DK167158B1 - Dna-sekvens, der koder for et protein, der er immunologisk reaktivt mod antistoffer for lav, et rekombinantplasmid indeholdende dna-sekvensen, bakteriecelle med rekombinantplasmidet, fremgangsmaade til fremstilling af proteiner som er immunologisk reaktive med antistoffer for lav, samt proteinet og anvendelser af proteinet - Google Patents
Dna-sekvens, der koder for et protein, der er immunologisk reaktivt mod antistoffer for lav, et rekombinantplasmid indeholdende dna-sekvensen, bakteriecelle med rekombinantplasmidet, fremgangsmaade til fremstilling af proteiner som er immunologisk reaktive med antistoffer for lav, samt proteinet og anvendelser af proteinet Download PDFInfo
- Publication number
- DK167158B1 DK167158B1 DK157186A DK157186A DK167158B1 DK 167158 B1 DK167158 B1 DK 167158B1 DK 157186 A DK157186 A DK 157186A DK 157186 A DK157186 A DK 157186A DK 167158 B1 DK167158 B1 DK 167158B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- protein
- lav
- antibodies
- env
- penv
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 92
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 90
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims abstract description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 7
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 35
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 4
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 abstract description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 3
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 65
- 206010001513 AIDS related complex Diseases 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 12
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 230000000652 homosexual effect Effects 0.000 description 9
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 5
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000423 heterosexual effect Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 3
- 206010020460 Human T-cell lymphotropic virus type I infection Diseases 0.000 description 3
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 3
- 241000714259 Human T-lymphotropic virus 2 Species 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101000906736 Escherichia phage Mu DNA circularization protein N Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 2
- 101000764570 Streptomyces phage phiC31 Probable tape measure protein Proteins 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- -1 pi3 Proteins 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WBQJTPDOGLYTBE-VIFPVBQESA-N 1-nitroso-L-tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CN(N=O)C2=C1 WBQJTPDOGLYTBE-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000714195 Aids-associated retrovirus Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O Chemical compound CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 229940126656 GS-4224 Drugs 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 101100111302 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) BCK1 gene Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 229960003699 evans blue Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 229910052976 metal sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 206010051747 multiple endocrine neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 201000005484 prostate carcinoma in situ Diseases 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 229940126583 recombinant protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
- C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
DK 167158 B1
Den foreliggende opfindelse angår DNA-sekvens, der koder for et protein, der er immunologisk reaktivt mod antistoffer for LAV, et rekombinantplasmid indeholdende DNA-sekvensen, bakteriecelle med rekombinantplas-5 midet, fremgangsmåde til fremstilling af proteiner som er immunologisk reaktive med antistoffer for LAV, samt proteinet og anvendelser af proteinet.
Erhvervet immundefekt-syndrom (AIDS) er en cellulær immunitetdefekt, der kan overføres og er karakte-10 riseret ved oppotunistiske infektioner og visse sjældne maligne lidelser. Hovedrisikogrupperne for AIDS omfatter homoseksuelt aktive mænd, intravenøse narkomaner, recipienter for transfusioner og blodprodukter og hete-roseksuelle partnere og børn af individer fra disse 15 højrisikogrupper, hvilket antyder, at infektiøst materiale, der overføres ved intim kontakt eller via blodprodukter, er involveret.
Nye undersøgelsesresultater viser, at det infek-tiøse materiale, der er ansvarligt for overførsel af 20 sygdommen, er en hidtil ukendt lymfotrof retrovirus, der kendes som lymfadenopatia-associeret virus (LAV) (Barré Sinoussi et al., Science 220: 868 (1983)). Lignende virus er beskrevet af andre videnskabelige grupper (Popovic et al., Science 224: 497 (1984); Levy et 25 al·, Science 225: 840 (1984)) og betegnet human T-cel-le-lymfotrof virus type III (HTLV-III), AIDS-associeret retrovirus (ARV) eller immundefekt-associeret virus (IDAV). Endnu nyere data viser, at LAV, HTLV-III, ARV og IDAV deler visse vigtige egenskaber, herunder i det 30 væsentlige nucleotidhomologi (Wain-Hobson et al., Cell 40: 9 (1985); Muesing et al., Nature 313: 450 (1985): SanchezPescador et al.. Science 227: 484 (1985)), og derfor kan betragtes som isolater af den samme virus, skønt der er en sandsynlighed for, at variationer fra 35 stamme til stamme blandt de virale isolater vil forekomme. Foruden at udvise i det væsentlige nucleotidhomologi er isolaterne ens med hensyn til morfologi, cy- 2 DK 167158 B1 topatologi, krav til optimal revers transcriptaseakti-vitet og i det mindste nogle antigene egenskaber (Levy, se ovenfor; Schupbach et al., Science 224: 503 (1984)).
Som bemærket ovenfor er det kendt, at virusen 5 kan overføres gennem blodprodukter (blod, blodserum, blodplasma og fraktioner deraf), hvilket gør det vigtigt at screene blodprodukter til bestemmelse af, om donoren har været udsat for virusen. Dette kan gøres på en række forskellige måder, herunder enzymforbundet 10 immunosorbent-assay (ELISA) til påvisning af antistoffer for LAV og beslægtede virus. Individer, hvis blod indeholder antistoffer for LAV, siges at være "seropositive" . Blod fra seropositive donorer kan elimineres fra blodbeholdningerne efter påvisningen, hvilket hjæl-15 per til hindring af spredning af sygdommen.
Immunresponset hos individer udsat for LAV varierer. Antistoffer kan dannes mod ethvert af en række virale proteiner, herunder pi3, pi8, p25, p36, gp43, p55, gpllO, osv. (Schupbach et al., New Engl. J. Med.
20 312: 265 (1985)). Ikke alle individer vil danne anti stoffer for de samme proteiner eller for den samme epitop på et givet protein.
Påvisningen af seropositive individer, som den i dag praktiseres, har en række iboende problemer. Det 25 vigtigste af disse problemer er nødvendigheden af at isolere antigener fra hele virus til de immunologiske assays. Denne isolation kræver håndtering af store voluminer levende, potentielt infektiøse virus, og udgør således en væsentlig sikkerhedsrisiko. Desuden er der 30 bekymringer i forbindelse med udbyttet, renheden og reproducerbarheden af virus fra en produktion til en anden. Dette kan resultere i et uacceptabelt antal falske positiver og/eller negativer. Følgelig er der indenfor dette område et behov for alternative fremgangs-35 måder til fremstilling af virale antigener, som kan anvendes ved blodscreenings-asays og som yderligere giver 3 DK 167158 B1 andre fordele.
Desuden er der hidtil ikke fundet nogen effektiv behandling af sygdommen. Idet spredningen af AIDS begynder at nå overordentligt høje, hvis ikke epidemiske 5 hastigheder, og idet omfanget, med hvilket virusen kan overføres, stadig er tvivlsomt, er der også indenfor teknikken et behov for et farmaceutisk præparat til generel immunisering af befolkningen. Den foreliggende opfindelse opfylder dette behov og giver andre fordele.
10 Opfindelsen angår en DNA-sekvens, der er ejen dommelig ved, at den indeholder en del af LAV-genomets anv-region, især én eller flere sekvenser, der i det væsentlige omfatter pENV-1, pENV-2, pENV-3, pENV-4 eller pENV-5, hvilken del koder for et protein, som er 15 immunologisk reaktivt med antistoffer for LAV.
Desuden beskrives et rekombinantplasmid, der er i stand til at replikere i bakterieværtsceller. Plas-midet omfatter prokaryotiske transcriptions- og translationssignaler for ekspression, der i læsefasen efter-20 følges af den ovenfor beskrevne DNA-sekvens. Ved en foretrukken udførelsesform vælges signalerne blandt opéroner, såsom trp-operonet, som er inducerbart og/el-ler kan undertrykkes. Desuden beskrives bakterieceller, såsom E. coli, som er transformeret med rekombi-25 nantplasmidet beskrevet ovenfor.
Et andet aspekt af opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af proteiner, som er immunologisk reaktive med antistoffer for LAV eller T-celler, der er reaktive overfor LAV. Fremgangsmåden omfatter 30 indføjelse i en bakterieværtscelle af et rekombinantplasmid, der er i stand til at replikere i baterie-værtscellen. Plasmidet omfatter prokaryotiske transcriptions- og -translationssignaler til ekspression, efterfulgt i aflæsningsfasen af en DNA-sekvens omfat-35 tende en del af LAV-genomets env-region, hvilken del koder for et protein, som er immunologisk reaktivt med 4 DK 167158 B1 antistoffer for LAV. Efter indføjelse af plasmidet dyrkes bakterieværtscellen i et passende medium. Ekspression af proteinet induceres dernæst, og proteinproduktet af sekvensen isoleres fra bakterieværtscellerne.
5 Proteinproduktet kan renses efter isolation, f.eks. ved gelpermeationschromatografi.
Et yderligere aspekt af opfindelsen angår anvendelsen af protein, fremstillet som beskrevet ovenfor, til bestemmelse af forekomsten af anti-10 stoffer for LAV i en biologisk væske. Ved en udførelsesform omfatter fremgangsmåden inkubation af den biologiske væske med et protein fremstillet af bakterieceller transformeret med et rekombinantplasmid som beskrevet ovenfor til dannelse af en reaktionsblanding, 15 og dernæst analyse af reaktionsblandingen til bestemmelse af forekomsten af antistoffer. Ved en foretruk-ken udførelsesform omfatter trinnet til analyse af reaktionsblandingen, at reaktionsblandingen bringes i kontakt med en mærket specifik bindingspartner for an-20 tistoffet. Ved en anden udførelsesform bestemmes forekomsten af antistoffer for LAV ved udførelse af en kom-pet-itiv test mellem en prøve mistænkt for at indeholde antistof og et mærket monoklonalt antistof for binding til et immobiliseret rekombinantprotein. Reaktions- 25 blandingen analyseres derefter til bestemmelse af mængden af mærket antistof bundet til den faste fase.
Endnu et aspekt af opfindelsen angår anvendelsen af protein, fremstillet som beskrevet ovenfor til bestemmelse af forekomsten af LAV-antigen 30 i en biologisk væske, omfattende inkubation af den biologiske væske med et mærket protein fremstillet af bakterieceller transformeret med et rekombinantplasmid som beskrevet ovenfor, og enten efterfølgende eller samtidig inkubation med et antistof for proteinet, således 35 at specifik binding sker. Dernæst analyseres reaktionsblandingen dannet under inkubationen til bestemmelse af mængden af markør bundet til antistoffet.
DK 167158 B1 5
Der beskrives også anvendelsen af protein, fremstillet som beskrevet ovenfor til fremstilling af antistoffer for LAV omfattende immunisering af et dyr med et protein fremstillet af bakterieceller transformeret 5 med et rekombinantplasmid som beskrevet ovenfor.
Yderligere et aspekt af opfindelsen angår en fremgangsmåde til bestemmelse af forekomsten af antistoffer for LAV i en biologisk væske, omfattende konju-gering af latexkugler til et protein dannet af bakte-10 rieceller transformeret med et rekombinantplasmid som beskrevet ovenfor. Derefter inkuberes den biologiske væske med kugle/proteinkonjugatet til dannelse af en reaktionsblanding. Reaktionsblandingen analyseres dernæst til bestemmelse af forekomsten af antistofferne.
15 Opfindelsen angår yderligere proteiner fremstil let som beskrevet ovenfor, omfattende ENV-1, ENV-2, ENV-3, ENV-4 og ENV-5. Et foretrukket protein ifølge opfindelsen er ENV-3.
Proteinerne, fremstillet ifølge opfindelsen, 20 danner, når de anvendes med en egnet bærer eller et egnet fortyndingsmiddel, et immunologisk effektivt vaccinepræparat. Ved administrering af en immunogent effektiv mængde af et protein kodet af en DNA-sekvens omfattende en del af LAV-genomets env-region og bundet til 25 en fysiologisk acceptabel bærer til en person, kan infektion forårsaget af virusen, der er ansvarlig for AIDS, forebygges.
Andre aspekter af opfindelsen vil fremgå af den følgende detaljerede beskrivelse og af tegningerne.
30 Nedenfor følger en kort beskrivelse af tegningerne:
Fig. 1 viser fremstillingen af mpSW16 og mpSW19 ud fra XJ19, fig. 2 viser trp-E-ekspressionsvektorerne pJH 11, pJH 12 og pJH 14, indeholdende poly-35 linkersekvenserne, fig. 3 viser oprindelsen af LAV-insert'ene i pENV-l, pENV-2, pENV-3, pENV-4 og pENV-5, 6 DK 167158 B1 fig. 4 viser fremstillingen af pENV-5 og pENV-4 ud fra pJH 12 og mpSW19, fig. 5 viser fremstillingen af pENV-2 ud fra pJH 14 og mpSW19 og fremstillingen af pENV-3 5 ud fra pJH 11 og mpSW19, fig. 6 viser fremstillingen af pENV-4 ud fra pJH 12 og mpSW16, fig. 7 viser aminosyresekvensen for ENV-3, og fig. 8 viser nucleotidsekvensen af ENV-regionen 10 og dets proteinprodukt.
Inden nærmere beskrivelse af opfindelsen kan det være nyttigt for forståelsen deraf at fremsætte definitioner på visse udtryk, der anvendes i det følgende.
15 Lymfadenopatia-associeret virus (LAV):
En human T-lymfotrof retrovirus. I forbindelse med den foreliggende opfindelse betragtes en virus som værende den samme som eller ækvivalent med LAV, hvis 20 den i det væsentlige opfylder de følgende kriterier: (a) virusen er trofisk for T-lymfocytter, især T-hjælpeceller (CD4+ ifølge den international nomenklatur defineret i Bernard et al., red., Leucocytes Typing, New York: Springer Verlag (1984)); 25 (b) virusen er cytopatisk for inficerede CD4+ celler (i stedet for transformerende, som HTLV-I og -II er); (c) virusen koder for en RNA-afhængig DNA-poly-merase (revers transcriptase), som er Mg2+-afhængig 30 (optimal koncentration 5 mM, optimal pH-værdi 7,8, in-hiberes ikke af actinomycin D) og kan anvende oligo-(dT)12-18 som en Primer til revers transcription fra dens 3' LTR; (d) virusen slutter sig sammen i en saccharose-35 gradient ved en densitet på ca. 1,16; (e) virusen kan mærkes med [3H]-uridin; 7 DK 167158 B1 (f) virusen er ud fra immunologi- og nucleotid-sekvenskriterier forskellig fra medlemmer af HTLV-I/II-familien af virus (ved dette kriterie kan HTLV-III ikke betragtes som et medlem af HTLV-I/II-familien); 5 (g) virusen er i det væsentlige immunologisk krydsreaktiv med proteinerne som gag- og env-regionerne af LAV koder for; og (h) virusen deler i det væsentlige nucleotidho-mologi (78-100%) og aminosyresekvenshomologi (90-100%) 10 med LAV.
Immonologisk reaktiv:
Et antigen og et antistof siges at være "immunologisk reaktive", hvis de er i stand til at binde spe-15 cifikt med hinanden, typisk med en affinitet på mindst 106M-1, oftest mindst 108M-1.
Transformeret eller transformation: 20 Processen til stabil og vedblivende ændring af en recipientcelles eller mikroorganismes genotype ved indføring af renset DNA.
Lynfadenopatia-associeret virus (LAV) kan isoleres fra patienter med AIDS eller lymfadenopatiasyndrom.
25 Der udføres typisk biopsi på sådanne patienters lymfeknuder, og det udtagne placeres i et kulturmedium, der er tilsat de nødvendige komponenter til opretholdelse af vækst. Et mitogen, såsom interleukin-2 (IL-2) eller phytohæmaglutinin (PHA) kan være inkorporeret. Antise-30 rum for humant interferon kan også være inkorporeret.
Revers transcriptaseaktivtet fremkommer typisk på ca.
15. dagen af dyrkningen, hvilket viser tilstedeværelsen af virus, virusen kan opkoncentreres fra kultursuper-natanten ved anvendelse af en ikke-ionisk detergent, 35 efterfulgt af sammenslutning i en saccharosegradient.
Disse og andre fremgangsmåder til oprensning er vel- 8 DK 167158 B1 kendte indenfor dette fagområde og er f.eks. beskrevet i Montelaro et al., J. Virology 42: 1029 (1982).
LAV kan propageres på en vilkårlig af en række forskellige måder. Den kan dyrkes i T-lymfocytter op-5 nået ud fra navlestrengen, perifert blod eller benmarv. Alternativt kan den propargeres i dræbte T-celler eller B-celler; se f.eks. Popovic et al., Science 224: 497 (1984), og Montagnier et al., Science 225: 63 (1984). Væksten af virusen måles sædvanligvis ved forekomsten 10 af revers transeriptaseaktivitet.
En genomklon af LAV kan fremstilles ved enhver af de adskillige fremgangsmåder, der er velkendte indenfor dette fagområde, herunder, men ikke begrænset til, dem der er beskrevet af Hahn et al., Nature 312: 15 166 (1984); Alizon et al., Nature 312: 757 (1984);
Luciw et al., Na-ture 313: 760 (1984); og Muesing et al., Nature 313: 450 (1985).
Kort beskrevet isoleres DNA ved en af disse fremgangsmåder (Alizon et al.) fra LAV-inficerede T-20 celler fra en rask donor, den nedbrydes delvist med en restrik-tionsendonuclease, såsom Hind III, og det opnåede nedbrydningsprodukt fraktioneres elektroforetisk. Fragmenter, som svarer i størrelse til størrelsen af hele LAVgenomet (ca. 9,2 Kb), elueres fra gelen, bund-25 fældes, gensuspenderes og ligeres i armene af en passende restringeret vektor. Ligeringsblandingen pakkes ind i bakteriofagpartikler. Bakterier transficeres med bakteriofagen, og klonerne screenes in situ for LAV-in-serts ved anvendelse af en passende probe (såsom et 30 cDNA opnået ud fra LAV-RNA). Fra en sådan klon kan den ønskede LAV-region klones ind i en bakteriel plasmid-vektor, såsom pUC 18. Yderligere subkloning kan være ønskelig til fjernelse af uønskede sekvenser og tilføjelse af yderligere restriktionssteder (i form af en 35 poly linker) til hver ende med det formål at lette klo ning ind i en ekspressionsvektor.
9 DK 167158 B1 LAV-Sekvenserne kan dernæst subklones ind i en inducerbar ekspressionsvektor. En række ekspressions
vektorer er kendte indenfor fagområdet og omfatter Xgt 11 :Tn5 (Hall et al., Nature 311: 379 (1984); trp E
5 (Paul et al., Euro. J. Cell. Biol. 31: 171 (1983); pINIII (Masui et al., Biotechnology, Jan. 1984, s. 81).
De opnåede proteiner kan delvist renses og anvendes til en række forskellige formål, herunder som immunogener og antigener i immunoassays. Til anvendel-10 se som immunogener kan proteinerne injiceres i et dyr, såsom en mus, kanin, ged, osv., enten i pufferopløsning eller adjuvans. Alternativt kan proteinerne renses ved polyacrylamidgelelektroforese, og båndene af interesse kan udtages fra gelen, tritureres og gensuspenderes i 15 puffer til injektion i værtsdyr. Polyklonale eller mo-noklonale antistoffer kan fremstilles. Til anvendelse som antigener i immunoassays kan proteinerne anvendes på mærket eller ikke-mærket form. Hvor de mærkes, kan markørerne omfatte radioisotoper, fluorophorer, enzy-20 mer, luminescerende stoffer eller partikler. Disse og andre markører er velkendte indenfor dette fagområde og er' f.eks. beskrevet i de følgende US patentskrifter: nr. 3.766.162; 3.791.932; 3.817.837; 3.996.345 og 4.233.402.
25 Assays, ved hvilke rekombinantproteinerne ifølge den foreliggende opfindelse anvendes, kan være heterogene (dvs. kræve et separationstrin) eller homogene.
Hvis assayen er heterogen, kan en række separationsmetoder anvendes, herunder centrifugering, filtrering, 30 chromatografi eller magnetisme.
Et foretrukket assay til screening af blodprodukter eller andre fysiologiske væsker for tilstedeværelsen af antistoffer er en ELISA-assay. Typisk adsor-beres antigen (i dette tilfælde et eller en kombination 35 af rekombinantproteiner) til overfladen af en mikroti-terbrønd. Resterende proteinbindingssteder på overfla- 10 DK 167158 B1 den blokeres dernæst med et passende middel, såsom bovint serumalbumin (BSA), varmeinaktiveret normalt gede-serum (NGS) eller BLOTTO (en pufret opløsning af fedtfri tør mælk, som også indeholder et konserveringsmid-5 del, salte og et antiskumningsmiddel). Brønden inkuberes dernæst med en prøve, der mistænkes for at indeholde specifikt antistof. Prøven kan påføres rent, eller oftere kan den fortyndes, sædvanligvis i en pufferopløsning, som indeholder en lille mængde (0,1-5,0 vægt%) 10 protein, såsom BSA, NGS eller BLOTTO. Efter inkubation i et tilstrækkeligt tidsrum til muliggørelse af at specifik binding kan ske, vaskes brøndene til fjernelse af ubundet protein, hvorefter de inkuberes med et mærket, anti-humant immunoglobulin-antistof (aHulg). Markøren 15 kan vælges blandt en række forskellige enzymer, herunder peberrodsperoxidase (HRP), β-galactosidase, alkalisk phosphatase og glucoseoxidase. Man lader tilstrækkelig tid forløbe til, at specifik binding kan ske, hvorefter brønden igen vaskes til fjernelse af 20 ikke-bundet konjugat, og substratet for enzymet tilsæt tes. Farve lades udvikles, og den optiske tæthed af brøndens indhold bestemmes visuelt eller instrumentelt.
For nemheds skyld kan reagenser for ELISA-assays tilvejebringes i form af sæt. Disse sæt kan omfatte 25 mikrotiterplader, hvortil virale proteiner fremstillet ved rekombinantteknikker er preadsorberet, forskellige fortyndingsmidler og puffere, mærkede konjugater til påvisning af specifikt bundne antistoffer og andre signaludviklende reagenser, såsom enzymsubstrater, co-30 faktorer og chromogener.
På grund af det faktum, at et væsentligt antal AIDS-patienter har en høj grad af immunosuppression og gradvist tabt evnen til at danne højtiter-antistoffer, anvendes der ifølge den foreliggende opfindelse dele af 35 LAV-genomets kapselregion (env-region), hvilke dele koder for et protein, der er immunologisk reaktivt med 11 DK 167158 B1 antistoffer for LAV. Tilstedeværelsen af antistoffer for LAV's kapselglycoprotein er en bedre indikator for LAV-infektion end forekomsten af antistoffer for andre virale proteiner, idet antistoftiterne for kapselglyco-5 proteinerne formodes at vedblive med at være til stede under sygdommens senere stadier, medens mængden af antistoffer for andre proteiner, såsom kerneproteinet, kan falde til mindre end påviselige niveauer.
En anden anvendelse af rekombinantproteinerne 10 ifølge opfindelsen er som humane vacciner. Rekombinantproteinerne kan renses indgående og formuleres på hensigtsmæssig måde, almindeligvis i koncentrationer på 1 pg til 20 mg pr. kg af værten. Fysiologisk acceptable bærere, såsom sterilt vand, saltvand, pufret salt-15 vand, osv., kan anvendes. Adjuvanser, såsom aluminiumhydroxid kan også anvendes. Vaccinen kan administreres ved intravenøs, subkutan, intramuskulær eller peritoneal injektion. En injektion kan være tilstrækkelig, men oftere foretrækkes flere injektioner med ugers til må-20 neders intervaller.
Alternativt kan man fremstilles vaccinia-virus-rekombinanter, som eksprimerer regioner af LAV-genomet.
F.eks. kan de konstruerede rekombinaneter ifølge opfindelsen inføjes i et plasmid, såsom pMM34 (Mackett, et 25 al., Science 227: 433, 1985), og vaccinia-virushybrider indeholdende det opnåede kimære plasmid, fremstillet ved homolog rekombination. Immunisering med sådanne rekombinantvirusvacciner har vist sig at være effektivt til frembringelse af beskyttende immunitet i dyr over-30 for hepatitis B virus og vesikulær stomatitis-virus (Smith et al., Nature 311: 578, 1984).
Anvendelsen af en rekombinantproteinvaccine på denne måde eliminerer behovet for at fremstille vacciner ud fra inaktiverede præparater eller avirulente 35 stammer af patogene mikroorganismer.
Den genetiske organisation af LAV, 5'LTR-gag- 12 DK 167158 B1 pol-Q~env-F-3'-LTR, er enestående blandt retrovirus. X alle andre kendte retrovirus med evne til replikation, overlapper pol- og env-generne. I LAV er de adskilt af en åben læseramme Q (Wain-Hobson et al., Cell 40: 9 5 (1985).
Den åbne env-læseramme har et muligt initieringssted (methionincodon) ved den ottende triplet og forventes således at kode for et protein med en molekylvægt på 97 kd. Dette stemmer overens med den tilsy-10 neladende molekylvægt (110 kd) af LAV-glycoproteinet på denaturerende polyamidgeler. Der er 32 potentielle N-glycosyleringssteder i env-genet (Asn-x-Ser/Thr). Der er også tre hydrofobe regioner, som er karakteristiske for retrovirale kappeproteiner og svarer til et signal-15 peptid (som nucleotiderne 5815-5850 koder for), en anden region (7315-7350) og et tranmembransegment (7831-7896). Den anden region efterfølger en Arg/Lys-rig region, som formodes at repræsentere et proteolytisk reaktionssted (Wain-Hobson, se ovenfor).
20 Som bemærket ovenfor, opstår antistoffer for LAV-glycoproteinet (env-genproduktet) tidligt i virusinfektionens forløb, og de vedbliver med at forekomme også under sygdommens senere stadier (Kitchen et al., Nature 312: 367 (1984)). Antistoffer for glycoprotei-25 nerne er derfor en særligt god indikator for tidligere udsættelse for LAV, hvilket gør glycoproteinerne eller dele deraf særligt anvendelige ved blodscreeningsas-says.
En særligt foretrukket del af LAV-genomets env-30 region er ENV-3. Som vist i fig. 3 spænder ENV-3 over nucleotidsekvensen fra bp 7178 til bp 7698. Som det ses i fig. 7 er følgende underregioner inkluderet i regionen (overstreget i fig. 7): (1) et hydrofobt peptid, som bp 7315 til 7350 koder for; (2) et dodecapeptid in-35 deholdende formodede proteolytiske bearbejdningssteder for spaltning af kapselprecursorproteinet til gp 65 og 13 DK 167158 B1 gp 43; (3) en i høj grad bevaret region omkring to cy-steinrester; (4) en bevaret sekvens ved den 3'-(carb-oxy-)terminale ende; og (5) en bevaret sekvens ved den 5'-(amino-)terminale ende.
5 Data opnået ved anvendelse af syntetiske pepti der, som svarer til de forskellige underregione af ENV-3, viser, at de vigtigste regioner er dem, der omgiver eller ligger nærved cysteinresterne, og dem der omgiver eller ligger nærved den proteolytiske bearbejd-10 ningsregion. Syntesen og screeningen af visse af disse peptider er beskrevet i den samtidigt verserende US patentansøgning serie-nr. 728.052, indleveret den 29. april 1985 af Cosand og inkorporeret heri ved henvisning.
15 Desuden er ENV-3 næsten helt frit for potentiel le glycosyleringssteder, hvorfor den antigene virkning af rekombinantproteinet med rimelighed kan forventes at have lighed med den antigene virkning af det naturlige protein. Hele sekvensen af env-genet og dets genpro-20 dukt er vist i fig. 8, hvori de potentielle glycosyleringssteder er overstreget. I fig. 8 kan det ses, at en‘stor strækning af ENV-3 er fri for sådanne steder, og at ENV-3 i sammenligning med resten af genet i helhed er påfaldende underglycosyleret.
25 I det følgende eksempel blev en LAV-genomklon, betegnet XJ19, subklonet ind i den bakterielle plasmid-vektor, pUC18. Den resulterende underklon, betegnet pBT-l (tildelt ATCC accessionsnummer 53069), yderligere subklonet til opnåelse af pRS-3, som hovedsagelig inde-30 holdt env-, F- og LTR-regionsekvenser. env-Sekvensen og en del af F-sekvensen blev yderligere subklonet ind i M13mpl8, og regionerne af env-sekvensen blev først ind i den trp-E-inducerbare ekspressionsvektor. env-DNA'et blev indføjet i rammen nedstrøms for trp E-ge-35 net, hvilket resulterende i ekspressionen af et trp E-envfusionsprotein, når E. coli blev transformeret med 14 DK 167158 B1 dette produkt. De opnåede proteiner blev delvist renset og karakteriseret ved deres reaktivitet i ELISA med sera fra individer, som man vidste var henholdsvis seropositive og seronegative. Fem nyttige produkter, be-5 tegnet pENV-1 til pENV-5, blev identificeret.
Det følgende eksempel gives til nærmere belysning af opfindelsen og på ingen måde til begrænsning deraf.
10 Eksempel A. Fremstilling af trp-env-ekspressionsvektorer
Enhver af en række forskellige bakterielle ekspressionssystemer kan anvendes til eksprimering af 15 fremmede proteiner. trp E-systemet valgtes til ekspression af LAV-env-sekvenser, idet det indeholder en stærk, inducerbar promotor, men dets ekspression kan også undertrykkes, således at fremmede (og potentielt toksiske) proteiner ikke akkumuleres i bakterien i lang 20 tid.
Idet der ikke findes nogen hurtig og bekvem måde at' screene og udvælge bakterier transformeret med en vektor indeholdende et fremmed insert (i modsætning til bakterier transformeret med vektoren alene), er det 25 hensigtsmæssigt at subklone den ønskede region af et stort DNA-stykke (såsom Xfag-DNA) ind i en vektor indeholdende et selektionssystem for inserts, inden det overføres til trp E-ekspressionsvektoren. Dette letter screeningen af transformerede bakterier for dem, der 30 indeholder det ønskede insert.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen var derfor først at subklone det meste af LAV-genomets env-region ind i en transfervektor, M13mpl8 (fig. 1), i to trin. Derefter blev forskellige fragmenter af denne subklon 35 ligeret ind i hver af tre trp-ekspressionsvektorer (pJHll, pJH12, pJH14), som kun adskilte sig fra hinan- 15 DK 167158 B1 den ved aflæsningsrammen for restriktionsstederne i po-lylinkerregionen (se fig. 2). Nogle af de opnåede sub-kloner (f.eks. pENV-5 og pENV-4) anvendtes som sådanne, men andre krævede yderligere modifikationer (pENV-1, 5 pENV-2 og pENV-3) til opnåelse af det ønskede produkt.
1. Subkloning af LAV-qenomet a. Fremstilling af fag-DNA.
10 Hele LAV-genomet blev tilvejebragt fra Pasteur
Instituttet i form af Xfag-partikler indeholdende et 9,2 Kb genomet DNA-insert i Hind Ill-stedet af fagen XL47.1. Denne klon betegnes XJ19 og er beskrevet i Wain-Hobson et al., Cell 40: 9 (1985). XJ19 fagpartik-15 ler blev ført ind i Q359-stammen af E. coli K-12 (genotypen af Q359 er hsdRK-, hsdMk+, supF, φ80, P2) ved fremgangsmåden ifølge Maniatis et al., Moleculat Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, s. 64. En enkelt plaque blev 20 opsamlet, og fagen forøget ved pladelysatmetoden (Maniatis, se ovenfor, s. 65). Efter en ni timers in kubation ved 37°C blev pladerne (100 mm i diameter) indeholdende sammenløbende plaques overhældt med 5 ml af 100 mM NaCl/20 mM MgS04/50 mM Tris, pH 7,5. Efter in-25 kubation i 12 timer ved 4°C blev væsken opsamlet og ekstraheret to gange med et ligeså stort volumen chloroform.
Til 10 ml af den opnåede vandige fase indeholdende fagpartiklerne sattes 2 ml 0,25 M EDTA/2,5% SDS/ 30 0,5 M Tris, pH 9, og suspensionen blev inkuberet ved 70°C i 15 minutter til nedbrydning af fagen. 2,5 ml 8 M kaliumacetat blev tilsat, og opløsningen blev inkuberet på is i 15 minutter og dernæst centrifugeret i 10 minutter ved 12.000 x g og 4°C til dannelse af pellet-35 ter af proteinet. Supernatanten blev overført til et 50 ml polypropylencentrifugerør og ekstraheret med et 16 DK 167158 B1 ligeså stort volumen phenol (pH 8, ækvilibreret med 1 M Tris, pH 8) ved 20°C. Den vandige fase blev dernæst ekstraheret med et ligeså stort volumen chloroform:iso-amylalkohol (24:1) ved 20°C. Til den vandige fase sat-5 tes dernæst 2,5 voluminer 95% ethanol til bundfælding af DNA'et. Efter centrifugering blev DNA-pelletten tørret og gensuspenderet i 10 mM Tris-HCl, pH 7,4/1 mM EDTA.
10 b. Subkloning af env-regionen
Ca. 12 yg XJ19-DNA fremstillet i A.l.a ovenfor blev nedbrudt fuldstændig med restriktionsensymet Sst I (Bethesda Research Labs. Bethesda, MD), som kun klipper 15 i LTR-regionerne af dette isolat af LAV. Blandingen af nedbrydningsprodukterne blev udsat for elektroforese ved 1 V/cm gennem 0,9% agarose i 0,089 M Tris-borat/ 0,089 M borsyre/1 mM EDTA. Positionen af 9,1 Kb-frag-mentet blev bestemt i forhold til molekylvægtsstandar-20 der efter farvning med ethidiumbromid. Båndet blev elektroelueret ind i NA45-papir (Schleicher og Schuell), Keene, NH). DNA'et blev udvundet fra papiret efter instruktionerne givet af producenten.
9,1 Kb Sst I-fragmentet blev ligeret ind i den 25 Sst-I-nedbrudte vektor pUC18 i et forhold på 10 insert molekyler: 1 vektormolekyle. EL coli stamme HB101 blev transformeret med ligeringsblandingen ved CaCl2-metoden ifølge Maniatis et al. (se ovenfor) og udspredt på LB-plus ampicillin (20 yg/ml) agarplader.
30 Enkeltkolonier blev opsamlet og fortyndet i 3 ml LB plus ampicillin-medium og dyrket natten over ved 37°C under konstant omrystning. Plasmid-DNA blev fremstillet ved den alkaliske lysemetode (Maniatis et al., se ovenfor, side 368). Der blev opsamlet en koloni, 35 som indeholdt 9,1 Kb Sst 1-insertet i en orientering, således at Eco Ri-stedet i polylinkeren var nærmest 17 DK 167158 B1 5'-enden af LAV-genomet, som bestemt ved restriktionsanalyse af plasmid-DNA'et. Denne subklon blev betegnet pBT-l (ATCC accessionsnummer 53069) (fig. 1).
Plasmidet pBT-l blev dernæst nedbrudt med Eco 5 RI, og vektoren, der stadig indeholdt 3' enden af LAV-genomet, blev religeret. Dette tjente til fjernelse af 5'Eco Ri-fragmenterne fra plasmidet. HB10l-cel-ler blev transformeret med ligeringsblandingen, og en koloni indeholdende insertet, pRS-3, blev identifice-10 ret ved restriktionsanalyse af det oprensede plasmid-DNA.
Sekvensen mellem Κρη I stederne ved bp 5889 og bp 8572 [nummerering efter Wain-Hobson et al., Cell 40: 9 (1985)], indeholdende det meste af env-regionen, blev 15 dernæst overført fra pRS-3 til M13mpl8-vektoren, Dette blev gjort til yderligere fjernelse af uvedkommende sekvenser (ikke-env-sekvenser) og desuden til at placere env-sekvenserne i en vektor, som udnytter β-galactosi-dase i stedet for ampicillin som markøren, der kan ud-20 vælges/screenes. Dette var fordelagtigt, idet trp E- ekspressionsvektoren anvender ampicillinresistens som dens markør, der kan udvælges. Overførsel af insert fra en vektor (pUC 18), der koder for ampicillinresi-stensfaktoren til en anden (trp-ekspressionsvektorer 25 pJH 11, 12 og 14) ville gøre screening for det ønskede insert og vektor vanskeligere. M13-fag blev screenet ved anvendelse af det chromogene stof 5-brom-4-chlor-3-indolyl-pgalactosid (Sigma Chemical Co.) til bedømmelse af inaktivering af β-galactosidase på grund af indfø-30 jelse af env-sekvensen. Disse fagholdige inserts blev screenet for orienteringen af insertet i forhold til restriktionsstederne i polylinkerregionen. DNA blev isoleret fra rekombinanter (mpSW16 og mpSW19) for hver orientering (fig. 1).
35 18 DK 167158 B1 2. Indføjelse af env-sekvensen i trp-vektorer
Ekspressionsvektorerne indeholdt coli trp- operon-promotoren, operator og trp E-gen indføjet i 5 pBR322 (fig. 2). trp E-genet var afskåret ved dets 5'-most Bgl II steder ved indføjelse af en polylinker-sekvens (Konopka et al., Jj_ Virol 51: 223 (1984)). De forskellige trp-vektorer (pJH 11, pJH 12 og pJH 14) adskilte sig fra hinanden ved restriktionsstedernes læse-10 ramme i polylinkerregionen. Indføjelse af en åben læseramme i vedkommende vektor resulterer i dannelse af et fusionsprotein med trp E-sekvenser ved den aminoter-minale ende (Spindler et al., Virol 49: 132 (1984)).
Man valgte fem overlappende LAV-eng-regioner til 15 ekspression (fig. 3). Valget var bestemt af grænsen på insertstørrelsen i disse vektorer (Konopka et al., J.
Virol 51: 223 (1984)) og af placeringen af hydrofobe sekvenser, som kan være skadelige for ekspression.
pENV-5 (ATCC accessionsnummer 53074) blev frem-20 stillet ved ligering af env-regionen, der går fra mpSW19' s Barn Hl-sted i polylinkerregionen til env Hind III-stedet (bp nr. 7698), til pJH 12 restringeret med Barn Hl og Hind III (New England Biolabs) (fig. 4). Li-gater blev transformeret ind i coli HB101, der havde 25 været udsat for CaCl2-chok, og bakterierne blev podet på plader i tilstedeværelse af ampicillin (Sigma) i en mængde på 100 pg/ml og tryptophan (Sigma) i en mængde på 20 pg/ml. Tryptophanet blev tilsat til undertrykkelse af ekspression af det fremmede protein, hvis ak-30 kumulering kunne være skadeligt for bakterierne. Ampi-cillinresistente kolonier blev screenet ved hjælp af minilysater for tilstedeværelsen af rekombinantplasmi-der, indeholdende env-fragmentet.
pENV-l (ATCC accessionsnummer 53070) opnåedes ud 35 fra pENV-5 ved udeladelse af sekvensen mellem to Bgl
Il-steder (bp 6598 og bp 7178) (fig. 4). Denne udela- 19 DK 167158 B1 delse formindskede størrelsen af den åbne læseramme ved indførelse af et stopcodon kort efter Bgl Il-stedet.
pENV-2 (ATCC accessionsnummer 53071) blev fremstillet ved indføjelse af fragmentet mellem to Bgl II-5 steder (bp 6598 og bp 7178) i pJH 14 restringeret med Bam Hl (fig. 5) (Bgl II og Barn Hl overlap er kompatib-le). coli HB101 blev transformeret med ligerings produkterne og de ampicillinresistente kolonier blev screenet ved restriktionsanalyse for tilstedeværelsen 10 og orienteringen af env-inserts i pJH 14.
pENV-3 (ATCC accessionsnummer 53072) krævede ligering af env-regionen mellem mpSW19's Barn Hl-sted (i polylinkeren) og Hind III-sted (bp 7698) til pJH 11 restringeret med Barn Hl og Hind III (fig. 5). coli 15 HB101 blev transformeret med ligeringsproduktet, og am picillinresistente kolonier blev screenet ved hjælp af minilysater. DNA fra en passende koloni blev isoleret, spaltet med Barn Hl og Bgl II (New England Biolabs) og religeret. Dette DNA blev anvendt til transformation 20 af coli HB101. Den opnåede ampicillinresistente bakterie blev screenet ved restriktionsanalyse for re-kombinantplasmider, hvori fragmentet fra Barn Hl til Bgl II var udeladt (fig. 5). Udeladelse af dette fragment bragte env-sekvenserne mellem Bgl Il-stedet (bp 7178) 25 og Hind III-stedet (bp 7698) ind i den korrekte læseramme.
pENV-4 (ATCC accessionsnummer 53073) blev fremstillet ved ligering af Hind III-fragmentet fra mpSW16 ind i pJH 12, som var behandlet med Hind III og inte-30 stinal, alkalisk phosphatase fra kalve (Boehringer Mannheim) (fig. 6). Rekombinantplasmider blev identificeret ved transformation af EL_ coli HB101 med ligat-blandingen og dernæst screening ved restriktionsanalyse af minilysater.
35 20 DK 167158 B1 B. Proteinekspression 1. Transformation af E. coli med trp-env-plasmiderne
Hver af rekombinant trp-env-ekspressionsplasmi-5 derne blev overført fra E^_ coli HB101 til E-coli C600, idet den sidstnævnte er en potentielt bedre vært for proteindannelse. Overførslen omfattede transformation af C600 udsat for CaCl2-chok med superfoldet DNA fra minilysater af HB101. Bakterierne blev podet på plader 10 i tilstedeværelse af ampicillin og tryptophan som beskrevet (Konopka et al., Virol♦ 51: 223 (1984)).
Medikamentresistente kolonier blev screenet ved hjælp af minilysater til bekræftelse af forekomsten af det rette plasmid.
15 2. Ekspression af trp-env-proteiner
Dyrking og induktion af E_^ coli C600 transformeret med trp-ekspressionsvektorerne var, som beskrevet, 20 (Spindler et al., Virol. 49: 132 (1984); Konopka et al., Virol. 51: 223 (1984)). Kort beskrevet blev minimalt medium indeholdende 20 yg/ml tryptophan og 100 yg/ml ampicillin inoculeret med transformerede bakterier fra glycerolstamkulturer. Kulturerne blev dyrket 25 under luftning ved 37°C natten over. Kulturerne, der havde stået natten over, blev dernæst inoculeret i forhold på 1:100 i frisk minimalmedium indeholdende 100 yg/ml ampicillin men ingen tryptophan. Disse kulturer blev dyrket under luftning i 2-3 timer (indtil den tid-30 lige logfase) ved 37°C. Induceren, 3-8-indolacrylsyre (Sigma) tilsattes til en slutkoncentration på 20 yg/ml fra frisk fremstillede stamopløsninger med en koncentration på 20 yg/ml i 95%'s ethanol.
Inducerede kulturer blev dyrket ved 37°C under 35 luftning i 4-5 timer og dernæst bragt på pelletform og eventuelt frosset. Proteinudbytter fra pENV-l, pENV-2 21 DK 167158 B1 og pENV-3 var typisk melløm 10-30 mg/liter, medens udbytterne fra pENV-4 og pENV-5 typisk var mindre end 1 mg/liter.
5 C. Isolation og rensning af trp-env-proteinerne
Fusionsproteiner blev delvist oprenset fra cel-lepelletter som beskrevet (Konopka et al., Virol.
51: 223 (1984)). Kort beskrevet blev bakterier resu-10 spenderet i 100 ml 50 mM Tris, pH 7,5/0,5 mM EDTA/150 mM NaCl (TNE) pr. liter induceret kultur. Lysozym (Sigma) blev tilsat til en slutkoncentration på l mg/ ml. Efter 15 minutter ved 0°C tilsattes NP40 til blandingen til en slutkoncentration på 0,2% i 10 minutter 15 ved 0°C. 1-2 mg DNase (Sigma) tilsattes dernæst med 150 ml DNase-puffer (150 mM NaCl/12 mM MgCl2)· Reaktionsblandingerne blev inkuberet i en time ved 0°C under hyppig omrøring. Uopløselige proteiner blev dernæst bragt på pelletform ved centrifugering i 15 minutter 20 ved 8000 x g og 0°C. Pelletterne blev vasket to gange i TNE og derefter analyseret for tilstedeværelsen af uopløselige proteiner ved denatureringspolyacrylamid-gelelektroforese. Proteiner blev visualiseret ved farvning med Coomassie Brilliant blå R.
25 Pelletten indeholdende det uopløselige materiale fra 1 liter bakterier blev opløseliggjort i 6 ml af 6 M guanidiniumchlorid/0,1 M Tris-HCl, pH 7,8. Til denne opløsning sattes ca. 60 mg fast dithiothreitol (DTT), og man lod reduktionen forløbe i 30 minutter ved 37°C.
30 Det opløseliggjorte reducerede protein blev ud sat for gelpermeationschromatografi på en 9,4 mm x 25 cm GF-250 Zorbax-kolonne (Du Pont, Wilmington, DE). En delmængde på 100 μΐ af proteinopløsningen blev indført i kolonnen og elueret med 6 M guanidiniumchlorid med en 35 strømningshastighed på 0,5 ml/min. Den optiske tæthed ved 280 mm blev målt, og fraktioner blev opsamlet med 22 DK 167158 B1 30 sekunders intervaller. Fraktion nr. 32, dvs. fraktionen elueret mellem 7,75 og 8,00 ml, blev anvendt til de følgende assays. Note: Inkorporering af DTT vil resultere i dannelse af uopløselige metalsulfider, når 5 dårligere kvaliteter af guanidiumchlorid anvendes.
trp-env-Pusionsproteinerne er også blevet oprenset som følger:
Fusionsproteinerne blev delvist oprenset fra cellepelletter som en uopløselig pellet (som beskrevet 10 ovenfor). Pelleten indeholdende det uopløselige materiale fra 4 liter bakteriekultur blev opløseliggj ort i 4 ml af 6 M guanidiumchlorid/0,1 M Tris-HCl, pH 7,8.
Til denne opløsning sattes ca. 100 mg fast dithiothrei-tol (DTT), man lod reduktionen forløbe i en time ved 15 37 °C.
Det opløseliggjorte, reducerede protein blev udsat for gelpermeationschromatografi på en 2,6 x 87 cm kolonne af Fractogel TSK. HW-50(S) (MCB Manufacturing Chemists, Gibbsown, NJ). De 4 ml af den reducerede 20 proteinopløsning blev pumpet til kolonnen og elueret med 2 x lo-4 M DTT/2 x 10-3 ethylendiamintetraeddike-syre (EDTA)/6 M guanidiniumchlorid (American Research Products Co., South Euclid, OH). Kolonnen blev drevet ved en strømningshastighed på 0,5 ml/min., den optiske 25 tæthed ved 280 nm blev målt, og fraktioner opsamledes med 10 minutters intervaller. Fraktionerne nr. 34 og 35, de to fraktioner fra midten af UV-absorptionstoppen, blev anvendt i de følgende assays.
30 D. Immunologisk reaktivitet af trp-env-proteiner 1. Analyse ved Western blots
Delmængder af de uopløselige proteinpræparater eksprimeret af pENV-1, pENV-2, pENV-3, pENV-4 og pENV-5 35 blev opløseliggort i 2%'s natriumdodecylsulfat/100 mM Tris, pH 6,8/20% glycerol/1,5 M β-mercaptoethanol og 23 DK 167158 B1 udsat for elektroforese på denaturerende polyacrylamid-geler. Proteinerne blev elektrooverført til nitrocellulose (BA85, Schleicher og Schuell, Keene, NH) og filtrene blokeret med 5%'s bovint serumalbumin (Sigma).
5 Filtrene blev dernæst sonderet med EL coli-adsorberet humant sera opsamlet fra AlDS-patienter. Filtrene blev fremkaldt med HRP-konjugeret gede-aHulg. De samlede blodsera reagerede med alle fem trp-env-fusionsproteiner, men- ikke med trp E-protein alene.
10
2. Analyse ved ELISA
Uopløselige proteinpræparater af pENV-1, pENV-2, pENV-3, pENV-5 og trp E blev opløseliggjort i 3 M gua-15 nidiniumchlorid. Uopløseligt materiale blev fjernet ved centrifugering ved 15.000 x g i 5 minutter. Koncentrationerne af opløseliggjorte proteiner blev bestemt ved fremgangsmåden ifølge Bradford (Analytical Biochemistry 72: 248 (1976)). Proteinerne blev fortyn-20 det i 0,05 M carbonat/hydrogencarbonatpuffer (pH 9,6) til en slutkoncentration på 1-2 yg/ml. Delmængder af 50"μΐ blev fyldt i hver mikrotiterbrønd og inkuberet ved 4°C natten over. Pladerne blev dernæst blokeret med BLOTTO (5 vægt/vol% fedtfri tørmælk/0,01%, thime-25 rosol/0,01%, antiskummiddel A i 0,01 M natriumphosphat, pH 7 ,2/0,15 M natriumchlorid) i 1 time ved 37°C. Sammenhældte seropositive sera, sera fra homoseksuelle mænd eller LASpatienter og sera fra raske heteroseksu-elle blev fortyndet i forholdet 1:100 med en 1:1 blan-30 ding af BLOTTO og PBS (0,01 M natriumphosphat, pH 7,3/0,15 M NaCl), og 50 μΐ fortyndet serum tilsattes pr. brønd i 1 time ved 37 °C. Serummet blev fjernet, og pladerne blev vasket tre gange i vaskepuffer (0,15 M NaCl/0,05 væg/vol% Tween 20) inden tilsætning af 100 μΐ 35 gede-antihumant IgG/peberrodsperoxidasekonjugat (fortyndet 1:10.000 i 50 mM NaCitrat/0,05% Tween 20/1% var- r 24 DK 167158 B1 meinaktiveret normalt gedeserum, opnået fra Antibodies,
Ind,m Davis, CA) i 1 time ved 37°C. Kongugatet blev fjernet, og pladerne vasket tre gange med 0,15 M NaCl/0,05 væg/vol% Tween 20. ELISATesten blev frem-5 kaldt ved tilsætning af 100 μΐ/brønd substratopløsning (10 mg o-phenylendiamin i 50 ml 0,05 M natriumcitrat, pH 7,0) i 30 minutter ved stuetemperatur. Reaktionen blev standset med 100 μΐ/brønd af 3N H2S04, og den optiske tæthed ved 490 nm blev bestemt ved hjælp af et 10 automatiseret ELISA-aflæsningsapparat. Proteinerne fremstillet af pENV-1, pENV-2, pENV-3 og pENV-5 fandtes alle at reagere med sera, som man vidste var seropositive.
Yderligere screening af proteiner eksprimeret af 15 pENV-1, pENV-3 og pENV-5 udførtes ved anvendelse af materialet fra de guanidiumchlorid-opløseliggjorte pel-letter beskrevet ovenfor (det pENV-l eksprimerede protein blev renset yderligere ved gelpermeationschromato-grafi som beskrevet ovenfor) overfor en række på 31 hu-20 mane serumprøver. Den række omfattede otte sera fra raske heteroseksuelle (defineret som negative ved en helvirus-ELISA), to samlinger af serum fra AIDS-patien-ter og 21 sera fra individer med diagnostiseret LAS (lymfadenopatia-syndrom). Sera fra LAS-individer blev 25 bestemt som seropositive ved en helvirus-ELISA. Tolv blev yderligere bestemt ved Western blot-analyse. Resultaterne er vist i Tabel l. Disse resultater viser, at sera fra AIDS- eller LAS-patienter var mere reaktivt med proteiner, som pENV-l, pENV-3 og pENV-5 koder for, 30 end sera fra normale personer. Denne fremstilling viser, at trp-env-fusionsproteiner kan anvendes til screening for tilstedeværelsen af sera, der reagerer med det AIDS-forårsagende virus, LAV.
35 25 DK 167158 B1
Tabel 1
Sammenligning af ENV1, ENV3 og ENV5 med et hel-virus-lysat ved en Elisa-assay til påvisning af antistoffer
for LAV. ELISA
5 Serum Diagnose Hel- ENV1 ENV3 ENV5 Bestemt nr. virus- som sero- _lysat1_positiv^ 501 Positiv 1,109 1,744 0,744 1,685 ja kontrol (sammenhældte 10 sera) Y-l Positiv 2,000 1,564 0,854 1,499 n.d.4 CDC kontrol (sammenhældte sera) 120 LAS3 og/ 1,540 1,650 1,086 1,371 ja 15 eller homosek suel 121 LAS og/ 1,483 2,207 1,083 1,233 ja eller homosek suel 20 122 LAS og/ 1,283 1,318 0,752 1,465 ja eller homoseksuel 124 LAS og/ 1,189 2,068 1,158 1,316 ja eller homosek-25 suel 125 LAS og/ 1,232 2,233 1,255 1,802 ja eller homosek suel 126 LAS og/ 1,233 0,878 0,689 0,816 ja eller 30 homosek suel 127 LAS og/ 1,046 1,398 0,899 1,495 ja eller homosek suel 128 LAS og/ 1,284 1,542 0,746 1,189 ja 35 eller homosek suel 26 DK 167158 B1
Tabel 1 (fortsat)
Sammenligning af ENV1, ENV3 og ENV5 med et hel-virus-lysat ved en Elisa-assay til påvisning af antistoffer for LAV.
5 Serum Diagnose Hel- ENV1 ENV3 ENV5 Bestemt nr. virus- som sero- _lysat1_ positiv2 129 LAS og/ 1,081 0,719 0,484 0,944 ja eller homoseksuel 10 130 LAS og/ 0,912 1,541 1,000 1,547 ja eller homoseksuel 131 LAS og/ 1,220 1,208 0,794 1,120 ja eller homosek-15 suel 132 LAS og/ 1,237 1,245 0,735 1,127 ja eller homosek suel 133 LAS og/ 1,250 1,513 0,881 1,472 ja eller 20 homosek suel 134 LAS og/ 1,050 1,684 0,800 1,660 ja eller homosek suel 135 LAS og/ 1,310 0,705 0,516 1,005 ja 25 eller homosek suel 138 LAS og/ 1,302 0,710 0,730 0,934 ja eller homoseksuel 30 153 LAS og/ 2,000 1,444 0,830 1,369 ja eller homoseksuel 154 LAS og/ 1,41 0,815 0,662 0,959 ja eller homosek-35 suel 27 DK 167158 B1
Tabel 1 (fortsat)
Sammenligning af ENV1, ENV3 og ENV5 med et hel-virus-lysat ved en Elisa-assay til påvisning af antistoffer for LAV.
5 Serum Diagnose Hel- ENV1 ENV3 ENV5 Bestemt nr. virus- som sero- _lysat1_positiv2 155 LAS og/ 1,069 1,824 1,199 1,644 ja eller homosek- 10 suel 157 LAS og/ 1,349 1,679 1,098 1,433 ja eller homoseksuel 666 ukendt 2,000 1,737 1,172 1,683 ja 15 633 Rask hete- 0,222 0,089 0,113 0,135 ikke roseksuel sero- positiv 637 Rask hete- 0,097 0,067 0,065 0,183 ikke roseksuel sero- positiv 639 Rask hetero- 20 seksuel 0,123 0,073 0,045 0,186 ikke sero- positiv 641 Rask hete- 0,199 0,100 0,075 0,236 ikke roseksuel sero- positiv 667 Rask hete- 0,095 0,208 0,H3 0,450 n.d.
25 roséksuel 1890 Rask hete- n.d. 0,093 0,082 0,311 n.d.
seksuel 1891 Rask heteT n.d. 0,164 0,086 0,411 n.d.
ro'seksuel 1892 Rask hete- n.d. 0,055 0,045 0,169 n.d.
30 roseksuel 28 DK 167158 B1 1 Viruslysatet blev fremstillet ved bundfældning af supernatanten af inficerede cellekulturer med 10%'s polyethylenglycol (PEG 6000), og dernæst sammenslutning to gange til ligevægt i en 20-60%'s saccharosegradient.
5 De forenede virus med en densitet på 1,16 blev fjernet, og viralte partikler blev yderligere koncentreret ved ultracentrifugering og derefter lyseret i RIPA-puffer (beskrevet i fodnote 2) indeholdende 0,5% natriumdode-cylsulfat, og til sidst anbragt i brønde af mikrotiter-10 testplader.
2 Radiomærkede LAV-antigener blev opløst i RIPA-puffer (Gilead et al., Nature 264: 263 (1976)) og derefter omsat med humant serum. De opnåede immunkomplekser blev skilt fra ved binding til en Staphylococ- 15 cus aureus adsorbent (Kessler, J. Immunology 115: 1617 (1975)), efterfulgt af flere vaskninger. Immunudfæl-dede antigener blev analyseret ved SDS-polyacrylamid-gelelektroforese (Laemmli, Nature 227: 680, (1970)), efterfulgt af fluorografi. Forekomsten af enten et p25 20 eller gp43 bånd blev undersøgt nødvendigt og tilstrækkeligt til bekræftelse af om en prøve var seropositiv.
3 LAS « lymfadenopatia-syndrom.
4 n.d. = ikke udført.
25 3. Fluororescens-objektglastest til påvirning af se rumantistof for LAV.
Opløselige proteiner fremstillet som beskrevet i det foregående konjugeres til latexkugler, og protein/ 30 kuglepræparatet ethanolfikseres på mikroskopobjektglas.
En delmængde af serum fra en patient inkuberes med pro-tein/kuglerne på et objektglas. Objektglassene vaskes, og FITC-mærket anti-humant immunoglobulin i Evans blå modfarve tilsættes. Objektglassene vaskes, og fikser-35 medium og dækglas anbringes på hver.
Alternativt placeres protein/kuglepræparatet i 29 DK 167158 B1 testrøret til inkubation med serum fra patienter. Rørene centrifugeres og vaskes, og FITC-mærket anti-hu-mant immunoglobulin i Evand blå modfarve tilsættes. Rørene centrifugeres, og supernatanten suges fra. En 5 delmængde af kuglerne placeres på et mikroskopobjekt-glas og fikseres med ethanol, og dækglas anbringes.
Alle objektglassene undersøges ved fluorescensmikroskopi. Hvis testserummet er antistofpositivt, ses kuglerne som fluorescerende grønne sphærer, hvis test-10 serummet er antistofnegativ ses kuglerne som røde sphærer.
Claims (16)
1. DNA-Sekvens, kendetegnet ved, at den indeholder en del af LAV-genomets env-region, især én eller flere sekvenser, der i det væsentlige omfatter 5 pENV-l, pENV-2, pENV-3, pENV-4 eller pENV-5, hvilken del koder for et protein, som er immunologisk reaktivt med antistoffer for LAV.
2. DNA-Sekvens ifølge krav l, kendetegne t ved, at den koder for ENV-3.
3. Rekombinantplasmid, der er i stand til at replikere i bakterieværtsceller, kendetegnet ved, at det omfatter prokaryotiske transcriptions- og translationssignaler for ekspression, efterfulgt i læ-sefasen af en DNA-sekvens ifølge krav 1 eller 2, hvil-15 ken sekvens koder for et protein, der er immunologisk reaktivt med antistoffer for LAV.
4. Rekombinantplasmid ifølge krav 3, k endete g n e t ved, at signalerne opnås fra trp-operonet.
5. Bakteriecelle, kendetegnet ved, 20 at den er transformeret med et rekombinantplasmid ifølge krav 3 eller 4.
6. Transformeret celle ifølge krav 5, kendetegnet ved, at bakteriecellen er E^ coli.
7. Fremgangsmåde til fremstilling af proteiner, 25 som er immunologisk reaktive med antistoffer for LAV, kendetegnet ved, at den omfatter, at man: i en bakterieværtscelle indfører et rekombinantplasmid ifølge krav 3 eller 4. dyrker denne bakterieværtscelle i et passende 30 medium, og isolerer proteinproduktet af denne sekvens fra bakterieværtscellen.
8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den omfatter at man efter isola- 35 tion af proteinproduktet renser det ved gelpermeations-chromatografi. 31 DK 167158 B1
9. Anvendelse af protein, fremstillet ifølge krav 7 eller 8 ved en assay til bestemmelse af forekomsten af antistoffer for LAV i en biologisk væske.
10. Anvendelse ifølge krav 9, kendeteg- 5 net ved, at et protein fremstillet ifølge krav 7 eller 8 bringes i kontakt med den biologiske væske, og den specifikke binding mellem proteinet og antistoffet for LAV detekteres.
11. Anvendelse af protein, fremstillet ifølge 10 krav 7 eller 8 ved en assay til bestemmelse af forekomsten af LAV-antigen i en biologisk væske.
12. Anvendelse ifølge krav 11, kendetegnet ved, at den biologiske væske blandes med proteiner fremstillet ifølge krav 7 eller 8, til dannelse af en 15 blanding, hvori proteinerne er mærkede, hvilken blanding bringes i kontakt med antistoffer som reagerer med et protein fremstillet ifølge krav 7 eller 8, og den specifikke binding mellem de mærkede proteiner og antistofferne detektes, og forekomsten af LAV-antigen bestemmes på 20 baggrund heraf.
13. Anvendelse af protein, fremstillet ifølge krav 7 eller 8 ved fremstilling af antistoffer for LAV.
14. Anvendelse ifølge krav 13, kendetegnet ved, at et dyr immuniseres med et protein frem- 25 stillet ifølge krav 7 eller 8.
15. Protein, fremstillet ifølge krav 7 eller 8, kendetegnet ved, at det omfatter ENV-1, ENV-2, ENV-3, ENV-4 eller ENV-5.
16. Protein, fremstillet ifølge krav 7 eller 8, 30 kendetegnet ved, at det omfatter ENV-3. 35
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US72123785A | 1985-04-08 | 1985-04-08 | |
| US72123785 | 1985-04-08 | ||
| US72805285A | 1985-04-29 | 1985-04-29 | |
| US72805285 | 1985-04-29 | ||
| US75376985A | 1985-07-10 | 1985-07-10 | |
| US75376985 | 1985-07-10 | ||
| US78329985 | 1985-11-07 | ||
| US06/783,299 US4784941A (en) | 1985-04-08 | 1985-11-07 | Expression and diagnostic use of pENV-3 encoded peptides which are immunologically reactive with antibodies to LAV |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK157186D0 DK157186D0 (da) | 1986-04-07 |
| DK157186A DK157186A (da) | 1986-10-09 |
| DK167158B1 true DK167158B1 (da) | 1993-09-06 |
Family
ID=27505552
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK157186A DK167158B1 (da) | 1985-04-08 | 1986-04-07 | Dna-sekvens, der koder for et protein, der er immunologisk reaktivt mod antistoffer for lav, et rekombinantplasmid indeholdende dna-sekvensen, bakteriecelle med rekombinantplasmidet, fremgangsmaade til fremstilling af proteiner som er immunologisk reaktive med antistoffer for lav, samt proteinet og anvendelser af proteinet |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0201716B1 (da) |
| JP (1) | JP2679973B2 (da) |
| AT (1) | ATE109830T1 (da) |
| AU (1) | AU571128B2 (da) |
| DE (1) | DE3650019T2 (da) |
| DK (1) | DK167158B1 (da) |
| ES (1) | ES8706208A1 (da) |
| FI (1) | FI861485A (da) |
| GR (1) | GR860914B (da) |
| IE (1) | IE64785B1 (da) |
| NO (1) | NO301176B1 (da) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4774175A (en) * | 1985-03-01 | 1988-09-27 | Centocor, Inc. | Immunochemical methods for the detection of antibody against HTLV-III |
| DK171119B1 (da) * | 1985-04-19 | 1996-06-17 | Hoffmann La Roche | AIDS-viruskappeprotein, ekspressionsvektor bærende viruskappeproteinet, transformanter transformeret med ekspressionsvektoren, fremgangsmåde til fremstilling af viruskappeproteinet, fremgangsmåde til detektion af AIDS-antistoffer, fremgangsmåde til bestemmelse af AIDS-virus, vaccine mod AIDS, antistoffer mod viruskappeproteinet samt anvendelse af dette til fremstilling af en vaccine og til testnin |
| US5773210A (en) * | 1985-04-19 | 1998-06-30 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Acquired immune deficiency syndrome (AIDS) viral envelope protein and method of testing for AIDS |
| JP2702911B2 (ja) * | 1985-09-11 | 1998-01-26 | ユナイテツド・バイオメデイカル・インコ−ポレ−テツド | 合成ペプチド、並びにそれを用いたエイズおよびプリ・エイズの検出方法 |
| US4734362A (en) * | 1986-02-03 | 1988-03-29 | Cambridge Bioscience Corporation | Process for purifying recombinant proteins, and products thereof |
| US4772547A (en) * | 1986-02-03 | 1988-09-20 | Hoffmann-La Roche Inc. | HTLV-III envelope peptides |
| US4879212A (en) * | 1986-04-02 | 1989-11-07 | United Biomedical Inc. | Peptide composition and method for the detection of antibodies to HTLV-III |
| EP0247557B1 (en) * | 1986-05-27 | 1994-04-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | HTLV-III(LAV) Envelope peptides |
| US5017688A (en) * | 1986-06-12 | 1991-05-21 | Biogen, Inc. | Peptides involved in the pathogenesis of HIV infection |
| US4943627A (en) * | 1986-06-12 | 1990-07-24 | Biogen, Inc. | Peptides involved in the pathogenesis of HIV infection |
| DK169582B1 (da) * | 1986-06-23 | 1994-12-12 | Squibb Bristol Myers Co | Humant monoklonalt antistof, der er i stand til at reagere med en epitop på LAV/HTLV-III kappeglycoproteinet gp41, cellelinier, som producerer sådant antistof, farmaceutisk præparat indeholdende antistoffet samt fremgangsmåde til bestemmelse af nærværelsen af LAV/HTLV-III i en biologisk prøve og fremgangsmåde til separering af specifikke antigendeterminanter af LAV/HTLV-III under anvendelse af ant |
| EP0525828A3 (en) * | 1986-08-01 | 1993-02-24 | Repligen Corporation | Recombinant polypeptides and their uses, including assay for aids virus |
| NZ221440A (en) * | 1986-08-20 | 1991-11-26 | Genetic Systems Corp | Composition containing monoclonal antibodies/peptides useful in treating and diagnosing hiv infections |
| NO881151L (no) * | 1987-03-27 | 1988-09-28 | Syntello Ab | Syntetisk hiv-1-antigen. |
| SE8701628D0 (sv) * | 1987-04-16 | 1987-04-16 | Erling Norrby | Medel for analys mm |
| US4921787A (en) * | 1987-05-01 | 1990-05-01 | Cambridge Bioscience Corporation | Detection of antibodies to human immunodeficiency virus by agglutination of antigen coated latex |
| US5447837A (en) * | 1987-08-05 | 1995-09-05 | Calypte, Inc. | Multi-immunoassay diagnostic system for antigens or antibodies or both |
| KR970007080B1 (ko) * | 1987-08-05 | 1997-05-02 | 칼립트 인크 | 자체-완비된 다중-면역분석 진단시스템 |
| DE3727137A1 (de) * | 1987-08-14 | 1989-02-23 | Behringwerke Ag | Herstellung von antigenen des human immunodeficiency virus typ 1 sowie deren verwendung als diagnostisches mittel und therapeutikum |
| DE4405810A1 (de) | 1994-02-23 | 1995-08-24 | Behringwerke Ag | Von einem Retrovirus aus der HIV-Gruppe abgeleitete Peptide und deren Verwendung |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3817837A (en) | 1971-05-14 | 1974-06-18 | Syva Corp | Enzyme amplification assay |
| US3766162A (en) | 1971-08-24 | 1973-10-16 | Hoffmann La Roche | Barbituric acid antigens and antibodies specific therefor |
| US3996345A (en) | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
| US4233402A (en) | 1978-04-05 | 1980-11-11 | Syva Company | Reagents and method employing channeling |
| US9328391B1 (en) * | 1984-08-22 | 2016-05-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Cloning and expression of HIV-1 DNA |
| IL76082A (en) * | 1984-08-22 | 1991-07-18 | Us Health | Molecular clones of the genome of htlv-iii and a process for the preparation thereof |
| CA1341482C (en) * | 1984-10-31 | 2005-05-10 | Paul A. Luciw | Process for preparing fragments of aids-associated retroviruses |
| AU600658B2 (en) * | 1984-12-24 | 1990-08-23 | Genentech Inc. | Molecularly cloned acquired immunodeficiency syndrome polypeptides and their methods of use |
| FR2580177B2 (fr) * | 1985-04-15 | 1989-06-02 | Pasteur Institut | Antigenes apparentes a la glycoproteine d'enveloppe du virus du sida, notamment precurseurs de cette glycoproteine, procedes d'obtention de ces antigenes et moyens mis en oeuvre dans ces procedes, applications de ces antigenes a la preparation de compositions immunogenes ou pour le diagnostic du sida ou des affections qui lui sont apparentees |
| DK171119B1 (da) * | 1985-04-19 | 1996-06-17 | Hoffmann La Roche | AIDS-viruskappeprotein, ekspressionsvektor bærende viruskappeproteinet, transformanter transformeret med ekspressionsvektoren, fremgangsmåde til fremstilling af viruskappeproteinet, fremgangsmåde til detektion af AIDS-antistoffer, fremgangsmåde til bestemmelse af AIDS-virus, vaccine mod AIDS, antistoffer mod viruskappeproteinet samt anvendelse af dette til fremstilling af en vaccine og til testnin |
| JP2702911B2 (ja) * | 1985-09-11 | 1998-01-26 | ユナイテツド・バイオメデイカル・インコ−ポレ−テツド | 合成ペプチド、並びにそれを用いたエイズおよびプリ・エイズの検出方法 |
-
1986
- 1986-04-04 IE IE89386A patent/IE64785B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-04-07 FI FI861485A patent/FI861485A/fi not_active Application Discontinuation
- 1986-04-07 GR GR860914A patent/GR860914B/el unknown
- 1986-04-07 EP EP86104741A patent/EP0201716B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-07 AT AT86104741T patent/ATE109830T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-04-07 DE DE3650019T patent/DE3650019T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-04-07 DK DK157186A patent/DK167158B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-04-07 ES ES553757A patent/ES8706208A1/es not_active Expired
- 1986-04-08 AU AU55727/86A patent/AU571128B2/en not_active Ceased
- 1986-04-08 NO NO861355A patent/NO301176B1/no unknown
- 1986-04-08 JP JP61080946A patent/JP2679973B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3650019T2 (de) | 1995-03-09 |
| EP0201716A2 (en) | 1986-11-20 |
| EP0201716A3 (en) | 1987-03-04 |
| FI861485A (fi) | 1986-10-09 |
| ES553757A0 (es) | 1987-06-01 |
| DE3650019D1 (de) | 1994-09-15 |
| AU571128B2 (en) | 1988-03-31 |
| IE860893L (en) | 1986-10-08 |
| NO301176B1 (no) | 1997-09-22 |
| AU5572786A (en) | 1986-10-16 |
| ES8706208A1 (es) | 1987-06-01 |
| IE64785B1 (en) | 1995-09-06 |
| GR860914B (en) | 1986-07-25 |
| JPS62239992A (ja) | 1987-10-20 |
| JP2679973B2 (ja) | 1997-11-19 |
| ATE109830T1 (de) | 1994-08-15 |
| DK157186A (da) | 1986-10-09 |
| NO861355L (no) | 1986-10-09 |
| FI861485A0 (fi) | 1986-04-07 |
| EP0201716B1 (en) | 1994-08-10 |
| DK157186D0 (da) | 1986-04-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK167158B1 (da) | Dna-sekvens, der koder for et protein, der er immunologisk reaktivt mod antistoffer for lav, et rekombinantplasmid indeholdende dna-sekvensen, bakteriecelle med rekombinantplasmidet, fremgangsmaade til fremstilling af proteiner som er immunologisk reaktive med antistoffer for lav, samt proteinet og anvendelser af proteinet | |
| US4784941A (en) | Expression and diagnostic use of pENV-3 encoded peptides which are immunologically reactive with antibodies to LAV | |
| Whetstone et al. | Humoral immune response to the bovine immunodeficiency-like virus in experimentally and naturally infected cattle | |
| CA1341409C (en) | Cloning and expression of htlv-iii dna | |
| DK171119B1 (da) | AIDS-viruskappeprotein, ekspressionsvektor bærende viruskappeproteinet, transformanter transformeret med ekspressionsvektoren, fremgangsmåde til fremstilling af viruskappeproteinet, fremgangsmåde til detektion af AIDS-antistoffer, fremgangsmåde til bestemmelse af AIDS-virus, vaccine mod AIDS, antistoffer mod viruskappeproteinet samt anvendelse af dette til fremstilling af en vaccine og til testnin | |
| EP0345375B1 (en) | HIV-3 retrovirus and its use | |
| EP0258404B1 (en) | Method of detecting antibody against htlv-iii | |
| JP3073752B2 (ja) | Ｈｉｖエンベロープタンパク質およびそれを用いたｈｉｖ抗原に対する抗体の検出方法 | |
| Steimer et al. | Recombinant polypeptide from the endonuclease region of the acquired immune deficiency syndrome retrovirus polymerase (pol) gene detects serum antibodies in most infected individuals | |
| AU594333B2 (en) | Expression and diagnostic use of gag encoded peptides which are immunologically reactive with antibodies to lav | |
| Hadlock et al. | Neutralizing human monoclonal antibodies to conformational epitopes of human T-cell lymphotropic virus type 1 and 2 gp46 | |
| US5175098A (en) | Expression and diagnostic use of gag encoded peptides which are immunologically reactive with antibodies to HIV | |
| JPS6226300A (ja) | Ｈｔｌｖ−３ｄｎａのクロ−ニングおよび発現 | |
| US5175097A (en) | Expression and diagnostic use of GAG-1 encoded peptides which are immunologically reactive with antibodies to HIV | |
| EP0345792A2 (en) | HTLV-I / HIV-1 fusion proteins | |
| Bhardwaj et al. | Recombinant HIV-1 p24 protein: cloning, expression, purification and use in the development of ELISA kits | |
| US5328835A (en) | Expression of immunologically reactive HIV envelope proteins | |
| US5134227A (en) | DNA encoding immunoreactive, chimeric HTLV-III GAG proteins | |
| DK168892B1 (da) | DNA-sekvens, der koder for proteiner, som er immunologisk reaktive med antistoffer mod LAV/HTLV-III, rekombinant plasmid indeholdende DNA'et, Bakteriecelle transformeret med plasmidet, fremgangsmåde til fremstilling af proteinet og anvendelse af proteinet ved analyser. | |
| KR910000748B1 (ko) | 사람 면역결핍증 바이러스의 gag-암호화된 단백질 | |
| EP0494317A1 (en) | The retrovirus SIV cpz-ant and its uses | |
| EP0235923B1 (en) | Sor gene product from human t-cell lymphotropic virus iii | |
| KR100264341B1 (ko) | 후천성면역결핍바이러스-1o형 특이항원 및 그의 제조방법 | |
| Sohn et al. | Overexpression and simple purification of human immunodeficiency virus-1 gag epitope derived from a recombinant antigen in E. coli and its use in ELISA |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PBP | Patent lapsed | ||
| PBP | Patent lapsed |