸条的反应条件
Figure BDA0002644746280000251
实施例6
将实施例1中制备的试纸条,用于新型冠状病毒的定性检测。
具体的,将实施例1制备的试纸条,分别检测感染新型冠状病毒患者 (经核酸检测后)的灭活后的咽喉分泌物和正常人的咽喉分泌物样本(均获得 自博尔诚(北京)科技有限公司,其中,正常人22例,阳性患者22例。 通过棉拭子采集咽喉部粘液样本,将粘有样本的棉拭子加入含有1.0mL样 本保存液(Tri-Hcl缓冲液)的保存管中,充分混匀后滴加3滴样本(约100μL) 至试纸条的样品垫,加样10分钟后,进行结果判读。
其中,肉眼判读检测结果。标准如下:
①阴性:只在质控区出现一条红色条带,检测区无红色条带出现;
②阳性:在检测区与质控区均出现一条红色条带;
③可疑;质控区和检测区红色条带不清楚,可再次进行检测;
④无效:质控区和检测区均无红色条带出现,或只在检测区出现一条 红色条带。
测试结果如表2所示。根据表2的检测结果,本试剂盒S蛋白试纸条检 测新型冠病毒的灵敏性为59.1%(13/22),N蛋白试纸条检测新型冠病毒的灵 敏性为50.0%(11/22),S蛋白试纸条在正常人中的特异性为100.0%(22/22), N蛋白试纸条在正常人中的特异性为95.5%(21/22)。
表2.肺炎患者和正常人咽喉分泌物样本检测结果
Figure BDA0002644746280000261
Figure BDA0002644746280000271
实施例7
将实施例2中制备的试纸条,用于新型冠状病毒的定性检测。
具体的,将实施例2制备的试纸条,分别检测感染新型冠状病毒患者 (经核酸检测后)的灭活后的咽喉分泌物和正常人的咽喉分泌物样本(均获得 自博尔诚(北京)科技有限公司),其中,正常人22例,阳性患者22例。 通过棉拭子采集咽喉部粘液样本,将粘有样本的棉拭子加入含有1.0mL样 本保存液(Tri-Hcl缓冲液)的保存管中,充分混匀后滴加3滴样本(约100μL) 至试纸条的样品垫,加样10分钟后,进行结果判读。
其中,肉眼判读检测结果。标准如下:
①阴性:只在质控区出现一条红色条带,检测区无红色条带出现;
②阳性:在检测区与质控区均出现一条红色条带;
③可疑;质控区和检测区红色条带不清楚,可再次进行检测;
④无效:质控区和检测区均无红色条带出现,或只在检测区出现一条 红色条带。
测试结果如表3所示。根据表3的检测结果,本试剂盒S蛋白试纸条检 测新型冠病毒的灵敏性为68.2%(15/22),N蛋白试纸条检测新型冠病毒的灵 敏性为59.1%(13/22),S蛋白试纸条在正常人中的特异性为95.5%(21/22), N蛋白试纸条在正常人中的特异性为95.5%(21/22)。
表3.肺炎患者和正常人咽喉分泌物样本检测结果
Figure BDA0002644746280000272
Figure BDA0002644746280000281
实施例8
将实施例3中制备的试纸条,用于新型冠状病毒的定性检测。
具体的,将实施例3制备的试纸条,分别检测感染新型冠状病毒患者 (经核酸检测后)的灭活后的咽喉分泌物和正常人的咽喉分泌物样本(均获得 自博尔诚(北京)科技有限公司),其中,正常人22例,阳性患者22例。 通过棉拭子采集咽喉部粘液样本,将粘有样本的棉拭子加入含有1.0mL样 本保存液(Tri-Hcl缓冲液)的保存管中,充分混匀后滴加3滴样本(约100μL) 至试纸条的样品垫,加样10分钟后,进行结果判读。
其中,肉眼判读检测结果。标准如下:
①阴性:只在质控区出现一条红色条带,检测区无红色条带出现;
②阳性:在检测区与质控区均出现一条红色条带;
③可疑;质控区和检测区红色条带不清楚,可再次进行检测;
④无效:质控区和检测区均无红色条带出现,或只在检测区出现一条 红色条带。
测试结果如表4所示。根据表4的检测结果,本试剂盒S蛋白试纸条检 测新型冠病毒的灵敏性为72.7%(16/22),N蛋白试纸条检测新型冠病毒的灵 敏性为63.6%(14/22),S蛋白试纸条在正常人中的特异性为95.5%(21/22),N 蛋白试纸条在正常人中的特异性为90.9%(20/22)。
表4.肺炎患者和正常人咽喉分泌物样本检测结果
Figure BDA0002644746280000291
实施例9
将实施例4中制备的试纸条,用于新型冠状病毒的定性检测。
具体的,将实施例4制备的试纸条,分别检测感染新型冠状病毒患者 (经核酸检测后)的灭活后的鼻腔分泌物和正常人的鼻腔分泌物样本(均获 得自博尔诚(北京)科技有限公司),其中,正常人22例,阳性患者22例。 通过棉拭子采集鼻腔部粘液样本,将粘有样本的棉拭子加入含有1.0mL样 本保存液(Tri-Hcl缓冲液)的保存管中,充分混匀后滴加3滴样本(约100μL) 至试纸条的样品垫,加样10分钟后,进行结果判读。
其中,肉眼判读检测结果。标准如下:
①阴性:只在质控区出现一条红色条带,检测区无红色条带出现;
②阳性:在检测区与质控区均出现一条红色条带;
③可疑;质控区和检测区红色条带不清楚,可再次进行检测;
④无效:质控区和检测区均无红色条带出现,或只在检测区出现一条 红色条带。
测试结果如表5所示。根据表5的检测结果,本试剂盒S蛋白试纸条检 测新型冠病毒的灵敏性为77.3%(17/22),N蛋白试纸条检测新型冠病毒的灵 敏性为68.2%(15/22),S蛋白试纸条在正常人中的特异性为86.4%(19/22),N 蛋白试纸条在正常人中的特异性为86.4%(19/22)。
表5.肺炎患者和正常人鼻腔分泌物样本检测结果
Figure BDA0002644746280000301
实施例10
将实施例5制备的试纸条,用于新型冠状病毒的定性检测。
具体的,将实施例5制备的试纸条,分别检测感染新型冠状病毒患者 (经核酸检测后)的灭活后的咽喉分泌物样本和正常人的咽喉分泌物样本(均获得自博尔诚(北京)科技有限公司),其中,正常人22例,阳性患者 22例。通过棉拭子采集咽喉部粘液样本,将粘有样本的棉拭子加入含有 1.0mL样本保存液(Tri-Hcl缓冲液)的保存管中,充分混匀后滴加3滴样本 (约100uL)至试纸条的样品垫,加样10分钟后,进行结果判读。
其中,肉眼判读检测结果。标准如下:
①阴性:只在质控区出现一条红色条带,检测区无红色条带出现;
②阳性:在检测区与质控区均出现一条红色条带;
③可疑;质控区和检测区红色条带不清楚,可再次进行检测;
④无效:质控区和检测区均无红色条带出现,或只在检测区出现一条 红色条带。
测试结果如下表6所示。根据表6检测结果,本试纸条S蛋白检测指标: 新型冠病毒的灵敏性为72.72%(16/22),特异性为95.5%(21/22);N蛋白检测 指标:新型冠病毒的灵敏性为68.18%(15/22),特异性为90.9%(20/22)。
表6.肺炎患者和正常人咽喉分泌物样本检测结果
Figure BDA0002644746280000311
Figure BDA0002644746280000321
尽管本申请已进行了一定程度的描述,明显地,在不脱离本申请的精神 和范围的条件下,可进行各个条件的适当变化,这对本领域技术人员是显而 易见的。可以理解,本申请不限于所述实施方案,而归于权利要求的范围, 其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒刺突糖蛋白S(S蛋白)和核蛋白N(N蛋白)联合检测胶体金试纸条,其特征在于,在所述试纸条上,从加样端开始依次形成有样本垫、金结合物垫、反应膜和吸收垫,所述金结合物垫上含有第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体和第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体,其反应膜上含有等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体和等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体。
2.一种新型冠状病毒S蛋白和N蛋白联合检测胶体金试纸条,其特征在于,所述试纸条包括S蛋白试纸条和N蛋白试纸条,在所述S蛋白试纸条上,从加样端开始依次形成有样本垫、金结合物垫、反应膜和吸收垫,所述金结合物垫上含有第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体,所述反应膜上含有等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体;在所述N蛋白试纸条上,从加样端开始依次形成有样本垫、金结合物垫、反应膜和吸收垫,所述金结合物垫上含有第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体,所述反应膜上含有等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体。
3.如权利要求1或2所述的试纸条,其特征在于,所述第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体为识别新型冠状病毒S蛋白的抗体,所述第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体为识别新型冠状病毒S蛋白的、与所述第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体不同的另外两个抗体。
4.如权利要求1-3中任一项所述的试纸条,其特征在于,所述第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体为识别新型冠状病毒N蛋白的抗体,所述第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体为识别新型冠状病毒N蛋白的、与所述第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体不同的另外两个抗体。
5.如权利要求1-4中任一项所述的试纸条,其特征在于,所述金结合物垫上,第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的含量为0.332-1.162μg/cm2,优选为0.498-0.996μg/cm2,最优选为0.664-0.830μg/cm2
6.如权利要求1-5中任一项所述的试纸条,其特征在于,所述金结合物垫上,第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的含量为0.332-1.162μg/cm2,优选为0.498-0.996μg/cm2,最优选为0.664-0.830μg/cm2
7.如权利要求1-6中任一项所述的试纸条,其特征在于,所述反应膜上等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的含量为5-20μg/cm2,优选为8-18μg/cm2,最优选为10-15μg/cm2
8.如权利要求1-7中任一项所述的试纸条,其特征在于,所述反应膜上等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的含量为10-25μg/cm2,优选为12-23μg/cm2,最优选为15-20μg/cm2
9.一种新型冠状病毒S蛋白和N蛋白联合检测胶体金试纸条的制备方法,其特征在于,所述方法包括:
制备胶体金颗粒;
将胶体金颗粒与第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体和第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体结合,形成胶体金标记的第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物和第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合物;
将所述第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物和第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合物等比例混匀后在玻璃纤维膜上喷涂、干燥得到金结合物垫;
在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线,得到反应膜,其中分别将含有等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体、等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的溶液和含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上,形成S蛋白检测线、N蛋白检测线和质控线;
将样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上,使样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列,并使裁切得到试纸条。
10.一种新型冠状病毒S蛋白和N蛋白联合检测胶体金试纸条的制备方法,其特征在于,所述方法包括:
1)制备胶体金颗粒;
将胶体金颗粒与第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体结合,形成胶体金标记的第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物;
将所述第一抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体胶体金结合物在玻璃纤维膜上喷涂、干燥得到金结合物垫;
在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线,得到反应膜,其中分别将含有等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体的溶液和含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上,形成检测线和质控线;
将样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上,使样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列,并使裁切得到S蛋白试纸条;
2)制备胶体金颗粒;
将胶体金颗粒与第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体结合,形成胶体金标记的第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合物;
将所述第一抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体胶体金结合物在玻璃纤维膜上喷涂、干燥得到金结合物垫;
在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线,得到反应膜,其中分别将含有等质量混合包被的第二与第三抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的溶液和含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上,形成检测线和质控线;
将样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上,使样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列,并使裁切得到N蛋白试纸条。
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