JPS62239992A - 免疫学的に反応性のウイルス蛋白質の発現 - Google Patents

免疫学的に反応性のウイルス蛋白質の発現

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JPS62239992A
JPS62239992A JP61080946A JP8094686A JPS62239992A JP S62239992 A JPS62239992 A JP S62239992A JP 61080946 A JP61080946 A JP 61080946A JP 8094686 A JP8094686 A JP 8094686A JP S62239992 A JPS62239992 A JP S62239992A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術の分野） 本発明は、組換えＤＮＡ技術の使用によるウィルス蛋白
質の発現に一般に関し、より詳しくはリンパ節症（ｌｙ
ｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ　）関連ウィルス（ＬＡＶ
）に対する抗体と免疫学的に反応性である蛋白質の発現
に関する。
（背　景） 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、日和見感染及び
あるまれな悪性腫瘍により特徴づけられる細胞免疫の伝
達しうる疾患である。ＡＩＤＳの主な危険性のある群と
して、同性愛活動の男性、静脈注射麻薬常用者、輸血及
び血液製剤を受ける人、及び危険度の高い個人の異性性
交相手及び子。
供が含まれ、このことは濃厚接触又は血液物質を通じて
伝達される感染物の関与を示唆している。
最近の証拠によると、病気伝達に責任ある感染エージェ
ントは、リンパ節症関連ウィルス（ＬＡＶ）として知ら
れる新しいリンパ反応性（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）
レトロウィルスである（バレージノウシ（Ｂａｒｒ　’
　ｅ−５ｉｎｏｕｓｓｉ）　ら、サイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ　）　　２２０　：８６８　　（１９８３））。
同様のウィルスが他の科学者グループにより報告されて
おり（ポボビック（Ｐｏｐｏｖｉｃ　）ら、サイエンス
２２４　：　４９７（１９８４）ｉレビイ（Ｌｅｖｙ）
　ら、サイエンス２２５　：　８４０　（１９８４）　
、ヒトＴ細胞リンパ反応性ウィルスタイプＩ［Ｉ　（Ｈ
ＴＬＶ−ＩＩＩ）　、エイズ関連レトロウィルス（ＡＲ
Ｖ）、又は免疫不全関連ウィルス（ＩＤＡＶ）と呼ばれ
た。より最近のデータによると、ＬＡＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ
、ＡＲＶ及びＩ　ＤＡＶは、実質的なヌクレオチド相同
性を含むいくつかの重要な特徴を共有しくワインーホブ
ソン（Ｗａｉｎ−１１ｏｂｓｏｎ　）ら、セル（Ｃｅｌ
ｌ）　４０　：９　　（１９８５）；ミューシング（Ｍ
ｕｅｓｉｎｇ　）ら、ネイチア（Ｎａｔｕｒｅ）３１３
：４５０　（１９８５）；サンチェス・ペスカドール（
Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ）ら、サイエンス２
２７　：　４８４　　（１９８５）　、ウィルス分離物
の間で株ごとの変化が存在する可能性はあるけれど、同
じウィルスの分離物であると考えられるべきである。実
質的なヌクレオチド相同性を示すことに加え、分離物は
、形態学、細胞病理学、最適逆転写酵素活動のための要
件、及び少くともいくつかの抗原的特性の点で同じであ
る（レビイ、前出；シュプバッハ（Ｓｃｈｕｐｈａｃｈ
　）ら、サイエンス２２４　：　５０３　　（１９８４
））。
上述のように、このウィルスは血液物質（血液、血清、
血漿、及びこれらの分画）を通して伝達しうろことが知
られ、提供者がウィルスに暴露されたことがあるかどう
か決定するために血液物質をスクリーンすることが重要
となる。これは、ＬＡＶ及び関連ウィルスに対する抗体
の検出のための酵素結合イミムソルベント評価（ＥＬＩ
ＳＡ）を含むいくつかの方法のいずれかで行うことがで
きる。
その血液がＬＡＶに対する抗体を含む個人は、「血清陽
性」と云われる。血清陽性提供者からの血液は、検出さ
れしだい血液供給から除外され、それにより病気の伝播
を除ぐのを助けうる。
ＬＡＶに暴露された個人の免疫応答は色々である。ｐ１
３、ｐ１８、ｐ２５、ｐ３６、ｇｐ４３、ｐ５５、ｇｐ
Ｈｏなどを含むいくつかのウィルス蛋白質のいずれかに
対して抗体が産生されることができる（シュプバッハら
、ニュー　イングランド　ジャーナル　オブ　メディシ
ン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ。
Ｊ、Ｍｅｄ、）３’！２：２６５　　（１９８５））、
総ての個人が、同じ蛋白質に対する又は所定の蛋白質上
の同じエピトープに対する抗体を作る訳ではない。
現在行われているような血清陽性者の検出は、い（つか
の固有の問題を持つ。これら問題のうち最大のものは、
免疫学的評価のために全ウィルスから抗原を分離する必
要性である。この分離は、多量の、生きた、感染可能性
のあるウィルスの取扱いを要し、これ自体、重大な安全
上の傷害を与える。加えて、収率、純度、及び実施ごと
のウィルスの再現性に関する心配がある。このことは、
許容できない多数の偽の陽性及び／又は陰性を結果する
。従って、血液スクリーニング評価において有用であり
、かつ更に他の関連した利点を持つウィルス抗原を作る
代りの方法に対して、当該分野にニーズがある。
加えて、この病気のための効果的処置はまだ見い出され
ていない。エイズの広がりが異例なものとなり初め、も
う疫病的割合でないなら、ウィルスが伝達される程度は
なお疑問であり、−設入を免疫化する医薬組成物に対す
るニーズがまた存在する。
（本発明の開示） 簡単に云えば、本発明はＬＡＶゲノムのエンベロープ（
ｅｎｖ　）　８ｍ域の一部分を含むＤＮＡ配列を開示し
、上記一部分は、ＬＡＶに対する抗体と免疫学的に反応
性である蛋白質をコードする。バクテリア宿主細胞中で
複製しうる組換えプラスミドも開示される。このプラス
ミドは、発現のための原核細胞（ｐｒｏｃａｒｙｏｔｉ
ｃ　）転写及び翻訳シグナルを含み、上述のＤＮＡ配列
が読みフェーズにおいて続く。好ましい実施態様におい
て、シグナルは、誘発しうる及び／又は抑制しうるオペ
ロンたとえば１オペロンから選ばれる。上述した組換え
プラスミドにより形質転換されたバクテリア細胞たとえ
ば大腸菌も開示される。
本発明の別の面は、ＬＡＶに対して反応性の抗体又はＴ
細胞と免疫的に反応性である蛋白質を作る方法を開示す
る。この方法は、バクテリア宿主細胞中で複製しうる組
換えプラスミドをバクテリア宿主細胞に導入することを
含む。このプラスミドは、発現のための原核細胞転写及
び翻訳シグナルを含み、ＬＡＶゲノムのｅｎｖ領域の一
部分（該一部分はＬＡＶに対する抗体と免疫学的に反応
性である蛋白質をコードする）を含むＤＮＡ配列が読み
フェーズ（ｒｅａｄｉｎｇ　ｐｈａｓｅ　）において続
く。
プラスミドの導入の次に、バクテリア宿主は、適当な培
地で増殖される。蛋白質の発現がそして誘発され、その
配列の蛋白質生成物がバクテリア宿主から分離される。
蛋白質生成物は、分離のあとでたとえばゲル浸透クロマ
トグラフィにより精製できる。
本発明の更に別の面は、生物的液中のＬＡＶに対する抗
体の存在を決定するための方法を開示する。一つの実施
態様において、この方法は、上述の組換えプラスミドで
形質転換されたバクテリア細胞により産生された蛋白質
と共に生物学的液体をインキュベートし、それにより反
応混合物を形成し、そして続いて抗体の存在を決定する
ために反応混合物を分析することを含む。好ましい実施
態様において、反応混合物を分析する工程は、抗体のた
めのラベルされた特異的結合パートナ−と反応混合物を
接触させることを含む。別の実施態様において、ＬＡＶ
に対する抗体の存在は、抗体を含むと疑われるサンプル
と固定化組換え蛋白質に結合するラベルされたモノクロ
ーナル抗体との間の競争を実施することにより決定され
る。反応混合物は次に、固相に結合したラベルされた抗
体の量を決定するために分析される。
本発明の別の面は、生物的液体中のＬＡＶ抗原の存在を
決定する方法を開示し、これは上述した組換えプラスミ
ドで形質転換したバクテリア細胞により産生されたラベ
ルされた蛋白質と共に生物的液体をインキュベートする
こと、及び続いて又は同時に、特異的結合が起るような
蛋白質に対する抗体と共にインキュベートすることを含
む。次に、インキュベーションの間に形成された反応混
合物が、抗体と結びついたラベルの量を決定するために
分析される。
上述した組換えプラスミドにより形質転換されたバクテ
リア細胞により産生された蛋白質により動物を免疫化す
ることを含む、ＬＡＶに対する抗体を作る方法も開示さ
れる。
本発明の別の面は、生物的液体中のＬＡＶに対する抗体
の存在を決定するための方法を開示し、これは上述の組
換えプラスミドにより形質転換されたバクテリア細胞に
より作られた蛋白質にラテンクスビースを接合すること
を含む。次に、生物的液体がビーズ／蛋白質接合体とイ
ンキュベートされ、それにより反応混合物を形成する。
反応混合物は次に、抗体の存在を決定するために分析さ
れる。
本発明に従い作られた蛋白質は、適当なキャリア又は希
釈剤と共に用いられると、免疫学的に効果的なワクチン
組成物を形成する。生理学的に許容できるキャリアに付
着されたＬＡＶゲノムのｅｎｖ領域の一部分を含むＤＮ
Ａ配列によりコードされる蛋白質の免疫学的有効量を個
体に投与することにより、エイズに責任あるウィルスに
より起される感染を防ぐことができる。
本発明の別の面は、下記の詳細な説明及び添付図面より
明らかとなろう。
本発明の実施のための最良の態様 本発明を述べる前に、本発明書で用いられる言葉の定義
を述べることが、本発明の理解のために役立つであろう
。
リンパ負性（Ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈ　　）関゛
】ウィルス（ＬＡＶ）：ヒトＴ−リンパ反応性（Ｔ−１
ｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）レトロウィルス。本発明の目
的のために、一つのウィルスがもし下記の判断基準を実
質上溝すなら、それはＬＡＶと同じ又は同等であると考
えられる二（ａ）　　ウィルスがＴリンパ球、特にＴヘ
ルパー細胞（ＣＤ４”″、ベルナート（Ｂｅｒｎａｒｄ
　）ら編、白血細胞タイプ分け（Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ　
Ｔｙｐｉｎｇ）　、ニューヨーク、スプリンガー出版（
１９８４）に定義された国際表記法による）に対して反
応する；（ｂｌ　　ウィルスが、感染されたＣＤ４”細
胞に対し細胞変性的である（ＨＴＬＶ−Ｉ及び■のよう
に形質転換的であるよりも）； （Ｃ）　　ウィルスが、Ｍｇ２＋依存性である（最適濃
度５ｍＭ、最適ｐＨ７，８、アクチノマイシンＤにより
抑制できない）ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写
酵素）をコードし、その３　’　ＬＴＲからの逆転写の
ためのブライマーとしてオリゴ（ｄＴ）　＋２−ＩＩ＋
を用いることができる； （ｄｌ　　ウィルスは、約１．１６の密度で蔗糖勾配中
でバンドをなす； （Ｑ）　　ウィルスは、［３Ｈ］ウリジンでラベルされ
うる； （ｆ）　　ウィルスは、免疫学的及びヌクレオチド配列
判断基準により、ウィルスのＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩ科の員
と区別される（この判断基準によりＨＴＬＶ−■はＨＴ
ＬＶ−１／ＩＩ科の一員とは考えられない）； （ｇ）　　ウィルスは、ＬＡＶのｆｌ及びｅｎｖｇｉ域
によりコードされる蛋白質と本質的に免疫学的に交叉反
応性である；及び 山）　ウィルスは、ＬＡＶと実質的なヌクレオチド相同
性（７８〜１００％）及びアミノ酸配列相同性（９０〜
１００％）を共有する。
免疫学的に反応性：抗原及び抗体が互いに特異的に、曲
型的には少くとも１０６Ｍ−’の親和性、より多くの場
合には少なくとも１０８Ｍ−’の親和性でもって結合で
きるとき、そさらは「免疫学的に反応性」であると云わ
れる。
形質転換された又は形質転換：精製したＤＮＡの導入に
より受は入れ細胞又は微生物の遺伝子型を安定かつ遺伝
しうるように変えるプロセス。
リンパ節症関連ウィルス（ＬＡＶ）は、エイズ又はリン
パ節症候群の患者から分離できる。そのような患者のリ
ンパ節は曲型的にはバイオプシーされ、増殖を支持する
のに必要なように補われた培養基中に置かれる。ミトゲ
ンたとえばインターロイキン−２（ＩＬ−２）又はヒト
へマグルチニン（ＰＨＡ）が含まれることができる；ヒ
トインターフェロンに対する抗血清も含まれることがで
きる。逆転写酵素活性は典型的には、培養の約１５日に
現われ、ウィルスの存在を示す。ウィルスは、非イオン
性界面活性剤を用い、次に蔗糖勾配中でのバンド形成に
より、培養上澄みから濃縮できる。精製のこれら及び他
の方法は、当業界で周知であり、たとえばモンテラロ（
Ｍｏｎｔｅｌａｒｏ　）ら、ジャーナル　オブ　パイロ
ロジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）４２：１０２９　　
（１９８２）に記載されている。
ＬＡＶは、多数の方法で増殖できる。請帯又は末梢血液
又は骨髄から由来するＴリンパ球中でそれは培養できる
。あるいはそれは、不死化したＴ細胞またはＢ細胞中で
増殖できる；たとえばポポビックら、サイエンス２２４
：４９７　　（１９８４）、及びモンタグニエル（Ｍｏ
ｎｔａｇｎｉｅｒ）　　ら、サイエンス２２５：６３　
　（１９８４）。ウィルスの増殖は通常、逆転写酵素活
性の存在によりモニターされる。
ＬＡＶのゲノムクローンは、当業界で周知のいくつかの
方法のいずれかで調製でき、たとえばバーン（Ｈａｈｎ
）ら、ネイチア３１２　：　１６６（１９８４）；アリ
ソ゛ン（八１ｉｚｏｎ）ら、ネイチア３１２ニア５７（
１９８４）；ルシウ（Ｌｕｃｉｗ　）ら、ネイチア３１
３ニア６０　（１９８４）；及びミューシング（Ｍｕｅ
ｓｉｎｇ　）ら、ネイチア３１３　：　４５０　（１９
８５）が挙げられるが、これらに限定されない。
簡単に云えば、これら方法の一つ（アリシンら）ではＤ
ＮＡが健康な提供者のＬＡＶ惑染したＴ細胞から分離さ
れ、Ｈｔｎｄｌ［のような制限エンドヌクレアーゼで部
分的に消化され、そして得られた消化物は電気泳動的に
分画される。全ＬＡＶゲノムのサイズ（約９．２Ｋｂ）
にサイズ的に対応する分画がゲルから溶出され、沈降さ
れ、再懸濁され、そして適当に制限したベクターのアー
ム中に連結（リゲート）される。リゲーション混合物は
バクテリオファージ粒子中に入れられる。バクテリアは
バクテリオファージによりトランスフェクションされ、
クローンは適当なプローブ（たとえばＬＡＶ−ＲＮＡか
ら作られたｃＤＮＡ）を用いてＬＡＶ挿入物についてイ
ンサイッにスクリーンされる。そのようなりローンから
、ＬＡＶの望む令頁域がｐｔＪｃｌＢのようなバクテリ
アプラスミドベクター中にサブクローンされうる。それ
以上のサブクローニングは、非所望の配列を除去するた
め、及び発現ベクター中へのクローニングを促進する目
的でいずれかの端に追加的制限部位（ポリリンカーの形
で）を加えるために望ましいことでありうる。
ＬＡＶ配列は次に、誘発しうる発現ベクター中にサブク
ローンされうる。種々の発現ベクターが当業界で知られ
ており、λｇｔｌ　１　：Ｔｎ　５　　（ホール（Ｈａ
ｌｌ）ら、ネイチア３１１　：　３７９　　（１９８４
）　　；に旦（ボール（Ｐａｕｌ）ら、ヨーロピアン　
ジャーナル　オブ　セル　バイオロジー（ＩＥｕｒｏ、
　Ｊ。
Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、３１　：　１７１　　（１９８３
）　　；ｐｌＮＩＩＩ（マスイ　（Ｍａｓｕｉ　）ら、
バイオテクノロジー、１９８４年１月、ｐ８１）を包含
する。
得られた蛋白質は、部分的に精製され、免疫原として及
び免疫評価における抗原としてを包含する種々の目的に
用いられることができる。免疫原としての使用のために
、蛋白質は緩衝溶液中又はアジュバントに含めて、マウ
ス、ラビット、ヤギなどのような動物に注射されうる。
あるいは蛋白質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により精製でき、興味のバンドがゲルから切断され、ト
リチュレート化され、そして宿主動物への注射のために
緩衝液に再懸濁される。ポリクローナル又はモノクロー
ナル抗体が作られうる。免疫評価における抗原としての
使用のために、蛋白質はラベルされた又はラベルされて
いない形で行いることができる。それらがラベルされる
場合、ラベルとしては放射性同位元素、蛍光物質、酵素
、燐光物質又は粒子が挙げられる。これら及び他のラベ
ルは当業界で周知であり、たとえば米国特許３．７６６
、１６２号、３，７９１，９３２号、３，８１７，８３
７号、３．９９６，３４５号、及び４，２３３，４０２
号に記載されている。
本発明の組換え蛋白質を用いる評価（アセイ）は、不均
一（すなわち分離工程を要する）又は均一でありうる。
もし評価（アセイ）が不均一であるなら、遠心分離、濾
過、クロマトグラフィ、又は磁化を含む種々の分離手段
を用いることができる。
抗体の存在について血液物質又は他の生理的液体をスク
リーンする一つの好ましい評価法は、ＥＬＩＳＡ評価法
である。典型的には、抗原（この場合、組換え蛋白質の
一つ又は組み合せ）は、微小力価くぼみの表面に吸着さ
れる。次に表面上の残りの蛋白質結合部位は、適当な剤
たとえばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、熱不活性化正
常ヤギ血清（ＮＧＳ）、又はＢＬＯＴＴＯ（保存剤、塩
及び消泡剤を含む脱脂乾燥ミルクの緩衝溶液）によりブ
ロックされる。くぼみは次に、特定の抗体を含むと疑わ
れるサンプルと共にインキュベートされる。サンプルは
無希釈で適用されることができ、又はより多くの場合に
はそれは、ＢＳＡ、ＮＧＳ又はＢＬＯＴＴＯのような蛋
白質の少量（０，１〜５．０重量％）を含む緩衝液を通
常用いて希釈されることができる。特異的結合が起るの
を許すのに十分の長さの時間インキュベートした後に、
くぼみは結合してない蛋白質を除くために洗われ、次に
ラベルされた抗ヒト免疫グロブリン抗体（αＩｌｕ１ｇ
）と共にインキュベートされる。ラベルは、ホースラデ
ィツシュ　ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクト
シダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、及びグルコース
オキシダーゼを含む種々の酵素から選ばれうる。特異的
結合が起るのに十分な時間を許し、次に、結合していな
い蛋白質を除くためにくぼみを再び洗い、そして酵素の
ための基質を加える。色が現われるのを許し、くぼみの
内容物の光学的密度を肉眼で又は機器で決定する。
便宜のために、ＥＬＩＳＡ評価のための剤は、キットの
形で用意される。これらキットは、組換え技術により作
られたウィルス蛋白質がそれに予め吸着されたところの
微小力価プレート、種々の希釈剤及び緩衝剤、特異的に
結合された抗体の検出のためのラベルされた接合体、及
び他のシグナル発生剤たとえば酵素基質、コファクター
、及び色原体を含むことができる。
エイズ患者のかなりの数が高度に免疫抑制され、そして
高力価抗体を作る能力を進行的に失うという事実により
、本発明は、ＬＡＶに対する抗体と免疫学的に反応性で
ある蛋白質をコードするＬＡＶゲノムのエンベロープ（
匹）領域の部分を用いる。ＬＡＶのエンベロープグリコ
プロティンに対する抗体の存在は、他のウィルス蛋白質
に対する抗体の存在よりも良いＬＡＶ感染の指標である
。
なぜなら、エンベロープグリコプロティンに対する抗体
力価は、病気の後半の段階の間持続すると考えられ、一
方、他の蛋白質たとえばコア蛋白質に対する抗体は検出
しうるレベルより下に低減するかも知れないからである
。
本発明の組換え蛋白質の別の適用は、ヒトワクチンとし
ての使用である。組換え蛋白質は、亮度に精製され、慣
用の方法で宿主の１　ｋｇ当り１μｇ〜２０ｍｇの濃度
で処方されうる。生理的に許容されるキャリアたとえば
滅菌水、食塩水、緩衝された食塩水などが用いられうる
。水酸化アルミニウムのようなアジュバントも用いうる
。ワクチンは、静脈内、皮下、筋肉内又は腹膜内注射に
より投与できる。−回の注射が十分でありうるが、より
多くの場合、逓倍ないし月毎の間隔での複数回注射が好
まれる。
アルイハ、ＬＡＶゲノムの領域を表現するワクチンウィ
ルス組換え体が構成されうる。たとえば、本発明の構成
物は、９ＭＭ３４（’７ゲツト（Ｍａｃｋｅｔｔ）ら、
サイエンス２２７：４３３　　（１９８５））のような
プラスミド、及び相同組換えにより形成された得られた
キメラプラスミドを含むワクチンウィルスハイブリッド
中に挿入されうる。そのような組換えウィルスワクチン
による免疫化は、動物においてＢ型肝炎ウィルス及び水
泡性口内炎ウィルスに対する保護免疫を誘発するのに有
効であると判っている（スミス（Ｓｍｉｔｈ　）ら、ネ
イチア３１１：５７８　　　（１９８４））。
この方法における組換え蛋白質ワクチンの使用は、不活
性化された調製物又は病原性微生物の非つイルレント（
ａｖｉｒｕｌｅｎｔ　）株からワクチンを構成する必要
を除去する。
ＬＡＶの遺伝子構造、５　’　ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ
−Ｑ−ｅｎｖ−Ｆ−３’−ＬＴＲは、レトロウィルスの
うちで独特である。他の総ての既知の複製能力あるレト
ロウィルスにおいて、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子はオーバ
ーランプしている。ＬＡＶにおいては、それらはオーブ
ン読み枠Ｑにより分離されている（ワインーホブソンら
、セル４０　：　９　（１９８５））。
ｅｎｖオープン読み枠は、第８トリプレツトにおいて可
能な開始部位（メチオニンコドン）を持チ、従って分子
１１９７．ｋｄの一部分をコードすると予期される。こ
れは、変性性ポリアクリルアミドゲル上のＬＡＶグリコ
プロティンの見かけ分子量（１１０ｋｄ）と一致する。
ｅｎｖ遺伝子中に３２の可能性あるＮ−グリコジル化部
位（Ａｓｎ−ｘ−３ｅｒ／Ｔｈｒ　）がある。レトロウ
ィルスエンベロープ蛋白質の特徴である三つの疎水性領
域も存在し、シグナルペプチド（ヌクレオチド　５８１
５−５８５０によりコードされる）、第二領域（７３１
５−７３５０）、及び透過膜セグメント（７８３１−７
８９６）に対応する。第二領域は、蛋白質分解プロセシ
ング部位を表わすと考えられるＡｒｇ／Ｌｙｓに冨む領
域に続＜（ワインーホブソン、前出）。
上述のように、ＬＡＶグリコプロティンに対する抗体（
皿ト遺伝子生成物）は、ウィルス感染の経過中初期に現
われ、病気の後半の段落でも同様に持続する（キフチェ
ン（Ｋｉｔｃｈｅｎ　）ら、ネイチア３１２：　３６７
　（１９８４））。従ってグリコプロティンに対する抗
体は、グリコプロティン又はその部分を作るＬＡＶに対
する過去の暴露の特に良い指標であり、血液スクリーニ
ング評価法において特に有用である。
ＬＡＶゲノムのｅｎｖ　領域の特に好ましい部分は、Ｅ
ＮＶ−３である。第３図に示すように、ＥＮＶ−３はヌ
クレオチド配列のｂｐ７１７８からｂｐ７６９８にわた
る。第７図において、下記のサブ領域（第７図で上に線
を引いた）が領域内に含まれる：（１）ｂρ７３１５か
ら７３５０によりコードされる疎水性ペプチド；　（２
）ｇＰ　６５及びｇｐ４３へのエンベロープ前駆体蛋白
質の開裂のための推定の蛋白質分解プロセシング部位を
含むドデカペプチド；（３）二つのシスティン残基の周
辺の高度に保存される領域；（４）３’（カルボキシル
）末端の保存さる配列；及び（５）５’（アミン）末端
の保存される配列。
ＥＮＶ−３の種々のサブ領域に対応する合成ペプチドを
用いて得られたデータは、最も重要な領域がシスティン
残基を含む又はこれに極近い領域及び蛋白質分解プロセ
シング領域を含む又はこれに極近い領域であることを示
す。これらペプチドの成る物の合成及びスクリーニング
は、出願中の米国特許出願シリアルＮｏ、　７２８．０
５２　（１９８５年４月２９日出願、コサンド（Ｃｏｓ
ａｎｄ）　）に記述されている。
また、ＥＮＤ−３はまた、潜在的グリコジル化部位を殆
んど欠き；従って組換え蛋白質の抗原性は天然蛋白質の
それを模倣すると合理的に予期されうる。ｅｎｖ遺伝子
及びその蛋白質生成物の全配列は第８図に示され、そこ
では潜在的グリコジル化部位が上に線を引かれている。
第８図で、ＥＮＶ−３の大きな範囲がそのような部位を
欠くこと、及び遺伝子の残部と比べてＥＮＶ−３は全体
として顕著にグリコジル化が少ない（ｕｎｄｅｒｇｌｙ
ｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ことが判る。
下記の実施例で、λＪ１９と名付けられたＬＡＶゲノム
クローンは、バクテリアプラスミドベクター、ｐＵｃ１
８、中にサブクローンされた。得られたサブクローン（
ｐＢＴ−１と呼ばれる）（ＡＴＣＣ寄託番号５３０６９
を与えられた）は更にサブクローンされて、ｐ　！：２
ｓ　−３を与え、これはｅｎＶ　％　Ｆ及びＬ　Ｔ　Ｒ
ｗ４域配列を主に含んだ。
虱及び旦配列の一部は、更にＭ１３ｍｐ１８中にサブク
ローンされ、次にｅｎｖ配列の領域かに旦誘発性発現ベ
クター中に移された。ｅｎｖＤＮＡは、ｔｒｐ　Ｅ遺伝
子のインフレーム下流に挿入され、大腸菌がこの構成物
により形質転換されたとき、ｔｒｐ　Ｅ−ｅｎｖ融合蛋
白質の発現を結果した。得られた蛋白質は部分的に精製
され、既知の血清陽性及び既知の血清陰性個体からの血
清を用いるＥＬＩＳＡにおけるそれらの反応性により特
徴づけられた。
ｐＥＮＶ−１ないしｐＥＮＶ−５と呼ばれる５つの有用
な構成が同定された。
下記の実施例は、例示のために示され、制限のためでは
ない。
実施例 Ａ、　ｔｒｐ−ｅｎｖ発現ベクターの構成外来蛋白質を
発現するために、いくつかのバクテリア発現系のいずれ
かを用いることができる。
ｔｒｐ　Ｅ系がＬ　Ａ　Ｖｅｎｖ配列の発現のために選
ばれた。なぜならそれは強い誘発しうるプロモータを含
み、しかしその発現はまた、外来の（がっ潜在的に毒性
の）蛋白質がバクテリア内に長時間蓄積しないように抑
制されうるからである。外来挿入物を含むベクターで形
質転換されたバクテリアをスクリーン又は選別するため
の速く簡便な方法はない（ベクター単独で形質転換され
たバクテリアとはちがって）ので、ＤＮＡの大きな片（
たとえばλフアージＤＮＡ）の望む領域を、挿入物のた
めの選択系を含むベクター中に、ｔｒｐ　Ｅ発現ベクタ
ーにそれを移す前にサブクローンすることが便宜である
。これは、望む挿入物を含むもののために、形質転換さ
れたバクテリアをスクリーンすることを容易にする。
従って本発明者のアプローチは、まずＬＡＶゲノムのｅ
ｎｖ領域の多くを転移ベクターＭ１３ｍｐ１８中に二段
階でサブクローンすることであった（第１図）。次に、
このサブクローンの種々のフラグメントは、ポリリンカ
ー領域中の制限部位の読み枠においてのみ異る三つの皿
発現ベクター（ｐＪＨｌｌ、ｐＪＨｌ２、ｐＪＨｌ　４
）のいずれかへと連結された（第２図）。得られたサブ
クローンのいくつか（たとえばｐＥＮＶ−５、ｐＥＮＶ
−４＞はそのままで用いられたが、他のものは望む生成
物を作るために更に修正を必要としり（ｐ［ＥＮＶ　−
１、ｐＥＮＶ　−２、ｐ［ＥＮＶ　−３）。
１、　　ＬＡＶゲノムサブクローニングａ、ファージＤ
ＮＡの調製 ＬＡＶゲノム全体は、ファージλＬ４７．１のＨｉｎｄ
Ｉ［部位に９．２Ｋｂゲ／ムＤＮＡ挿入物を含むλフア
ージ粒子の形でパスツール　インスティチュート（Ｐａ
ｓｔｅｕｒ　［ｎ５ｔｉｔｕｔ）から得られた。このク
ローンは、λＪ１９と呼ばれ、ワイン・ホブソンら、セ
ル４０　：　９　（１９８５）に記載される。
λＪ１９ファージ粒子は、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）ら、モレキュラークローニング：ラボラトリ−マニ
ュアル、ニューヨーク、コールドスプリングハーバ−ラ
ボラトリ−１１９８２、ｐ６４の手順に従って、大腸菌
に−１２の０３５９株（０３５９株のゲッタイブはｈｓ
ｄＲｋ”　＋ｈｓｄＭｋ’　５ｕｐＦ、　　φ８０、Ｐ
２である）中にトランスフェクトされた。単一のプラー
クが取り上げられ、ファージはプレートリセード法（マ
ニアチス、前出、ｐ６５）により増幅された。３７℃で
９時間のインキュベーション後に、豊富なプラークを含
むプレー１−（１００龍直径）は、１００ｍＭ　ＮａＣ
１／　２０ｍＭ　　Ｍｇ５Ｏａ　１５０ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ、　ｐＨ７，５、の５１Ｉ１１によりおおわれた。
４°Ｃで１２時間のインキュベーション後に、液体が集
められ、等体積のクロロホルムで２度抽出された。
ファージ粒子を含む得た水性相のｌＱｍｊ！に、０．２
５Ｍ　　ＥＤＴＡ／２．５％５ＤＳ１０．５ＭＴｒｉｓ
、　ｐＨ９、の２ｍ７！を加え、懸濁物を７０°Ｃで１
５分間インキュベートして、ファージを破壊した。８Ｍ
酢酸カリウム２．５　ｍ　ｌ！を加え、溶液を氷上で１
５分間インキュベートし、次に４℃で１２．０ＯＯＸ　
ｇで１０分間遠心分離して蛋白質をペレット状にした。
上澄みを、５　Ｑ　ｍ　７！ポリプロピレン遠心分離管
に移し、２０″Ｃで等体積のフェノール（ｐＨ８、Ｉ　
Ｍ　　Ｔｒｉｓ、　ｐｆｌ　８、で緩衝）で抽出した。
水性相を次に、２０℃で等体積のクロロホルム：イソア
ミルアルコール（２４：１）で抽出した。水性相に次に
、２．５体積の９５％エタノールを加えて、ＤＮＡを沈
澱させた。遠心分離の後にＤＮＡベレットを乾燥し、１
０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　　ＨＣＩＩ。
ｐＨ７，４／　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ中に再懸濁した。
ｂ、ｅｎｖ領をサブクローニングすること上述の＾、１
．ａで調製されたλＪ１９ＤＮＡの約１２μｇを、制限
酵素５ｓｔｌ　　（ベセスダ　リサーチ　ラプズ、ベセ
スダ　メリーランド）で完全に消化した。これは、ＬＡ
Ｖのこの分離物のＬＴＲ領域においてのみ切断する。消
化混合物を、０．０８９Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩１０
．０８９Ｍホウ酸／１ｍＭＥＤＴＡ中の０．９％アガロ
ースを通してｌ　Ｖ　／　ｃｍで電気泳動した。９．Ｉ
Ｋｂフラグメントの位置は、臭化エチジウムで着色した
後に分子量標準に比べて決定された。このバンドは、Ｎ
Ａ４５紙（シュライヒエル　アンド　シュエル（Ｓｃｈ
ｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ　）　、キーン
、ＮＨ）中に電気？容出された。
ＤＮＡは、製造者により提供された指示書に従って紙か
ら回収された。
９、　Ｉ　Ｋｂ　Ｓｅｔ　Ｉフラグメントは、５ｅｔＩ
消化されたベクターｐＵｃ１１１１中に、１０挿入物分
子＝１ベクター分子の比で連結された。大腸菌株ＨＢ１
０１が、マニアチスら（前出）のＣａＣ１ｚ手順により
、連結混合物により形質転換され、ＬＢ＋アンピシリン
（２００Ｍｇ／ｍｊ２）寒天プレート上にプレートされ
た。
単一のコロニーを取り上げ、３　ｍ　ｌ！ＯＬＢ＋アン
ピシリン培養基で希釈し、一定振とう下に３７℃で一夜
増殖した。プラスミドＤＮＡは、アルカリ性すシス（ｌ
ｙｓｉｓ　）法（マニアチスら、前出、ｐ３６８）によ
り８周製された。プラスミドＤＮＡの制限分析により調
べたときポリリンカー中の［Ｅｃｏ　Ｒ１部位がＬＡＶ
ゲノムの５′末端に最も近いような配位で９．ＩＫｂＳ
ｓｔＩ挿入物を含む一つのコロニーが選択された。この
サブコローンはｐＢＴ−１と名付けられた（ＡＴＣＣ寄
託番号５３０６９）　　（第１図）。
プラスミドｐＢＴ−１は次に、Ｅｃｏ　ＲＩで消化され
、ＬＡＶゲノムの３′未堝をまだ含むベクターを再連結
した。これは、プラスミドから５′Ｅｃｏ　ＲＩフラグ
メントを除去するように働く。
ＨＢＩＯＩ細胞が、連結混合物で形質転換され、挿入物
ｐＲ３−３を含むコロニーが、精製されたプラスミドＤ
ＮＡの制限分析により同定された。
−領域の多（を含む、ｂｐ５８８９とｂｐ８５７２のＫ
ｐｎＩ部位の間の配列〔ワインーホブソンら、セル４０
：９　（１９８５）に従い番号付け〕が次に、ｐＲ３−
３からＭ１３ｍｐ１８ベクターへ転移された。これは、
余分の（非ｅｎｖ　）配列を更に除去するため、及びま
た選択／スクリーンできるマーカーとしてアンピシリン
でなくβ−ガラクトシダーゼを用いるベクター中に匹配
列を置くために行われた。これは、次の理由で有利であ
る。１旦発現ベクターはその選択マーカーとしてアンピ
シリン耐性を用いる；アンピシリン耐性因子をコードす
る一つのベクター（ｐＵｃ１８）から他のもの（狂り発
現ベクターｐＪＨ１１，１２，１４）への挿入物の転移
は、望む挿入物子ベクターのためのスクリーニングをよ
り困難にするであろう。
Ｍ１３ファージが、ｅｎｖ配列の挿入によるβ−ガラク
トシダーゼの不活性化を評価するために発色原基質５−
ブロムー４−クロル−３−インドリル−β−ガラクトシ
ド（シグマケミカル社）を用いてスクリーンされた。挿
入物を含むこれらファージは、ポリリンカー領域中の制
限部位に対しての挿入物の配位についてスクリーンされ
た。ＤＮＡは、組換え体（Ｎｏ．ｐｓＷｌ　６、ｍｐｓ
Ｗｌ　９）から各配位について単離された（第１図）。
２、匹と配列へのｎベクターへの挿入 発現ベクターは、大腸菌ｔｒｐオペロンプロモーター、
オペレーター、及びｐＢＲ３２２に挿入されたｔｒｐ　
Ｅ遺伝子を含んだ（第２図）。ｌ旦遺転子は、ポリリン
カー配列の挿入により、その５′の多くのＢｇｉｎ部位
で切り詰められた（コノプカ（Ｋｏｎｏｐｋａ　）　ら
、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　　５１　：　２２３　（１９８
４））一種々の旦Ｌベクター　（ｐＪＨｌｌ、ｐＪＨ１
２及びｐＪＨ１４）は、ポリリンカー領域内の制限部位
の読み枠に従って異った。適当なベクター中へのオープ
ン読み枠の挿入は、アミノ末端での！旦配列との融合蛋
白質の産生を結果する（スピントラ−（Ｓｐｉｎｄｌｅ
ｒ）　ら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　　４９　：　１３２（
１９８４））。
本発明者は、発現のためにＬ　Ａ　Ｖ−ｅｎｖの５つの
重なり合う領域を選んだ（第３図）。選択は、これらベ
クター中の挿入物サイズへの制限により（コノプカら、
Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　　５１　：　２２３　　（１９８
４））、及び発現のために有害でありうる疎水性配列の
位置により指示された。
ｐＥＮＡ−５（ＡＴＣＣ寄託番号５３０７４）は、ポリ
リンカー領域中のｍｐｓＷ１９のＢａｍ　Ｈ１部位か６
ｅｎｖ　１Ｉｉｎｄｎ［部位（ｂｐ＆７６９８）までの
ｅｎｖ領域を、Ｂａｍ　Ｈ１及びｌ１ｉｎｄｊＩ［にュ
ー　イングランド　バイオラブズ）制限されたｐＪＨ１
２へ連結することにより構成された（第４図）。連結物
は、ＣａＣｌ　ｚ　ショックされた大腸菌ＨＢＩＯＩ中
に形質転換され、バクテリアは、１００μｇ／ｍ１のア
ンピシリン（シグマ社）及び２０μｇ／ｍｌのトリプト
ファン（シグマ社）の存在下に置かれた。トリプトファ
ンは、その蓄積がバクテリアに対して有害でありうると
ころの外来蛋白質の発現を抑制するために加えられた。
アンピシリン耐性コロニーが、ｅｎｖ　７ラグメントを
含む組換えプラスミドの存在について微量溶解物（Ｎｏ
．ｉｎｉｌｙｓａｔｅｓ）によりスクリーンされた。
ｐ’ＥＮＶ−１（ＡＴＣＣ寄託番号５３０７０）は、二
つのＢｇｉｎ配列（ｂｐ６５９８及びｂｐ　７１７８）
の間の配列を除去することによってｐＥＮＶ−５から導
かれた（第４図）。この除去は、ＢｇｌＩＩ部位の少し
後に停止コドンを導入することによりオープン読み枠の
サイズを減少した。
ｐＥＮＶ−２（ＡＴＣＣ寄託番号５３０７１）は、二つ
のＢｇｌｎ配列（ｂｐ６５９Ｂ及びｂｐ　７１７８）の
間のフラグメントをＢａｍ　ＨＩ制限されたｐＪＨ１４
中に挿入することにより構成された（第５図）（Ｂｇｌ
ＩＩとＢａｍ　ＨＩ突出部は相容性である）。大腸菌Ｈ
Ｂ　１０１が連結反応により形質転換され、アンピシリ
ン耐性コロニーが、ｐＪＨ１４中への二種入物の存在及
び配位について制限分析によりスクリーンされた。
ｐＥＮＶ−３ＣＡＴＣＣ寄託番号５３０７２）は、ｍｐ
ｓＷ１９のＢａｍ　Ｈ１部位（ポリリンカー中の）と１
１ｉｎｄｌｌｒ部位（ｂｐ７６９８）の間のｅｎｖ領域
を、Ｂａｍ　ＨＩ及び旧ｎｄＩＩＩ制限されたｐＪＨｌ
ｌへ連結することを要する（第５図）。大腸菌ＨＢ１０
１が連続反応により形質転換され、アンピシリン耐性コ
ロニーが微小溶解物によりスクリーンされた。適当なコ
ロニーからのＤＮＡを分離し、Ｂａｍ　ＨＩ及びＢｇｌ
ＩＩにュー　イングランド　パイオラブズ）で消化し、
再連結した。このＤＮＡが、大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転
換するために用いられた。得たアンピシリン耐性バクテ
リアは、Ｂａｍ　ＨＩ〜ＢｇｌＩＩフラグメントを除去
した組換えプラスミドについて制限分析によりスクリー
ンされた（第５図）。フラグメントの除去は、Ｂｇｌｎ
部位（ｂｐ７１７８）とＨｉｎｄｕ部位（ｂｐ７６９８
）の間のｅｎｖ配列を正しい読み枠中にもたらした。
ｐＥＮＶ−４（ＡＴＣＣ寄託番号５３０７３）は、ｍｐ
ｓＷ１６からの旧ｎｄｌｌＩフラグメントを、Ｈｉｎｄ
Ｉ［Ｉ及びウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ボーリン
ガ−マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ）により処理されたｐ　Ｊ　Ｈ１２に連結すること
により構成された（第６図）。組み換えプラスミドは、
連結混合物により大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換し、そし
て微小溶解物の制限分析によるスクリーニングによって
同定された。
Ｂ、蛋白質発現 １、甘り憇り構成物による大腸菌の形質転換組換え互す
ュシドー発現プラスミドの各々は、大腸菌ＨＢＩＯ１か
ら大腸菌Ｃ６００へ転換された。
なぜなら、後者は蛋白質産生のための潜在的により良い
宿主であるからである。転移は、ＨＢＩＯＩの微小溶解
物（Ｎｏ．ｉｎｉｌｙｓａｔｅｓ　）からのスーパーコ
イルＤＮＡによる、Ｃｃ（ｌｚ　ショックされたＣ６０
０の形質転換を含む。バクテリアは、記載されるように
（コノブカら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　　５１　：　２２
３（１９８４）アンピシリン及びトリプトファンの存在
下でプレートされた。薬剤耐性コロニーは、適当なプラ
スミドの存在を確認するために微小溶解物によりスクリ
ーンされた。
２、　　ｔｒｐ−ｅｎｖ蛋白質の発現 Ｌｒｐ発現ベクターで形質転換された大腸菌Ｃ６００の
増殖及び誘導は、記述されている通りであった（スピン
トラ−ら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　　４９　：　１３２（
１９８４）；コノプカら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　　５１
　：２２３　（１９８４）。簡単に云えば、トリプトフ
ｙ　７　（２０ｐ　ｇ／ｍ１）及びアンピシリン（１０
０μｇ／ｍｌ）を含む最小培地が、グリセロール貯蔵か
らの形質転換されたバクテリアを接種された。
培養物は、３７°Ｃで空気吹込み下に一夜増殖された。
−夜培養物は次に、アンピシリン（１００μｇ／　ｍ　
７りを含みしかしトリプトファンを含まない新鮮な最小
培地に１：１００で接種された。これら培養物は、３７
℃で２〜３時間（初期対数相まで）空気吹込み下に増殖
された。誘導物質、３−β−インドール−アクリル酸（
シグマ社）が、９５％エタノール中２０■／　ｍ　ｌで
新鮮に作られたストックから２０μｇ　／　ｍ　ｌの最
終濃度まで加えられた。
誘発された培養物は、３７°Ｃで空気吹込み下に４〜５
時間増殖され、次にペレット化され、所望ニヨリ凍結さ
れた。ｐＥＮＶ−１、ｐｌＦ、ＮＶ−２、及びｐＥＮＶ
−３からの蛋白質収率は、典型的には１０〜３０■／ｌ
であり、一方、ｐＥＮＶ−４及びｐＥＮＶ−５からの収
率は典型的には１■／ｌより低かった。
Ｃ０豆と並と蛋白質の分離及び精製 融合蛋白質は、記載されているように（コノプカら、Ｊ
、Ｖｉｒｏｌ、　５１：２２３　（１９８４））細胞ペ
レットから部分的に精製された。簡単に云えば、バクテ
リアを、誘導された培養物１１当り５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
　ＸｐＨ７，５１０，５ｍＭＥＤＴＡ／　１５０ｍＭ　
ＮａＣ１（ＴＨＥ）の１００ｍＪ中に再ｇ、Ｓシた。
リゾチーム（シグマ社）を、最終濃度１■／　ｍ　Ａま
で加えた。０℃で１５分間後に、混合物にＮＰ４０を０
．２％の最終濃度まで０℃で１０分間加えた。次にＤＮ
ａｓｅ　　（シグマ社）の１〜２曜を、ＤＮａｓｅ緩衝
液（１５０ｍＭ　ＮａＣ１／　１２ｍＭ　ＭｇＣｊ’ｚ
　）　１５０ｍ１と共に加えた。反応混合物を０℃で１
時間、しばしば攪拌しながらインキュベートした。次に
、不溶性蛋白質を、０℃で８０００Ｘｇで１５分間の遠
心分離によりペレット化した。ペレットを”ＩＮＥ中で
二度洗い、変性性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り不溶性蛋白質の存在について分析した。蛋白質は、コ
ーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　）ブリリアント　ブル
ーＲでの着色により可視化された。
バクテリアの１１からの不溶性物質を含むペレットは、
６Ｍグアニジニウムクロライド１０．１ＭＴｒｉｓ　　
ＨＣｌ１ＳｐＨ７，８、の５ｒｎｌ中で可溶化された。
この溶液に約６０■の固体ジチオスレイトール（ＤＴＴ
）を加え、３７℃で３０分分間光が進行するのを許した
。
可溶化され還元された蛋白質は、９．４ｍ＋ｎＸ２５ａ
ｍ　　ＧＦ　−２５０Ｚｏｒｂａｘカラム（商標、デュ
ポン社、ウイルミントン、プラウエア）でのゲル浸透ク
ロマトグラフィに付された。蛋白質溶液の１００μｌを
カラム上に注射し、０．５ｍＩ２／分の流速で６Ｍグア
ニジウムクロライドにより溶出した。２８０ｎｍでの光
学的密度をモニターし、３０秒間隔で分画を集めた。分
画番号３２、すなわち７．７５〜８．ＯＯｍｎの間に溶
出した分画を、次の評価のために用いた。注：低等級の
グラニジニウムクロライドが用いられると、ＤＴＴの添
加は不溶性の金属硫化物の形成を結果するであろう。
ｔｒｐ−ｅｎｖ融合蛋白質も、下記のように精製された
。
融合蛋白質は、不溶性ペレットとして（上述）細胞ペレ
ットから部分的に精製された。バクテリア４βからの不
溶性物質を含むペレットは、６Ｍグアニジニウムクロラ
イド１０．　Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣβｐｈ７．８、の
４ｍｌ中に可溶化された。この溶液に、約１００ｍｇの
固体ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加え、３７℃で１
時間還元の進行を許した。
可溶化された還元された蛋白質は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ
ＴＳＫＨＷ−５０（Ｓ）（商標、ＭＣＢマニュファクチ
ュアリングケミスツ、ギブスタウン、ニュージャーシイ
）の２．６Ｘ８７ｃｍカラムでゲル浸透クロマトグラフ
ィに付された。還元された蛋白質４ｍｌをカラム上にポ
ンプで与え、２Ｘ１０−’ＭＤＴＴ／２Ｘ　１０−’エ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）／６Ｍグアニジウム
クロライド（アメリカン　リサーチ　プロダクツ社、サ
ウスユークリッド、オハイオ）で溶出した。カラムは０
．５ｍ１１分で運転され、２８０ｎｍでの光学密度をモ
ニターし、１０分間間隔で分画を集めた。ＵＶ吸収ピー
クの中心から二つの分画、分画３４及び３５、を次の評
価において用いた。
Ｄ、　「ム肌り蛋白質の免疫学的反応性■、　ウェスタ
ーンプロットによる分析ｐＥＮＶ、−１，ｐＥＮＶ−２
、ｐＥＮＶ−３、ｐＥＮＶ−４及びｐＥＮＶ−５と表わ
される不溶性蛋白質調製物からの小分けしたものを、２
％ドデシル硫酸ナトリウム／　１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
、　ｐＨ６、８／２０％グリセロール／　１．５　Ｍ　
　β−メルカプトエタノール中に可溶化し、変性性ポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動した。蛋白質をニトロ
セルロース（ＢＡ８５、シュライヒエル　アンド　シュ
エル、ケーン、ＮＨ）、及び５％ウシ血清アルブミン（
シグマ社）でブロックされたフィルター上にエレクトロ
トランスファーした。次にフィルターを、エイズ患者か
らプールした大腸菌吸着ヒト血清で調べた。フィルター
は、ＨＲＰ接合ヤギαｌｌｕ１ｇで現像された。プール
は、５つの江と肌り融合蛋白質の総てと反応性であった
が、！旦蛋白質単独とは反応性でなかった。
２、ＥＬＩＳＡによる分析 ｐＥＮＶ−１、ｐＥＮＶ−２、ｐＥＮＶ−３、ｐＥＮＶ
−５及び「Ｌ旦の不溶性蛋白質調製物を、３Ｍグアニジ
ウムクロライド中に可溶化した。不溶物質を１５．００
０Ｘｇで５分間の遠心分離により除去した。可溶化した
蛋白質濃度は、プラトフォード（アナリティ力ル　バイ
オケミストリー）（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、　　八ｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　）　　７
　２　　：２４８　　（１９７６）の方法により決定し
た。蛋白質を１〜２μｇ　／　ｍ　１２の最終濃度に０
．０５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６）で希釈
した。５０μｌの小分けしたものを微小力価くぼみ当り
与え、４°Ｃで一夜インキユベートした。次にプレート
を、ＢＬＯＴＴＯ（０，０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ
７，２１０，１５Ｍ塩化ナトリウム中の５％ｈ／ｖ　］
脱脂ドライミルク１０．０１％チメロソール（ｔｈｉｍ
ｅｒｏｓｏｌ）　／　０．０１％アンチフオームＡ）に
より３７℃で１時間ブロックした。プールした血清陽性
血清、実開性愛者又はＬＡＳ患者からの血清、及び健康
な異性愛者からの血清を、ＢＬＯＴＴＯとＰＢＳ（０，
０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，３１０、１５Ｍ　Ｎ
ａ（１）の１＝１混合物により１：１００希釈し、希釈
した血清５０μｌをくぼみに加え３７℃で１時間おいた
。血清を除き、プレートを洗浄緩衝液（０，１５Ｍ　Ｎ
ａＣ１／　０．０５％［ｗ／ｖ　］ＥＴｗｅｅｎ２０　
）中で３回洗い、ヤギ抗ヒトＩｇＧ　／ホースラディツ
シュ　ペルオキシダーゼ接合体（５０ｍＭクエン酸ナト
リウム１０．０５％Ｔｗｅｅｎ　　２０　／　１％加熱
不活性化性正常ヤギ血清；アンチボディーズ（Ａｎｔ　
１ｂｏｄ　ｉｅｓ　）社、デービス、カリフォルニアか
ら（等だ、中に１＝１０．０００希釈）の１００μｌを
３７℃で１時間加えた。接合体を除去し、プレートを０
．１５Ｍ　　ＮａＣ１１０，０５％（：ｗ／ｖ　ＥＴｗ
ｅｅｎ　２０により３度洗った。ＥＬＩＳＡ評価は、基
質溶液（０，０５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０の
５０ｍβ中の１０ｍｇの０−フェニレンジアミン）の１
００μＡ／＜ぼみを室温で３０分間加えることにより現
像さた。反応は、３　Ｎ　　Ｈ，Ｓｏ、の１００μβ／
くぼみにより停止され、４９０ｎｍでの光学的密度を自
動化Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ　リーダーで測定した。
ｐＥＮＶ−１、ｐＥＮＶ−２、ｐＥＮＶ−３、及びｐＥ
ＮＶ−５により産生された蛋白質は総て、既知の血清陽
性血清と反応性であると判った。
ｐＥＮＶ−１、ｐＥＮＶ−３、及びｐＥＮＶ−５でコー
ドされる蛋白質の別のスクリーニングは、３１のヒト血
清サンプルのパネルに対して、上述のグアニジニウムク
ロライド可溶化ペレットからの物’ｆ（ｐＥＮＶ−１で
コードされる蛋白質は更に、上述のようにゲル浸透クロ
マトグラフィにより精製された）を用いて実施された。
パネルには、健康な異性愛者（全ウィルスＥＬ　Ｉ　Ｓ
Ａで陰性と定義される）からの８つの血清、エイズ患者
からの２つの血清プール、及びＬＡＳ　（リンパ節症候
群）と診断された個体からの２１の血清が含まれる。
ＬＡＳ個体からの血清は、全ウィルスＥＬＩＳＡにおい
て血清陽性と確認された。１２がウェスターンプロット
分析により更に確認された。結果を表１に示す。これら
結果は、エイズ又はＬＡＳ患者からの血清が、正常個体
からの血清と比べて、ｐＥＮＶ−１、ｐＥＮＶ−３及び
ｐ　ＩＦ、ＮＶ−５でコードされる蛋白質とより反応性
であったことを示す。この記述は、ｔｒｐ−ｅｎν融合
蛋白質がエイズ原因ウィルス、ＬＡＶ、と反応性の血清
の存在についてスクリーンするために用いられうろこと
を示す。
１：ウィルス溶解物は、感染された細胞培養物の上澄み
を１０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）で
沈澱し、次に２０〜６０％蔗糖勾配中で平衡まで二度バ
ンド形成することにより調製された。密度１．１６での
ウィルスバンドを取出し、ウィルス粒子を超遠心分離に
より更に濃縮し１次に０．５％ドデシル硫酸ナトリウム
を含むＲＩＰＡ緩衝液（脚注２で述べる）中で溶解（分
解）し、次に微小力価テストプレートのくぼみにコーテ
ィングした。
２：放射能ラベルしたＬＡＶ抗原を、ＲＩＰＡ緩衝液（
ギリード（Ｇｉｌｅａｄ）ら、ネイチア２６４：２６３
　（１９７６））中で崩壊し、次にヒト血清と反応させ
た。得た免疫複合体を黄色ブドウ球菌吸着体に結合する
ことにより分離しくケスラー（Ｋｅｓｓｌｅｒ　）　、
Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１１５　：　１６１７（
１９７５））、繰返し洗った。免疫沈降した抗原をＳＯ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動次にフルオログラフ
ィにより分析した（ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ　）　、
ネイチア２２７　：　６８０　　（１９７０）。
ｐ２５又はｇｐ４３バンドの存在は、サンプルを血清陽
性と確認するのに必要かつ十分と考えられた。
３　：　ＬＡＳ＝リンパ節症候群 ４：ｎ、ｄ、＝不実施 ３、ＬＡＶに対する血清抗体の検出のための蛍光スライ
ドテスト 上述したように作った可溶性蛋白質をラテックスビーズ
に接合し、蛋白質／ビーズ調製物を顕微鏡スライドにエ
タノール固定する。小分けした患者血清をスライド上で
蛋白質／ビーズと共にインキュベートする。スライドを
洗い、エバンス　ブルー　カウンタースティン中のＦＩ
ＴＣラヘルした抗ヒト免疫グロブリンを加える。スライ
ドを洗い、培養基を乗せ、カバースリップを各々にかけ
る。
あるいは、蛋白質／ビーズ調製物を、患者血清とのイン
キュベーションのために試験管に入れる。
管を遠心分離し、洗い、そしてエバンス　ブルーカウン
タースティン中のＦＩＴＣラベルした抗ヒト免疫グロブ
リンを加えた。管を遠心分離し、上澄みを吸引した。小
分けしたビーズを顕微鏡スライド上に置き、エタノール
固定し、カバーグラスをかける。
総てのスライドを、蛍光顕微鏡により調べる。
もしテスト血清が抗体陽性なら、ビーズは蛍光緑色の球
のように見える；もしテスト血清が抗体陰性なら、ビー
ズは赤い球のように見える。
上述から、例示のために本発明の特定の実施態様を記載
したが、本発明の精神及び範囲を離れることなく種々の
変更ができることが理解されよう。
従って、本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定さ
れるものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、λＪ１９からのｍｐｓＷ１６及びｍｐＳＷ１
９の構成を示す。 第２図は、ポリリンカー配列を含むｔｒｐ　Ｅ発現ヘク
ターｐＪＨ１１、ｐＪＨ１２、及びｐＪＨ１４を示す。 第３図は、ｐＥＮＶ−１、ｐＥＮＶ−２、ｐＥＮＶ−３
、ｐＥＮＶ−４及びｐＥＮＶ−５中（７）　Ｌ　、Ａ　
Ｖ挿入物の由来を示す。 第４図は、ｐＪＨ１２及びｍｐｓＷ１９からのｐＥＮＶ
−５及びｐＥＮＶ−１の構成を示す。 第５図は、ｐＪＨ１４とｍｐｓＷ１９からのｐＥＮＶ−
２、及びｐＪＨｌｌとｍｐｓＷ１９からのｐＥＮＶ−３
の構成を示す。 第６図は、ｐＪＨ１２とｍｐｓＷ１６からのｐＥＮＶ−
４の構成を示す。 第７図は、ＥＮＶ−３のアミノ酸配列を示す。 第８図は、ｅｎｖ　ｆｉｉ域のヌクレオチド配列及びそ
の蛋白質生成物を示す。

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ＬＡＶゲノムの￥ｅｎｖ￥領域の一部分を含み、
    該一部分がＬＡＶに対する抗体と免疫学的に反応性であ
    る蛋白質をコードするところのＤＮＡ配列。
  2. （２）本質的にｐＥＮＶ−１である特許請求の範囲第１
    項記載のＤＮＡ配列。
  3. （３）本質的にｐＥＮＶ−２である特許請求の範囲第２
    項記載のＤＮＡ配列。
  4. （４）本質的にｐＥＮＶ−３である特許請求の範囲第３
    項記載のＤＮＡ配列。
  5. （５）本質的にｐＥＮＶ−４である特許請求の範囲第４
    項記載のＤＮＡ配列。
  6. （６）本質的にｐＥＮＶ−５である特許請求の範囲第５
    項記載のＤＮＡ配列。
  7. （７）ＬＡＶに対する抗体と免疫学的に反応性である蛋
    白質をコードする、ｂｐ７１７８〜ｂｐ７６９８の第８
    図の配列を含むＤＮＡ配列。
  8. （８）バクテリア宿主細胞中で複製することができる組
    換えプラスミドにおいて、該プラスミドが発現のための
    原核細胞転写及び翻訳シグナルを含むこと、ＬＡＶゲノ
    ムの￥ｅｎｖ￥領域の一部分を含み、該一部分がＬＡＶ
    に対する抗体と免疫学的に反応性である蛋白質をコード
    するところのＤＮＡ配列が読みフェーズにおいて続くこ
    とよりなる組換えプラスミド。
  9. （９）シグナルが￥ｔｒｐ￥オペロンに由来する特許請
    求の範囲第８項記載の組換えプラスミド。
  10. （１０）バクテリア宿主細胞中で複製することができる
    組換えプラスミドであって、該プラスミドが発現のため
    の原核細胞転写及び翻訳シグナルを含むこと、ＬＡＶゲ
    ノムの￥ｅｎｖ￥領域の一部分を含み、該一部分がＬＡ
    Ｖに対する抗体と免疫学的に反応性である蛋白質をコー
    ドするところのＤＮＡ配列が読みフェーズにおいて続く
    ことよりなる組換えプラスミドにより形質転換されたバ
    クテリア細胞。
  11. （１１）バクテリア細胞が大腸菌である特許請求の範囲
    第１０項記載の形質転換された細胞。
  12. （１２）バクテリア宿主細胞中で複製することができる
    組換えプラスミドであって、該プラスミドが発現のため
    の原核細胞転写及び翻訳シグナルを含むこと、ＬＡＶゲ
    ノムの￥ｅｎｖ￥領域の一部分を含み、該一部分がＬＡ
    Ｖに対する抗体と免疫学的に反応性である蛋白質をコー
    ドするところのＤＮＡ配列が読みフェーズにおいて統く
    ことよりなる組換えプラスミドをバクテリア宿主細胞中
    に導入すること、 このバクテリア宿主を適当な培養基中で増殖させること
    、及び上記配列の蛋白質生成物をバクテリア宿主から分
    離すること を含む、ＬＡＶに対する抗体と免疫学的に反応性である
    蛋白質を作る方法。
  13. （１３）蛋白質生成物の分離後に、これをゲル浸透クロ
    マトグラフィにより精製することを含む特許請求の範囲
    第１２項記載の方法。
  14. （１４）シグナルが￥ｔｒｐ￥オペロンから導かれる特
    許請求の範囲第１２項記載の方法。
  15. （１５）バクテリア宿主細胞中で複製することができる
    組換えプラスミドであって、該プラスミドが発現のため
    の原核細胞転写及び翻訳シグナルを含むこと、ＬＡＶゲ
    ノムの￥ｅｎｖ￥領域の一部分を含み、該一部分がＬＡ
    Ｖに対する抗体と免疫学的に反応性である蛋白質をコー
    ドするところのＤＮＡ配列が読みフェーズにおいて続く
    ことよりなる組換えプラスミドをバクテリア宿主細胞中
    に導入すること、 このバクテリア宿主を適当な培養基中で増殖させること
    、及び上記配列の蛋白質生成物をバクテリア宿主から分
    離すること を含む、ＬＡＶに対する抗体と免疫学的に反応性である
    蛋白質を作る方法により作られた蛋白質及び生理的に許
    容されるキャリア及び／又は希釈剤を含む医薬組成物。
  16. （１６）アジュバントを含む特許請求の範囲第１５項記
    載の医薬組成物。
  17. （１７）後天性免疫不全症候群に責任あるウィルスによ
    り起される感染に対して個体の免疫系を刺激するために
    用いられるための医薬組成物において、バクテリア宿主
    細胞中で複製することができる組換えプラスミドであっ
    て、該プラスミドが発現のための原核細胞転写及び翻訳
    シグナルを含むこと、ＬＡＶゲノムの￥ｅｎｖ￥領域の
    一部分を含み、該一部分がＬＡＶに対する抗体と免疫学
    的に反応性である蛋白質をコードするところのＤＮＡ配
    列が読みフェーズにおいて続くことよりなる組換えプラ
    スミドをバクテリア宿主細胞中に導入することこのバク
    テリア宿主を適当な培養基中で増殖させること、及び上
    記配列の蛋白質生成物をバクテリア宿主から分離するこ
    と を含む、ＬＡＶに対する抗体と免疫学的に反応性である
    蛋白質を作る方法により作られた蛋白質を含む医薬組成
    物。
  18. （１８）生物的液体中のＬＡＶに対する抗体の存在を調
    べるための評価において用いられるための、バクテリア
    宿主細胞中で複製することができる組換えプラスミドで
    あって、該プラスミドが発現のための原核細胞転写及び
    翻訳シグナルを含むこと、ＬＡＶゲノムの￥ｅｎｖ￥領
    域の一部分を含み、該一部分がＬＡＶに対する抗体と免
    疫学的に反応性である蛋白質をコードするところのＤＮ
    Ａ配列が読みフェーズにおいて続くことよりなる組換え
    プラスミドをバクテリア宿主細胞中に導入すること、こ
    のバクテリア宿主を適当な培養基中で増殖させること、
    及び上記配列の蛋白質生成物をバクテリア宿主から分離
    すること を含む、ＬＡＶに対する抗体と免疫学的に反応性である
    蛋白質を作る方法により作られた蛋白質。
  19. （１９）生物的液体中のＬＡＶ抗原の存在を調べるため
    の評価において用いられるための、 バクテリア宿主細胞中で複製することができる組換えプ
    ラスミドであって、該プラスミドが発現のための原核細
    胞転写及び翻訳シグナルを含むこと、ＬＡＶゲノムの￥
    ｅｎｖ￥領域の一部分を含み、該一部分がＬＡＶに対す
    る抗体と免疫学的に反応性である蛋白質をコードすると
    ころのＤＮＡ配列が読みフェーズにおいて続くことより
    なる組換えプラスミドをバクテリア宿主細胞中に導入す
    ること、このバクテリア宿主を適当な培養基中で増殖さ
    せること、及び上記配列の蛋白質生成物をバクテリア宿
    主から分離すること を含む、ＬＡＶに対する抗体と免疫学的に反応性である
    蛋白質を作る方法により作られた蛋白質。
  20. （２０）ＬＡＶに対する抗体を作るために用いられるた
    めの、 バクテリア宿主細胞中で複製することができる組換えプ
    ラスミドであって、該プラスミドが発現のための原核細
    胞転写及び翻訳シグナルを含むこと、ＬＡＶゲノムの￥
    ｅｎｖ￥領域の一部分を含み、該一部分がＬＡＶに対す
    る抗体と免疫学的に反応性である蛋白質をコードすると
    ころのＤＮＡ配列が読みフェーズにおいて続くことより
    なる組換えプラスミドをバクテリア宿主細胞中に導入す
    ること、このバクテリア宿主を適当な培養基中で増殖さ
    せること、及び上記配列の蛋白質生成物をバクテリア宿
    主から分離すること を含む、ＬＡＶに対する抗体と免疫学的に反応性である
    蛋白質を作る方法により作られた蛋白質。
  21. （２１）活性治療物質として用いられるための、バクテ
    リア宿主細胞中で複製することができる組換えプラスミ
    ドであって、該プラスミドが発現のための原核細胞転写
    及び翻訳シグナルを含むこと、ＬＡＶゲノムの￥ｅｎｖ
    ￥領域の一部分を含み、該一部分がＬＡＶに対する抗体
    と免疫学的に反応性である蛋白質をコードするところの
    ＤＮＡ配列が読みフェーズにおいて続くことよりなる組
    換えプラスミドをバクテリア宿主細胞中に導入すること
    、このバクテリア宿主を適当な培養基中で増殖させるこ
    と、及び上記配列の蛋白質生成物をバクテリア宿主から
    分離すること を含む、ＬＡＶに対する抗体と免疫学的に反応性である
    蛋白質を作る方法により作られた蛋白質。
  22. （２２）イソロイミンで始まり（Ｎｏ．１）、スレオニ
    ンで終る（Ｎｏ．１７３）第７図のアミノ酸配列を含み
    、かつＬＡＶに対する抗体と免疫学的に反応性であるペ
    プチド。
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