JP2001510553A

JP2001510553A - 組換え蛋白質を用いたｈｔｌｖ抗体の検出法

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Publication number: JP2001510553A
Application number: JP50110697A
Authority: JP
Inventors: ノウラン，シヨーン・エフ; ヒツクマン，キース・アール; シー，ジエシー・ダブリユ; サーニー，マイケル・ビイ; デイベア，スシル・ジー
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 2001-07-31
Also published as: WO1996039630A1; EP0848820A1; CA2223235A1

Abstract

(57)【要約】試験サンプル中のＨＴＬＶに対する抗体を検出するためにＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩの組換え抗原を用いるアッセイ。用いられる抗原は、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１、ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４、ＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１、ＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４及びその任意の組合せである。これらのＨＴＬＶ−Ｉ抗原及びＨＴＬＶ−ＩＩ抗原を含む試験キット、並びに、これらの組換え抗原を産生するプラスミドも提供される。

Description

【発明の詳細な説明】組換え蛋白質を用いたＨＴＬＶ抗体の検出法発明の分野本発明は一般的にヒトＴ−リンパ球向性ウィルス（ＨＴＬＶ）Ｉ及びＩＩ型に関するもので、特に試験試料中のＨＴＬＶ−Ｉ型抗体及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩ型抗体の検出用の免疫試験と試薬に関するものである。発明の背景ヒトＴ−リンパ球向性ウィルス（ＨＴＬＶ）Ｉ及びＩＩ型は、Ｃオンコウィルス型のレトロウィルスである。最初に発見されたヒトレトロウィルスであるＨＴＬＶ−Ｉは、１９７１年皮フＴ細胞リンパ腫の患者から単離された。（Ｂ．Ｐｏｉｅｓｚ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７；７４１５〜７４１９（１９８０）に発表。）ＨＴＬＶ−ＩＩは１９８２年に線毛細胞白血病の患者中で発見された。（Ｖ．Ｋａｌｙａｎａｒａｎａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２１８，５７１〜５７３、（１９８２）に発表。）ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−ＩＩの多数の単離体、変異体が世界各地で発見され配列決めされてきた。これまでに同定された２種の特異な細胞列と配列は、ＨＴＬＶ−ＩＨＵＴ１０２．Ｂ２（別名ＨＴＬＶ−ＩＣＲ）とＨＴＬＶ−ＩＩＷｉｌ−ＮＲＡ（別名ＨＴＬＶ−ＩＩｂ）である。ＨＴＬＶ−ＩＣＲの全配列は未だ公表されていないが、エンベロープ配列の一部がＴ．Ｓ．Ｐａｐａｓ他、ＥＰ１８１１０７により開示されている。ＨＴＬＶ−ＩＩＷｉｌ−ＮＲＡの全配列は既に配列決めされており（Ｈ．Ｌｅｅ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９６，５７〜６９（１９９３）参照）、米国特許出願番号第０８／０８６、４１５号、１９９３年７月１日出願に開示されて公開されその所有権を共有し本出願中にも引用されている。ＨＴＬＶの系統発生樹は、Ａ、Ｂ、Ｃで示される３種の別個のＨＴＬＶ−Ｉ族と、ＨＴＬＶ−ＩＩａ及びＨＴＬＶ−ＩＩｂで表される２種のＨＴＬＶ−ＩＩ群とにより確定されている。ＨＴＬＶ−Ｉに伴う疾病には、腺腫性の疾病や成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病（ＡＴＬ）及びＨＡＭ／ＴＳＰ（ＨＴＬＶに伴う脊髄症又は熱帯性痙撃性対性不全麻痺）を含む新生物の病気や多くの脱髄性神経学的障害がある。最近の報告によるとＨＴＬＶ−Ｉ起因の多発性筋炎、多発関節炎、小児感染性皮フ炎、及びぶどう膜炎が同定されている。ＨＴＬＶ−ＩＩによる疾病は十分にその特性が判明していない。ＨＴＬＶ−ＩＩが初めにＴ−リンパ球線毛細胞白血病の患者から単離されたとは言え、白血病病原論が確立したとは言い難い。大粒リンパ球白血病がＨＴＬＶ−ＩＩ感染との関連で報告されている。神経変性疾患とＨＴＬＶ−ＩＩ感染との関連を指摘する最近のレポートがいくつかある。ＨＴＬＶ感染の診断法としては、ウィルス検出法（ウィルスを単離する方法又はポリメラーゼ鎖反応［ＰＣＲ］のようなＤＮＡ増幅法による）かあるいはウィルスに対する抗体を血清学的に検出する方法がある。現在米国ではＨＴＬＶ−Ｉへの抗体に関して、供血試料のスクリーニングが義務づけられている。臨床研究所で用いる政府認可の分析試験の大半は、ＨＴＬＶ−Ｉ抗原を検出しＨＴＬＶ− ＩＩ抗原と交叉反応する天然のＨＴＬＶ−Ｉウィルス細胞分解産物抗原を用いている。ＨＴＬＶ−ＩＩウィルス細胞分解産物抗原は現在入手可能ではあるが、既知の市販試験キットには、使用されていない。更に、ＨＴＬＶに何度も反応性を示すと思われる供血者の５０％超がＨＴＬＶ−ＩＩ感染者であってＨＴＬＶ−Ｉ感染ではないにもかかわらず、アメリカではＨＴＬＶ−ＩＩ検査が義務づけられてはいないのである。ＨＴＬＶ−Ｉと、ＨＴＬＶ−ＩＩ用の合成ペプチド抗原とに対する特定の組換え抗原と合成ペプチド抗原については、ＨＴＬＶ−Ｉ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩ抗体検出用の、診断及びスクリーニング分析法に記載され、使用されてきた。例えばＬａｌ他、ＷＯ９２／０４０４６；Ｓｈｉｈ他、ＷＯ９３／０１３１６；及びＪ．Ｊ．Ｌｉｐｈａ他、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１６４：４００〜４０３（１９９１）を参照。しかしこれ等のいずれにも組換えＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１、ｐ２４蛋白質は記載されておらず、又ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−ＩＩ用の組換え抗原を使用する既知法もＷｉｌ−ＮＲＡに基づく組換え抗原をＨＴＬＶ−ＩＩに対して使用していない。更には、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１組換え蛋白質のすべてがＣ端末を欠いていると述べられており、欠けたこの部分に抗原活性が存することが判った。（例えばＴ．Ｐａｌｋｅｒ他、Ｊ．ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏ１４２：９７１〜９7８(1989)、Ｐ．Ｈｏｒａｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：５７５４〜５７５８（１９９１）を参照。）ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６配列のいくつかの部分が記述されており、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６が大小のエピトープを有することが知られている。（Ｔ．Ｐａｌｌｅｒ他、Ｊ．ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１４２：９７１〜９７８(1989)；Ｐ．Ｈｏｒａｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：５７５４〜５７５８（１９９１）を参照。）発明の概要本発明は試験試料中のＨＴＬＶ−Ｉ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体の有無、又は量を検出する為の分析試験法を示す。本分析試験方法は、試験試料を固相につけた捕獲試薬と接触させる工程から成り、この捕獲試薬は少なくとも１つの組換えＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩｅｎｖ抗原と少なくとも１つの組換えＨＴＬＶ−Ｉｇａｇ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩｇａｇ抗体とから成り、この捕獲試薬と試験試料をある時間適当な条件下で恒温培養して抗原／抗体複合物を形成させ、この抗原／抗体複合物を第１及び第２指示試薬と接触させる事を特徴とし、又この第１指示試薬は、信号発生化合物で標識づけされた組換えＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩｅｎｖ抗原から成り、第２指示試薬は、信号発生化合物で標識づけされた組換えＨＴＬＶ−Ｉｇａｇ及び／又はＨＴＬＶ− ＩＩｇａｇ抗原から成っており、前記複合物と第１及び第２指示試薬とをある時間適当な条件下で恒温培養して、抗原／抗体／第１指示試薬複合物、及び／又は抗原／抗体／第２指示試薬複合物とを得るものであって、次いで試験試料中のＨＴＬＶ−Ｉｅｎｇ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩｅｎｖ抗体及び／又はＨＴＬＶ −Ｉｇａｇ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩｇａｇ抗体の有無を、信号発生を検出することで測定する事を特徴とするものである。上記第１捕獲試薬は、組換えＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１、ＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１抗原と、これ等のあらゆる組合せとから成る群から選択される。上記第２捕獲試薬は、ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４及びＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４から成る群から選択される。組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６とはＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．９であり、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１とはＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．６、組換え抗原ＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１とはＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．１５、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２４はＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．３、更に組換え抗原ＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４は、ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．１２のことである。同一のＨＴＬＶ−Ｉ又はＨＴＬＶ−ＩＩｇａｇ又はｅｎｖ組換え抗原を、捕獲試薬として及び指示試薬中に使用する場合は、この抗原は異なる生体中（例えば異種源中）で、あるいは同一生体中（例えば同種源中）で得る事ができる。本発明は試験試料中のＨＴＬＶ−Ｉ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体の有無、あるいは量を検出する分析試験法も提供するもので、試験試料の第１アリコートを、固相についている第１捕獲試薬に接触させ、ここで捕獲試薬は組換えＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩｅｎｖ抗原であり、試験試料中の第２のアリコートを固相についた第２捕獲試薬と接触させ、ここで捕獲試薬がＨＴＬＶ−Ｉｇａｇ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩｇａｇから成る組換え体であり、前記接触は第１捕獲試薬／試験試料複合物及び／又は第２捕獲試薬／試験試料複合物とを形成するのに十分な条件下及び時間行なわれ、この第１捕獲試薬／試験試料複合物並びに第２捕獲試薬／試験試料複合物とを、信号発生化合物で標識づけされた抗ヒトＩｇＧ抗体から成る指示試薬に接触させて、第１捕獲試薬／試験試料／指示試薬複合物と第２捕獲試薬／試験試料／指示試薬複合物とを生成するのに十分な時間及び条件下で培養する。次いで測定可能な発生信号を検出することにより、ＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩｅｎｖ抗体、及び／又はＨＴＬＶ−Ｉｇａｇ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩｇａｇ抗体の試験試料中での有無を測定するものである。上記第１捕獲試薬は、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１、組換え抗原ＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１抗原と、これ等のあらゆる組合せとから成る群から選択される。上記第２捕獲試薬は、ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４とＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４から成る群から選択される。組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６とはＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．９であり、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１はＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．６、組換え抗原ＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１はＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．１５、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４はＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．３、更には組換え抗原ＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４はＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．１２のことである。本発明は又検査キットも開示するもので、これは固相につけた組換えＨＴＬＶ −Ｉｅｎｖ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩｅｎｖ抗原である第１捕獲試薬を収容した容器と、固相につけた組換えＨＴＬＶ −Ｉｇａｇ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩｇａｇ抗原である第２捕獲試薬を収容した容器とから成っている。上記第１捕獲試薬は、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１、ＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１及びこれ等のあらゆる組み合せとから成る群から選択される。上記第２捕獲試薬は、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４とＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４とから成る群から選択される。この第１捕獲試薬の組換え抗原は、ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．９、ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．６、及びＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．１５から成る群から選ばれる。第２捕獲試薬の組換え抗原は、ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．３とＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．１２から成る群から選ばれる。又第１捕獲試薬と第２捕獲試薬は１つの容器に組み合わせても良い。本発明中には、プラスミドｐ２４ＩＣＫＳ、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．デポＮｏ．、プラスミドｐ４６ＩＣＫＳ、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．デポＮｏ．、プラスミドｐ２４ＩＩＣＫＳ、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．デポＮｏ．、プラスミドｐ２１ＩＩＣＫＳ、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．デポＮｏ．、及びプラスミドｐ２１ＩＣＫＳ、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．デポＮｏ．も提供されている。組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６とは、ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．９であり、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１は、ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．６、組換え抗原ＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１は、ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．１５、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４はＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．３、組換え抗原ＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４はＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．１２である。図面の簡単な説明図１は、ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４ＣＫＳ発現ベクター（ｐ２４ＩＣＫＳ）（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．３）を構成する工程を示すフローチャートである。図２は、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１ＣＫＳ発現ベクター（ｐ２１ＩＣＫＳ）（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．６）を構成する工程を示すフローチャートである。図３は、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６ＣＫＳ発現ベクター（ｐ４６ＩＣＫＳ）（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．９）を構成する工程を示すフローチャートである。図４は、ＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４ＣＫＳ発現ベクター（ｐ２４ＩＩＣＫＳ）（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．１２）を構成する工程を示すフローチャートである。図５は、ＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１ＣＫＳ発現ベクター(ｐ２１ＩＩＣＫＳ)（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．１５）を構成する工程を示すフローチャートである。図６は、組換えＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩ抗原が血清反応試料に示した免疫反応性を示すスロットブロット写真である。図７は、ポリスチレン微小体に塗布した組換えＨＴＬＶ−Ｉｐ２４（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．３）抗原が血清反応試料に示した免疫反応性を示す棒グラフである。図８は、ポリスチレン微小体に塗布した組換えＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．６）抗原がＨＴＬＶ血清反応試料に示した免疫反応性を示す棒グラフである。図９は、ポリスチレン微小体に塗布した組換えＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．９）抗原が血清反応試料に示した免疫反応性を示す棒グラフである。図１０は、ポリスチレン微小体に塗布した組換えＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．１２）抗原がＨＴＬＶ血清反応試料に示した免疫反応性を示す棒グラフである。図１１は、ポリスチレン微小体に塗布した組換えＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．１５）抗原がＨＴＬＶ血清反応試料に示した免疫反応性を示す棒グラフである。図１２は、組換えｐ２４（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．３）、ｇｑ４６（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．９）、又はｇｐ２１（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．６）ＨＴＬＶ−Ｉ抗体を個々に塗布したポリエチレン微小体の組み合わせに対して示したＨＴＬＶ血清反応試料の免疫反応性を示す棒グラフである。図１３は、組換えｐ２４（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．１２）又はｇｐ２１（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．１５）ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を個々に塗布したポリエチレン微小体の組み合わせに対する、ＨＴＬＶ血清反応試料の免疫反応性を示す棒グラフである。発明の詳細な説明特に記載がなければ、下記の語句の意味は次の通りである。Ａ．定義明細書中に用いる「組換えポリペプチド」又は「組換え抗原」（両者は同等の意味で使われる）とは、ゲノム、半合成性又は合成由来のポリペプチドを言い、これは自然界又はライブラリーの形で結合しているポリペプチド及び／又は天然に結合しているもの以外のポリヌクレオチドと結合しているポリペプチドのすべて又は一部と、起源によりあるいは操作により結合していない。本文中で用いる「合成ペプチド」とは、あらゆる長さのアミノ酸の高分子体であって、これは当業者にとって公知の方法で科学的に合成される。これ等の合成ペプチドは多様な応用に有用である。本文中で用いる「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでも良く、あらゆる長さのヌクレオチド高分子体を言う。この用語は分子の１次構造にのみ用いる。従って二重及び一重鎖ＤＮＡ、二重及び一重鎖ＲＮＡが包まれる。又メチル化及び／又はキャッピングによる変更例も、ポリヌクレオチドの未修飾体も包まれる。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」「細胞」「細胞ライン」「細胞培養」、その他微生物又は単細胞体として培養された高次の真核細胞ラインを意味する語句は、組換えベクター又は他の転写ＤＮＡ用の受容体として使用され得るあるいは使用されている細胞を意味し、転写されたオリジナル細胞の本来の子孫を含む。本文で使用する「レプリコン」は、プラスミド染色体、又はウィルス等の遺伝子要素のすべてを意味し、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律単位として行動する。即ちそれ自身の管理下で複写を行なえる。「ベクター」とは、付加セグメントの複写及び／又は発現等を実施するために別ポリヌクレオチドセグメントが付けられたレプリコンである。「コントロール配列」は、ポリヌクレオチド配列が連結されているコード配列の発現を行なうのに必要な、ポリヌクレオチド配列を言う。この様なコントロール配列の性質は、宿主生体によって異なる。原核生物では、この様なコントロール配列は一般にプロモータ、リボソマル結合部、及びターミネータとがあり、真核細胞では、この様なコントロール配列はプロモータ、ターミネータ及びいくつかの例でエンハンサーがあるのが一般的である。この様に「コントロール配列」という語は、発現に不可欠なすべての成分を最低限でも含むもので、又、存在した方が有利な追加成分、例えばリーダー配列をも含むものである。「実施可能に結合された」との語句は、記述された成分が意図した態様で機能する様に関係づけられている事を意味する。従って、例えばコード配列に「実施可能に結合された」コントロール配列とは、コード配列の発現がコントロール配列に適した条件で行なわれる様な結合を意味している。「コード配列」は、適切な調整配列の管理下に置かれると、ｍＲＮＡに転写され及び／又はポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列の事である。コード配列の境界は、５’−端末の翻訳開始コドンと３’−端末の翻訳停止コドンとにより決められている。コード配列にはｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及び組換えポリヌクレオチド配列が含まれるが、これに制限されるわけではない。ポリペプチド内に含まれる特定のエピトープを抗体が認知すると、ポリペプチド又は抗原は抗体と結合し、ポリペプチドあるいは抗原は抗体と「免疫学的に反応性」を有する事になる。免疫学的反応性は、抗体結合、特に抗体結合力学により、及び／又は抗体が対向性を示すエピトプを含む既知のポリペプチドを競争相手として用いた結合の際の競合により測定される。ポリペプチドが抗体に対して免疫学的に反応性を有するかどうかの測定法は、当分野で公知となっている。「形質転換」の語句は、使用した挿入法に拘わらず宿主細胞中への外因性ポリヌクレオチド挿入を言う。例えば直接摂取、形質導入、又はｆ−交配等が含まれる。外因性ポリヌクレオチドは非組込ベクター、例えばプラスミドとして保持されるか又は宿主ゲノム中に組み込まれる。本文中の「個体」とは、脊椎動物、特に哺乳類のメンバーを指し、家畜、狩猟用動物、霊長類及び人類を意味するがこれに制限されるものではないし、又特に霊長類と人類を言う。「抗体含有体成分」（又は「試験試料」）の語句は、関連の抗体源である個体の体成分を意味する。これ等成分は当分野で公知となっている。これ等試験試料は本文中に記載した発明法により検査される生物学的試料を含み、ヒトや動物の体液には例えば全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液、及び種々の呼吸系服管系及び泌尿生殖器系の外分泌分、涙、唾液、乳、白血球、骨髄腫等の様なものがあり、又生物学的液体としては、細胞培養上澄み液、固定組織標本、固定細胞標本等がある。Ｂ．一般的使用法本発明の精製組換え抗原は、ここに述べる様に、ＨＴＬＶ−Ｉ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗原及び／又は抗体の有無を検出あるいは確認するための特異な分析試験を行なうのに使用される。これ等の組換え抗原は、免疫原として特定の組換え蛋白質を用いて、モノクロナル及び／又はポリクロナル抗体を開発するのにも使用し得る。精製抗原は又、ＨＴＬＶ−Ｉ又はＨＴＬＶ−ＩＩ細胞ラインから得たウィルス細胞分解産物等の天然のウィルス抗原と組み合わせて用いても良い。更には、精製抗原をＨＴＬＶ−Ｉ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩ合成ペプチドと組み合わせて使用する事もでき、例えば、ＷＯ９３／０１３１６に対応する米国特許出願番号第０７／７２７，７６５号及び１９９３年１２月２０日出願の米国特許出願番号０８／１７０，０６３中に開示されている合成ペプチド配列がこれであり、これ等は既に公開され、本文中にも引用として取り入れられている。この精製抗原は、ＨＴＬＶウィルス細胞分解産物と他の特定のペプチド配列、更には他のＨＴＬＶ組換え抗体と組み合わせて使用しても良い。分析試験に使用する試薬は、小ガラス瓶かボトル等の１つ以上の容器での検査キットの形式で提供することが意図される。各容器又は小ガラス瓶には、希釈剤、指示試薬、信号発生化合物、少くとも１つの本発明による組換え抗原を含む分析試薬、等の様なものを個別の試薬毎に入れる。この様な検査キットには、キットの内容物がＨＴＬＶ−Ｉ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩ抗体、及び／又は抗原の有無を検出／確認し、及び／又はＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−ＩＩとを識別するのに使用される事を説明した使用説明書も入れた方が良いであろう。「固相」はそれ程厳密ではなく、当業者が過度の試験をせずに選ぶであろう多様な材質であって良い。「固相」の語句は広義で用いており、不溶性又はその後の反応で不溶性となる材質であればどれでも良い。従って多孔性又は非孔性材質、ラテックス又はポリスチレン粒子、磁性又は非磁性微小物、ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイター穴の壁膜、及びタンニン酸処理羊赤血球等が好例として挙げられる。固相の寸法、径、形状等は本発明法を実施するのに概して厳密ではない。しかし本発明では微粒子又はビーズを、本文中に記載したＨＴＬＶ−Ｉ用の１つ又はそれ以上の組換え抗原と、あるいはこれも本文中に記述したＨＴＬＶ−ＩＩ用の１つ又はそれ以上の組換え抗原と、あるいは本文中に記載した様に少くとも１つのＨＴＬＶ−Ｉと１つのＨＴＬＶ−ＩＩ抗原組換え抗原との組み合わせと共に使用するのが望ましく、これは固相上に固定されている。固相上に抗原を固定化するのに適した方法には、イオン性、疎水性、共有性の相互作用等がある。当業者であれば、有用な固相を採用するのにふさわしい多様な方法論を習知しているであろう。当分野で公知の結合剤を組換え抗原の固相への固定に用いても良いであろう。この結合剤は、抗原の添加以前に固相の一部として組み込むか、又は固相上に誘導すると良い。「試験試料」とはヒト又は動物の生物学的液体で、例えば血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液、又はその他生体構成分、あるいは関連の抗体又は抗原を含有しうるあらゆる組織培養上澄み液等である。適切な「指示試薬」とは信号発生化合物（標識）から成り、この化合物は、試験試料からのＨＴＬＶに対する抗体用の特異的結合メンバーに結合していて、外的方法により検出可能な、測定可能信号を発生することができる。ここで言う「特異的結合メンバー」とは、特異的結合ペアのメンバーを言う。即ち２つの異なる分子の、一方の分子が化学的あるいは物理的方法により第２の分子と結合しているものである。試験試料由来の抗体用の特異的結合ペアの抗体メンバーに加え、指示試薬はあらゆる特異的結合ペアのメンバーであっても良く、例えばビオチン又は抗ビオチン、アビジン又はビオチン、炭水化物又は相補ヌクレオチド配列であるレクチン、エフェクター又はレセプター分子、酵素コファクターと酵素、酵素インヒビター又は酵素等の様な、ハプテン−抗ハプテンのいずれでも良い。免疫反応性の特異的結合メンバーとしては、抗体、抗原、又は抗体／抗原複合物であって、これはサンドウィッチ分析試験ではＨＴＬＶに、拮抗試験では捕獲試薬に、あるいは間接分析試験では附随性特異的結合メンバーに結合可能なものである。種々の「信号発生化合物」（標識）として考えられているものは、色原性、酵素等の触媒、フルオレッセインやローダミン等の蛍光化合物、ルミノール等の化学光化合物、ジオクセタン、アクリジニウム化合物及びフェナントリジニウム化合物、放射性元素及び直接可視標識等がある。酵素の例としては、アルカリフォスファターゼ、ワサビペルオキシターゼ、ベータガラクトシダーゼ等の様なものがある。特定標識の選択に関しては厳密ではないが、標識自体で信号を発するか、１つ又はそれ以上の追加物質と結合して信号を発する事ができるものである。反応混合物は、ある時間、ＨＴＬＶ抗原／抗体複合物を生成するのに十分な条件下で恒温培養される。適当な培養時間や温度等のテスト条件や、その他の条件及び分析の試薬の選択に関しては、当業者の技術範囲内で十分である。本発明は明細書に開示した、新規で特異なＨＴＬＶ−Ｉ及び／又はＨＴＬＶ− ＩＩ組換え抗原への抗体の結合を検出することにより、ＨＴＬＶ−Ｉ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体を検出する方法を提供するものである。又本発明は、これらウィルスのいずれへの抗体を含む試料を検出及び／又は識別する分析試験で大変有用な、ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩ領域内での新規かつ特異な抗原配列を同定するものである。このために、ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−ＩＩのｅｎｖとｇａｇ領域内に、この特異な抗原配列を設定している。このＨＴＬＶ−Ｉｐ２４（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．３）及びＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．６）組換え抗原は、ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体を有する試料に特異的に反応性を示し、又ＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体を含む試料に交叉反応性を示す。ＨＴＬＶ− ＩＩｐ２４（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．１２）及びＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩ．Ｄ．Ｎｏ．１５）組換え抗原は、ＨＴＬＶ− ＩＩに対する抗体を含む試料に特異的に反応性を有し、又ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体を有する試料に交叉反応性を示す。更には、特異な抗原配列がＨＴＬＶ−Ｉのｅｎｖ領域（ｇｐ４６）に設定され、これはウィルス特異性であり、高力価ＨＴＬＶ−ＩＩ試料に対してのみ交叉反応性を示す。一般に本発明法は、本文に開示された少くとも１つのＨＴＬＶ−Ｉ又は少くとも１つのＨＴＬＶ−ＩＩ組換え抗原、あるいは本文記載の少くとも１つのＨＴＬＶ−Ｉと１つのＨＴＬＶ−ＩＩ組換え抗原の組み合わせが結合されている、固相とヒト試験試料とを接触させて混合物を生成させ、この混合物をある時間、抗原／抗体複合物を生成するのに十分な条件下で培養する事から成っている。更には得たこれ等の複合物を、信号発生化合物を結合させた、抗ヒト抗体（又は他の適当な特異的結合ペアメンバー）から成る指示試薬と接触させて、第２の混合物を得る。この第２混合物をある時間、抗原／抗体／指示試薬複合物を生成するのに十分な条件下で培養する。試験試料中の、ＨＴＬＶへの固定化抗体の有無は、発生する測定可能な信号の検出により決定される。ＨＴＬＶ−Ｉへの抗体及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩへの抗体のこの様な分析試験は、これ等ウィルスのどちらか、又は両者によっておきるＨＴＬＶ感染の有無を検出するのに、大変有効な方法を提供するものである。本発明の実施態様では、ＨＴＬＶ−Ｉ又はＨＴＬＶ−ＩＩ、あるいはＨＴＬＶ −ＩとＨＴＬＶ−ＩＩの組み合わせに対する抗体に特異性を有し、本発明の組換え抗原は、ポリスチレンビーズ等の固相上に不動化されている。従ってこれ等ビーズを、ヒト血清、血漿、又は他の体液の（希釈又は未希釈）試験試料と共に培養し、試験試料中に存在するＨＴＬＶ抗体がビーズ上の不動化ＨＴＬＶ抗原と、特異的に結合する様な適当な条件下で適当な時間培養する。次いでこのビーズを洗浄して、存在し得る未結合蛋白質を除去する。次に第２培養を行ない、ここでビーズは信号発生化合物で標識づけされた抗ヒト抗体から成る指示試薬と共に培養される。適当な検出法により、検出可能な発生信号を測定して、ビーズ上に不動化された標識抗ヒト抗体複合物の量を測定する。この様にして試験試料中のＨＴＬＶ−Ｉ又はＨＴＬＶ−ＩＩへの特定抗体の有無、あるいはＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩ抗体の組み合わせの有無が決定される。他の実施態様では、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩに特異性を示す、本発明の組換え抗原を、ポリスチレンビーズ等の固相上に不動化させて、一段階サンドウィッチ分析試験を行なっている。このビーズを、希釈又は朱希釈試験試料と、抗ヒトＩｇＧに結合させた信号発生化合物から成る適当な指示試薬と共に、組換え抗原／抗体／指示試薬複合物を得るのに十分な条件下で適当な時間培養する。試験試料中に存在する抗ＨＴＬＶ抗体量は、指示試薬が発する測定可能な信号を検出して測定する。この様に、試験試料中の抗ＨＴＬＶ−Ｉ又はＨＴＬＶ−ＩＩ特定抗体の有無、あるいはＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩの組み合わせに対する抗体の有無が測定される。更に他の実施態様では、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ又はＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−ＩＩ組換え抗原に対する抗体に特異性を示す、本発明の組換え抗原の少くとも１つを、ニトロセルロース膜上に不動化している。ニトロセルロース膜上に不動化する前に、この組換え抗原をそれ自身又は他の抗原（組換えあるいは合成）に結合又は架橋させても良く、又ＢＳＡ、キーホールリンペットヘモシアニン、オバルブミンの様な種々の担体蛋白質に結合又は架橋させても良い。試験試料を希釈してから、抗原／抗体複合物を膜上に生成するのに十分な条件下と時間で、膜上で培養するのが望ましい。次いで膜表面を洗浄し、未結合蛋白質を除去する。第２培養では、膜上の得た複合物を、信号発生化合物で標識（結合）した抗ヒト抗体から成る指示試薬と接触させてから培養する。ニトロセルロース膜上に不動化した抗原によって異なるが、抗ＨＴＬＶ−Ｉ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩ抗体は、適当な検出システムを用いて測定可能な発生信号を検出する事により、測定される。試験試料中に存在するＨＴＬＶ−Ｉ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩへの特定抗体の量は、検出システムが測定した信号レベルの定量化によって決定される。更に他の実施態様ではサンドウィッチ試験を行なっている。この方法は、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ組換え抗原の少くとも１つが、又は本発明のＨＴＬＶ−ＩＩ組換え抗原の少くとも１つが、又は本発明の少くとも１つのＨＴＬＶ−Ｉと少くとも１つのＨＴＬＶ−ＩＩの組み合わせの組換え抗原が結合された固相に、試験試料を接触させて混合物を生成させる事から成っている。得た混合物は、抗原／抗体複合物を生成するのに十分な時間と条件下で培養する。次いでこれ等複合物を、予め信号発生化合物と結合させたＨＴＬＶ−Ｉ及び／又はＨＴＬＶ−ＩＩ抗原から成る指示試薬に接触させて、第２混合物を得る。この第２混合物を、抗原／抗体／指示試薬複合物を生成するのに十分な時間と条件下で培養する。抗原／抗体／指示試薬複合物の有無は、発生する測定可能な信号を検出して決定される。この分析試験では、検出すべき抗体に特異性を有する、本文記載の組換え抗原である第１抗原は、固相上に不動化されており、この抗体を保有する疑いのある試験試料を、この固相に添加する。そして、標識化処理された、本発明の組換え抗原である第２抗原を、この固相に接触させる。この様に、単一の結合ペアのメンバーに特異性を示す２つの組換え抗原が、捕獲相と、指示試薬の１部として、１つの分析試験中に使用される。これ等の抗原は同一源でも、異なる、例えば異性（hetero logous）源であっても良い。例えば出所源としてはバクテリアやイーストでも良い。本文記載の１つの組換え抗原を捕獲試薬として、あるいは指示試薬の１部として使用する事も可能であり、更にはこの分析試験中の他の抗原が、合成ペプチド又はウィルス細胞分解産物、あるいは当業者に公知の他の抗原源でも良く、これ等はすべて本発明の範囲内である。更には、ビオチンと抗ビオチン、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプタビジン等の使用は、これ等分析試験での発生信号を増幅させるのに有効であろう。好ましい実施態様は、ここに示した最低１個のＨＴＬＶ−Ｉ抗原、またはここに示した最低１個のＨＴＬＶ−ＩＩ抗原、またはここに示した最低１個のＨＴＬＶ−Ｉ抗原を最低１個のＨＴＬＶ−ＩＩ抗原と組み合わせたものを、固相として使用される磁気または非磁気微粒子と結合させたものから構成される。微粒子ＥＩＡ（ＭＥＩＡ）は好ましくは、ポリスチレン微粒子を使って行う。これらの粒子のサイズは好ましくは０．１９〜５ミクロンとする。組み換え抗原は微粒子に受動的に結合させても、能動的に結合させてもよい。ここで使用しているような受動的コーティングとは、組み換え抗原と微粒子とが共有結合していないこと、または共有付着していないことを意味している。受動的コーティングは例えば、組み換え抗原を希釈して、所望の最終コーティング濃度の２倍の濃度の適切なコーティング緩衝液にし、緩衝した塩コーティング溶液で微粒子を洗浄及び再懸濁し、微粒子と抗原溶液を同じ比率で混合し、適切な温度と時間の条件下において混合しながら溶液を培養するという作業が含まれる。コーティングした微粒子は、次に遠心分離によって分離し、洗浄し、微粒子希釈液に再懸濁させる。微粒子の性質のため、抗原は静電気のような相互作用によって微粒子に結合する。能動的コーティングとは、抗原と固体サポートとを共有結合させることを意味する。一般にこのような共有結合は抗原のカルボキシルまたはアミノ末端基によって、または微粒子表面上の適切な官能基に結合する蛋白質内の遊離カルボキシル基またはアミノ基によって形成される。このような官能基を持つこのような微粒子を、誘導体化微粒子と呼ぶ。誘導体化微粒子としては、例えば表面上にカルボキシル官能基を持つものがある。カルボキシル誘導体化微粒子は、次に１−エチル−３（ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）で処理する。次に微粒子を受動的微粒子コーティング法と類似の方法で処理するが、溶液のｐＨは好ましくは約４．５にする。ＥＤＣは組み換え抗原及び微粒子と同時に最終コーティング溶液に加えてもよいし、混合前の組み換え抗原または微粒子のいずれかに加えてもよい。その結果できあがったコーティングされた微粒子には、組み換え抗原のアミノ末端基と微粒子のカルボキシル基との間の反応により、組み換え抗原が結合されている。ＥＤＣを非誘導体化微粒子に使用しても、能動的コーティングができあがる。結合化合物（リンカー化合物）を使用しても、抗原と固体サポートとの間の共有結合形成を達成するという能動的コーティングが行える。スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスタシニミジル４−（Ｎマレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）またはスルホ−ＳＴＡＢ（スルホスクシニミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート）といった異種二官能性化合物、或いはスルホ−ＤＳＴ（酒石酸ジスホスクシニミジル）またはスルホ−ＥＧＳ（エチレングリコルビス［琥珀酸スルホスクシニミジル］）といった同種二官能性化合物を使用すれば、もっと特異的な、部位指向共有結合を実現することができる。結合化合物を加えれば、スペーサーアームを含めることもでき、これにより抗原は固相に結合しながら、抗体とより自由に相互作用することができる。当業者は結合基の化学的性質について十分に知っている。ここに示した２種類の組み換え抗原製剤による微粒子のコーティングは、２種類の方法によって行うことができ、同じ検定法で使用することができる。最初の方法では、別々の抗原製剤を適切な濃度で保存溶液に溶解し、互いに混合し、その中に微粒子を淵加することによって、微粒子を共同コーティングする。これよりも好ましいもう１つの方法では、最初の量の微粒子を最初の抗原製剤でコーティングし、次の量の微粒子を２番目の抗原製剤でコーティングするといった具合に続けていく。即ち、それぞれ別々にコーティングする。このように個々にコーティングした後、最初の量と次の量のコーティング済み微粒子を、全部または一部組み合わせ、検定法に使用する。この好ましい方法では、微粒子ビーズに実際に存在する各抗原の量を定量化するのが容易である。各抗原がコーティングされた微粒子を混合液に加える割合を変化させることによって、抗原の量を調整できるためである。本発明の方法は、固相が微粒子から構成される自動及び半自動システムを使ったシステムで使用することができる。このようなシステムには、特許出願中の米国特許出願第４２５，６５１号及び第４２５，６４３号に説明されているものが含まれる。これはそれぞれＥＰＯ出願番号第０４２５６３３号及び第０４２４６３４号に対応するものであり、これらは参考文献として本文書に取り込まれる。その他の様々な固相を使用するその他の実施例も企図しており、これも本発明の範囲内である。例えば係属中の米国特許出願番号第１５０，２７８号（ＥＰＯ公開第０３２６１００号に対応）及び米国特許出願番号第３７５，０２９号（ＥＰＯ公開第０４０６４７３号）（どちらも所有者が同じ）に説明されており、本書には参考文献として取り込まれる、負帯電ポリマーを持つ固定可能反応複合体を固定するためのイオンキャプチャー法を本発明に従って採用すれば、高速液体相免疫化学的反応が可能になる。この実施態様では、固定可能免疫複合体は、負に帯電したポリアニオン／免疫複合体と、処理済みの正に帯電した多孔性マトリックスの間のイオンの相互作用によって反応混合物の残りの部分から分離され、過去に説明した様々な信号生成システムを用いて検出される。この中には、継続中の米国特許出願番号第９２１，９７９号（ＥＰＯ公開第０２７３１１５号）（どちらも所有者が同じ）に説明されており、ここに参考文献として取り込まれる化学ルミネセンス信号測定法も含まれる。免疫検定用の走査型トンネリング顕微鏡を使用することも、本発明の方法を容易に適応できるようにする技術である。走査型プローブ顕微鏡、特に原子力顕微鏡で、捕獲相、例えば発明の選り抜きの抗原を固相に付着させ、走査型プローブ顕微鏡を用いて、固相の表面に存在するかも知れない抗原／抗体複合体を検出することができる。走査型トンネリング顕微鏡を使用すれば、抗原／抗体複合体を検出するのに、通常は多くの免疫検定システムで使用しなければならない標識を使う必要がなくなる。このようなシステムは継続中の米国特許出願番号第６６２，１４７号（同じ所有者）の中で説明されており、ここに参考文献として取り込まれる。フロー免疫検定（ＦＩＡ）を使用することも、本発明の方法を容易に適応することができるもう１つの技術である。ＦＩＡを利用すれば、１つの患者試料を使って複数の分析物を同時に検出することができる。このアプローチは例えば５、７、１０、１５μｍといった様々なサイズの微粒子を使用する。これらにはそれぞれに、発明の特異的組み換え抗原が個々にコーティングされている。これらの粒子の混合物を試料に加え、培養し、洗浄し、蛍光色素を標識として付けた抗ヒトＩｇＧを加え、試料中の特異的ヒト抗体の結合を検出する。様々な抗体を区別するには、蛍光色素の標識の仕方をいくつか用いればよい。分析はフロー細胞計で行うが、これにより試料中に存在する様々なサイズの粒子と蛍光色素で標識した検出試薬との結合を同時に検出することができる。照明を当てた細胞からの電子信号及び光信号を感知するフロー細胞計法では、細胞表面の特性、体積、及び細胞のサイズを測定することができる。試験試料中に存在する抗体は捕獲試薬（例えば発明の組み換え抗原）に結合し、捕獲試薬に直接共役するか第２反応を介して追加する蛍光色素によって検出される。異なる波長で励起する異なる色素を、異なる抗体に対して特異的な複数の捕獲試薬と一緒に使えば、１つの試料から複数の抗体を検出することができる。蛍光フロー細胞計測では、粒子懸濁液、一般に試験試料中の細胞は、フローセルによって輸送される。フローセルでは試料中の個々の粒子に、１つまたは複数に焦点を合わせた光束が当てられ、１つまたは複数のディテクタが、光束とフローセルを通過する標識粒子との間の相互作用を検出する。一般に、一部のディテクタは蛍光放出を測定するようにデザインされており、他のディテクターは散乱強度またはパルス持続時間を測定するようにデザインされている。従って、フローセルを通過する各粒子は、放出色、光強度、またはその他の特性（例、ディテクターが測定した散乱）を軸とした特性スペースにマッピングすることができる。ある状況では、試料中の別々の粒子が特性スペースのオーバーラップしない別々の領域にマッピングされ、特性スペースのこのマッピングに基づいて各粒子を分析することができる。フロー細胞計測分析のために試験試料を準備するには、術者は試料試験管から分析試験管に、試験試料の量をマニュアルでピペットで移す。所望の蛍光色素を標識した捕獲試薬を１容量加える。次に試料と捕獲試薬の混合物を、抗体／組み換え抗原の結合が起こるのに十分な時間と条件で培養する。培養後、必要に応じて術者は試料中のＲＢＣを破壊するためにＲＮＳｌｙｓｅ（溶解剤）を１容量加える。溶解後、試料を遠心分離し洗浄して、溶解段階で生じた残ったデブリを除去する。遠心分離／洗浄段階は、数回繰り返してもよい。試料を固定液１容量に懸濁させ、次に蛍光フロー細胞計量装置に通過させる。フロー自動分析の方法とそれに用いる装置については、同一所有者の米国特許出願番号第０８／２８３，３７９に号に説明されており、ここには参考文献として取り込まれる。ミクロスフェアをここで説明した方法の中で利用し、標識を付け、ｉｎｖｉｔｒｏ診断法で採用するのは、本発明の範囲内である。またその他の細胞または粒子、例えば細菌、ウイルス、ｄｕｒｏｃｙｔｅｓなどに、本発明が説明している組み換え抗原の標識を付け、フロー細胞計測法に使用するのも、本発明の範囲内である。粒子計数では、特異的結合対の他のメンバーとして目的の抗体に結合することができる捕獲試薬でコーティングした微粒子と、試験試料のアリコートを混合することによって、特異的結合対の他の一部である分析物を定量する。試験試料中に核酸が存在する場合、これは捕獲試薬でコーティングされた微粒子の一部と結合し、凝集物が形成される。分析物の濃度は非凝集粒子数に反比例する。参考文献として、例えばＲｏｓｅｅｔａｌ.，ｅｄｓ.，ＭａｎｕａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版、第８章、ページ４３〜４８、ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８６）を参照されたい。本発明は固相を使用することが好ましいとしているが、本発明の抗原を非固相の検定システムに利用してもよい。これらのアッセイシステムは当業者には知られており、本発明の範囲内だと考えられる。もう１つの実施態様では、ＨＴＬＶ−Ｉに特異的な組み換え抗原またはＨＴＬＶ−ＩＩに特異的な組み換え抗原だけを、上述の方法に従って免疫検定で用いる。ここに示した抗原の特異性により、これらの組み換え抗原は単一検定に使用することができる。従って、本発明に従って、ＨＴＬＶ−Ｉに特異的な１つまたは複数の組み換え抗原、或いはＨＴＬＶ−ＩＩに特異的な１つまたは複数の抗原を使って単一免疫検定を行うことにより、患者試料中のＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体の検出に関して、特異性及び選択性が高まり、ＨＴＬＶ− Ｉ及び（または）ＨＴＬＶ−ＩＩによる感染を示すことができる。検定フォーマットは、ここで詳しく説明するＣＫＳ蛋白質を利用してデザインすることができる。融合蛋白質は大腸菌酵素、ＣＫＳ（ＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−マンノ−オクツロソネート・シチジリル・トランスフェラーゼまたはＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ）によって生成され、異質蛋白質はＣＫＳ及び異質蛋白質をコードするＤＮＡ挿入物を持つクローニング媒介物によって形質転換した細胞で発現される。この発現システムは米国特許番号第５，３２２，７６９号の中で開示されており、ここには参考文献として取り込まれた。別の検定フォーマットでは、免疫ドットブロット検定システムでこの発明の組み換え抗原を使用することができる。免疫ドットブロット検定システムは、ここで示した精製した組み換え抗原のパネルをニトロセルロース固体サポートの土に置いて使用する。調製した固体サポートは試験試料と接触して、組み換え抗原（その他の特異的結合部分）に特異的な抗体（特異的結合部分）を捕獲し、特異的結合部分対を形成する。捕獲された抗体は、指示試薬との反応によって検出される。好ましくは共役特異的反応は、１９８８年８月２日に出願された米国特許出願番号第０７／２２７，４０８号で説明されている装置内の反射率光学アセンブリを使って定量する。免疫ドットアッセイを実施するのに有用な特別の方法及び装置については、関連のある米国特許出願番号第０７／２２７，５８６号及び第０７／２７，５９０号（どちらも１９８８年８月２日に出願された）の中でもっと詳しく説明されており、また共通の所有者を持ち、参考文献としてここに添付してある米国特許番号第５，０７５，０７７号（米国出願番号第０７／２２７，２７２号、１９８８年８月２日出願）にも説明されている。簡単に言えば、ニトロセルロースベースのテストカートリッジを複数の抗原性ポリペプチドで処理する。各ポリペプチドはテストカートリッジの特異的反応ゾーン内に含まれる。抗原性ポリペプチドがすべてニトロセルロースの上に置かれたら、ニトロセルロース上の余分な結合部位をブロックする。次にテストカートリッジを試験試料と接触させ、試験試料に適切な抗体が含まれていれば、各反応ゾーンの各組み換え抗原が反応するようにする。反応後、テストカートリッジを洗浄し、抗原抗体反応を適切な既知の試薬で同定する。ここに説明したとおり、プロセス全体は自動化が可能である。材料及び方法Ａ．一般的な技法発明の実施では、特に指摘のない限り、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ及び免疫学といった分野での従来のよく知られた技術及び方法が使用される。このような技術は文献の中で詳しく説明されている。例えば次のような文献がある：Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．(1989)；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．，ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，ＶｏｌｕｍｅＩａｎｄＩＩ（１９８５）；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔｅｄ．，ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，(1984)；Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，（１９８４）；Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，（１９８４）；Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙｅｄ．，ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ，(1986)；ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓａｎｄＥｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ（１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，（１９８４）；ｔｈｅｓｅｒｉｅｓ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌｏｒｉｄａ；Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８７）；Ｗｕｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５４ａｎｄ１５５；Ｍａｙｅｒｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓＩｎＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｓｃｏｐｅｓ，ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．；ａｎｄＤ．Ｗｅｉｒｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＨａｎｄｂｏｏｋＯｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＶｏｌｕｍｅｓＩ−ＩＶ（１９８６）。Ｂ．組み換え抗原の調製核酸シーケンスが得られれば、どちらかの鎖に符号化（コード）されたポリペプチドの抗原的に活発な領域を符号化（コード）している発現ベクターを構築することができる。これらの抗原的に活発な領域は、ＨＴＬＶ− Ｉ及び（または）ＨＴＬＶ−ＩＩの構造的領域（例えばコア抗原のエンベロープ（コート）又はコア抗原）から、またＨＴＬＶ−Ｉ及び（または）ＨＴＬＶ−ＩＩの非構造的領域(例えばポリヌクレオチド結合蛋白質、ポリヌクレオチドポリメラーゼ、及びウイルス粒子の複製及び（または）組立に必要なその他のウイルス蛋白質)から誘導することができる。所望のポリペプチドを符号化する断片は、従来の制限消化法または合成法を使ってゲノムまたはｃＤＮＡのクローンから誘導し、例えばβガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）またはスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）またはＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ（CKS）といった融合シーケンスの一部を含むかも知れないベクターに連結する。或いはＬａｍｂｄａＰＬシステムを使用してもよい。ＳＯＤの融合シーケンスを含むポリペプチド生成に有用な方法及びベクターについては、１９８６年１０月１日に発行されたＥＰＯ０１９６０５６で説明されており、ＣＫＳのそれについては１９８９年９月１３日に発行されたＥＰＯ発行番号０３３１９６１の中で説明されている。所望のポリペプチドを符号化している核酸シーケンスは、融合形態であろうと成熟形態であろうと、また分泌を許容する信号シーケンスを含んでいるか否かに係わらず、便利な宿主に適した発現ベクターに連結してよい。組み換え蛋白質の形成には、真核生物と原核生物の両方の宿主システムを使用する。その一部はここにリストしてある。次に溶解した細胞または培地からポリペプチドを分離し、用途に必要な程度まで精製する。精製はよく知られた技術によって実施することができるが、その中には塩分別、イオン交換とサイジング樹脂でのクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離などがある。このようなポリペプチドは、診断用試薬として、または受動的免疫療法に使用することができる。Ｃ．ＨＴＬＶ−Ｉ及び（または）ＩＩエピトープに対する抗体の調製ここでの説明に従って調製した免疫原性組み換え抗原を使えば、ポリクロナル抗体またはモノクロナル抗体を調製することができる。ポリクロナル抗体を調製する場合、選択した哺乳動物（例、マウス、ウサギ、山羊、馬など）を、ＨＴＬＶエピトープを最低１個持つ免疫原性ポリペプチドを持っている発明の組み換え抗原で免疫化する。適切な培養期間の後、免疫化した動物の血清を採取し、既知の手続きに従って処理する。ＨＴＬＶエピトープに対するポリクロナル抗体を含む血清に、他の抗原に対する抗体が含まれている場合、ポリクロナル抗体は、例えばイムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。ポリクロナル抗体を生成し処理する技術は、当該分野では既知のものであり、次の文献などでも説明されている：ＭａｙｅｒａｎｄＷａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓＩｎＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）。ポリクロナル抗体は、ＨＴＬＶに感染したことのある哺乳動物からも入手できる。ＨＴＬＶに感染した哺乳動物の血清から得たＨＴＬＶエピトープに対する抗体を精製する方法の例はここに説明されている。ＨＴＬＶエピトープに対するモノクロナル抗体も、当業者が生成することができる。このような抗体を生成する一般的な方法は公知であり、例えば次の文献などで紹介されている：ＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９４(１９７５)；Ｊ．Ｇ．Ｒ．Ｈｕｒｒｅｌ，ｅｄ．，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＨｙｂｒｉｄｏｍａＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣＰｒｅｓｓＩｎｃ．；ＢｏｃｏＲａｔｏｎ，ＦＬ（１９８２）；Ｌ．Ｔ．Ｍｉｍｍｓｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７６：６０４−６１９（１９９０）。不死の抗体生成細胞系列は、細胞融合によって形成することができ、また腫瘍形成性ＤＮＡによるＢ型リンパ球の直接形質転換、またはＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスによるトランスフェクションといったその他の技術によっても形成可能である。次の文献も参照すること：Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒｅｔａｌ．，ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｃｏｐｅｓ（１９８０）ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８４）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇｅｔａｌ．，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＴ−ＣｅｌｌＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔｅｔａｌ．，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１９８０）。モノクロナル抗体の使用及び技術の例は、米国特許出願番号第７４８，２９２号；第７４８，５６３号；第６１０，１７５号；第６４８，４７３号；第６４８，４７７号及び第６４８，４７５号の中で説明されており、ここには参考文献として取り込まれる。このようにして得たＨＴＬＶエピトープ用のモノクロナル抗体及びポリクロナル抗体は、診断及び予後判断に有用であり、中和抗体は受動的免疫療法に有用である。特にモノクロナル抗体は、抗遺伝子型抗体の生成に使用することができる。これらの抗遺伝子型抗体は、防御しようとしている感染源の抗原の“内部イメージ”を持ったイムノグロブリンである。例えば次の文献を参考にされたい：Ａ．Ｎｉｓｏｎｏｆｆｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．２１：３９７−４０６（１９８１）；Ｄｒｅｅｓｍａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５１：７６１（１９８５）。このような遺伝子型抗体を生成する技法はよく知られており、例えば次の文献で例が示されている：Ｇｒｙｃｈｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１６：７４（１９８５）；ＭａｃＮａｍａｒａｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２６：１３２５（１９８４）；ａｎｄＵｙｔｄｅｈａａｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：１２２５（１９８５）。これらの抗遺伝子型抗体は、ＨＴＬＶ感染の治療や、ＨＴＬＶ抗原の免疫原性領域の解明に有用かもしれない。Ｄ．形質転換形質転換はポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する方法として知られている任意の方法によって行ってよい。これにはポリヌクレオチドをウイルスの中にパッケージングする方法、宿主細胞をウイルスで形質導入する方法、またポリヌクレオチドを直接摂取する方法などがある。選択する形質転換法は、形質転換する宿主に依存している。直接摂取による細菌の形質転換では、一般に塩化カルシウムまたは塩化ルビジウムによる処理を行う。Ｃｏｈｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｒｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９：２１１０（１９７２）。直接摂取によるイースト菌形質転換は、Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：５２６（１９７８）のリン酸カルシウム沈殿法またはその修正法によって実施することができるだろう。Ｅ．ベクターの構築ベクターの構築には、よく知られた方法を使用する。一般に、適切な制限酵素を、市販されているこれらの酵素のメーカーが指定している条件下で処理することによって、部位特異的なＤＮＡ分裂を行う。通常、約１マイクログラム（μｇ）のプラスミドまたはＤＮＡシーケンスを、約２０μｌの緩衝液の中で、３７℃ で１〜２時間培養することにより、１〜１０単位の酵素によって分裂させる。制限酵素による培養後、蛋白質をフェノール／クロロホルム抽出によって除去し、エタノールによる沈殿によってＤＮＡを回収する。分裂した断片は、当業者がよく知っている方法に従って、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲルによる電気泳動法を用いて分離することができる。付着性の末端開裂断片は、混合物に存在する適切なデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰｓ）が存在するとき大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１（Ｋｌｅｎｏｗ）を使えば末端平滑化され得る。Ｓ１ヌクレアーゼによる処理を使用することもでき、一本鎖ＤＮＡの任意部分が加水分解する。連結はＴ４ＤＮＡリガーゼ及びＡＴＰを用い、標準的な緩衝液と温度条件を用いて実施する。付着性の末端連結は、平滑末端連結よりも、必要となるＡＴＰ及びリガーゼが少ない。連結混合物の一部としてベクター断片を使用する場合、５’−燐酸塩を除去し、ベクターの再連結を防止するため、ベクター断片は細菌のアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）または牛腸アルカリホスファターゼを使って処理することがある。或いは、連結を防止するために、不要な断片の制限酵素消化を使うことができる。連結混合物は大腸菌のような適切なクローン化宿主に形質転換し、抗生物質耐性のような方法によって、うまく形質転換したものを選択し、次に正しい構造についてスクリーニングする。Ｆ．所望のＤＮＡシーケンスの構築合成オリゴヌクレオチドは、Ｗａｒｎｅｒ，ＤＮＡ３：４０１（１９８４）に説明されているような自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製してもよい。希望すれば、反応の標準条件を用いて³²Ｐ−ＡＴＰの存在下でポリヌクレオチドキナーゼによって処理することにより、合成鎖に³²Ｐの標識を付けてもよい。ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリから分離したものを含むＤＮＡシーケンスは、Ｚｏｌｌｅｒ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１０：６４８７（１９８２）に説明されているような部位指向突然変異生成を含む既知の方法によって修飾してもよい。簡単に言えば、修飾するＤＮＡを一本鎖シーケンスとしてファージにパッケージングし、修飾するＤＮＡ部分を補足する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、希望する修飾を自身のシーケンスに含め、ＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖ＤＮＡに変換する。ファージの各鎖の複製を含む形質転換細菌の培養物を寒天培地に植えつけ、プラクを得る。理論的には新しいプラクの５０％に突然変異したシーケンスを持つファージが含まれており、残りの５０％にはオリジナルのシーケンスが含まれているはずである。正しい鎖を用いたハイブリダイゼーションにとって適切な温度と条件を用いて、但し未修飾のシーケンスは用いずに、プラクの複製を標識した合成プローブにハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーションによって同定したシーケンスを回収し、クローン化する。Ｇ．構築及びシーケンスの確認標準的なベクター構築の場合、連結混合物は大腸菌種ＸＬ−１Ｂｌｕｅまたはその他の適切な宿主に形質転換され、うまく形質転換したものは、抗生物質耐性またはその他のマーカーによって選択する。次に、通常はＣｌｅｗｅｌｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１０：６６７（1972）が報告したクロラムフェニコール増幅の後に行う、Ｃｌｅｗｅｌｌｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６２：１１５９（１９６９）の方法に従い、形質転換したものからプラスミドを調製する。ＤＮＡは通常、制限酵素分析及び（または）シーケンシングによって分離し、分析する。シーケンシングは、Ｓａｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３（１９７７）（この方法についてはＭｅｓｓｉｎｇｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．９：３０９（１９８１）にも説明されている）のよく知られたジデオキシ法、またはＭａｘａｍｅｔａｌ.，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６５：４９９（１９８０）の方法によって行うことができる。ＧＣが多い部分で時々観察されるバンド圧縮という問題は、Ｂａｒｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：４２８（１９８６）が報告した方法に従って、Ｔ−デアゾグアノシンを使って克服する。次に本発明について例を用いて説明する。これは限定はされないが発明の精神と範囲を示すことを意図する。実施例実施例１組換えＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩ抗原の調製及び発現Ａ．ＨＴＬＶ−Ｉ抗原の調製総量１ｍｌのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１０６細胞を１５分間沸騰させることによってＨＵＴ１０２．Ｂ２細胞から全核酸を単離した。典型的には、各ＰＣＲ増幅に１０μｌを使用した。ＨＵＴ１０２．Ｂ２細胞系は、ＨＵＴ１０（ＡＴＣＣ寄託番号ＴＩＢ１６２、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０２３１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ２０８５２）のサブクローンである。ｉ．ｐ２４抗原の調製図１に示すように、このコアタンパク質の全コーディング領域に隣接するプライマー（配列１及び２）を設計した。クローニングを容易にするために、５’プライマー（配列１）にＥｃｏＲＩ部位を付加し、３’プライマー（配列２）にＢａｍＨＩ部位を組み込んだ。翻訳終了を可能にするために３’プライマー（配列２）に人工終止コドン（ＴＡＧ）も付加した。これらのプライマーを使用すると、６５７ｂｐのフラグメントが増幅されたので、このフラグメントを次に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いてＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２０１に結合させた。ＥｃｏＲＩ部位は、完全形（ｉｎｔａｃｔ）のｐ２４遺伝子（配列３）の直前のＣＫＳタンパク質のアミノ酸番号２４５及び２４６のＧｌｕＰｈｅに翻訳された。このプラスミドをｐ２４ＩＣＫＳと命名した。ｉｉ．ｇｐ２１抗原の調製図２に示すように、このエンベロープタンパク質の全コーディング領域に隣接するプライマー（配列４及び５）を設計した。ｇｐ４６と２１ｅとの接合部にＢａｍＨＩ部位が既に存在していたので、５’プライマー（配列４）に人工制限部位を含ませなかった。しかしながら、３’プライマー（配列５）にはＨｉｎＤＩＩＩ部位と終止コドンとを組み込んだ。これらのプライマーを使用すると、５４６塩基対のフラグメントが増幅された。ＢａｍＨＩ及びＨｉｎＤＩＩＩ制限部位を用いてＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２０１に結合させた。この手順で、全ｇｐ２１タンパク質（配列６）がＣＫＳタンパク質のアミノ酸番号２５２及び２５３（図２参照）に融合し、プラスミドｐＳＮ７８４が得られた。このｇｐ２１タンパク質の発現は適格なレベルに到達していないことが判明した。しかしながら、疎水性Ｎ末端の最初の１７個のアミノ酸の除去によって発現レベルが劇的に向上することが判明した。この切除は、制限酵素ＥｃｏＲＩ（この部位はｐＪＯ２０１のポリリンカーに存在する）及びＮｃｏＩを用いて行った。再結合に先立って、オーバーハングしている付着末端をＤＮＡポリメラーゼ（クレノウフラグメント）の付加によって埋め戻した。この結果として、ｇｐ２１のＮ末端から１７個のアミノ酸が除去され、更に、ｐＪＯ２０１のポリリンカーから８個のアミノ酸が除去され、プラスミドｐ２１ＩＣＫＳが得られた。ｉｉｉ．ｇｐ４６抗原の調製図３に示すように、このエンベロープタンパク質のＣ末端側の半鎖に隣接するプライマー（配列７及び８）を設計した。５’プライマー（配列７）はｇｐ４６の非反復ＳａｌＩ制限部位を使用し、３’プライマー（配列８）は終止コドンとＨｉｎＤＩＩＩ部位との双方を含んでいた。ｐＪＯ２０１発現ベクターには２個のＳａｌＩ制限部位が存在していたので、ｐＪＯ２０１ポリリンカーと適正に位置合わせできるように５’プライマー（配列７）に追加のＸｂａＩ部位を組み込んだ。増幅した４５９塩基対のｇｐ４６フラグメントをＸｂａＩ及びＨｉｎＤＩＩＩで消化し、これらの部位でｐＪＯ２０１に結合させ、ＣＫＳのアミノ酸２５３に融合させた。このプラスミドをｐ４６ＩＣＫＳ（配列９）と命名した。Ｂ．ＨＴＬＶ−ＩＩ抗原の調製総量１ｍｌのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１０６細胞を１５分間沸騰させることによってＨＴＬＶ−ＩＩＷｉｌ−ＮＲＡ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＬＲ１１５８０、参照によって本発明に含まれると前述した１９９３年７月１日出願の米国特許出願第０８／０８６，４１５号に開示）から全核酸を単離した。典型的には、各ＰＣＲ増幅に１０μｌの細胞を使用した。ｉ．ｐ２４抗原の調製図４に示すように、このコアタンパク質の全コーディング領域に隣接するプライマー（配列１０及び１１）を設計した。クローニングを容易にするために、５ ’プライマー（配列１０）にＥｃｏＲＩ部位を付加し、３’プライマー（配列１１）にＢａｍＨＩ部位を組み込んだ。翻訳終了を可能にするために３’プライマー（配列１１）に終止コドン（ＴＡＧ）も付加した。これらのプライマーを使用すると、６５７ｂｐのフラグメントが増幅されたので、このフラグメントを次に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いてＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２０１に結合させた。ＥｃｏＲＩ部位は、完全形のｐ２４遺伝子（配列１２）の直前のＣＫＳタンパク質のアミノ酸番号２４５及び２４６のＧｌｕＰｈｅに翻訳された。このプラスミドをｐ２４ＩＩＣＫＳと命名した。ｉｉ．ｇｐ２１抗原の調製疎水性Ｎ末端を切除するために使用できる非反復制限部位がこの遺伝子には存在しなかったので、先端が欠失した形態のＨＴＬＶ−Ｉのｇｐ２１と同じ場所で増幅を開始させる５’プライマー（配列１３）を作製した。この手順を図５に示す。この場合にも、ＥｃｏＲＩ部位はこの５’プライマー（配列１３）に含まれており、ＢａｍＨＩ部位（終止コドンを含む）は３’プライマー（配列１４）に組み込まれた。これらのプライマーは５１０塩基対のフラグメント（配列１５）を増幅させ、このフラグメントをｐＪＯ２０１のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位に結合させると、このエンベロープタンパク質はアミノ酸２４５及び２４６でＣＫＳに融合した。このプラスミドをｐ２１ＩＩＣＫＳと命名した（図５参照）。Ｃ．ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩ組換え抗原構築物による大腸菌株の増殖及び誘発組換え抗原構築物を含む大腸菌の一夜播種培養物（ＸＬ１Ｂｌｕｅ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａＣａ．から入手可能）を、５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン−ＨＣｌ及び１００μｇ／ｍｌのナトリウムアンピシリンを補充した５００ｍｌの滅菌ＥｘｃｅｌｌＴｅｒｒｉｆｉｃブイヨン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ．，Ｓｔ．ＬｏｕｉｓＭｏ．から入手可能）中で調製し、３７℃の軌道旋回型振盪インキュベータに配置した。播種培養物から１００ｍｌの接種物を、１００μｇ／ｍｌのナトリウムアンピシリンを補充した１リットルの滅菌ＥｘｃｅｌｌＴｅｒｒｉｆｉｃブイヨンを収容したフラスコに移し、培養物が中期対数増殖期に達するまで３７℃でインキュベートした。次に、培養物を１ｍＭのＩＴＰＧ（イソプロピルチオガラクトシド）によって３７ ℃で３時間誘発した。誘発期間の終了後、細胞を遠心によってペレット化して収集した。ペレット化した細胞を以後の処理まで−７０℃で保存した。Ｄ．大腸菌中で産生された可溶性組換えＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩ抗原（即ち、ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４及びＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４）の単離前項の実施例１（Ｃ）に記載の手順で調製した凍結大腸菌細胞を、５０ｍＭのトリス（トリス〔ヒドロキシメチル〕アミノメタン）ｐＨ８、１０ｍＭのＮａＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸ナトリウム）、１５０ｍＭのＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオリド）及び１μＭのペプスタチンＡから成る低温の溶菌バッファに均質化（ＶｉｒｔｕｓＣｏｍｐａｎｙＩｎｃ．，Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ｎ．Ｙ．）によって再懸濁させた。リゾチーム（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を処理細胞１グラムあたり１．３ｍｇの濃度でホモジネートに添加した。ホモジネートを氷上で３０分間インキュベートした。トリトンＸ−１００（登録商標）（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）をホモジネートに最終濃度０．１％ｖ／ｖで添加して細胞を溶解した。ＤＮアーゼＩ（デオキシリボヌクレアーゼＩ、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を２０単位／ｍｌの最終濃度で添加し、ホモジネートを３７℃で３０分間インキュベートした。ホモジネートを遠心によって清澄化した。清澄化したホモジネート中の可溶性ｐ２４抗原を２０％〜３５％飽和の硫安（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓＤｉｖｉｓｉｏｎ，ＢａｘｔｅｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＩｎｃ．，ＭｃＧａｗＰｋ．，ＩＬ．）分画によって沈殿させた。沈殿したタンパク質を遠心によってペレット化した。ペレット化したタンパク質を５０ｍＭのトリスｐＨ８、５０ｍＭのＮａＣｌに再懸濁させ、クロマトグラフィーで精製するまで４℃で保存した。Ｅ．大腸菌中の不溶性封入体として産生された組換えＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩ抗原（即ちＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６、ｇｐ２１及びＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１）の単離及び可溶化上記の実施例１（Ｃ）に記載の手順で調製した凍結大腸菌細胞を５０ｍＭのトリスｐＨ８、１０ｍＭのＮａＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、８％（ｗ／ｖ）のショ糖、５％のトリトンＸ−１００（登録商標）（ｖ／ｖ）、１ｍＭのＰＭＳＦ及び１μＭのペプスタチンＡから成る低温の溶菌バッファに均質化によって再葱濁させた。処理細胞１グラムあたり１．３ｍｇの濃度でリゾチームをホモジネートに添加し、ホモジネートを氷上で３０分間インキュベートして細胞を溶解した。遠心によって可溶性タンパク質から封入体を分離した。これらのペレット化した封入体を、（１）溶菌バッファ、（２）１０ｍＭのＮａＥＤＴＡｐＨ８、３０％（ｗ／ｖ）ショ糖、及び、（３）水を順次に用いて洗浄し、ペレット化した。洗浄した封入体を５０ｍＭのトリスｐＨ８、１０ｍＭのＮａＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び３Ｍの尿素に再懸濁させ、氷上で１時間インキュベートした。次に、遠心によって可溶化タンパク質から封入体を分離した。ペレット化した封入体は７Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭのトリスｐＨ８、０．１％（ｖ／ｖ）のベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ）中に４℃で一夜維持することによって完全に可溶化した。可溶化した組換え抗原を遠心によって清澄化し、０．２μｍのフィルターに通し、クロマトグラフィーによって精製するまで−２０℃以下で保存した。Ｆ．組換えＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩ抗原のクロマトグラフィーによる精製ｉ．ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩのｐ２４抗原可溶性の組換えＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩのｐ２４抗原（夫々、配列３及び１２）を以下のごとき２段階方法によって精製した。硫安分画したタンパク質をカチオン交換カラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．から入手可能なＳ−セファロース）に充填し、５０ｍＭのトリスｐＨ８で平衡させた。カチオン交換マトリックスに結合しないタンパク質を収集し、アニオン交換カラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．から入手可能なＱ−セファロース）に充填し、５０ｍＭのトリスｐＨ８で平衡させた。０−１ＭのＮａＣｌ勾配を用いてアニオン交換カラムからタンパク質を溶出させた。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して画分を分析した。組換えｐ２４抗原（配列３及び１２）を含む画分をプールし、次いでカットオフ分子量１０，０００のスピンフイルター（ＡｍｉｃｏｎＩｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）を用いた限外濾過によって濃縮した。プールした画分を４％ＳＤＳ及び５％ＢＭＥによって１００℃で５分間処理した。熱処理した組換えＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩのｐ２４抗原（夫々、配列３及び１２）を、２５ｍＭのトリスｐＨ８．０、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）のＢＭＥ、０．１％のＳＤＳ（ｗ／ｖ）で平衡させたＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）カラムでサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して画分を分析した。精製した組換えｐ２４抗原を含む画分をプールし、０．２μ ｍのフィルターに通し、−７０℃で保存した。ｉｉ．ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１及びＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１抗原不溶性のＨＴＬＶ組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６(配列９)、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１(配列６)またはＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１（配列１５）を以下の２段階方法で精製した。不溶性抗原のグアニジン−ＨＣｌ抽出物を、５０ｍＭのトリスｐＨ８、８Ｍの尿素及び０．１％（ｖ／ｖ）のＢＭＥで平衡させたＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００カラムでサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して画分を分析した。ＨＴＬＶ組換え抗原を含む画分をプールし、次いで限外濾過によって濃縮した。プールした画分を４％のＳＤＳ（ｗ／ｖ）及び５％のＢＭＥ（ｗ／ｖ）によって室温で３時間処理した。ＳＤＳ処理した組換え抗原を、２５ｍＭのトリスｐＨ８、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１％ｖ／ｖのＢＭＥ、０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳで平衡させたＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００カラムでサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して画分を分析した。精製したＨＴＬＶ組換え抗原を含む画分をプールし、０．２μｍのフィルターに通し、−７０℃で保存した。実施例２ニトロセルロース上のＨＴＬＶ−Ｉ及び／またはＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体の検出Ａ．試薬実施例１に記載の手順で調製した精製ＨＴＬＶ組換え抗原を、当業界で公知の以下のような手順によってニトロセルロース固体支持体にコートした。簡単に説明すると、ＨＴＬＶ組換え抗原（表１参照）であるＨＴＬＶ−Ｉｐ２４（配列３）、ＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４（配列１２）、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６（配列９）、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１（配列６）及びＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１（配列１５）またはヒトＩｇＧ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）を個々に、５０ｍＭのＭｏｐｓｏ（３−〔Ｎ−モルフォリノ〕−２−ヒドロキシ− プロパンスルホン酸）ｐＨ７に希釈し、スロットブロット装置（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＳｅｐａｒａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ，ＨｙｄｅＰａｒｋ，ＭＡから入手可能）を介して０．４５μｍのニトロセルロースシート（ＢｉｏｒａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡから入手可能）に室温で６０分間接触させた。ニトロセルロース膜を先ずＰＢＳで洗浄し、次いで５％ｗ／ｖのＮＦＤＭ（脱脂ドライミルク）を含むＰＢＳでブロックした。膜を乾燥させ、ストリップに裁断した（図８参照）。アルカリ性ホスファターゼ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）によって標識したヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体と基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）とを使用して、免疫反応性ニトロセルロースブロットを染色した。Ｂ．方法３ｍｌのサンプル希釈用バッファ（５％ｗ／ｖのＮＦＤＭ及び１０％ｖ／ｖの熱失活ヤギ血清を加えたＰＢＳ）にストリップを添加した。３０マイクロリットル（３０μｌ）の試験サンプルを各ストリップに添加し、室温で１６〜２０時間インキュベートした。ストリップを０．０２５％のトゥイーン−２０（登録商標）（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）を含むＰＢＳによって洗浄した。サンプル希釈用バッファに希釈した３ｍｌの結合体（アルカリ性ホスファターゼで標識したヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体）をストリップに添加し、室温で６０分間インキュベートした。０．０２５％のトゥイーン−２０（登録商標）を含むＰＢＳでストリップを再度洗浄した。ストリップを２ｍｌのＮＢＴ／ＢＣＩＰホスファターゼ基質に室温で１５分間接触させることによって、ニトロセルロースに固定化されたヤギ抗−ヒトアルカリ性ホスファターゼ結合体の量を不溶性青色沈殿物の沈殿によって測定した。２ｍｌの１Ｍの酢酸ナトリウムバッファｐＨ４で反応を停止させた。次にストリップを蒸留水ですすぎ、室温で乾燥した。Ｃ．結果上記の本発明の方法を用い、非希釈血漿及び希釈血漿の２５のサンプルから成る試験パネルを試験した。試験パネルは、ＨＴＬＶ−Ｉ陽性が確認された７サンプル、ＨＴＬＶ−ＩＩ陽性が確認された８サンプル及び５つの陰性サンプルを含んでいた。ＨＴＬＶ陽性の２０の試験サンプルのうちの１７サンプルはＳｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＳｐｅｃｉａｌｔｙＰｒｏｄｕｃｔｓ，７８０ＰａｒｋＮ．Ｂｌｖｄ．，Ｃｌａｒｋｓｔｏｎ，ＧＡ３００２１から得られたものである。得られた全部のサンプルがウェスタンブロット、ＲＩＰＡ及びＰＣＲの併用によって陽性であることが確認された。残りの３つの陽性サンプルは、ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで試験しウェスタンブロット、ＲＩＰＡ及びＰＣＲの併用によって陽性であることが確認されたドナーサンプル（２）または異性パートナー試験サンプル（１）であった。５つの血清陰性サンプルは社内研究室から得られた。本文中に記載のイムノ−スロットブロットアッセイは、２０サンプルから成る抗体陽性サンプルパネルのうちの２０サンプルを検出した（１００％）。血清陽性サンプルの各々は、少なくとも１つのｇａｇ遺伝子産物（ＨＴＬＶ−１ｐ２４〔配列３〕）及び／またはＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４〔配列１２〕）及び１つのｅｎｖ遺伝子産物（ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１〔配列６〕及び／またはＨＴＬＶ− Ｉｇｐ４６〔配列９〕及び／またはＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ１２〔配列１５〕）に反応した。５つの陰性サンプルは、ストリップにコートされた組換えＨＴＬＶ抗原に非反応性であった（図６参照）。これらのデータを更に表２に示す。実施例３ＥＬＩＳＡによるＨＴＬＶ−Ｉ及び／またはＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体の検出Ａ．試薬当業界で公知の以下のような手順を用いてＨＴＬＶ−Ｉ及び／またはＨＴＬＶ −ＩＩに対する抗体を捕獲するために、先行実施例で記載の手順で調製した精製ＨＴＬＶ組換え抗原をポリスチレン微粒子固体支持体（Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｔｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮから入手可能）にコートした。この実施例に使用した微粒子に、組換えＨＴＬＶ−Ｉｐ２４〔配列３〕、ＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４〔配列１２〕、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６〔配列９〕、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１〔配列６〕またはＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１〔配列15〕をコートした。簡単に説明すると、０．５μｍのポリスチレン微粒子を蒸留水で洗浄した。固体分１％の洗浄した微粒子をＰＢＳｐＨ７．４中の２００μｇ／ｍｌの組換え抗原と共に室温で一夜インキュベートした。微粒子をＰＢＳで洗浄し、次いで微粒子希釈剤（６５ｍＭのトリスｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．４Ｍのショ糖及び０．２％ｗ／ｖのナトリウアジド）に固体分１％に再懸濁させた。微粒子を３０％（ｖ／ｖ）の熱失活ヤギ血清と共に微粒子希釈剤に希釈し、使用前に４℃で一夜インキュベートした。Ｂ．方法血漿サンプルをサンプル希釈用ＭＥＩＡバッファで１：１０または１：２０に希釈し、市販のバッファ及び指示試薬（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ，ＩＬから入手可能）を本文で指示した以外は製造業者の指示通りに用いてＩＭｘ（登録商標）アッセイフォーマットで処理した。簡単に説明すると、１５μｌの希釈試験サンプルを１１５μｌのＭＥＩＡバッファで吸引し、１００μｌのコートされた微粒子と希釈剤（先行実施例に記載のごとく調製）中で混合し、３７℃でインキュベートした。洗浄後、６０μｌのヤギ抗−ヒトアルカリ性ホスファターゼ結合体を微粒子に添加した。固定化されたヤギ抗−ヒトアルカリホスファターゼ結合体の量を蛍光性基質試薬４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）の代謝回転によって定量した。Ｃ．結果前述したこの実施例の方法を用いて２１サンプルから成る試験パネルを試験した。試験パネルはＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩの非希釈サンプル及び希釈サンプルを含んでいた。パネルは、ＨＴＬＶ−Ｉ陽性が確認された７サンプル、ＨＴＬＶ−ＩＩ陽性が確認された８サンプル及び１つの陰性サンプルを含んでいた。個々の組換え抗原の各々を固体分０．１％の最終濃度で微粒子にコートし、アッセイ実施に先立ってサンプル希釈用ＭＥＩＡバッファで１：１０に希釈した試験サンプルと共に試験した。ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩのコンビネーションアッセイの場合には、微粒子を等しい割合で混合した。（１）ＨＴＬＶ−Ｉコンビネーションアッセイでは、ｐ２４（配列３）、ｇｐ４６（配列９）及びｇｐ２１（配列６）の各々を固体分０．１％とし、合計で固体分０．３％として微粒子にコートした；（２）ＨＴＬＶ−ＩＩコンビネーションアッセイでは、ｐ２４（配列１２）及びｇｐ２１（配列１５）の各々を固体分０．１％とし、合計で固体分０．２％として微粒子にコートした。コンビネーションアッセイでは、試験に先立ってサンプルをサンプル希釈用ＭＥＩＡバッファで１：２０に希釈した。陽性対陰性のカットオフ比が２であるサンプルは反応性であると判断した。本発明のＨＴＬＶ−Ｉｐ２４組換え抗原（配列３）をコートした微粒子は、図７に示すように、ＨＴＬＶ−Ｉ陽性の１０サンプルのうちの５サンプル及びＨＴＬＶ−ＩＩ陽性の１０サンプルのうちの８サンプルを検出し、合計では試験パネルの２０の陽性サンプルのうちの１３サンプルを検出した（６５％）。本発明のＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１組換え抗原（配列６）をコートした微粒子は、図８に示すように、ＨＴＬＶ−Ｉ陽性の１０サンプルのうちの１０サンプル及びＨＴＬＶ−ＩＩ陽性の１０サンプルのうちの９サンプルを検出し、合計では試験パネルの２０の陽性サンプルのうちの１９サンプルを検出した（９５％）。本発明のＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６組換え抗原（配列９）をコートした微粒子は、図９に示すように、ＨＴＬＶ−Ｉ陽性の１０サンプルのうちの５サンプル及びＨＴＬＶ−ＩＩ陽性の１０サンプルのうちの４サンプルを検出し、合計では試験パネルの２０の陽性サンプルのうちの９サンプルを検出した（４５％）。本発明のＨＴＬＶ− ＩＩｐ２４組換え抗原（配列１２）をコートした微粒子は、図１０に示すように、ＨＴＬＶ−Ｉ陽性の１０サンプルのうちの５サンプル及びＨＴＬＶ−ＩＩ陽性の１０サンプルのうちの１０サンプルを検出し、合計では試験パネルの２０の陽性サンプルのうちの１５サンプルを検出した（７５％）。本発明のＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１組換え抗原（配列１５）をコートした微粒子は、図１１に示すように、ＨＴＬＶ−Ｉ陽性の１０サンプルのうちの７サンプル及びＨＴＬＶ−ＩＩ陽性の１０サンプルのうちの９サンプルを検出し、合計では試験パネルの２０の陽性サンプルのうちの１６サンプルを検出した（８０％）。ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６及びＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１の微粒子を用いたＨＴＬＶ−Ｉコンビネーションアッセイは、図１２に示すように、１０個のＨＴＬＶ−Ｉ陽性サンプルのうちの１０サンプル及び１０個のＨＴＬＶ−ＩＩ陽性サンプルのうちの８サンプルを検出し、合計では試験パネルの２０の陽性サンプルのうちの１８サンプルを検出した（９０％）。このＨＴＬＶ− Ｉコンビネーションアッセイは、純（非希釈）血清がＨＴＬＶ−Ｉ陽性を示す８サンプルのうちの８サンプル及びＨＴＬＶ−ＩＩ陽性を示す６サンプルのうちの５サンプルを検出し、合計では試験パネルの１４の陽性サンプルのうちの１３サンプルを検出した（９３％）。ＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４及びＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１組換え抗原を用いたＨＴＬＶ−ＩＩコンビネーションアッセイは、図１３に示すように、１０個のＨＴＬＶ−Ｉ陽性サンプルのうちの５サンプル及び１０個のＨＴＬＶ −ＩＩ陽性サンプルのうちの９サンプルを検出し、合計では試験パネルの２０の陽性サンプルのうちの１４サンプルを検出した（７０％）。このＨＴＬＶ−ＩＩコンビネーションアッセイは、純（非希釈）血清がＨＴＬＶ−Ｉ陽性を示す８サンプルのうちの５サンプル及びＨＴＬＶ−ＩＩ陽性を示す６サンプルのうちの６サンプルを検出し、合計では試験パネルの１４の陽性サンプルのうちの１１サンプルを検出した（７９％）。これらのデータを表３にまとめる。本文中に記載のプラスミドはブダペスト条約の規約に従って１９９５年にＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ２０８３１，ＵＳＡに寄託され、寄託日から３０年間、または、最終寄託要求後５年間、または、米国特許の権利有効期間のうちの最も長い期間にわたって維持されるであろう。これらの寄託プラスミド及び本文中に記載の他の任意の寄託物質は、本文の教示に基づいて本発明を実施するときに好都合な例として示しただけであり、必すしもこれらを使用しなくてもよい。寄託されたすべての物質中のＨＴＬＶ配列は参照によって本発明に含まれるものとする。プラスミドｐ２４ＩＣＫＳはＡＴＣＣ受託番号、プラスミドｐ２１ＩＣＫＳはＡＴＣＣ受託番号、プラスミドｐ４６ＩＣＫＳはＱＴＣＣ受託番号、プラスミドｐ２４ＩＩＣＫＳはＡＴＣＣ受託番号及びプラスミドｐ２１ＩＩＣＫＳはＡＴＣＣ受託番号で受託された。本文中に例示した本発明の特定実施態様の他の変形及び変更は当業者に明らかであろう。従って、本発明は添付の請求の範囲によって限定されることを理解されたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ヒツクマン，キース・アールアメリカ合衆国、イリノイ・60060、マンデレイン、サウス・プレーリー・アベニユー・524 (72)発明者シー，ジエシー・ダブリユアメリカ合衆国、イリノイ・60045、レイク・フオレスト、エツジウツド・ロード・ 1415 (72)発明者サーニー，マイケル・ビイアメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバテイビル、バツキンガム・プレイス・600 (72)発明者デイベア，スシル・ジーアメリカ合衆国、イリノイ・60062、ノースブルツク、フラーンスワース・レイン・ 2492

Claims

【特許請求の範囲】１．試験サンプル中のＨＴＬＶ−Ｉ及び／またはＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体の存在又は量を検出するアッセイであって、ａ．少なくとも１種の組換えＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ抗原及び／またはＨＴＬＶ −ＩＩｅｎｖ抗原と、少なくとも１種の組換えＨＴＬＶ−Ｉｇａｇ抗原及び／またはＨＴＬＶ−ＩＩｇａｇ抗原とを含む固相に付着させた捕獲試薬と試験サンプルとを接触させ、前記捕獲試薬と試験サンプルとを抗原／抗体複合体を形成するに十分な条件下で所定時間インキュベートする段階と、ｂ．シグナル発生化合物によって標識した組換えＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ抗原及び／またはＨＴＬＶ−ＩＩｅｎｖ抗原から成る第一指示試薬とシグナル発生化合物によって標識した組換えＨＴＬＶ−Ｉｇａｇ抗原及び／またはＨＴＬＶ− ＩＩｇａｇ抗原から成る第二指示試薬とを前記抗原／抗体複合体と接触させ、前記複合体と第一指示試薬及び第二指示試薬とを、抗原／抗体／第一指示試薬複合体及び／または抗原／抗体／第二指示試薬複合体を形成するに十分な条件下で所定時間インキュベートする段階と、ｃ．発生したシグナルを検出することによって試験サンプル中のＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ抗体及び／またはＨＴＬＶ−ＩＩｅｎｖ抗体、及び／またはＨＴＬＶ −Ｉｇａｇ抗体及び／またはＨＴＬＶ−ＩＩｇａｇ抗体の存在を判定する段階とから成るアッセイ。２．第一捕獲試薬が、組換えＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６抗原、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１抗原、ＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１抗原及びその任意の組合せから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載のアッセイ。３．前記第二捕獲試薬が、ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４及びＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載のアッセイ。４．第一捕獲試薬が、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１、ＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１及びその任意の組合せから成るグループから選択され、第二捕獲試薬が、組換えＨＴＬＶ−Ｉｐ２４、ＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４及びその任意の組合せから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載のアッセイ。５．組換えＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６が配列番号９であることを特徴とする請求項２に記載のアッセイ。６．組換えＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１が配列番号６であることを特徴とする請求項２に記載のアッセイ。７．組換えＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１が配列番号１５であることを特徴とする請求項２に記載のアッセイ。８．第二捕獲試薬が配列番号３であることを特徴とする請求項３に記載のアッセイ。９．第二捕獲試薬が配列番号１２であることを特徴とする請求項３に記載のアッセイ。１０．第一捕獲試薬が、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６（配列番号９）、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１（配列番号６）、または、組換え抗原ＨＴＬＶ −ＩＩｇｐ２１（配列番号１５）及びその任意の組合せであり、第二捕獲試薬が、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４（配列番号３）または組換え抗原ＨＴＬＶ −ＩＩｐ２４（配列番号１２）及びその任意の組合せであることを特徴とする請求項４に記載のアッセイ。１１．試験サンプル中のＨＴＬＶ−Ｉ及び／またはＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体の存在又は量を検出するアッセイであって、ａ．組換えＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ抗原及び／またはＨＴＬＶ−ＩＩｅｎｖ抗原から成る固相に付着させた第一捕獲試薬と試験サンプルの第一アリコートとを接触させ、ＨＴＬＶ−Ｉｇａｇ抗原及び／またはＨＴＬＶ−ＩＩｇａｇ抗原を含むポリペプチドから成る固相に付着させた第二捕獲試薬と試験サンプルの第二アリコートとを接触させ、ここで前記接触を第一捕獲試薬／試験サンプル複合体及び／または第二捕獲試薬／試験サンプル複合体を形成するに十分な条件下で所定時間維持する段階と、ｂ．シグナル発生化合物によって標識した抗−ヒトＩｇＧ抗体から成る指示試薬と第一捕獲試薬／試験サンプル複合体及び第二捕獲試薬／試験サンプル複合体とを接触させ、第一捕獲試薬／試験サンプル／指示試薬複合体及び／または第二捕獲試薬／試験サンプル／指示試薬複合体を形成するに十分な条件下で所定時間インキュベートする段階と、ｃ．発生した測定可能シグナルを検出することによって試験サンプル中のＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ抗体及び／またはＨＴＬＶ−ＩＩｅｎｖ抗体、及び／またはＨＴＬＶ−Ｉｇａｇ抗体及び／またはＨＴＬＶ−ＩＩｇａｇ抗体の存在を判定する段階とから成るアッセイ。１２．第一捕獲試薬が、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１、組換え抗原ＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１及びその任意の組合せから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１１に記載のアッセイ。１３．前記第二捕獲試薬が、ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４及びＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１１に記載のアッセイ。１４．第一捕獲試薬が、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６（配列番号９）、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１（配列番号６）、または、組換え抗原ＨＴＬＶ −ＩＩｇｐ２１（配列番号１５）及びその任意の組合せであり、第二捕獲試薬が、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４（配列番号３）または組換え抗原ＨＴＬＶ −ＩＩｐ２４（配列番号１２）及びその任意の組合せであることを特徴とする請求項１１に記載のアッセイ。１５．組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６が配列番号９であることを特徴とする請求項１２に記載のアッセイ。１６．組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１が配列番号６であることを特徴とする請求項１２に記載のアッセイ。１７．組換え抗原ＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１が配列番号１５であることを特徴とする請求項１２に記載のアッセイ。１８．第二捕獲試薬が組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４（配列番号３）であることを特徴とする請求項１３に記載のアッセイ。１９．第二捕獲試薬が組換え抗原ＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４（配列番号１２）であることを特徴とする請求項１３に記載のアッセイ。２０．第一捕獲試薬が、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６(配列番号９)、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１（配列番号６）、または、組換え抗原ＨＴＬＶ− ＩＩｇｐ２１（配列番号１５）及びその任意の組合せであり、第二捕獲試薬が、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４（配列番号３）または組換え抗原ＨＴＬＶ− ＩＩｐ２４（配列番号１２）及びその任意の組合せであることを特徴とする請求項１４に記載のアッセイ。２１．試験サンプル中のＨＴＬＶ−Ｉ及び／またはＨＴＬＶ−ＩＩの存在又は量を判定する試験キットであって、ａ．固相に付着した組換えＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ抗原及び／またはＨＴＬＶ− ＩＩｅｎｖ抗原から成る第一捕獲試薬を収容している容器と、ｂ．固相に付着した組換えＨＴＬＶ−Ｉｇａｇ抗原及び／またはＨＴＬＶ− ＩＩｇａｇ抗原から成る第二捕獲試薬を収容している容器とから成る試験キット。２２．第一捕獲試薬が、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ２１、ＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１及びその任意の組合せから成るグループから選択されることを特徴とする請求項２１に記載の試験キット。２３．第二捕獲試薬が、組換え抗原ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４及びＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４から成るグループから選択されることを特徴とする請求項２２に記載の試験キット。２４．第一捕獲試薬の組換え抗原が、配列番号９、配列番号６及び配列番号１５から成るグループから選択されることを特徴とする請求項２２に記載の試験キット。２５．第二捕獲試薬の組換え抗原が、配列番号３及び配列番号１２から成るグループから選択されることを特徴とする請求項２２に記載の試験キット。２６．ＡＴＣＣ寄託番号のプラスミドｐ２４ＩＣＫＳ。２７．ＡＴＣＣ寄託番号のプラスミドｐ４６ＩＣＫＳ。２８．ＡＴＣＣ寄託番号のプラスミドｐ２４ＩＩＣＫＳ。２９．ＡＴＣＣ寄託番号のプラスミドｐ２１ＩＩＣＫＳ。３０．ＡＴＣＣ寄託番号のプラスミドｐ２１ＩＣＫＳ。