JP2679973B2 - 免疫学的に反応性のウイルス蛋白質の発現 - Google Patents
免疫学的に反応性のウイルス蛋白質の発現Info
- Publication number
- JP2679973B2 JP2679973B2 JP61080946A JP8094686A JP2679973B2 JP 2679973 B2 JP2679973 B2 JP 2679973B2 JP 61080946 A JP61080946 A JP 61080946A JP 8094686 A JP8094686 A JP 8094686A JP 2679973 B2 JP2679973 B2 JP 2679973B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- env
- penv
- lav
- plasmid
- atcc
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 title description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 67
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 41
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 16
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 13
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 9
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 10
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 abstract description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 5
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 56
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 12
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 12
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 11
- 101150044170 trpE gene Proteins 0.000 description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 101100408135 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) phnA gene Proteins 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 4
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 101000906736 Escherichia phage Mu DNA circularization protein N Proteins 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 206010020460 Human T-cell lymphotropic virus type I infection Diseases 0.000 description 3
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 3
- 241000714259 Human T-lymphotropic virus 2 Species 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 101000764570 Streptomyces phage phiC31 Probable tape measure protein Proteins 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 2
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000000423 heterosexual effect Effects 0.000 description 2
- 230000000652 homosexual effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000005541 medical transmission Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 2
- AEELXMHQIJJMKP-QWWZWVQMSA-N (2r,3r)-3-sulfanylbutane-1,2,4-triol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](S)CO AEELXMHQIJJMKP-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- PLVPPLCLBIEYEA-WAYWQWQTSA-N (z)-3-(1h-indol-3-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(\C=C/C(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-WAYWQWQTSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 229940126656 GS-4224 Drugs 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001024304 Mino Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- AQHKQYNFAIQLHA-UHFFFAOYSA-N NC(N)=N.[Cl+] Chemical compound NC(N)=N.[Cl+] AQHKQYNFAIQLHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100333320 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) end-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 235000007189 Oryza longistaminata Nutrition 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037062 Polyps Diseases 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283068 Tapiridae Species 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229960001948 caffeine Drugs 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical group [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 150000004683 dihydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical compound NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N indoleacrylic acid Natural products C1=CC=C2C(C=CC(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000003265 lymphadenitis Diseases 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000005415 magnetization Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000002969 morbid Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 201000005484 prostate carcinoma in situ Diseases 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 229940126583 recombinant protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N trimethylxanthine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
- C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
(技術の分野)
本発明は、組換えDNA技術の使用によるウィルス蛋白
質の発現に一般に関し、より詳しくはリンパ節症(lymp
hadenopathy)関連ウィルス(LAV)に対する抗体と免疫
学的に反応性である蛋白質の発現に関する。 (背 景) 後天性免疫不全症候群(AIDS)は、日和見感染及びあ
るまれな悪性腫瘍により特徴づけられる細胞免疫の伝達
しうる疾患である。AIDSの主な危険性のある群として、
同性愛活動の男性、静脈注射麻薬常用者、輸血及び血液
製剤を受ける人、及び危険度の高い個人の異性性交相手
及び子供が含まれ、このことは濃厚接触又は血液物質を
通じて伝達される感染物の関与を示唆している。 最近の証拠によると、病気伝達に責任ある感染エージ
ェントは、リンパ節症関連ウィルス(LAV)として知ら
れる新しいリンパ反応性(lymphotropic)レトロウィル
スである(バレーシノウシ(Barr′e−Sinoussi)ら、
サイエンス(Science)220:868(1983))。同様のウィ
ルスが他の科学者グループにより報告されており(ポポ
ビック(Popovic)ら、サイエンス224:497(1984);レ
ビィ(Levy)ら、サイエンス225:840(1984)、ヒトT
細胞リンパ反応性ウィルスタイプIII(HTLV−III)、エ
イズ関連レトロウィルス(ARV)、又は免疫不全関連ウ
ィルス(IDAV)と呼ばれた。より最近のデータによる
と、LAV,HTLV−III,ARV及びIDAVは、実質的なヌクレオ
チド相同性を含むいくつかの重要な特徴を共有し(ワイ
ン−ホブソン(Wain−Hobson)ら、セル(Cell)40:9
(1985);ミューシング(Muesing)ら、ネイチア(Nat
ure)313:450(1985);サンチェス・ペスカドール(Sa
nchez−Pescador)ら、サイエンス227:484(1985)、ウ
ィルス分離物の間で株ごとの変化が存在する可能性はあ
るけれど、同じウィルスの分離物であると考えられるべ
きである。実質的なヌクレオチド相同性を示すことに加
え、分離物は、形態学、細胞病理学、最適逆転写酵素活
動のための要件、及び少くともいくつかの抗原的特性の
点で同じである(レビイ、前出;シュプバッハ(Schuph
ach)ら、サイエンス224:503(1984))。 上述のように、このウィルスは血液物質(血液、血
清、血漿、及びこれらの分画)を通して伝達しうること
が知られ、提供者がウィルスに暴露されたことがあるか
どうか決定するために血液物質をスクリーンすることが
重要となる。これは、LAV及び関連ウィルスに対する抗
体の検出のための酵素結合イミムソルベント評価(ELIS
A)を含むいくつかの方法のいずれかで行うことができ
る。その血液がLAVに対する抗体を含む個人は、「血清
陽性」と云われる。血清陽性提供者からの血液は、検出
されしだい血液供給から除外され、それにより病気の伝
播を除ぐのを助けうる。 LAVに暴露された個人の免疫応答は色々である。p13、
p18、p25、p36、gp43、p55、gp110などを含むいくつか
のウィルス蛋白質のいずれかに対して抗体が産生される
ことができる(シュプバッハら、ニュー イングランド
ジャーナル オブ メディシン(New Engl.J.Med.)3
12:265(1985))。総ての個人が、同じ蛋白質に対する
又は所定の蛋白質上の同じエピトープに対する抗体を作
る訳ではない。 現在行われているような血清陽性者の検出は、いくつ
かの固有の問題を持つ。これら問題のうち最大のもの
は、免疫学的評価のために全ウィルスから抗原を分離す
る必要性である。この分離は、多量の、生きた、感染可
能性のあるウィルスの取扱いを要し、これ自体、重大な
安全上の傷害を与える。加えて、収率、純度、及び実施
ごとのウィルスの再現性に関する心配がある。このこと
は、許容できない多数の偽の陽性及び/又は陰性を結果
する。従って、血液スクリーニング評価において有用で
あり、かつ更に他の関連した利点を持つウィルス抗原を
作る代りの方法に対して、当該分野にニーズがある。 加えて、この病気のための効果的処置はまだ見い出さ
れていない。エイズの広がりが異例なものとなり初め、
もう疾病的割合でないなら、ウィルスが伝達される程度
はなお疑問であり、一般人を免疫化する医薬組成物に対
するニーズがまた存在する。 (本発明の開示) 簡単に云えば、本発明はLAVゲノムのエンベロープ(e
nv)領域の一部分を含むDNA配列を開示し、上記一部分
は、LAVに対する抗体と免疫学的に反応性である蛋白質
をコードする。バクテリア宿主細胞中で複製しうる組換
えプラスミドも開示される。このプラスミドは、発現の
ための原核細胞(procaryotic)転写及び翻訳シグナル
を含み、上述のDNA配列が読みフェーズにおいて続く。
好ましい実施態様において、シグナルは、誘発しうる及
び/又は抑制しうるオペロンたとえばtrpオペロンから
選ばれる。上述した組換えプラスミドにより形質転換さ
れたバクテリア細胞たとえば大腸菌も開示される。 本発明の別の面は、LAVに対して反応性の抗体又はT
細胞と免疫的に反応性である蛋白質を作る方法を開示す
る。この方法は、バクテリア宿主細胞中で複製しうる組
換えプラスミドをバクテリア宿主細胞に導入することを
含む。このプラスミドは、発現のための原核細胞転写及
び翻訳シグナルを含み、LAVゲノムのenv領域の一部分
(該一部分はLAVに対する抗体と免疫学的に反応性であ
る蛋白質をコードする)を含むDNA配列が読みフェーズ
(reading phase)において続く。プラスミドの導入の
次に、バクテリア宿主は、適当な倍地で増殖される。蛋
白質の発現がそして誘発され、その配列の蛋白質生成物
がバクテリア宿主から分離される。蛋白質生成物は、分
離のあとでたとえばゲル浸透クロマトグラフィにより精
製できる。 本発明の更に別の面は、生物的液中のLAVに対する抗
体の存在を決定するための方法を開示する。一つの実施
態様において、この方法は、上述の組換えプラスミドで
形質転換されたバクテリア細胞により産生された蛋白質
と共に生物学的液体をインキュベートし、それにより反
応混合物を形成し、そして続いて抗体の存在を決定する
ために反応混合物を分析することを含む。好ましい実施
態様において、反応混合物を分析する工程は、抗体のた
めのラベルされた特異的結合パートナーと反応混合物を
接触させることを含む。別の実施態様において、LAVに
対する抗体の存在は、抗体を含むと疑われるサンプルと
固定化組換え蛋白質に結合するラベルされたモノクロー
ナル抗体との間の競争を実施することにより決定され
る。反応混合物は次に、固相に結合したラベルされた抗
体の量を決定するために分析される。 本発明の別の面は、生物的液体中のLAV抗原の存在を
決定する方法を開示し、これは上述した組換えプラスミ
ドで形質転換したバクテリア細胞により産生されたラベ
ルされた蛋白質と共に生物的液体をインキュベートする
こと、及び続いて又は同時に、特異的結合が起るような
蛋白質に対する抗体と共にインキュベートすることを含
む。次に、インキュベーションの間に形成された反応混
合物が、抗体と結びついたラベルの量を決定するために
分析される。 上述した組換えプラスミドにより形質転換されたバク
テリア細胞により産生された蛋白質により動物を免疫化
することを含む、LAVに対する抗体を作る方法も開示さ
れる。 本発明の別の面は、生物的液体中のLAVに対する抗体
の存在を決定するための方法を開示し、これは上述の組
換えプラスミドにより形質転換されたバクテリア細胞に
より作られた蛋白質にラテックスビースを接合すること
を含む。次に、生物的液体がビーズ/蛋白質接合体とイ
ンキュベートされ、それにより反応混合物を形成する。
反応混合物は次に、抗体の存在を決定するために分析さ
れる。 本発明に従い作られた蛋白質は、適当なキャリア又は
希釈剤と共に用いられると、免疫学的に効果的なワクチ
ン組成物を形成する。生理学的に許容できるキャリアに
付着されたLAVゲノムのenv領域の一部分を含むDNA配列
によりコードされる蛋白質の免疫学的有効量を個体に投
与することにより、エイズに責任あるウィルスにより起
される感染を防ぐことができる。 本発明の別の面は、下記の詳細な説明及び添付図面よ
り明らかとなろう。 本発明の実施のための最良の態様 本発明を述べる前に、本発明書で用いられる言葉の定
義を述べることが、本発明の理解のために役立つであろ
う。 リンパ節症(Lymphadenopathy)関連ウィルス(LAV):
ヒトT−リンパ反応性(T−lymphotropic)レトロウィ
ルス。本発明の目的のために、一つのウィルスがもし下
記の判断基準を実質上満すなら、それはLAVと同じ又は
同等であると考えられる: (a) ウィルスがTリンパ球、特にTヘルパー細胞
(CD4+、ベルナード(Bernard)ら編、白血細胞タイプ
分け(Leucocyte Typing)、ニューヨーク、スプリンガ
ー出版(1984)に定義された国際表記法による)に対し
て反応する; (b) ウィルスが、感染されたCD4+細胞に対し細胞変
性的である(HTLV−I及びIIのように形質転換的である
よりも); (c) ウィルスが、Mg2+依存性である(最適濃度5m
M、最適pH7.8、アクチノマイシンDにより抑制できな
い)RNA依存DNAポリメラーゼ(逆転写酵素)をコード
し、その3′LTRからの逆転写のためのプライマーとし
てオリゴ(dT)12-18を用いることができる; (d) ウィルスは、約1.16の密度で蔗糖勾配中でバン
ドをなす; (e) ウィルスは、[3H]ウリジンでラベルされう
る; (f) ウィルスは、免疫学的及びヌクレオチド配列判
断基準により、ウィルスのHTLV−I/II科の員と区別され
る(この判断基準によりHTLV−IIIはHTLV−I/II科の一
員とは考えられない); (g) ウィルスは、LAVのgag及びenv領域によりコー
ドされる蛋白質と本質的に免疫学的に交叉反応性であ
る;及び (h) ウィルスは、LAVと実質的なヌクレオチド相同
性(78〜100%)及びアミノ酸配列相同性(90〜100%)
を共有する。 免疫学的に反応性:抗原及び抗体が互いに特異的に、曲
型的には少くとも106M-1の親和性、より多くの場合には
少なくとも108M-1の親和性でもって結合できるとき、そ
さらは「免疫学的に反応性」であると云われる。 形質転換された又は形質転換:精製したDNAの導入によ
り受け入れ細胞又は微生物の遺伝子型を安定かつ遺伝し
うるように変えるプロセス。 リンパ節症関連ウィルス(LAV)は、エイズ又はリン
パ節症候群の患者から分離できる。そのような患者のリ
ンパ節は曲型的にはバイオプシーされ、増殖を支持する
のに必要なように補われた培養基中に置かれる。ミトゲ
ンたとえばインターロイキン−2(IL−2)又はヒトヘ
マグルチニン(PHA)が含まれることができる;ヒトイ
ンターフェロンに対する抗血清も含まれることができ
る。逆転写酵素活性は典型的には、培養の約15日に現わ
れ、ウィルスの存在を示す。ウィルスは、非イオン性界
面活性剤を用い、次に蔗糖勾配中でのバンド形成によ
り、培養上澄みから濃縮できる。精製のこれら及び他の
方法は、当業界で周知であり、たとえばモンテラロ(Mo
ntelaro)ら、ジャーナル オブ バイロロジー(J.Vir
ology)42:1029(1982)に記載されている。 LAVは、多数の方法で増殖できる。臍帯又は末梢血液
又は骨髄から由来するTリンパ球中でそれは培養でき
る。あるいはそれは、不死化したT細胞またはB細胞中
で増殖できる;たとえばポポビックら、サイエンス224:
497(1984)、及びモンタグニエル(Montagnier)ら、
サイエンス225:63(1984)。ウィルスの増殖は通常、逆
転写酵素活性の存在によりモニターされる。 LAVのゲノムクローンは、当業界で周知のいくつかの
方法のいずれかで調製でき、たとえばハーン(Hahn)
ら、ネイチア312:166(1984);アリゾン(Alizon)
ら、ネイチア312:757(1984);ルシウ(Luciw)ら、ネ
イチア313:760(1984);及びミューシング(Muesing)
ら、ネイチア313:450(1985)が挙げられるが、これら
に限定されない。 簡単に云えば、これら方法の一つ(アリゾンら)では
DNAが健康な提供者のLAV感染したT細胞から分離され、
Hind IIIののような制限エンドヌクレアーゼで部分的に
消化され、そして得られた消化物は電気泳動的に分画さ
れる。全LAVゲノムのサイズ(約9.2Kb)にサイズ的に対
応する分画がゲルから溶出され、沈降され、再懸濁さ
れ、そして適当に制限したベクターのアーム中に連結
(リゲート)される。リゲーション混合物はバクテリオ
ファージ粒子中に入れられる。バクテリアはバクテリオ
ファージによりトランスフェクションされ、クローンは
適当なプローブ(たとえばLAV−RNAから作られたcDNA)
を用いてLAV挿入物についてインサイツにスクリーンさ
れる。そのようなクローンから、LAVの望む領域がpUC18
のようなバクテリアプラスミドベクター中にサブクロー
ンされうる。それ以上のサブクローニングは、非所望の
配列を除去するため、及び発現ベクター中へのクローニ
ングを促進する目的でいずれかの端に追加的制限部位
(ポリリンカーの形で)を加えるために望ましいことで
ありうる。 LAV配列は次に、誘発しうる発現ベクター中にサブク
ローンされうる。種々の発現ベクターが当業界で知られ
ており、λgt11:Tn5(ホール(Hall)ら、ネイチア311:
379(1984);trpE(ポール(Paul)ら、ヨーロピアン
ジャーナル オブ セル バイオロジー(Euro.J.Cell
Biol.31:171(1983);pIN III(マスイ(Masui)ら、バ
イオテクノロジー、1984年1月、p81)を包含する。 得られた蛋白質は、部分的に精製され、免疫原として
及び免疫評価における抗原として包含する種々の目的に
用いられることができる。免疫原としての使用のため
に、蛋白質は緩衝溶液中又はアジュバントに含めて、マ
ウス、ラビット、ヤギなどのような動物に注射されう
る。あるいは蛋白質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により精製でき、興味のバンドがゲルから切断さ
れ、トリチュレート化され、そして宿主動物への注射の
ために緩衝液に再懸濁される。ポリクローナル又はモノ
クローナル抗体が作られうる。免疫評価における抗原と
しての使用のために、蛋白質はラベルされた又はラベル
されていない形で行いることができる。それらがラベル
される場合、ラベルとしては放射性同位元素、蛍光物
質、酵素、燐光物質又は粒子が挙げられる。これら及び
他のラベルは当業界で周知であり、たとえば米国特許3,
766,162号、3,791,932号、3,817,837号、3,996,345号、
及び4,233,402号に記載されている。 本発明の組換え蛋白質を用いる評価(アセイ)は、不
均一(すなわち分離工程を要する)又は均一でありう
る。もし評価(アセイ)が不均一であるなら、遠心分
離、濾過、クロマトグラフィ、又は磁化を含む種々の分
離手段を用いることができる。 抗体の存在について血液物質又は他の生理的液体をス
クリーンする一つの好ましい評価法は、ELISA評価法で
ある。典型的には、抗原(この場合、組換え蛋白質の一
つ又組み合せ)は、微小力価くぼみの表面に吸着され
る。次に表面上の残りの蛋白質結合部位は、適当な剤た
とえばウシ血清アルブミン(BSA)、熱不活性化正常ヤ
ギ血清(NGS)、又はBLOTTO(保存剤、塩及び消泡剤を
含む脱脂乾燥ミルクの緩衝溶液)によりブロックされ
る。くぼみは次に、特定の抗体を含むと疑われるサンプ
ルと共にインキュベートされる。サンプルは無希釈で適
用されることができ、又はより多くの場合にはそれは、
BSA、NGS又はBLOTTOのような蛋白質の少量(0.1〜5.0重
量%)を含む緩衝液を通常用いて希釈されることができ
る。特異的結合が起るのを許すのに十分の長さの時間イ
ンキュベートした後に、くぼみは結合していない蛋白質
を除くために洗われ、次にラベルされた抗ヒト免疫グロ
ブリン抗体(αHuIg)と共にインキュベートされる。ラ
ベルは、ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ(HR
P)、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファター
ゼ、及びグルコースオキシダーゼを含む種々の酵素から
選ばれうる。特異的結合が起るのに十分な時間を許し、
次に、結合していない蛋白質を除くためにくぼみを再び
洗い、そして酵素のための基質を加える。色が現われる
のを許し、くぼみの内容物の光学的密度を肉眼で又は機
器で決定する。 便宜のために、ELISA評価のための剤は、キットの形
で用意される。これらキットは、組換え技術により作ら
れたウィルス蛋白質がそれに予め吸着されたところの微
小力価プレート、種々の希釈剤及び緩衝剤、特異的に結
合された抗体の検出のためのラベルされた接合体、及び
他のシグナル発生剤たとえば酵素基質、コファクター、
及び色原体を含むことができる。 エイズ患者のかなりの数が高度に免疫抑制され、そし
て高力価抗体を作る能力を進行的に失うという事実によ
り、本発明は、LAVに対する抗体と免疫学的に反応性で
ある蛋白質をコードするLAVゲノムのエンベロープ(en
v)領域の部分を用いる。LAVのエンベロープグリコプロ
ティンに対する抗体の存在は、他のウィルス蛋白質に対
する抗体の存在よりも良いLAV感染の指標である。なぜ
なら、エンベロープグリコプロティンに対する抗体力価
は、病気の後半の段階の間持続すると考えられ、一方、
他の蛋白質たとえばコア蛋白質に対する抗体は検出しう
るレベルより下に低減するかも知れないからである。 本発明の組換え蛋白質の別の適用は、ヒトワクチンと
しての使用である。組換え蛋白質は、高度に精製され、
慣用の方法で宿主の1kg当り1μg〜20mgの濃度で処方
されうる。生理的に許容されるキャリアたとえば滅菌
水、食塩水、緩衝された食塩水などが用いられうる。水
酸化アルミニウムのようなアジュバントも用いうる。ワ
クチンは、静脈内、皮下、筋肉内又は腹膜内注射により
投与できる。一回の注射が十分でありうるが、より多く
の場合、週毎ないし月毎の間隔での複数回注射が好まれ
る。 あるいは、LAVゲノムの領域を表現するワクチンウィ
ルス組換え体が構成されうる。たとえば、本発明の構成
物は、pMM34(マケット(Mackett)ら、サイエンス227:
433(1985))のようなプラスミド、及び相同組換えに
より形成された得られたキメラプラスミドを含むワクチ
ンウィルスハイブリッド中に挿入されうる。そのような
組換えウィルスワクチンによる免疫化は、動物において
B型肝炎ウィルス及び水泡性口内炎ウィルスに対する保
護免疫を誘発するのに有効であると判っている(スミス
(Smith)ら、ネイチア311:578(1984))。 この方法における組換え蛋白質ワクチンの使用は、不
活性化された調製物又は病原性微生物の非ウイルレント
(avirulent)株からワクチンを構成する必要を除去す
る。 LAVの遺伝子構造、5′LTR−gag−pol−Q−env−F
−3′−LTRは、レトロウィルスのうちで独特である。
他の総ての既知の複製能力であるレトロウィルスにおい
て、pol及びenv遺伝子はオーバーラップしている;LAVに
おいては、それらはオープン読み枠Qにより分離されて
いる(ワイン−ホブソンら、セル40:9(1985))。 envオープン読み枠は、第8トリプレットにおいて可
能な開始部位(メチオニンコドン)を持ち、従って分子
量97kdの一部分をコードすると予期される。これは、変
性性ポリアクリルアミドゲル上のLAVグリコプロテイン
の見かけ分子量(110kd)と一致する。env遺伝子中に32
の可能性あるN−グリコシル化部位(Asn−x−Ser/Th
r)がある。レトロウィルスエンベロープ蛋白質の特徴
である三つの疎水性領域も存在し、シグナルペプチド
(ヌクレオチド5815−5850によりコードされる)、第二
領域(7315−7350)、及び透過膜セグメント(7831−78
96)に対応する。第二領域は、蛋白質分解プロセシング
部位を表わすと考えられるArg/Lysに富む領域に続く
(ワイン−ホブソン、前出)。 上述のように、LAVグリコプロテインに対する抗体(e
nv遺伝子生成物)は、ウィルス感染の経過中初期に現わ
れ、病気の後半の段階でも同様に持続する(キッチェン
(kitchen)ら、ネイチア312:367(1984))。従ってグ
リコプロテインに対する抗体は、グリコプロテイン又は
その部分を作るLAVに対する過去の暴露の特に良い指標
であり、血液スクリーニング評価法において特に有用で
ある。 LAVゲノムのenv領域の特に好ましい部分は、ENV−3
である。第3図に示すように、ENV−3はヌクレオチド
配列のbp7178からbp7698にわたる。第7図において、下
記のサブ領域(第7図上で上に線を引いた)が領域内に
含まれる:(1)bp7315から7350によりコードされる疎
水性ペプチド;(2)gp65及びgp43へのエンベロープ前
駆体蛋白質の開裂のための推定の蛋白質分解プロセシン
グ部位を含むドデカペプチド;(3)二つのシステイン
残基の周辺の高度に保存される領域;(4)3′(カル
ボキシル)末端の保存される配列;及び(5)5′(ア
ミノ)末端の保存される配列。 ENV−3の種々のサブ領域に対応する合成ペプチドを
用いて得られたデータは、最も重要な領域がシステイン
残基を含む又はこれに極近い領域及び蛋白質分解プロセ
シング領域を含む又はこれに極近い領域であることを示
す。これらペプチドの或る物の合成及びスクリーニング
は、出願中の米国特許出願シリアルNo.728,052(1985年
4月29日出願、コサンド(Cosand))に記述されてい
る。 また、END−3はまた、潜在的グリコシル化部位を殆
んど欠き;従って組換え蛋白質の抗原性は天然蛋白質の
それを模倣すると合理的に予期されうる。env遺伝子及
びその蛋白質生成物の全配列は第8図に示され、そこで
は潜在的グリコシル化部位が上に線を引かれている。第
8図で、ENV−3の大きな範囲がそのような部位を欠く
こと、及び遺伝子の残部と比べてENV−3は全体として
顕著にグリコシル化が少ない(underglycosylated)こ
とが判る。 下記の実施例で、λJ19と名付けられたLAVゲノムクロ
ーンは、バクテリアプラスミドベクター、pUC18、中に
サブクローンされた。得られたサブクローン(pBT−1
と呼ばれる) (ATCC寄託番号53069を与えられた)は更にサブクロー
ンされて、pRS−3を与え、これはenv、F及びLTR領域
配列を主に含んだ。env及びF配列の一部は、更にM13mp
18中にサブクローンされ、次にenv配列の領域がtrpE誘
発性発現ベクター中に移された。envDNAは、trpE遺伝子
のインフレーム下流に挿入され、大腸菌がこの構成物に
より形質転換されたとき、trpE−env融合蛋白質の発現
を結果した。得られた蛋白質は部分的に精製され、既知
の血清陽性及び既知の血清陰性個体からの血清を用いる
ELISAにおけるそれらの反応性により特徴づけられた。p
ENV−1ないしpENV−5と呼ばれる5つの有用な構成が
同定された。 下記の実施例は、例示のために示され、制限のためで
はない。 実施例 A.trp−env発現ベクターの構成 外来蛋白質を発現するために、いくつかのバクテリア
発現系のいずれかを用いることができる。trpE系がLAVe
nv配列の発現のために選ばれた。なぜならそれは強い誘
発しうるプロモータを含み、しかしその発現はまた、外
来の(かつ潜在的に毒性の)蛋白質がバクテリア内に長
時間蓄積しないように抑制されうるからである。外来挿
入物を含むベクターで形質転換されたバクテリアをスク
リーン又は選別するための速く簡便な方法はない(ベク
ター単独で形質転換されたバクテリアとはちがって)の
で、DNAの大きな片(たとえばλファージDNA)の望む領
域を、挿入物のための選択系を含むベクター中に、trpE
発現ベクターにそれを移す前にサブクローンすることが
便宜である。これは、望む挿入物を含むもののために、
形質転換されたバクテリアをスクリーンすることを容易
にする。 従って本発明のアプローチは、まずLAVゲノムのenv領
域の多くを転移ベクターM13mp18中に二段階でサブクロ
ーンすることであった(第1図)。次に、このサブクロ
ーンの種々のフラグメントは、ポリリンカー領域中の制
限部位の読み枠においてのみ異る三つのtrp発現ベクタ
ー(pJH11、pJH12、pJH14)のいずれかへと連結された
(第2図)。得られたサブクローンのいくつか(たとえ
ばpENV−5、pENV−4)はそのままで用いられたが、他
のものは望む生成物を作るために更に修正を必要とした
(pENV−1、pENV−2、p−ENV−3)。 1.LAVゲノムサブクローニング a.ファージDNAの調製 LAVゲノム全体は、ファージλL47.1のHind III部位に
9.2KbゲノムDNA挿入物を含むλファージ粒子の形でパス
ツール インスティチュート(Pasteur Institut)から
得られた。このクローンは、λJ19と呼ばれ、ワイン・
ホブソンら、セル40:9(1985)に記載される。λJ19フ
ァージ粒子は、マニアチス(Maniatis)ら、モレキュラ
ークローニング:ラボラトリーマニュアル、ニューヨー
ク、コールドスプリングハーバーラボラトリー、1982、
p64の手順に従って、大腸菌K−12のQ359株(Q359株の
ゲノタイプはhsdRk-,hsdMk+supF,φ80、P2である)中に
トランスフェクトされた。単一のプラークが取り上げら
れ、ファージはプレートリセート法(マニチアス、前
出、p65)により増幅された。37℃で9時間のインキュ
ベーション後に、豊富なプラークを含むプレート(100m
m直径)は、100mM NaCl/20mM MgSO4/50mM Tris、pH7.
5、の5mlによりおおわれた。4℃で12時間のインキュベ
ーション後に、液体が集められ、等体積のクロロホルム
で2度抽出された。 ファージ粒子を含む得た水性相の10mlに、0.25M EDTA
/2.5%SDS/0.5M Tris、pH9、の2mlを加え、懸濁物を70
℃で15分間インキュベートして、ファージを破壊した。
8M酢酸カリウム2.5mlを加え、溶液を氷上で15分間イン
キュベートし、次に4℃で12,000×gで10分間遠心分離
して蛋白質をペレット状にした。上澄みを、50mlポリプ
ロピレン遠心分離管に移し、20℃で等体積のフェノール
(pH8、1M Tris、pH8、で緩衝)で抽出した。水性相を
次に、20℃で等体積のクロロホルム:イソアミルアルコ
ール(24:1)で抽出した。水性相に次に、2.5体積の95
%エタノールを加えて、DNAを沈澱させた。遠心分離の
後にDNAペレットを乾燥し、10mM Tris HCl、pH7.4/1mM
EDTA中に再懸濁した。 b.env領をサブクローニングすること 上述のA.1.aで調製されたλJ19DNAの約12μgを、制
限酵素Sst I(ベセスダ リサーチ ラブズ、ベセスダ
メリーランド)で完全に消化した。これは、LAVのこ
の分離物のLTR領域においてのみ切断する。消化混合物
を、0.089M Tris−ホウ酸塩/0.089Mホウ酸/1mM EDTA中
の0.9%アガロースを通して1V/cmで電気泳動した。9.1K
bフラグメントの位置は、臭化エチジウムで着色した後
に分子量標準に比べて決定された。このバンドは、NA45
紙(シュライヒェル アンド シュエル(Sch1eicher a
nd Schuell)、キーン、NH)中に電気溶出された。DNA
は、製造者により提供された指示書に従って紙から回収
された。 9.1Kb Set Iフラグメントは、Set I消化されたベクタ
ーpUC18中に、10挿入物分子:1ベクター分子の比で連結
された。大腸菌株HB101が、マニアチスら(前出)のCaC
l2手順により、連結混合物により形質転換され、LB+ア
ンピシリン(200μg/ml)寒天プレート上にプレートさ
れた。 単一のコロニーを取り上げ、3mlのLB+アンピシリン
培養基で希釈し、一定振とう下に37℃で一夜増殖した。
プラスミドDNAは、アルカリ性リシス(lysis)法(マニ
アチスら、前出、p368)により調製された。プラスミド
DNAの制限分析により調べたときポリリンカー中のEco R
I部位がLAVゲノムの5′末端に最も近いような配位で
9.1Kb Sst I挿入物を含む一つのコロニーが選択され
た。このサブコローンはpBT−1と名付けられた(ATCC
寄託番号53069)(第1図)。 プラスミドpBT−1は次に、Eco R Iで消化され、LAV
ゲノムの3′末端をまだ含むベクターを再連結した。こ
れは、プラスミドから5′Eco R Iフラグメントを除去
するように働く。HB101細胞が、連結混合物で形質転換
され、挿入物pRS−3を含むコロニーが、精製されたプ
ラスミドDNAの制限分析により同定された。 env領域の多くを含む、bp5889とbp8572のKpn I部位の
間の配列〔ワイン−ホブソンら、セル40:9(1985)に従
い番号付け〕が次に、pRS−3からM13mp18ベクターへ転
移された。これは、余分の(非env)配列を更に除去す
るため、及びまた選択/スクリーンできるマーカーとし
てアンピシリンでなくβ−ガラクトシダーゼを用いるベ
クター中にenv配列を置くために行われた。これは、次
の理由で有利である。trpE発現ベクターはその選択マー
カーとしてアンピシリン耐性を用いる;アンピシリン耐
性因子をコードする一つのベクター(pUC18)から他の
もの(trp発現ベクターpJH11、12、14)への挿入物の転
移は、望む挿入物+ベクターのためのスクリーニングを
より困難にするであろう。M13ファージが、env配列の挿
入によるβ−ガラクトシダーゼの不活性化を評価するた
めに発色原基質5−ブロム−4−クロル−3−インドリ
ル−β−ガラクトシド(シグマケミカル社)を用いてス
クリーンされた。挿入物を含むこれらファージは、ポリ
リンカー領域中の制限部位に対しての挿入物の配位につ
いてスクリーンされた。DNAは、組換え体(mpSW16、mpS
W19)から各配位について単離された(第1図)。 2.env配列へのtrpベクターへの挿入 発現ベクターは、大腸菌trpオペロンプロモーター、
オペレーター、及びpBR322に挿入されたtrpE遺伝子を含
んだ(第2図)。trpE遺伝子は、ポリリンカー配列の挿
入により、その5′の多くのBg1 II部位で切り詰められ
た(コノプカ(Konopka)ら、J.Virol.51:223(198
4))。種々のtrpベクター(pJH11、pJH12及びpJH14)
は、ポリリンカー領域内の制限部位の読み枠に従って異
った。適当なベクター中へのオープン読み枠の挿入は、
アミノ末端でのtrpE配列との融合蛋白質の産生を結果す
る(スピンドラー(Spindler)ら、J.Virol.49:132(19
84))。 本発明者は、発現のためにLAV−envの5つの重なり合
う領域を選んだ(第3図)。選択は、これらベクター中
の挿入物サイズへの制限により(コノプカら、J.Virol.
51:223(1984))、及び発現のために有害でありうる疎
水性配列の位置により指示された。 pENA−5(ATCC寄託番号53074)は、ポリリンカー領
域中のmpSW19のBam H1部位からenvHind III部位(bpNo.
7698)までのenv領域を、Bam H1及びHind III(ニュー
インランド バイオラブズ)制限されたpJH12へ連結
することにより構成された(第4図)。連結物は、CaCl
2ショックされた大腸菌HB101中に形質転換され、バクテ
リアは、100μg/mlのアンピシリン(シグマ社)及び20
μg/mlのトリプトファン(シグマ社)の存在下に置かれ
た。トリプトファンは、その蓄積がバクテリアに対して
有害でありうるところの外来蛋白質の発現を抑制するた
めに加えられた。アンピシリン耐性コロニーが、envフ
ラグメントを含む組換えプラスミドの存在について微量
溶解物(minilysates)によりスクリーンされた。 pENV−1(ATCC寄託番号53070)は、二つのBg1 II配
列(bp6598及びbp7178)の間の配列を除去することによ
ってpENV−5から導かれた(第4図)。この除去は、Bg
1 II部位の少し後に停止コドンを導入することによりオ
ープンし読み枠のサイズを減少した。 pENV−2(ATCC寄託番号53071)は、二つのBg1 II配
列(bp6598及びbp7178)の間のフラグメントをBamHI制
限されたpJH14中に挿入することにより構成された(第
5図)(Bg1 IIとBam H I突出部は相溶性である)。大
腸菌HB101が連結反応により形質転換され、アンピシリ
ン耐性コロニーが、pJH14中へのenv挿入物の存在及び配
位について制限分析によりスクリーンされた。 pENV−3(ATCC寄託番号53072)は、mpSW19のBam H I
部位(ポリリンカー中の)とHind III部位(bp7698)の
間のenv領域を、Bam H I及びHind III制限されたpJH11
へ連結することを要する(第5図)。大腸菌HB101が連
続反応により形質転換され、アンピシリン耐性コロニー
が微小溶解物によりスクリーンされた。適当なコロニー
からのDNAを分離し、Bam H I及びBg1 II(ニュー イン
グランド バイオラブズ)で消化し、再連結した。この
DNAが、大腸菌HB101を形質転換するために用いられた。
得たアンピシリン耐性バクテリアは、Bam H I〜Bg1 II
フラグメントを除去した組換えプラスミドについて制限
分析によりスクリーンされた(第5図)。フラグメント
の除去は、Bg1 II部位(bp7178)とHind III部位(bp76
98)の間のenv配列を正しい読み枠中にもたらした。 pENV−4(ATCC寄託番号53073)は、mpSW16からのHin
d IIIフラグメントを、Hind III及びウシ腸アルカリ性
ホスファターゼ(ボーリンガー マンハイム(Boehring
er Mannheim)により処理されたpJH2に連結することに
より構成された(第6図)。組み換えプラスミドは、連
結混合物により大腸菌HB101を形質転換し、そして微小
溶解物の制限分析によるスクリーニングによって同定さ
れた。 B.蛋白質発現 1.trp−env構成物による大腸菌の形質転換組換えtrp−e
nv発現プラスミドの各々は、大腸菌HB101から大腸菌C60
0へ転換された。なぜなら、後者は蛋白質産生のための
潜在的により良い宿主であるからである。転移は、HB10
1の微小溶解物(minilysates)からのスーパーコイルDN
Aによる、CcCl2ショックされたC600の形質転換を含む、
バクテリアは、記載されるように(コノプから、J.Viro
l.51:223(1984)アンピシリン及びトリプトファンの存
在下でプレートされた。薬剤耐性コロニーは、適当なプ
ラスミドの存在を確認するために微小溶解物によりスク
リーンされた。 2.trp−env蛋白質の発現 trp発現ベクターで形質転換された大腸菌C600の増殖
及び誘導は、記述されている通りであった(スピンドラ
ーら、J.Virol.49:132(1984);コノプガら、J.Virol.
51:223(1984)。簡単に云えば、トリプトファン(20μ
g/ml)及びアンピシリン(100μg/ml)を含む最小培地
が、グリセロール貯蔵からの形質転換されたバクテリア
を接種された。培養物は、37℃で空気吹込み下に一夜増
殖された。一夜培養物は次に、アンピシリン(100μg/m
l)を含みしかしトリプトファンを含まない新鮮な最小
培地に1:100で接種された。これら培養物は、37℃で2
〜3時間(初期対数相まで)空気吹込み下に増殖され
た。誘導物質、3−β−インドールアクリル酸(シグマ
社)が、95%エタノール中20mg/mlで新鮮に作られたス
トックから20μg/mlの最終濃度まで加えられた。 誘発された培養物は、37℃で空気吹込み下に4〜5時
間増殖され、次にペレット化され、所望により凍結され
た。pENV−1、pENV−2、及びpENV−3からの蛋白質収
率は、典型的には10〜30mg/であり、一方、pENV−4
及びpENV−5からの収率は典型的には1mg/より低かっ
た。 C.trp−env蛋白質の分離及び精製 融合蛋白質は、記載されているように(コノプカら、
J.Virol.51:223(1984))細胞ペレットから部分的に精
製された。簡単に云えば、バクテリアを、誘導された培
養物1当り50mM Tris、pH7.5/0.5mM EDTA/150mM NaCl
(TNE)の100ml中に再懸濁した。リゾチーム(シグマ
社)を、最終濃度1mg/mlまで加えた。0℃で15分間後
に、混合物にNP40を0.2%の最終濃度まで0℃で10分間
加えた。次にDNase(シグマ社)の1〜2mgを、DNase緩
衝液(150mM NaCl/12mM MgCl2)150mlと共に加えた。反
応混合物を0℃で1時間、しばしば撹拌しながらインキ
ュベートした。次に、不溶性蛋白質を、0℃で8000×g
で15分間の遠心分離によりペレット化した。ペレットを
TNE中で二度洗い、変性性ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により不溶性蛋白質の存在について分析した。蛋白
質は、コーマシー(Coomassie)ブリリアント ブルー
Rでの着色により可視化された。 バクテリアの1からの不溶性物質を含むペレット
は、6Mグアニジニウムクロライド/0.1M Tris HCl、pH7.
8、の6ml中で可溶化された。この溶液に約60mgの固体ジ
チオスレイトール(DTT)を加え、37℃で30分間還元が
進行するのを許した。 可溶化され還元された蛋白質は、9.4mm×25cmGF−250
Zorbaxカラム(商標、デュポン社、ウイルミントン、デ
ラウエア)でのゲル浸透クロマトグラフィに付された。
蛋白質溶液の100μlをカラム上に注射し、0.5ml/分の
流速で6Mグアニジウムクロライドにより溶出した。280n
mでの光学的密度をモニターし、30秒間隔で分画を集め
た。分画番号32、すなわち7.75〜8.00mlの間に溶出した
分画を、次の評価のために用いた。注:抵等級のグラニ
ジニウムクロライドが用いられると、DTTの添加は不溶
性の金属硫化物の形成を結果するであろう。 trp−env融合蛋白質も、下記のように精製された。 融合蛋白質は、不溶性ペレットとして(上述)細胞ペ
レットから部分的に精製された。バクテリア4からの
不溶性物質を含むペレットは、6Mグアニジニウムクロラ
イド/0.1M Tris HCl ph7.8、の4ml中に可溶化された。
この溶液に、約100mgの固体ジチオスレイトール(DTT)
を加え、37℃で1時間還元の進行を許した。 可溶化された還元された蛋白質は、FractogelTSKHW−
50(S)(商標、MCBマニュファクチュアリングケミス
ツ、ギブスタウン、ニュージャージィ)の2.6×87cmカ
ラムでゲル浸透クロマトグラフィに付された。還元され
た蛋白質4mlをカラム上にポンプで与え、2×10-4MDTT/
2×10-3エチレンジアミン四酢酸(EDTA)/6Mグアニジウ
ムクロライド(アメリカン リサーチ プロダクツ社、
サウスユークリッド、オハイオ)で溶出した。カラムは
0.5ml/分で運転され、280nmでの光学密度をモニター
し、10分間間隔で分画を集めた。UV吸収ピークの中心か
ら二つの分画、分画34及び35、を次の評価において用い
た。 D.trp−env蛋白質の免疫学的反応性 1.ウエスターンブロットによる分析 pENV−1、pENV−2、pvEN−3、pENV−4及びpENV−
5と表わされる不溶性蛋白質調製物からの小分けしたも
のを、2%ドデシル硫酸ナトリウム/100mM Tris、pH6.8
/20%グリセロール/1.5M β−メルカプトエタノール中
に可溶化し、変性性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳
動した。蛋白質をニトロセルロース(BA85、シュライヒ
ェル アンド シュエル、ケーン、NH)、及び5%ウシ
血清アルブミン(シグマ社)でブロックされたフィルタ
ー上にエレクトロランスファーした。次にフィルター
を、エイズ患者からプールした大腸菌吸着ヒト血清で調
べた。フィルターは、HRP接合ヤギαHuIgで現像され
た。プールは、5つのtrp−env融合蛋白質の総てと反応
性であったが、trpE蛋白質単独とは反応性でなかった。 2.ELISAによる分析 pENV−1、pENV−2、pENV−3、pENV−5及びtrpEの
不溶性蛋白質調製物を、3Mグアニジウムクロライド中に
可溶化した。不溶物質を15,000×gで5分間の遠心分離
により除去した。可溶化した蛋白質濃度は、ブラドフォ
ード(アナリティカル バイオケミストリー)(Bradfo
rd,Analytical Biochemistry)72:248(1976)の方法に
より決定した。蛋白質を1〜2μg/mlの最終濃度に0.05
M炭酸塩/重炭酸塩緩衝液(pH9.6)で希釈した。50μ
の小分けしたものを微小力価くぼみ当り与え、4℃で一
夜インキュベートした。次にプレートを、BLOTTO(0.01
Mリン酸ナトリウム、pH7.2/0.15M塩化ナトリウム中の5
%[w/v]脱脂ドライミルク/0.01%チメロソール (thimerosol)/0.01%アンチフォームA)により37℃
1時間ブロックした。プールした血清陽性血清、男同性
愛者又はLAS患者からの血清、及び健康な異性愛者から
の血清を、BLOTTOとPBS(0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.
3/0.15M NaCl)の1:1混合物により1:100希釈し、希釈し
た血清50μをくぼみに加え37℃で1時間おいた。血清
を除き、プレートを洗浄緩衝液(0.15MNaCl/0.05%[w/
v]Tween20)中で3回洗い、ヤギ抗ヒトIgG/ホースラデ
ィッシュ ペルオキシダーゼ接合体(50mMクエン酸ナト
リウム/0.05%Tween20/1%加熱不活性化性正常ヤギ血
清;アンチボディーズ(Antibodies)社、デービス、カ
リフォルニアから得た、中に1:10,000希釈)の100μ
を37℃で1時間加えた。接合体を除去し、プレートを0.
15M NaCl/0.05%〔w/v〕Tween20により3度洗った。ELI
SA評価は、基質溶液(0.05Mクエン酸ナトリウム、pH7.0
の50ml中の10mgのo−フェニレンジアミン)の100μ
/くぼみを室温で30分間加えることにより現像さた。反
応は、3N H2SO4の100μ/くぼみにより停止され、490
nmでの光学的密度を自動化ELISAリーダーで測定した。p
ENV−1、pENV−2、pENV−3、及びpENV−5により産
生された蛋白質は総て、既知の血清陽性血清と反応性で
あると判った。 pENV−1、pENV−3、及びpENV−5でコードされる蛋
白質の別のスクリーニングは、31のヒト血清サンプルの
パネルに対して上述のグアニジニウムクロライド可溶化
ペレットからの物質(pENV−1でコードされる蛋白質は
更に、上述のようにゲル浸透クロマトグラフィにより精
製された)を用いて実施された。パネルには、健康な異
性愛者(全ウィルスELISAで陰性と定義される)からの
8つの血清、エイズ患者からの2つの血清プール、及び
LAS(リンパ節症候群)と診断された個体からの21の血
清が含まれる。LAS個体からの血清は、全ウィルスELISA
において血清陽性と確認された。12がウエスターンブロ
ット分析により更に確認された。結果を表1に示す。こ
れら結果は、エイズ又はLAS患者からの血清が、正常個
体からの血清と比べて、pENV−1、pENV−3及びpENV−
5でコードされる蛋白質とにより反応性であったことを
示す。この記述は、trp−env融合蛋白質がエイズ原因ウ
ィルス、LAV、と反応性の血清の存在についてスクリー
ンするために用いられうることを示す。 1:ウィルス溶解物は、感染された細胞培養物の上澄みを
10%ポリエチレングリコール(PEG6000)で沈澱し、次
に20〜60%蔗糖勾配中で平衡まで二度バンド形成するこ
とにより調製された。密度1.16でのウィルスバンドを取
出し、ウィルス粒子を超遠心分離により更に濃縮し,次
に0.5%ドデシル硫酸ナトリウムを含むRIPA緩衝液(脚
注2で述べる)中で溶解(分解)し、次に微小力価テス
トプレートのくぼみにコーティングした。 2:放射能ラベルしたLAV抗原を、RIPA緩衝液(ギリード
(Gilead)ら、ネイチア264:263(1976))中で崩壊
し、次にヒト血清と反応させた。得た免疫複合体を黄色
ブドウ球菌吸着体に結合することにより分離し(ケスラ
ー(Kessler)、J.Immunology115:1617(1975))、繰
返し洗った。免疫沈降した抗原をSDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動次にフルオログラフィにより分析した
(ラエムリ(Laemmli)、ネイチア227:680(1970)。p2
5又はgp43バンドの存在は、サンプルを血清陽性と確認
するのに必要かつ十分と考えられた。 3:LAS=リンパ節症候群 4:n.d.=不実施 3.LAVに対する血清抗体の検出のための蛍光スライドテ
スト 上述したように作った可溶性蛋白質をラテックスビー
ズに接合し、蛋白質/ビーズ調製物を顕微鏡スライドに
エタノール固定する。小分けした患者血清をスライド上
で蛋白質/ビーズと共にインキュベートする。スライド
を洗い、エバンス ブルー カウンターステイン中のFI
TCラベルした抗ヒト免疫グロブリンを加える。スライド
を洗い、培養基を乗せ、カバースリップを各々にかけ
る。 あるいは、蛋白質/ビーズ調製物を、患者血清とのイ
ンキュベーションのために試験管に入れる。管を遠心分
離し、洗い、そしてエンバンス ブルー カウンタース
テイン中のFITCラベルした抗ヒト免疫グロブリンを加え
た。管を遠心分離し、上澄みを吸引した。小分けしたビ
ーズを顕微鏡スライド上に置き、エタノール固定し、カ
バーグラスをかける。 総てのスライドを、蛍光顕微鏡により調べる。もしテ
スト血清が抗体陽性なら、ビーズは蛍光緑色の球のよう
に見える;もしテスト血清が抗体陰性なら、ビーズは赤
い球のように見える。 上述から、例示のために本発明の特定の実施態様を記
載したが、本発明の精神及び範囲を離れることなく種々
の変更ができることが理解されよう。従って、本発明
は、特許請求の範囲によってのみ限定されるものであ
る。
質の発現に一般に関し、より詳しくはリンパ節症(lymp
hadenopathy)関連ウィルス(LAV)に対する抗体と免疫
学的に反応性である蛋白質の発現に関する。 (背 景) 後天性免疫不全症候群(AIDS)は、日和見感染及びあ
るまれな悪性腫瘍により特徴づけられる細胞免疫の伝達
しうる疾患である。AIDSの主な危険性のある群として、
同性愛活動の男性、静脈注射麻薬常用者、輸血及び血液
製剤を受ける人、及び危険度の高い個人の異性性交相手
及び子供が含まれ、このことは濃厚接触又は血液物質を
通じて伝達される感染物の関与を示唆している。 最近の証拠によると、病気伝達に責任ある感染エージ
ェントは、リンパ節症関連ウィルス(LAV)として知ら
れる新しいリンパ反応性(lymphotropic)レトロウィル
スである(バレーシノウシ(Barr′e−Sinoussi)ら、
サイエンス(Science)220:868(1983))。同様のウィ
ルスが他の科学者グループにより報告されており(ポポ
ビック(Popovic)ら、サイエンス224:497(1984);レ
ビィ(Levy)ら、サイエンス225:840(1984)、ヒトT
細胞リンパ反応性ウィルスタイプIII(HTLV−III)、エ
イズ関連レトロウィルス(ARV)、又は免疫不全関連ウ
ィルス(IDAV)と呼ばれた。より最近のデータによる
と、LAV,HTLV−III,ARV及びIDAVは、実質的なヌクレオ
チド相同性を含むいくつかの重要な特徴を共有し(ワイ
ン−ホブソン(Wain−Hobson)ら、セル(Cell)40:9
(1985);ミューシング(Muesing)ら、ネイチア(Nat
ure)313:450(1985);サンチェス・ペスカドール(Sa
nchez−Pescador)ら、サイエンス227:484(1985)、ウ
ィルス分離物の間で株ごとの変化が存在する可能性はあ
るけれど、同じウィルスの分離物であると考えられるべ
きである。実質的なヌクレオチド相同性を示すことに加
え、分離物は、形態学、細胞病理学、最適逆転写酵素活
動のための要件、及び少くともいくつかの抗原的特性の
点で同じである(レビイ、前出;シュプバッハ(Schuph
ach)ら、サイエンス224:503(1984))。 上述のように、このウィルスは血液物質(血液、血
清、血漿、及びこれらの分画)を通して伝達しうること
が知られ、提供者がウィルスに暴露されたことがあるか
どうか決定するために血液物質をスクリーンすることが
重要となる。これは、LAV及び関連ウィルスに対する抗
体の検出のための酵素結合イミムソルベント評価(ELIS
A)を含むいくつかの方法のいずれかで行うことができ
る。その血液がLAVに対する抗体を含む個人は、「血清
陽性」と云われる。血清陽性提供者からの血液は、検出
されしだい血液供給から除外され、それにより病気の伝
播を除ぐのを助けうる。 LAVに暴露された個人の免疫応答は色々である。p13、
p18、p25、p36、gp43、p55、gp110などを含むいくつか
のウィルス蛋白質のいずれかに対して抗体が産生される
ことができる(シュプバッハら、ニュー イングランド
ジャーナル オブ メディシン(New Engl.J.Med.)3
12:265(1985))。総ての個人が、同じ蛋白質に対する
又は所定の蛋白質上の同じエピトープに対する抗体を作
る訳ではない。 現在行われているような血清陽性者の検出は、いくつ
かの固有の問題を持つ。これら問題のうち最大のもの
は、免疫学的評価のために全ウィルスから抗原を分離す
る必要性である。この分離は、多量の、生きた、感染可
能性のあるウィルスの取扱いを要し、これ自体、重大な
安全上の傷害を与える。加えて、収率、純度、及び実施
ごとのウィルスの再現性に関する心配がある。このこと
は、許容できない多数の偽の陽性及び/又は陰性を結果
する。従って、血液スクリーニング評価において有用で
あり、かつ更に他の関連した利点を持つウィルス抗原を
作る代りの方法に対して、当該分野にニーズがある。 加えて、この病気のための効果的処置はまだ見い出さ
れていない。エイズの広がりが異例なものとなり初め、
もう疾病的割合でないなら、ウィルスが伝達される程度
はなお疑問であり、一般人を免疫化する医薬組成物に対
するニーズがまた存在する。 (本発明の開示) 簡単に云えば、本発明はLAVゲノムのエンベロープ(e
nv)領域の一部分を含むDNA配列を開示し、上記一部分
は、LAVに対する抗体と免疫学的に反応性である蛋白質
をコードする。バクテリア宿主細胞中で複製しうる組換
えプラスミドも開示される。このプラスミドは、発現の
ための原核細胞(procaryotic)転写及び翻訳シグナル
を含み、上述のDNA配列が読みフェーズにおいて続く。
好ましい実施態様において、シグナルは、誘発しうる及
び/又は抑制しうるオペロンたとえばtrpオペロンから
選ばれる。上述した組換えプラスミドにより形質転換さ
れたバクテリア細胞たとえば大腸菌も開示される。 本発明の別の面は、LAVに対して反応性の抗体又はT
細胞と免疫的に反応性である蛋白質を作る方法を開示す
る。この方法は、バクテリア宿主細胞中で複製しうる組
換えプラスミドをバクテリア宿主細胞に導入することを
含む。このプラスミドは、発現のための原核細胞転写及
び翻訳シグナルを含み、LAVゲノムのenv領域の一部分
(該一部分はLAVに対する抗体と免疫学的に反応性であ
る蛋白質をコードする)を含むDNA配列が読みフェーズ
(reading phase)において続く。プラスミドの導入の
次に、バクテリア宿主は、適当な倍地で増殖される。蛋
白質の発現がそして誘発され、その配列の蛋白質生成物
がバクテリア宿主から分離される。蛋白質生成物は、分
離のあとでたとえばゲル浸透クロマトグラフィにより精
製できる。 本発明の更に別の面は、生物的液中のLAVに対する抗
体の存在を決定するための方法を開示する。一つの実施
態様において、この方法は、上述の組換えプラスミドで
形質転換されたバクテリア細胞により産生された蛋白質
と共に生物学的液体をインキュベートし、それにより反
応混合物を形成し、そして続いて抗体の存在を決定する
ために反応混合物を分析することを含む。好ましい実施
態様において、反応混合物を分析する工程は、抗体のた
めのラベルされた特異的結合パートナーと反応混合物を
接触させることを含む。別の実施態様において、LAVに
対する抗体の存在は、抗体を含むと疑われるサンプルと
固定化組換え蛋白質に結合するラベルされたモノクロー
ナル抗体との間の競争を実施することにより決定され
る。反応混合物は次に、固相に結合したラベルされた抗
体の量を決定するために分析される。 本発明の別の面は、生物的液体中のLAV抗原の存在を
決定する方法を開示し、これは上述した組換えプラスミ
ドで形質転換したバクテリア細胞により産生されたラベ
ルされた蛋白質と共に生物的液体をインキュベートする
こと、及び続いて又は同時に、特異的結合が起るような
蛋白質に対する抗体と共にインキュベートすることを含
む。次に、インキュベーションの間に形成された反応混
合物が、抗体と結びついたラベルの量を決定するために
分析される。 上述した組換えプラスミドにより形質転換されたバク
テリア細胞により産生された蛋白質により動物を免疫化
することを含む、LAVに対する抗体を作る方法も開示さ
れる。 本発明の別の面は、生物的液体中のLAVに対する抗体
の存在を決定するための方法を開示し、これは上述の組
換えプラスミドにより形質転換されたバクテリア細胞に
より作られた蛋白質にラテックスビースを接合すること
を含む。次に、生物的液体がビーズ/蛋白質接合体とイ
ンキュベートされ、それにより反応混合物を形成する。
反応混合物は次に、抗体の存在を決定するために分析さ
れる。 本発明に従い作られた蛋白質は、適当なキャリア又は
希釈剤と共に用いられると、免疫学的に効果的なワクチ
ン組成物を形成する。生理学的に許容できるキャリアに
付着されたLAVゲノムのenv領域の一部分を含むDNA配列
によりコードされる蛋白質の免疫学的有効量を個体に投
与することにより、エイズに責任あるウィルスにより起
される感染を防ぐことができる。 本発明の別の面は、下記の詳細な説明及び添付図面よ
り明らかとなろう。 本発明の実施のための最良の態様 本発明を述べる前に、本発明書で用いられる言葉の定
義を述べることが、本発明の理解のために役立つであろ
う。 リンパ節症(Lymphadenopathy)関連ウィルス(LAV):
ヒトT−リンパ反応性(T−lymphotropic)レトロウィ
ルス。本発明の目的のために、一つのウィルスがもし下
記の判断基準を実質上満すなら、それはLAVと同じ又は
同等であると考えられる: (a) ウィルスがTリンパ球、特にTヘルパー細胞
(CD4+、ベルナード(Bernard)ら編、白血細胞タイプ
分け(Leucocyte Typing)、ニューヨーク、スプリンガ
ー出版(1984)に定義された国際表記法による)に対し
て反応する; (b) ウィルスが、感染されたCD4+細胞に対し細胞変
性的である(HTLV−I及びIIのように形質転換的である
よりも); (c) ウィルスが、Mg2+依存性である(最適濃度5m
M、最適pH7.8、アクチノマイシンDにより抑制できな
い)RNA依存DNAポリメラーゼ(逆転写酵素)をコード
し、その3′LTRからの逆転写のためのプライマーとし
てオリゴ(dT)12-18を用いることができる; (d) ウィルスは、約1.16の密度で蔗糖勾配中でバン
ドをなす; (e) ウィルスは、[3H]ウリジンでラベルされう
る; (f) ウィルスは、免疫学的及びヌクレオチド配列判
断基準により、ウィルスのHTLV−I/II科の員と区別され
る(この判断基準によりHTLV−IIIはHTLV−I/II科の一
員とは考えられない); (g) ウィルスは、LAVのgag及びenv領域によりコー
ドされる蛋白質と本質的に免疫学的に交叉反応性であ
る;及び (h) ウィルスは、LAVと実質的なヌクレオチド相同
性(78〜100%)及びアミノ酸配列相同性(90〜100%)
を共有する。 免疫学的に反応性:抗原及び抗体が互いに特異的に、曲
型的には少くとも106M-1の親和性、より多くの場合には
少なくとも108M-1の親和性でもって結合できるとき、そ
さらは「免疫学的に反応性」であると云われる。 形質転換された又は形質転換:精製したDNAの導入によ
り受け入れ細胞又は微生物の遺伝子型を安定かつ遺伝し
うるように変えるプロセス。 リンパ節症関連ウィルス(LAV)は、エイズ又はリン
パ節症候群の患者から分離できる。そのような患者のリ
ンパ節は曲型的にはバイオプシーされ、増殖を支持する
のに必要なように補われた培養基中に置かれる。ミトゲ
ンたとえばインターロイキン−2(IL−2)又はヒトヘ
マグルチニン(PHA)が含まれることができる;ヒトイ
ンターフェロンに対する抗血清も含まれることができ
る。逆転写酵素活性は典型的には、培養の約15日に現わ
れ、ウィルスの存在を示す。ウィルスは、非イオン性界
面活性剤を用い、次に蔗糖勾配中でのバンド形成によ
り、培養上澄みから濃縮できる。精製のこれら及び他の
方法は、当業界で周知であり、たとえばモンテラロ(Mo
ntelaro)ら、ジャーナル オブ バイロロジー(J.Vir
ology)42:1029(1982)に記載されている。 LAVは、多数の方法で増殖できる。臍帯又は末梢血液
又は骨髄から由来するTリンパ球中でそれは培養でき
る。あるいはそれは、不死化したT細胞またはB細胞中
で増殖できる;たとえばポポビックら、サイエンス224:
497(1984)、及びモンタグニエル(Montagnier)ら、
サイエンス225:63(1984)。ウィルスの増殖は通常、逆
転写酵素活性の存在によりモニターされる。 LAVのゲノムクローンは、当業界で周知のいくつかの
方法のいずれかで調製でき、たとえばハーン(Hahn)
ら、ネイチア312:166(1984);アリゾン(Alizon)
ら、ネイチア312:757(1984);ルシウ(Luciw)ら、ネ
イチア313:760(1984);及びミューシング(Muesing)
ら、ネイチア313:450(1985)が挙げられるが、これら
に限定されない。 簡単に云えば、これら方法の一つ(アリゾンら)では
DNAが健康な提供者のLAV感染したT細胞から分離され、
Hind IIIののような制限エンドヌクレアーゼで部分的に
消化され、そして得られた消化物は電気泳動的に分画さ
れる。全LAVゲノムのサイズ(約9.2Kb)にサイズ的に対
応する分画がゲルから溶出され、沈降され、再懸濁さ
れ、そして適当に制限したベクターのアーム中に連結
(リゲート)される。リゲーション混合物はバクテリオ
ファージ粒子中に入れられる。バクテリアはバクテリオ
ファージによりトランスフェクションされ、クローンは
適当なプローブ(たとえばLAV−RNAから作られたcDNA)
を用いてLAV挿入物についてインサイツにスクリーンさ
れる。そのようなクローンから、LAVの望む領域がpUC18
のようなバクテリアプラスミドベクター中にサブクロー
ンされうる。それ以上のサブクローニングは、非所望の
配列を除去するため、及び発現ベクター中へのクローニ
ングを促進する目的でいずれかの端に追加的制限部位
(ポリリンカーの形で)を加えるために望ましいことで
ありうる。 LAV配列は次に、誘発しうる発現ベクター中にサブク
ローンされうる。種々の発現ベクターが当業界で知られ
ており、λgt11:Tn5(ホール(Hall)ら、ネイチア311:
379(1984);trpE(ポール(Paul)ら、ヨーロピアン
ジャーナル オブ セル バイオロジー(Euro.J.Cell
Biol.31:171(1983);pIN III(マスイ(Masui)ら、バ
イオテクノロジー、1984年1月、p81)を包含する。 得られた蛋白質は、部分的に精製され、免疫原として
及び免疫評価における抗原として包含する種々の目的に
用いられることができる。免疫原としての使用のため
に、蛋白質は緩衝溶液中又はアジュバントに含めて、マ
ウス、ラビット、ヤギなどのような動物に注射されう
る。あるいは蛋白質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により精製でき、興味のバンドがゲルから切断さ
れ、トリチュレート化され、そして宿主動物への注射の
ために緩衝液に再懸濁される。ポリクローナル又はモノ
クローナル抗体が作られうる。免疫評価における抗原と
しての使用のために、蛋白質はラベルされた又はラベル
されていない形で行いることができる。それらがラベル
される場合、ラベルとしては放射性同位元素、蛍光物
質、酵素、燐光物質又は粒子が挙げられる。これら及び
他のラベルは当業界で周知であり、たとえば米国特許3,
766,162号、3,791,932号、3,817,837号、3,996,345号、
及び4,233,402号に記載されている。 本発明の組換え蛋白質を用いる評価(アセイ)は、不
均一(すなわち分離工程を要する)又は均一でありう
る。もし評価(アセイ)が不均一であるなら、遠心分
離、濾過、クロマトグラフィ、又は磁化を含む種々の分
離手段を用いることができる。 抗体の存在について血液物質又は他の生理的液体をス
クリーンする一つの好ましい評価法は、ELISA評価法で
ある。典型的には、抗原(この場合、組換え蛋白質の一
つ又組み合せ)は、微小力価くぼみの表面に吸着され
る。次に表面上の残りの蛋白質結合部位は、適当な剤た
とえばウシ血清アルブミン(BSA)、熱不活性化正常ヤ
ギ血清(NGS)、又はBLOTTO(保存剤、塩及び消泡剤を
含む脱脂乾燥ミルクの緩衝溶液)によりブロックされ
る。くぼみは次に、特定の抗体を含むと疑われるサンプ
ルと共にインキュベートされる。サンプルは無希釈で適
用されることができ、又はより多くの場合にはそれは、
BSA、NGS又はBLOTTOのような蛋白質の少量(0.1〜5.0重
量%)を含む緩衝液を通常用いて希釈されることができ
る。特異的結合が起るのを許すのに十分の長さの時間イ
ンキュベートした後に、くぼみは結合していない蛋白質
を除くために洗われ、次にラベルされた抗ヒト免疫グロ
ブリン抗体(αHuIg)と共にインキュベートされる。ラ
ベルは、ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ(HR
P)、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファター
ゼ、及びグルコースオキシダーゼを含む種々の酵素から
選ばれうる。特異的結合が起るのに十分な時間を許し、
次に、結合していない蛋白質を除くためにくぼみを再び
洗い、そして酵素のための基質を加える。色が現われる
のを許し、くぼみの内容物の光学的密度を肉眼で又は機
器で決定する。 便宜のために、ELISA評価のための剤は、キットの形
で用意される。これらキットは、組換え技術により作ら
れたウィルス蛋白質がそれに予め吸着されたところの微
小力価プレート、種々の希釈剤及び緩衝剤、特異的に結
合された抗体の検出のためのラベルされた接合体、及び
他のシグナル発生剤たとえば酵素基質、コファクター、
及び色原体を含むことができる。 エイズ患者のかなりの数が高度に免疫抑制され、そし
て高力価抗体を作る能力を進行的に失うという事実によ
り、本発明は、LAVに対する抗体と免疫学的に反応性で
ある蛋白質をコードするLAVゲノムのエンベロープ(en
v)領域の部分を用いる。LAVのエンベロープグリコプロ
ティンに対する抗体の存在は、他のウィルス蛋白質に対
する抗体の存在よりも良いLAV感染の指標である。なぜ
なら、エンベロープグリコプロティンに対する抗体力価
は、病気の後半の段階の間持続すると考えられ、一方、
他の蛋白質たとえばコア蛋白質に対する抗体は検出しう
るレベルより下に低減するかも知れないからである。 本発明の組換え蛋白質の別の適用は、ヒトワクチンと
しての使用である。組換え蛋白質は、高度に精製され、
慣用の方法で宿主の1kg当り1μg〜20mgの濃度で処方
されうる。生理的に許容されるキャリアたとえば滅菌
水、食塩水、緩衝された食塩水などが用いられうる。水
酸化アルミニウムのようなアジュバントも用いうる。ワ
クチンは、静脈内、皮下、筋肉内又は腹膜内注射により
投与できる。一回の注射が十分でありうるが、より多く
の場合、週毎ないし月毎の間隔での複数回注射が好まれ
る。 あるいは、LAVゲノムの領域を表現するワクチンウィ
ルス組換え体が構成されうる。たとえば、本発明の構成
物は、pMM34(マケット(Mackett)ら、サイエンス227:
433(1985))のようなプラスミド、及び相同組換えに
より形成された得られたキメラプラスミドを含むワクチ
ンウィルスハイブリッド中に挿入されうる。そのような
組換えウィルスワクチンによる免疫化は、動物において
B型肝炎ウィルス及び水泡性口内炎ウィルスに対する保
護免疫を誘発するのに有効であると判っている(スミス
(Smith)ら、ネイチア311:578(1984))。 この方法における組換え蛋白質ワクチンの使用は、不
活性化された調製物又は病原性微生物の非ウイルレント
(avirulent)株からワクチンを構成する必要を除去す
る。 LAVの遺伝子構造、5′LTR−gag−pol−Q−env−F
−3′−LTRは、レトロウィルスのうちで独特である。
他の総ての既知の複製能力であるレトロウィルスにおい
て、pol及びenv遺伝子はオーバーラップしている;LAVに
おいては、それらはオープン読み枠Qにより分離されて
いる(ワイン−ホブソンら、セル40:9(1985))。 envオープン読み枠は、第8トリプレットにおいて可
能な開始部位(メチオニンコドン)を持ち、従って分子
量97kdの一部分をコードすると予期される。これは、変
性性ポリアクリルアミドゲル上のLAVグリコプロテイン
の見かけ分子量(110kd)と一致する。env遺伝子中に32
の可能性あるN−グリコシル化部位(Asn−x−Ser/Th
r)がある。レトロウィルスエンベロープ蛋白質の特徴
である三つの疎水性領域も存在し、シグナルペプチド
(ヌクレオチド5815−5850によりコードされる)、第二
領域(7315−7350)、及び透過膜セグメント(7831−78
96)に対応する。第二領域は、蛋白質分解プロセシング
部位を表わすと考えられるArg/Lysに富む領域に続く
(ワイン−ホブソン、前出)。 上述のように、LAVグリコプロテインに対する抗体(e
nv遺伝子生成物)は、ウィルス感染の経過中初期に現わ
れ、病気の後半の段階でも同様に持続する(キッチェン
(kitchen)ら、ネイチア312:367(1984))。従ってグ
リコプロテインに対する抗体は、グリコプロテイン又は
その部分を作るLAVに対する過去の暴露の特に良い指標
であり、血液スクリーニング評価法において特に有用で
ある。 LAVゲノムのenv領域の特に好ましい部分は、ENV−3
である。第3図に示すように、ENV−3はヌクレオチド
配列のbp7178からbp7698にわたる。第7図において、下
記のサブ領域(第7図上で上に線を引いた)が領域内に
含まれる:(1)bp7315から7350によりコードされる疎
水性ペプチド;(2)gp65及びgp43へのエンベロープ前
駆体蛋白質の開裂のための推定の蛋白質分解プロセシン
グ部位を含むドデカペプチド;(3)二つのシステイン
残基の周辺の高度に保存される領域;(4)3′(カル
ボキシル)末端の保存される配列;及び(5)5′(ア
ミノ)末端の保存される配列。 ENV−3の種々のサブ領域に対応する合成ペプチドを
用いて得られたデータは、最も重要な領域がシステイン
残基を含む又はこれに極近い領域及び蛋白質分解プロセ
シング領域を含む又はこれに極近い領域であることを示
す。これらペプチドの或る物の合成及びスクリーニング
は、出願中の米国特許出願シリアルNo.728,052(1985年
4月29日出願、コサンド(Cosand))に記述されてい
る。 また、END−3はまた、潜在的グリコシル化部位を殆
んど欠き;従って組換え蛋白質の抗原性は天然蛋白質の
それを模倣すると合理的に予期されうる。env遺伝子及
びその蛋白質生成物の全配列は第8図に示され、そこで
は潜在的グリコシル化部位が上に線を引かれている。第
8図で、ENV−3の大きな範囲がそのような部位を欠く
こと、及び遺伝子の残部と比べてENV−3は全体として
顕著にグリコシル化が少ない(underglycosylated)こ
とが判る。 下記の実施例で、λJ19と名付けられたLAVゲノムクロ
ーンは、バクテリアプラスミドベクター、pUC18、中に
サブクローンされた。得られたサブクローン(pBT−1
と呼ばれる) (ATCC寄託番号53069を与えられた)は更にサブクロー
ンされて、pRS−3を与え、これはenv、F及びLTR領域
配列を主に含んだ。env及びF配列の一部は、更にM13mp
18中にサブクローンされ、次にenv配列の領域がtrpE誘
発性発現ベクター中に移された。envDNAは、trpE遺伝子
のインフレーム下流に挿入され、大腸菌がこの構成物に
より形質転換されたとき、trpE−env融合蛋白質の発現
を結果した。得られた蛋白質は部分的に精製され、既知
の血清陽性及び既知の血清陰性個体からの血清を用いる
ELISAにおけるそれらの反応性により特徴づけられた。p
ENV−1ないしpENV−5と呼ばれる5つの有用な構成が
同定された。 下記の実施例は、例示のために示され、制限のためで
はない。 実施例 A.trp−env発現ベクターの構成 外来蛋白質を発現するために、いくつかのバクテリア
発現系のいずれかを用いることができる。trpE系がLAVe
nv配列の発現のために選ばれた。なぜならそれは強い誘
発しうるプロモータを含み、しかしその発現はまた、外
来の(かつ潜在的に毒性の)蛋白質がバクテリア内に長
時間蓄積しないように抑制されうるからである。外来挿
入物を含むベクターで形質転換されたバクテリアをスク
リーン又は選別するための速く簡便な方法はない(ベク
ター単独で形質転換されたバクテリアとはちがって)の
で、DNAの大きな片(たとえばλファージDNA)の望む領
域を、挿入物のための選択系を含むベクター中に、trpE
発現ベクターにそれを移す前にサブクローンすることが
便宜である。これは、望む挿入物を含むもののために、
形質転換されたバクテリアをスクリーンすることを容易
にする。 従って本発明のアプローチは、まずLAVゲノムのenv領
域の多くを転移ベクターM13mp18中に二段階でサブクロ
ーンすることであった(第1図)。次に、このサブクロ
ーンの種々のフラグメントは、ポリリンカー領域中の制
限部位の読み枠においてのみ異る三つのtrp発現ベクタ
ー(pJH11、pJH12、pJH14)のいずれかへと連結された
(第2図)。得られたサブクローンのいくつか(たとえ
ばpENV−5、pENV−4)はそのままで用いられたが、他
のものは望む生成物を作るために更に修正を必要とした
(pENV−1、pENV−2、p−ENV−3)。 1.LAVゲノムサブクローニング a.ファージDNAの調製 LAVゲノム全体は、ファージλL47.1のHind III部位に
9.2KbゲノムDNA挿入物を含むλファージ粒子の形でパス
ツール インスティチュート(Pasteur Institut)から
得られた。このクローンは、λJ19と呼ばれ、ワイン・
ホブソンら、セル40:9(1985)に記載される。λJ19フ
ァージ粒子は、マニアチス(Maniatis)ら、モレキュラ
ークローニング:ラボラトリーマニュアル、ニューヨー
ク、コールドスプリングハーバーラボラトリー、1982、
p64の手順に従って、大腸菌K−12のQ359株(Q359株の
ゲノタイプはhsdRk-,hsdMk+supF,φ80、P2である)中に
トランスフェクトされた。単一のプラークが取り上げら
れ、ファージはプレートリセート法(マニチアス、前
出、p65)により増幅された。37℃で9時間のインキュ
ベーション後に、豊富なプラークを含むプレート(100m
m直径)は、100mM NaCl/20mM MgSO4/50mM Tris、pH7.
5、の5mlによりおおわれた。4℃で12時間のインキュベ
ーション後に、液体が集められ、等体積のクロロホルム
で2度抽出された。 ファージ粒子を含む得た水性相の10mlに、0.25M EDTA
/2.5%SDS/0.5M Tris、pH9、の2mlを加え、懸濁物を70
℃で15分間インキュベートして、ファージを破壊した。
8M酢酸カリウム2.5mlを加え、溶液を氷上で15分間イン
キュベートし、次に4℃で12,000×gで10分間遠心分離
して蛋白質をペレット状にした。上澄みを、50mlポリプ
ロピレン遠心分離管に移し、20℃で等体積のフェノール
(pH8、1M Tris、pH8、で緩衝)で抽出した。水性相を
次に、20℃で等体積のクロロホルム:イソアミルアルコ
ール(24:1)で抽出した。水性相に次に、2.5体積の95
%エタノールを加えて、DNAを沈澱させた。遠心分離の
後にDNAペレットを乾燥し、10mM Tris HCl、pH7.4/1mM
EDTA中に再懸濁した。 b.env領をサブクローニングすること 上述のA.1.aで調製されたλJ19DNAの約12μgを、制
限酵素Sst I(ベセスダ リサーチ ラブズ、ベセスダ
メリーランド)で完全に消化した。これは、LAVのこ
の分離物のLTR領域においてのみ切断する。消化混合物
を、0.089M Tris−ホウ酸塩/0.089Mホウ酸/1mM EDTA中
の0.9%アガロースを通して1V/cmで電気泳動した。9.1K
bフラグメントの位置は、臭化エチジウムで着色した後
に分子量標準に比べて決定された。このバンドは、NA45
紙(シュライヒェル アンド シュエル(Sch1eicher a
nd Schuell)、キーン、NH)中に電気溶出された。DNA
は、製造者により提供された指示書に従って紙から回収
された。 9.1Kb Set Iフラグメントは、Set I消化されたベクタ
ーpUC18中に、10挿入物分子:1ベクター分子の比で連結
された。大腸菌株HB101が、マニアチスら(前出)のCaC
l2手順により、連結混合物により形質転換され、LB+ア
ンピシリン(200μg/ml)寒天プレート上にプレートさ
れた。 単一のコロニーを取り上げ、3mlのLB+アンピシリン
培養基で希釈し、一定振とう下に37℃で一夜増殖した。
プラスミドDNAは、アルカリ性リシス(lysis)法(マニ
アチスら、前出、p368)により調製された。プラスミド
DNAの制限分析により調べたときポリリンカー中のEco R
I部位がLAVゲノムの5′末端に最も近いような配位で
9.1Kb Sst I挿入物を含む一つのコロニーが選択され
た。このサブコローンはpBT−1と名付けられた(ATCC
寄託番号53069)(第1図)。 プラスミドpBT−1は次に、Eco R Iで消化され、LAV
ゲノムの3′末端をまだ含むベクターを再連結した。こ
れは、プラスミドから5′Eco R Iフラグメントを除去
するように働く。HB101細胞が、連結混合物で形質転換
され、挿入物pRS−3を含むコロニーが、精製されたプ
ラスミドDNAの制限分析により同定された。 env領域の多くを含む、bp5889とbp8572のKpn I部位の
間の配列〔ワイン−ホブソンら、セル40:9(1985)に従
い番号付け〕が次に、pRS−3からM13mp18ベクターへ転
移された。これは、余分の(非env)配列を更に除去す
るため、及びまた選択/スクリーンできるマーカーとし
てアンピシリンでなくβ−ガラクトシダーゼを用いるベ
クター中にenv配列を置くために行われた。これは、次
の理由で有利である。trpE発現ベクターはその選択マー
カーとしてアンピシリン耐性を用いる;アンピシリン耐
性因子をコードする一つのベクター(pUC18)から他の
もの(trp発現ベクターpJH11、12、14)への挿入物の転
移は、望む挿入物+ベクターのためのスクリーニングを
より困難にするであろう。M13ファージが、env配列の挿
入によるβ−ガラクトシダーゼの不活性化を評価するた
めに発色原基質5−ブロム−4−クロル−3−インドリ
ル−β−ガラクトシド(シグマケミカル社)を用いてス
クリーンされた。挿入物を含むこれらファージは、ポリ
リンカー領域中の制限部位に対しての挿入物の配位につ
いてスクリーンされた。DNAは、組換え体(mpSW16、mpS
W19)から各配位について単離された(第1図)。 2.env配列へのtrpベクターへの挿入 発現ベクターは、大腸菌trpオペロンプロモーター、
オペレーター、及びpBR322に挿入されたtrpE遺伝子を含
んだ(第2図)。trpE遺伝子は、ポリリンカー配列の挿
入により、その5′の多くのBg1 II部位で切り詰められ
た(コノプカ(Konopka)ら、J.Virol.51:223(198
4))。種々のtrpベクター(pJH11、pJH12及びpJH14)
は、ポリリンカー領域内の制限部位の読み枠に従って異
った。適当なベクター中へのオープン読み枠の挿入は、
アミノ末端でのtrpE配列との融合蛋白質の産生を結果す
る(スピンドラー(Spindler)ら、J.Virol.49:132(19
84))。 本発明者は、発現のためにLAV−envの5つの重なり合
う領域を選んだ(第3図)。選択は、これらベクター中
の挿入物サイズへの制限により(コノプカら、J.Virol.
51:223(1984))、及び発現のために有害でありうる疎
水性配列の位置により指示された。 pENA−5(ATCC寄託番号53074)は、ポリリンカー領
域中のmpSW19のBam H1部位からenvHind III部位(bpNo.
7698)までのenv領域を、Bam H1及びHind III(ニュー
インランド バイオラブズ)制限されたpJH12へ連結
することにより構成された(第4図)。連結物は、CaCl
2ショックされた大腸菌HB101中に形質転換され、バクテ
リアは、100μg/mlのアンピシリン(シグマ社)及び20
μg/mlのトリプトファン(シグマ社)の存在下に置かれ
た。トリプトファンは、その蓄積がバクテリアに対して
有害でありうるところの外来蛋白質の発現を抑制するた
めに加えられた。アンピシリン耐性コロニーが、envフ
ラグメントを含む組換えプラスミドの存在について微量
溶解物(minilysates)によりスクリーンされた。 pENV−1(ATCC寄託番号53070)は、二つのBg1 II配
列(bp6598及びbp7178)の間の配列を除去することによ
ってpENV−5から導かれた(第4図)。この除去は、Bg
1 II部位の少し後に停止コドンを導入することによりオ
ープンし読み枠のサイズを減少した。 pENV−2(ATCC寄託番号53071)は、二つのBg1 II配
列(bp6598及びbp7178)の間のフラグメントをBamHI制
限されたpJH14中に挿入することにより構成された(第
5図)(Bg1 IIとBam H I突出部は相溶性である)。大
腸菌HB101が連結反応により形質転換され、アンピシリ
ン耐性コロニーが、pJH14中へのenv挿入物の存在及び配
位について制限分析によりスクリーンされた。 pENV−3(ATCC寄託番号53072)は、mpSW19のBam H I
部位(ポリリンカー中の)とHind III部位(bp7698)の
間のenv領域を、Bam H I及びHind III制限されたpJH11
へ連結することを要する(第5図)。大腸菌HB101が連
続反応により形質転換され、アンピシリン耐性コロニー
が微小溶解物によりスクリーンされた。適当なコロニー
からのDNAを分離し、Bam H I及びBg1 II(ニュー イン
グランド バイオラブズ)で消化し、再連結した。この
DNAが、大腸菌HB101を形質転換するために用いられた。
得たアンピシリン耐性バクテリアは、Bam H I〜Bg1 II
フラグメントを除去した組換えプラスミドについて制限
分析によりスクリーンされた(第5図)。フラグメント
の除去は、Bg1 II部位(bp7178)とHind III部位(bp76
98)の間のenv配列を正しい読み枠中にもたらした。 pENV−4(ATCC寄託番号53073)は、mpSW16からのHin
d IIIフラグメントを、Hind III及びウシ腸アルカリ性
ホスファターゼ(ボーリンガー マンハイム(Boehring
er Mannheim)により処理されたpJH2に連結することに
より構成された(第6図)。組み換えプラスミドは、連
結混合物により大腸菌HB101を形質転換し、そして微小
溶解物の制限分析によるスクリーニングによって同定さ
れた。 B.蛋白質発現 1.trp−env構成物による大腸菌の形質転換組換えtrp−e
nv発現プラスミドの各々は、大腸菌HB101から大腸菌C60
0へ転換された。なぜなら、後者は蛋白質産生のための
潜在的により良い宿主であるからである。転移は、HB10
1の微小溶解物(minilysates)からのスーパーコイルDN
Aによる、CcCl2ショックされたC600の形質転換を含む、
バクテリアは、記載されるように(コノプから、J.Viro
l.51:223(1984)アンピシリン及びトリプトファンの存
在下でプレートされた。薬剤耐性コロニーは、適当なプ
ラスミドの存在を確認するために微小溶解物によりスク
リーンされた。 2.trp−env蛋白質の発現 trp発現ベクターで形質転換された大腸菌C600の増殖
及び誘導は、記述されている通りであった(スピンドラ
ーら、J.Virol.49:132(1984);コノプガら、J.Virol.
51:223(1984)。簡単に云えば、トリプトファン(20μ
g/ml)及びアンピシリン(100μg/ml)を含む最小培地
が、グリセロール貯蔵からの形質転換されたバクテリア
を接種された。培養物は、37℃で空気吹込み下に一夜増
殖された。一夜培養物は次に、アンピシリン(100μg/m
l)を含みしかしトリプトファンを含まない新鮮な最小
培地に1:100で接種された。これら培養物は、37℃で2
〜3時間(初期対数相まで)空気吹込み下に増殖され
た。誘導物質、3−β−インドールアクリル酸(シグマ
社)が、95%エタノール中20mg/mlで新鮮に作られたス
トックから20μg/mlの最終濃度まで加えられた。 誘発された培養物は、37℃で空気吹込み下に4〜5時
間増殖され、次にペレット化され、所望により凍結され
た。pENV−1、pENV−2、及びpENV−3からの蛋白質収
率は、典型的には10〜30mg/であり、一方、pENV−4
及びpENV−5からの収率は典型的には1mg/より低かっ
た。 C.trp−env蛋白質の分離及び精製 融合蛋白質は、記載されているように(コノプカら、
J.Virol.51:223(1984))細胞ペレットから部分的に精
製された。簡単に云えば、バクテリアを、誘導された培
養物1当り50mM Tris、pH7.5/0.5mM EDTA/150mM NaCl
(TNE)の100ml中に再懸濁した。リゾチーム(シグマ
社)を、最終濃度1mg/mlまで加えた。0℃で15分間後
に、混合物にNP40を0.2%の最終濃度まで0℃で10分間
加えた。次にDNase(シグマ社)の1〜2mgを、DNase緩
衝液(150mM NaCl/12mM MgCl2)150mlと共に加えた。反
応混合物を0℃で1時間、しばしば撹拌しながらインキ
ュベートした。次に、不溶性蛋白質を、0℃で8000×g
で15分間の遠心分離によりペレット化した。ペレットを
TNE中で二度洗い、変性性ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により不溶性蛋白質の存在について分析した。蛋白
質は、コーマシー(Coomassie)ブリリアント ブルー
Rでの着色により可視化された。 バクテリアの1からの不溶性物質を含むペレット
は、6Mグアニジニウムクロライド/0.1M Tris HCl、pH7.
8、の6ml中で可溶化された。この溶液に約60mgの固体ジ
チオスレイトール(DTT)を加え、37℃で30分間還元が
進行するのを許した。 可溶化され還元された蛋白質は、9.4mm×25cmGF−250
Zorbaxカラム(商標、デュポン社、ウイルミントン、デ
ラウエア)でのゲル浸透クロマトグラフィに付された。
蛋白質溶液の100μlをカラム上に注射し、0.5ml/分の
流速で6Mグアニジウムクロライドにより溶出した。280n
mでの光学的密度をモニターし、30秒間隔で分画を集め
た。分画番号32、すなわち7.75〜8.00mlの間に溶出した
分画を、次の評価のために用いた。注:抵等級のグラニ
ジニウムクロライドが用いられると、DTTの添加は不溶
性の金属硫化物の形成を結果するであろう。 trp−env融合蛋白質も、下記のように精製された。 融合蛋白質は、不溶性ペレットとして(上述)細胞ペ
レットから部分的に精製された。バクテリア4からの
不溶性物質を含むペレットは、6Mグアニジニウムクロラ
イド/0.1M Tris HCl ph7.8、の4ml中に可溶化された。
この溶液に、約100mgの固体ジチオスレイトール(DTT)
を加え、37℃で1時間還元の進行を許した。 可溶化された還元された蛋白質は、FractogelTSKHW−
50(S)(商標、MCBマニュファクチュアリングケミス
ツ、ギブスタウン、ニュージャージィ)の2.6×87cmカ
ラムでゲル浸透クロマトグラフィに付された。還元され
た蛋白質4mlをカラム上にポンプで与え、2×10-4MDTT/
2×10-3エチレンジアミン四酢酸(EDTA)/6Mグアニジウ
ムクロライド(アメリカン リサーチ プロダクツ社、
サウスユークリッド、オハイオ)で溶出した。カラムは
0.5ml/分で運転され、280nmでの光学密度をモニター
し、10分間間隔で分画を集めた。UV吸収ピークの中心か
ら二つの分画、分画34及び35、を次の評価において用い
た。 D.trp−env蛋白質の免疫学的反応性 1.ウエスターンブロットによる分析 pENV−1、pENV−2、pvEN−3、pENV−4及びpENV−
5と表わされる不溶性蛋白質調製物からの小分けしたも
のを、2%ドデシル硫酸ナトリウム/100mM Tris、pH6.8
/20%グリセロール/1.5M β−メルカプトエタノール中
に可溶化し、変性性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳
動した。蛋白質をニトロセルロース(BA85、シュライヒ
ェル アンド シュエル、ケーン、NH)、及び5%ウシ
血清アルブミン(シグマ社)でブロックされたフィルタ
ー上にエレクトロランスファーした。次にフィルター
を、エイズ患者からプールした大腸菌吸着ヒト血清で調
べた。フィルターは、HRP接合ヤギαHuIgで現像され
た。プールは、5つのtrp−env融合蛋白質の総てと反応
性であったが、trpE蛋白質単独とは反応性でなかった。 2.ELISAによる分析 pENV−1、pENV−2、pENV−3、pENV−5及びtrpEの
不溶性蛋白質調製物を、3Mグアニジウムクロライド中に
可溶化した。不溶物質を15,000×gで5分間の遠心分離
により除去した。可溶化した蛋白質濃度は、ブラドフォ
ード(アナリティカル バイオケミストリー)(Bradfo
rd,Analytical Biochemistry)72:248(1976)の方法に
より決定した。蛋白質を1〜2μg/mlの最終濃度に0.05
M炭酸塩/重炭酸塩緩衝液(pH9.6)で希釈した。50μ
の小分けしたものを微小力価くぼみ当り与え、4℃で一
夜インキュベートした。次にプレートを、BLOTTO(0.01
Mリン酸ナトリウム、pH7.2/0.15M塩化ナトリウム中の5
%[w/v]脱脂ドライミルク/0.01%チメロソール (thimerosol)/0.01%アンチフォームA)により37℃
1時間ブロックした。プールした血清陽性血清、男同性
愛者又はLAS患者からの血清、及び健康な異性愛者から
の血清を、BLOTTOとPBS(0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.
3/0.15M NaCl)の1:1混合物により1:100希釈し、希釈し
た血清50μをくぼみに加え37℃で1時間おいた。血清
を除き、プレートを洗浄緩衝液(0.15MNaCl/0.05%[w/
v]Tween20)中で3回洗い、ヤギ抗ヒトIgG/ホースラデ
ィッシュ ペルオキシダーゼ接合体(50mMクエン酸ナト
リウム/0.05%Tween20/1%加熱不活性化性正常ヤギ血
清;アンチボディーズ(Antibodies)社、デービス、カ
リフォルニアから得た、中に1:10,000希釈)の100μ
を37℃で1時間加えた。接合体を除去し、プレートを0.
15M NaCl/0.05%〔w/v〕Tween20により3度洗った。ELI
SA評価は、基質溶液(0.05Mクエン酸ナトリウム、pH7.0
の50ml中の10mgのo−フェニレンジアミン)の100μ
/くぼみを室温で30分間加えることにより現像さた。反
応は、3N H2SO4の100μ/くぼみにより停止され、490
nmでの光学的密度を自動化ELISAリーダーで測定した。p
ENV−1、pENV−2、pENV−3、及びpENV−5により産
生された蛋白質は総て、既知の血清陽性血清と反応性で
あると判った。 pENV−1、pENV−3、及びpENV−5でコードされる蛋
白質の別のスクリーニングは、31のヒト血清サンプルの
パネルに対して上述のグアニジニウムクロライド可溶化
ペレットからの物質(pENV−1でコードされる蛋白質は
更に、上述のようにゲル浸透クロマトグラフィにより精
製された)を用いて実施された。パネルには、健康な異
性愛者(全ウィルスELISAで陰性と定義される)からの
8つの血清、エイズ患者からの2つの血清プール、及び
LAS(リンパ節症候群)と診断された個体からの21の血
清が含まれる。LAS個体からの血清は、全ウィルスELISA
において血清陽性と確認された。12がウエスターンブロ
ット分析により更に確認された。結果を表1に示す。こ
れら結果は、エイズ又はLAS患者からの血清が、正常個
体からの血清と比べて、pENV−1、pENV−3及びpENV−
5でコードされる蛋白質とにより反応性であったことを
示す。この記述は、trp−env融合蛋白質がエイズ原因ウ
ィルス、LAV、と反応性の血清の存在についてスクリー
ンするために用いられうることを示す。 1:ウィルス溶解物は、感染された細胞培養物の上澄みを
10%ポリエチレングリコール(PEG6000)で沈澱し、次
に20〜60%蔗糖勾配中で平衡まで二度バンド形成するこ
とにより調製された。密度1.16でのウィルスバンドを取
出し、ウィルス粒子を超遠心分離により更に濃縮し,次
に0.5%ドデシル硫酸ナトリウムを含むRIPA緩衝液(脚
注2で述べる)中で溶解(分解)し、次に微小力価テス
トプレートのくぼみにコーティングした。 2:放射能ラベルしたLAV抗原を、RIPA緩衝液(ギリード
(Gilead)ら、ネイチア264:263(1976))中で崩壊
し、次にヒト血清と反応させた。得た免疫複合体を黄色
ブドウ球菌吸着体に結合することにより分離し(ケスラ
ー(Kessler)、J.Immunology115:1617(1975))、繰
返し洗った。免疫沈降した抗原をSDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動次にフルオログラフィにより分析した
(ラエムリ(Laemmli)、ネイチア227:680(1970)。p2
5又はgp43バンドの存在は、サンプルを血清陽性と確認
するのに必要かつ十分と考えられた。 3:LAS=リンパ節症候群 4:n.d.=不実施 3.LAVに対する血清抗体の検出のための蛍光スライドテ
スト 上述したように作った可溶性蛋白質をラテックスビー
ズに接合し、蛋白質/ビーズ調製物を顕微鏡スライドに
エタノール固定する。小分けした患者血清をスライド上
で蛋白質/ビーズと共にインキュベートする。スライド
を洗い、エバンス ブルー カウンターステイン中のFI
TCラベルした抗ヒト免疫グロブリンを加える。スライド
を洗い、培養基を乗せ、カバースリップを各々にかけ
る。 あるいは、蛋白質/ビーズ調製物を、患者血清とのイ
ンキュベーションのために試験管に入れる。管を遠心分
離し、洗い、そしてエンバンス ブルー カウンタース
テイン中のFITCラベルした抗ヒト免疫グロブリンを加え
た。管を遠心分離し、上澄みを吸引した。小分けしたビ
ーズを顕微鏡スライド上に置き、エタノール固定し、カ
バーグラスをかける。 総てのスライドを、蛍光顕微鏡により調べる。もしテ
スト血清が抗体陽性なら、ビーズは蛍光緑色の球のよう
に見える;もしテスト血清が抗体陰性なら、ビーズは赤
い球のように見える。 上述から、例示のために本発明の特定の実施態様を記
載したが、本発明の精神及び範囲を離れることなく種々
の変更ができることが理解されよう。従って、本発明
は、特許請求の範囲によってのみ限定されるものであ
る。
【図面の簡単な説明】
第1図は、λJ19からのmpSW16及びmpSW19の構成を示
す。 第2図は、ポリリンカー配列を含むtrpE発現ベクターpJ
H11、pJH12、及びpJH14を示す。 第3図は、pENV−1、pENV−2、pENV−3、pENV−4及
びpENV−5中のLAV挿入物の由来を示す。 第4図は、pJH12及びmpSW19からのpENV−5及びpENV−
1の構成を示す。 第5図は、pJH14とmpSW19からのpENV−2、及びpJH11と
mpSW19からのpENV−3の構成を示す。 第6図は、pJH12とmpSW16からのpENV−4の構成を示
す。 第7図は、ENV−3のアミノ酸配列を示す。 第8図は、env領域のヌクレオチド配列及びその蛋白質
生成物を示す。
す。 第2図は、ポリリンカー配列を含むtrpE発現ベクターpJ
H11、pJH12、及びpJH14を示す。 第3図は、pENV−1、pENV−2、pENV−3、pENV−4及
びpENV−5中のLAV挿入物の由来を示す。 第4図は、pJH12及びmpSW19からのpENV−5及びpENV−
1の構成を示す。 第5図は、pJH14とmpSW19からのpENV−2、及びpJH11と
mpSW19からのpENV−3の構成を示す。 第6図は、pJH12とmpSW16からのpENV−4の構成を示
す。 第7図は、ENV−3のアミノ酸配列を示す。 第8図は、env領域のヌクレオチド配列及びその蛋白質
生成物を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所
C12R 1:92)
(C12N 1/21
C12R 1:19)
(31)優先権主張番号 783299
(32)優先日 1985年11月7日
(33)優先権主張国 米国
(US)
微生物の受託番号 ATCC 53069
微生物の受託番号 ATCC 53071
微生物の受託番号 ATCC 53070
微生物の受託番号 ATCC 53072
微生物の受託番号 ATCC 53073
微生物の受託番号 ATCC 53074
審判番号 平8−5380
(72)発明者 ウエスリー コーサンド
アメリカ合衆国 ワシントン州 98011
ボーセル ノースイースト ワンハン
ドレッド アンド フィフティーセカン
ド ストリート 9022
(72)発明者 スーザン マッカードル
アメリカ合衆国 ワシントン州 98105
シアトル アパートメント ディー
ノースイースト フォールス アベニュ
ー 3911
(72)発明者 ブルース マックファーランド トレイ
ヴィス
アメリカ合衆国 ワシントン州 98115
シアトル トゥエンティーナインス
アベニュー ノースイースト 6092
(56)参考文献 特開 昭61−173782(JP,A)
Science,228 (1985) P.
93−96
Science,227 (1985) P.
484−492
Nature,313 (1985) P.
277−284
Cell,40 (1985) P.9−17
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1.LAVゲノムのenv領域のセグメントを含む単離された
DNA配列であって、該配列が、LAVに対する抗体と免疫学
的に反応性である蛋白質をコードし、該配列が、プラス
ミドpENV−1(ATCCNo.53070)の挿入env−1、プラス
ミドpENV−2(ATCCNo.53071)の挿入env−2、プラス
ミドpENV−3(ATCCNo.53072)の挿入env−3、プラス
ミドpENV−4(ATCCNo.53073)の挿入env−4、及びプ
ラスミドpENV−5(ATCCNo.53074)の挿入env−5から
なる群から選ばれることを特徴とするDNA配列。 2.本質的にpENV−1である特許請求の範囲第1項記載
のDNA配列。 3.本質的にpENV−2である特許請求の範囲第1項記載
のDNA配列。 4.本質的にpENV−3である特許請求の範囲第1項記載
のDNA配列。 5.本質的にpENV−4である特許請求の範囲第1項記載
のDNA配列。 6.本質的にpENV−5である特許請求の範囲第1項記載
のDNA配列。 7.LAVに対する抗体と免疫学的に反応性である蛋白質
をコードする、第8図のbp7178〜bp7698の配列を含む特
許請求の範囲第1項記載のDNA配列。 8.バクテリア宿主細胞中で複製することができる組換
えプラスミドであって、該プラスミドが、発現のための
原核細胞転写及び翻訳シグナルを含み、その下流側に、
LAVゲノムのenv領域のセグメントを含む単離されたDNA
配列であって、該配列が、LAVに対する抗体と免疫学的
に反応性である蛋白質をコードし、該配列が、プラスミ
ドpENV−1(ATCCNo.53070)の挿入env−1、プラスミ
ドpENV−2(ATCCNo.53071)の挿入env−2、プラスミ
ドpENV−3(ATCCNo.53072)の挿入env−3、プラスミ
ドpENV−4(ATCCNo.53073)の挿入env−4、及びプラ
スミドpENV−5(ATCCNo.53074)の挿入env−5からな
る群より選ばれることを特徴とするDNA配列が読みフェ
ーズにおいて続いているものであることを特徴とする組
換えプラスミド。 9.シグナルがtrpオペロンに由来する特許請求の範囲
第8項記載の組換えプラスミド。 10.バクテリア宿主細胞中で複製することができる組
換えプラスミドにより形質転換されたバクテリア細胞で
あって、 該組換えプラスミドが、発現のための原核細胞転写及び
翻訳シグナルを含み、その下流側に、LAVゲノムのenv領
域のセグメントを含む単離されたDNA配列であって、該
配列が、LAVに対する抗体と免疫学的に反応性である蛋
白質をコードし、該配列が、プラスミドpENV−1(ATCC
No.53070)の挿入env−1、プラスミドpENV−2(ATCCN
o.53071)の挿入env−2、プラスミドpENV−3(ATCCN
o.53072)の挿入env−3、プラスミドpENV−4(ATCCN
o.53073)の挿入env−4、及びプラスミドpENV−5(AT
CCNo.53074)の挿入env−5からなる群から選ばれるこ
とを特徴とするDNA配列が読みフェーズにおいて続いて
いる組換えプラスミドであることを特徴とするバクテリ
ア細胞。 11.バクテリア細胞が大腸菌である特許請求の範囲第
10項記載のバクテリア細胞。
Applications Claiming Priority (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US72123785A | 1985-04-08 | 1985-04-08 | |
US721237 | 1985-04-08 | ||
US72805285A | 1985-04-29 | 1985-04-29 | |
US728052 | 1985-04-29 | ||
US75376985A | 1985-07-10 | 1985-07-10 | |
US753769 | 1985-07-10 | ||
US06/783,299 US4784941A (en) | 1985-04-08 | 1985-11-07 | Expression and diagnostic use of pENV-3 encoded peptides which are immunologically reactive with antibodies to LAV |
US783299 | 1985-11-07 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62239992A JPS62239992A (ja) | 1987-10-20 |
JP2679973B2 true JP2679973B2 (ja) | 1997-11-19 |
Family
ID=27505552
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61080946A Expired - Lifetime JP2679973B2 (ja) | 1985-04-08 | 1986-04-08 | 免疫学的に反応性のウイルス蛋白質の発現 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0201716B1 (ja) |
JP (1) | JP2679973B2 (ja) |
AT (1) | ATE109830T1 (ja) |
AU (1) | AU571128B2 (ja) |
DE (1) | DE3650019T2 (ja) |
DK (1) | DK167158B1 (ja) |
ES (1) | ES8706208A1 (ja) |
FI (1) | FI861485A (ja) |
GR (1) | GR860914B (ja) |
IE (1) | IE64785B1 (ja) |
NO (1) | NO301176B1 (ja) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4774175A (en) * | 1985-03-01 | 1988-09-27 | Centocor, Inc. | Immunochemical methods for the detection of antibody against HTLV-III |
DK171119B1 (da) * | 1985-04-19 | 1996-06-17 | Hoffmann La Roche | AIDS-viruskappeprotein, ekspressionsvektor bærende viruskappeproteinet, transformanter transformeret med ekspressionsvektoren, fremgangsmåde til fremstilling af viruskappeproteinet, fremgangsmåde til detektion af AIDS-antistoffer, fremgangsmåde til bestemmelse af AIDS-virus, vaccine mod AIDS, antistoffer mod viruskappeproteinet samt anvendelse af dette til fremstilling af en vaccine og til testnin |
US5773210A (en) * | 1985-04-19 | 1998-06-30 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Acquired immune deficiency syndrome (AIDS) viral envelope protein and method of testing for AIDS |
JP2702911B2 (ja) * | 1985-09-11 | 1998-01-26 | ユナイテツド・バイオメデイカル・インコ−ポレ−テツド | 合成ペプチド、並びにそれを用いたエイズおよびプリ・エイズの検出方法 |
US4734362A (en) * | 1986-02-03 | 1988-03-29 | Cambridge Bioscience Corporation | Process for purifying recombinant proteins, and products thereof |
US4772547A (en) * | 1986-02-03 | 1988-09-20 | Hoffmann-La Roche Inc. | HTLV-III envelope peptides |
US4879212A (en) * | 1986-04-02 | 1989-11-07 | United Biomedical Inc. | Peptide composition and method for the detection of antibodies to HTLV-III |
EP0247557B1 (en) * | 1986-05-27 | 1994-04-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | HTLV-III(LAV) Envelope peptides |
US5017688A (en) * | 1986-06-12 | 1991-05-21 | Biogen, Inc. | Peptides involved in the pathogenesis of HIV infection |
US4943627A (en) * | 1986-06-12 | 1990-07-24 | Biogen, Inc. | Peptides involved in the pathogenesis of HIV infection |
DK169582B1 (da) * | 1986-06-23 | 1994-12-12 | Squibb Bristol Myers Co | Humant monoklonalt antistof, der er i stand til at reagere med en epitop på LAV/HTLV-III kappeglycoproteinet gp41, cellelinier, som producerer sådant antistof, farmaceutisk præparat indeholdende antistoffet samt fremgangsmåde til bestemmelse af nærværelsen af LAV/HTLV-III i en biologisk prøve og fremgangsmåde til separering af specifikke antigendeterminanter af LAV/HTLV-III under anvendelse af ant |
EP0525828A3 (en) * | 1986-08-01 | 1993-02-24 | Repligen Corporation | Recombinant polypeptides and their uses, including assay for aids virus |
NZ221440A (en) * | 1986-08-20 | 1991-11-26 | Genetic Systems Corp | Composition containing monoclonal antibodies/peptides useful in treating and diagnosing hiv infections |
NO881151L (no) * | 1987-03-27 | 1988-09-28 | Syntello Ab | Syntetisk hiv-1-antigen. |
SE8701628D0 (sv) * | 1987-04-16 | 1987-04-16 | Erling Norrby | Medel for analys mm |
US4921787A (en) * | 1987-05-01 | 1990-05-01 | Cambridge Bioscience Corporation | Detection of antibodies to human immunodeficiency virus by agglutination of antigen coated latex |
US5447837A (en) * | 1987-08-05 | 1995-09-05 | Calypte, Inc. | Multi-immunoassay diagnostic system for antigens or antibodies or both |
KR970007080B1 (ko) * | 1987-08-05 | 1997-05-02 | 칼립트 인크 | 자체-완비된 다중-면역분석 진단시스템 |
DE3727137A1 (de) * | 1987-08-14 | 1989-02-23 | Behringwerke Ag | Herstellung von antigenen des human immunodeficiency virus typ 1 sowie deren verwendung als diagnostisches mittel und therapeutikum |
DE4405810A1 (de) | 1994-02-23 | 1995-08-24 | Behringwerke Ag | Von einem Retrovirus aus der HIV-Gruppe abgeleitete Peptide und deren Verwendung |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3817837A (en) | 1971-05-14 | 1974-06-18 | Syva Corp | Enzyme amplification assay |
US3766162A (en) | 1971-08-24 | 1973-10-16 | Hoffmann La Roche | Barbituric acid antigens and antibodies specific therefor |
US3996345A (en) | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
US4233402A (en) | 1978-04-05 | 1980-11-11 | Syva Company | Reagents and method employing channeling |
US9328391B1 (en) * | 1984-08-22 | 2016-05-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Cloning and expression of HIV-1 DNA |
IL76082A (en) * | 1984-08-22 | 1991-07-18 | Us Health | Molecular clones of the genome of htlv-iii and a process for the preparation thereof |
CA1341482C (en) * | 1984-10-31 | 2005-05-10 | Paul A. Luciw | Process for preparing fragments of aids-associated retroviruses |
AU600658B2 (en) * | 1984-12-24 | 1990-08-23 | Genentech Inc. | Molecularly cloned acquired immunodeficiency syndrome polypeptides and their methods of use |
FR2580177B2 (fr) * | 1985-04-15 | 1989-06-02 | Pasteur Institut | Antigenes apparentes a la glycoproteine d'enveloppe du virus du sida, notamment precurseurs de cette glycoproteine, procedes d'obtention de ces antigenes et moyens mis en oeuvre dans ces procedes, applications de ces antigenes a la preparation de compositions immunogenes ou pour le diagnostic du sida ou des affections qui lui sont apparentees |
DK171119B1 (da) * | 1985-04-19 | 1996-06-17 | Hoffmann La Roche | AIDS-viruskappeprotein, ekspressionsvektor bærende viruskappeproteinet, transformanter transformeret med ekspressionsvektoren, fremgangsmåde til fremstilling af viruskappeproteinet, fremgangsmåde til detektion af AIDS-antistoffer, fremgangsmåde til bestemmelse af AIDS-virus, vaccine mod AIDS, antistoffer mod viruskappeproteinet samt anvendelse af dette til fremstilling af en vaccine og til testnin |
JP2702911B2 (ja) * | 1985-09-11 | 1998-01-26 | ユナイテツド・バイオメデイカル・インコ−ポレ−テツド | 合成ペプチド、並びにそれを用いたエイズおよびプリ・エイズの検出方法 |
-
1986
- 1986-04-04 IE IE89386A patent/IE64785B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-04-07 FI FI861485A patent/FI861485A/fi not_active Application Discontinuation
- 1986-04-07 GR GR860914A patent/GR860914B/el unknown
- 1986-04-07 EP EP86104741A patent/EP0201716B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-07 AT AT86104741T patent/ATE109830T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-04-07 DE DE3650019T patent/DE3650019T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-04-07 DK DK157186A patent/DK167158B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-04-07 ES ES553757A patent/ES8706208A1/es not_active Expired
- 1986-04-08 AU AU55727/86A patent/AU571128B2/en not_active Ceased
- 1986-04-08 NO NO861355A patent/NO301176B1/no unknown
- 1986-04-08 JP JP61080946A patent/JP2679973B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Cell,40 (1985) P.9−17 |
Nature,313 (1985) P.277−284 |
Science,227 (1985) P.484−492 |
Science,228 (1985) P.93−96 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE3650019T2 (de) | 1995-03-09 |
EP0201716A2 (en) | 1986-11-20 |
EP0201716A3 (en) | 1987-03-04 |
FI861485A (fi) | 1986-10-09 |
ES553757A0 (es) | 1987-06-01 |
DE3650019D1 (de) | 1994-09-15 |
AU571128B2 (en) | 1988-03-31 |
IE860893L (en) | 1986-10-08 |
NO301176B1 (no) | 1997-09-22 |
DK167158B1 (da) | 1993-09-06 |
AU5572786A (en) | 1986-10-16 |
ES8706208A1 (es) | 1987-06-01 |
IE64785B1 (en) | 1995-09-06 |
GR860914B (en) | 1986-07-25 |
JPS62239992A (ja) | 1987-10-20 |
ATE109830T1 (de) | 1994-08-15 |
DK157186A (da) | 1986-10-09 |
NO861355L (no) | 1986-10-09 |
FI861485A0 (fi) | 1986-04-07 |
EP0201716B1 (en) | 1994-08-10 |
DK157186D0 (da) | 1986-04-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2679973B2 (ja) | 免疫学的に反応性のウイルス蛋白質の発現 | |
US4784941A (en) | Expression and diagnostic use of pENV-3 encoded peptides which are immunologically reactive with antibodies to LAV | |
EP0199438B1 (en) | Htlv iii polypeptides | |
EP0258404B1 (en) | Method of detecting antibody against htlv-iii | |
JP3073752B2 (ja) | Hivエンベロープタンパク質およびそれを用いたhiv抗原に対する抗体の検出方法 | |
JP3058685B2 (ja) | ネコt細胞リンパトロピック レンチウィルスのポリペプチド | |
US20050095581A1 (en) | Detection of HIV-1 DNA | |
KR100847586B1 (ko) | C형 간염 바이러스의 측정방법 | |
JP2004081219A (ja) | Hiv−iポリヌクレオチド | |
JP3095219B2 (ja) | LAVに対する抗体と反応性であるgagによりコードされたペプチド及びその使用 | |
US5175098A (en) | Expression and diagnostic use of gag encoded peptides which are immunologically reactive with antibodies to HIV | |
JPH01193299A (ja) | 組替htlv−3蛋白質及びその用途 | |
US5134227A (en) | DNA encoding immunoreactive, chimeric HTLV-III GAG proteins | |
US5328835A (en) | Expression of immunologically reactive HIV envelope proteins | |
EP0293184A2 (en) | Immunodiagnostic assays using chimeric antigens | |
US5175097A (en) | Expression and diagnostic use of GAG-1 encoded peptides which are immunologically reactive with antibodies to HIV | |
EP0293792A2 (en) | Human immunodeficiency virus GAG-encoded proteins | |
EP0235923B1 (en) | Sor gene product from human t-cell lymphotropic virus iii | |
JP2001510553A (ja) | 組換え蛋白質を用いたhtlv抗体の検出法 | |
CN116718765A (zh) | 一种牛结节性皮肤病阻断elisa抗体检测试剂盒及其应用 | |
JPH02131575A (ja) | Hiv―2変異株 |