NO301176B1 - Isolert DNA-sekvens som omfatter et segment av env-regionen til LAV-genomet, plasmid og celle inneholdende DNA-sekvensen samt fremgangsmåte for fremstilling av proteiner kodet for av nevnte DNA-sekvens - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår generelt ekspresjon av virusproteiner gjennom bruken av rekombinant DNA-teknologi, og nærmere bestemt angår oppfinnelsen ekspresjon av proteiner som er immunologisk reaktive med antistoffer for lymfadenopati-assosiert virus (LAV), nå kjent som human immunosviktvirus-1 (HTV-1), isolert DNA-sekvens, rekombinant plasmid og vertscelle.

Ervervet immunsvikt-syndrom (AIDS) er en overførbar svekkelse

av celleimmunitet, karakterisert ved opportunistiske infeksjoner og visse sjeldne ondartede sykdommer. De dominerende risiko-grupper for AIDS omfatter homoseksuelt aktive menn, sprøyte-narkomane, mottagere av blodoverføringer og blodprodukter

og heteroseksuelle partnere og barn av individer i høyrisiko-gruppen, hvilket antyder at et smittestoff som overføres gjennom intim kontakt eller blodprodukter, er involvert.

Nyere opplysninger tyder på at smittestoffet som er ansvarlig for overføring av sykdommen, er et nytt lymfotropt retrovirus, kjent som lymfadenopati-assosiert virus (LAV) (Barré-Sinoussi et al., Science 220: 868 (1983)). Lignende viruser er blitt rapportert av andre forskningsgrupper (Propovic et al., Science 224: 497 (1984), Levy et al., Science 225: 840 (1984)) og er gitt betegnelsen menneskelig T-celle lymfotropt virus type III (HTLV-III), AIDS-assosiert retrovirus (ARV) eller immun-sviktassosiert virus (IDAV). Enda nyere data antyder at LAV, HTLV-III, ARV og IDAV deler flere viktige karakteristikker omfattende stort sett nukleotid homologi (Wain-Hobson et al., Cell 40: 9 (1985); Muesing et al., Nature 313: 450 (1985); Sanches-Pescador et al., Science 227: 484 (1985)) og bør be-traktes som isolater av det samme virus, skjønt der er en sannsynlighet for at stamme-til-stamme-variasjoner blant virus-isolatene vil eksistere. Foruten å oppvise stort sett nukleotid homologi, er isolatene stort sett like med hensyn til morfologi, cytopatologi, behov for optimal reversert transkriptase-aktivitet og i det minste noen antigen-egenskaper (Levy, supra; Schupbach et al., Science 224: 503 (1984)).

Som angitt ovenfor er det kjent at viruset overføres gjennom blodprodukter (blod, bodserum, blodplasma og fraksjoner derav), noe som gjør det viktig å foreta en kontroll av blodproduktene for å bestemme om giveren har vært utsatt for viruset. Dette kan gjøres på en hvilken som helst av flere forskjellige måter, innbefattet enzym-forbundet immunosorbent-prøve (ELISA) for oppdagelsen av antistoffer for LAV og beslektede viruser. Individer hvis blod inneholder antistoffer for LAV sies å være "seropositive". Blod fra seropositive givere kan elimineres fra blodforrådet når det oppdages, hvilket hjelper til å hindre at sykdommen sprer seg.

Immunreaksjonen 'hos individer som utsettes for LAV, varierer. Antistoffer kan produseres for et hvilket som helst av flere forskjellige virusproteiner, innbefattet pl 3, p18, p25, p36, gp43, p55, gp110 etc. (Schupbach et al., New Engl. J. Med. 312: 265 (1985). Ikke alle individer vil produsere antistoffer overfor de samme proteiner eller overfor det samme epitop på et gitt protein.

Oppdagelsen av seropositive individer, slik den praktiseres for tiden, har en rekke iboende problemer. Først blant disse problemer er behovet for å isolere antigen fra hele viruser for de immunologiske prøver. Denne isolasjon krever håndteringen av store volumer levende, potensielt infektiøse virus, og

har som sådan en betydelig sikkerhetsrisiko. Dessuten er der problemer hva angår utbyttet, renheten og reproduserbarheten av virus fra ett preparat til et annet. Dette kan resultere i et ikke-akseptabelt antall falske positive og/eller negative resultater. Følgelig er der innen faget et behov for alternative metoder til fremstilling av virusantigener som er nyttige i tester som sorterer ut blod og som videre skaffer andre beslektede fordeler.

Forøvrig er ennå ingen effektiv behandling av sykdommen funnet. Når spredningen av AIDS nå begynner å nå ekstraordinære, om ikke epidemiske proporsjoner, og den utstrekning i hvilken viruset kan overføres fortsatt er et åpent spørsmål, er der også et behov innen faget for et farmasøytisk preparat som kan immunisere befolkningen i sin alminnelighet. Den foreliggende oppfinnelse oppfyller dette behov og skaffer andre beslektede fordeler.

Kort fortalt angir den foreliggende oppfinnelse DNA-sekvenser som omfatter et parti av kappe-( env) området av LAV-genomet, idet partiet koder for et protein som er immunologisk reaktivt med antistoffer for LAV. Et rekombinant plasmid som kan gjennomgå replikasjon i bakterielle vertceller, er også beskrevet. Plasmidet innbefatter prokaryote transkripsjonene og translasjonene signaler for ekspresjon, fulgt i lesefase av DNA-sekvensen som er beskrevet ovenfor. I en foretrukket utførelsesform velges signaler fra en operon såsom trp-operonen, som er induserbar og/eller undertrykkbar. Bakterielle celler såsom E. coli, som er blitt transformert med det rekombinante plasmid beskrevet ovenfor, er også beskrevet.

En annen side ved oppfinnelsen viser en fremgangsmåte for fremstilling av proteiner som er immunologisk reaktive med antistoffer eller T-celler som er reaktive overfor LAV. Fremgangsmåten omfatter å innføre i en bakteriell vertscelle et rekombinant plasmid som kan gjennomgå replikasjon i bakterielle vertsceller. Plasmidet innbefatter prokaryote transkripsjonene og translasjonene signaler for ekspresjon, fulgt i lesefase av en DNA-sekvens som omfatter et parti av env-området av LAV-genomet, idet partiet koder for et protein som er immunologisk reaktivt med antistoffene for LAV. Etter innføring av plasmidet dyrkes bakterieverten i et passende medium. Ekspresjon av proteinet induseres deretter og proteinproduktet av sekvensen isoleres fra bakterieverten. Proteinproduktet kan renses etter isolering, f.eks. ved gel-gjennomtrengnings-kromatografi.

Andre sider av oppfinnelsen vil fremgå ved gjennomgåelse av den følgende detaljerte beskrivelse og de ledsagende tegninger.

Fig. 1 viser konstruksjonen av mpSW16 og mpSW19 fra AJ19.

Fig. 2 viser trp E-ekspresjonsvektorene pJH 11, pJH 12 og

pJH 14, innbefattet polylinkersekvensene.

Fig. 3 viser opprinnelsen av LAV-innføyelsene i pENV-1, pENV-2, pENV-3, pENV-4 og pENV-5.

Fig. 4 viser konstruksjonen av pENV-5 og pENV-1 fra pJH 12

og mpSW19.

Fig. 5 viser konstruksjonen av pENV-2 fra pJH 14 og mpSW19

og konstruksjonen av pENV-3 fra pHJ 11 og mpSW19.

Fig. 6 viser konstruksjonen av pENV-4 fra pJH 12 og mpSW16.

Fig. 7 viser aminosyresekvensen av ENV-3.

Fig. 8 viser nukleotidsekvensen av env-området og dets proteinprodukt.

Den beste fremgangsmåte for utførelse av oppfinnelsen Før oppfinnelsen gjennomgås kan det være nyttig, for å få

en bedre forståelse av denne, å se på definisjonen av visse termer som heretter skal benyttes.

Lymfadenopati- assosiert virus ( LAV): Et menneskelig T-lymfo-tropisk retrovirus. Hva den foreliggende oppfinnelse angår, skal et virus anses å være det samme eller ekvivalent med LAV dersom det stort sett oppfyller de følgende kriterier: (a) viruset er tropisk for T-lymfocytter, særlig T-hjelpe-celler' (CD4<+>, i henhold til den internasjonale nomenklatur som er angitt i Bernard et al., eds., Leucocyte Typing, New York: Springer Verlag (1984)); (b) viruset er cytopatisk for infiserte DC4<+->celler (snarere enn transformerende, på samme måte som HTLV-I og II); (c) viruset koder for en RNA-avhengig DNA-polymerase (revers transkriptase) som er Mg 2 +-avhengig (optimal konsentrasjon 5 mM, optimal pH = 7,8, ikke inhiberbart av actinomycin D)

og kan anvende oligo (dTj^^g som en primer for revers tran-skripsjon fra dets 3'-LTR;

(d) virusbåndene i en sukrosegradient ved en tetthet på

ca. 1,16;

(e) viruset kan merkes med [ 3H]-uridin; (f) viruset skiller seg ved immunologiske og nukleotide sekvenskriterier fra medlemmer av HTLV-I/lI-familien av viruser (ved dette kriterium skal HTLV-III ikke anses å være et medlem av HTLV-I/II-familien); (g) viruset er stort sett kryssreaktivt immunologisk med proteinene kodet for av gag- og env-områdene av LAV, og (h) viruset har betydelig nukleotidhomologi (78-100%) og aminosyresekvens-homologi (90-100%) til felles med LAV.

Immunologisk reaktivt: Et antigen og et antistoff sies å

være "immunologisk reaktive" dersom de kan bindes spesifikt til hverandre, typisk med en affinitet på minst 10^M \ oftere minst 10 M

Transformert eller transformasjon: Den prosess som går ut

på å forandre, på stabil og arvelig måte, genotypen av en mot-tagercelle eller mikroorganisme ved innføringen av renset DNA.

Lymfadenopati-assosiert virus (LAV) kan isoleres fra pasienter med AIDS eller lymfadenopati-syndrom. Lymfenoder hos slike pasienter blir typisk underkastet biopsi og plassert i dyrk-ningsmedium supplert etter behov for å understøtte vekst.

Et mitogen såsom et interleukin-2 (IL-2) eller fytohemagglutinin (PHA) kan innlemmes; antiserum for menneskelig interferon kan også innlemmes. Revers transkriptase-aktivitet viser seg typisk ca. dag 15 av dyrkningen, hvilket indikerer nærværet av virus. Viruset kan konsentreres fra dyrkningens ovenpåflytende væske ved bruk av et ikke-ionisk vaskemiddel, fulgt av bandingsteknikk i en sakkarosegradient. Disse og andre rensemetoder er velkjent i faget og er beskrevet f.eks.

i Montelaro et al., J. Virology 42: 1029 (1982).

LAV kan formeres på hvilken som helst av en rekke forskjellige måter. Det kan dyrkes i T-lymfocytter som fås fra navlestreng eller perifert blod eller benmarg. Alternativt kan det formeres i udødeliggjorte T-celler eller B-celler, se f.eks. Popovic et al., Science 224: 497 (1984) og Montagnier et al., Science 225: 63 (1984). Veksten av disse virus blir vanligvis målt ved nærværet av aktiviteten av revers-transkriptase.

En genomisk klon- av LAV kan fremstilles ved en hvilken som helst av flere metoder som er velkjente i faget, omfattende, men ikke begrenset til dem som er beskrevet av Hahn et al-, Nature 312: 166 (1984), Alizon et al., Nature 312: 757 (1984), Luciw et al., Nature 313: 760 (1984) og Muesing et al., Nature 313: 450 (1985).

Kort fortalt blir i en av disse fremgangsmåter (Alizon et

al.) DNA isolert fra LAV-infiserte T-celler fra en frisk giver, fordøyet partielt med et restriksjonsendonuklease såsom Hind III, og det resulterende fordøy ede produkt fraksjonert elektro-foretisk. Fragmenter som i størrelse svarer til strørrelsen av hele LAV-genomet (ca. 9,2 kb), elueres fra gelen, bunnfelles, resuspenderes og ligeres inn i armene av en passende begrenset vektor. Ligasjonsblandingen pakkes inn i bakteriofag-partikler. Bakterier transfiseres med bakteriofagen, og klonene sorteres ut in situ for LAV-innføyelser ved bruk av en passende probe (såsom et cDNA fremstilt av LAV-RNA). Fra en slik klon kan det ønskede område av LAV subklones inn i en bakteriell plasmid-vektor såsom pUC 18. Ytterligere subkloning kan være ønskelig for å fjerne uønskede sekvenser og føye til ytterligere restriksjonsseter (i form av en polylinker) ved hver ende for å lette kloningen inn i en ekspresjonsvektor.

LAV-sekvensene kan deretter subklones inn i en induserbar ekspresjonsvektor. En rekke forskjellige ekspresjonsvektorer

er kjent i faget og omfatter Xgt 11:Tn5 (riall et al., Nature 313: 379 (1984); trp E (Paul et al., Euro. J. Cell Biol. 31:

171 (1983); pINIII (Masui et al., Biotechnology, jan. 1984,

p. 81 ) .

De resulterende proteiner kan delvis renses og kan brukes

for en rekke formål, bl.a. som immunogener og antigener i immunanalyser. For bruk som immunogener kan proteinene inji-seres inn i et dyr, f.eks. en mus, kanin, geit etc, enten i en buffret oppløsning eller i et hjelpestoff. Alternativt kan proteinene renses ved polyakryalamidgel-elektroforese,

og de bånd som er av interesse, kan skjæres ut fra gelen,

males i stykker og resuspenderes i buffer for injisering i vertsdyret. Polyklonale eller monoklonale antistoffer kan fremstilles. For bruk som antigener i immunanalyser kan proteinene anvendes i merket eller umerket form. Når de er merket, kan merkelappene omfatte radioisotoper, fluorforer, enzymer, luminiscerende materialer eller partikler. Disse og andre merkelapper er velkjent i faget og er beskrevet f.eks. i de følgende US-PS: 3 766 162, 3 791 932, 3 817 837, 3 996 345

og 4 233 402.

Analyser som anvender de rekombinante proteiner ifølge oppfinnelsen, kan være heterogene (dvs. de krever et separasjons-trinn) eller homogene. Dersom analysen er heterogen, kan en rekke forskjellige separasjonsmetoder anvendes innbefattet sentrifugering, filtrering, kromatografi eller magnetisme.

En foretrukket analysemetode for å skille ut blodprodukter eller andre fysiologiske fluider for nærværet av antistoffer,

er en ELISA-analysemetode. Typisk blir antigen (i dette tilfelle ett eller en kombinasjon av rekombinante proteiner) adsorbert

på overflaten av en mikrotiterbrønn (microtiter well). Res-terende proteinbindingsseter på overflaten blir deretter blok-kert med et passende middel såsom serumalbumin fra storfe (BSA), varmeinaktivert normalt geiteserum (NGS) eler BLOTTO

(en buffret oppløsning av ikke-fet tørrmelk som også inneholder et konserveringsmiddel, salter og et antiskummemiddel). Brønnen blir deretter inkubert med en prøve som man mistenker inneholder et spesielt antistoff. Prøven kan tilføres i ren tilstand, eller vanligere, den kan fortynnes, som regel i en buffret oppløsning som inneholder en liten mengde (0,1-5,0 vektprosent) protein såsom BSA, NGS eller BLOTTO. Etter inkubering i tilstrekkelig lang tid til å tillate spesiell binding å finne sted, blir brønnen vasket for å fjerne ubundet protein og deretter inkubert med et merket anti-menneske immunoglobulin-antistoff (a Hulg). Merkelappen kan velges fra en rekke forskjellige enzymer, innbefattet pepperrot-peroksidase (HRP), 8-galaktosidase, alkalisk fosfatase og glukoseoksidase. Tilstrekkelig tid tillates til at spesiell binding kan finne sted, og deretter blir brønnen pånytt vasket for å fjerne ubundet konjugat, og substratet for enzymet tilsettes. Farge tillates å utvikles, og den optiske tetthet av innholdet i brønnen bestemmes visuelt eller ved hjelp av instrumenter.

For letthets skyld kan reagenser for ELISA-analyser skaffes

i form av pakker (kits). Disse pakker kan omfatte mikrotiter-væskeplater til hvilke virusproteiner fremstilt ved rekombinant-teknikker er blitt pre-adsorbert, forskjellige fortynnings-midler og buffrer, merkede konjugater for påvisning av spesielle bundede antistoffer og andre signalgenererende reagenser såsom enzymsubstrater, kofaktorer og kromogener.

Da et betydelig antall AIDS-pasienter har en høy grad av immuno-suppresjon og etter hvert har mistet evnen til å fremstille høytiter-antistoffer, anvender den foreliggende oppfinnelse deler av kappeområdet (env) av LAV-genomet som koder for et protein som er immunologisk reaktivt med antistoffer for LAV. Nærværet av antistoffer for kappeglykoprotein av LAV er en bedre indikator på LAV-infeksjon enn nærværet av antistoffer for andre virusproteiner, fordi antistoff-titerne for kappeglykoproteinet antas å vedvare under de senere

stadier av sykdommen, mens antistoffer for andre proteiner såsom kjerneproteinet, kan avta til nivåer hvor de ikke er påviselige.

En annen anvendelse av de rekombinante proteiner

er bruk som vaksine for mennesker. De rekombinante proteiner kan renses i utstrakt grad og settes sammen på en passende måte, generelt i konsentrasjoner på 1 ug til 20 mg pr. kg vert. Fysiologisk godtagbare bærere såsom sterilt vann, saline, buffret saline etc. kan anvendes. Hjelpestoffer såsom aluminiumhydroksid kan også anvendes. Vaksinen kan gis ved intravenøs, subkutanøs, intramuskulær eller peritoneal injeksjon. Én injeksjon kan være tilstrekkelig, men oftest fore-trekkes flere injeksjoner med ukentlige eller månedlige mellomrom.

Alternativt kan virusrekombinanter av kukopper (vaccinia) konstrueres som uttrykker områder av LAV-genomet. For eksempel kan de konstruerte materialer ifølge oppfinnelsen innføyes i et plasmid såsom pMM34 (Mackett et al., Science 227: 433, 1985) og virushybrider av kukopper inneholdende det resulterende kimeriske plasmid dannet ved homolog rekombinasjon. Immunisering med slike vaksiner av rekombinant virus har vist seg å være virksom med hensyn til å opparbeide beskyttende immunitet i dyr overfor hepatitt-B-virus og vesikulær-stomatitt-virus (Smith et al., Nature Hl: 578, 1984).

Bruken av en rekombinant-protein-vaksine på denne måte elimi-nerer behovet for å komponere vaksiner fra inaktiverte pre-parater eller avirulente stammer av patogene mikroorganismer.

Den genetiske organisasjon av LAV, 5'LTR-gag-pol-Q-env-F-3'-LTR er unik blant retroviruser. I'alle andre kjente replika-sjonskompetente retroviruser overlapper pol- og env-genene;

i LAV er de separert ved en åpen leseramme Q (Wain-Hobson et al., Cell 40: 9 (1985)).

Den åpne leseramme for env har et mulig initieringssete (meti-oninkodon) ved det åttende trippel, og følgelig er det ventet at det vil kode for et protein med molekylvekt på 97 kd. Dette er i overensstemmelse med den tilsynelatende molekylvekt

(110 kd) av LAV-glykoproteinet på denaturerende polyakrylamidgeler. Der er 32 potensielle N-glykosyleringsseter i env-genet (Asn-x-Ser/Thr). Der er også tre hydrofobe områder, karak-teristiske for retrovirus-kappeproteiner, svarende til

et signalpeptid (kodet for ved nukleotider 5815-5850), et andre område (7315-7350) og et transmembransegment (7831-7896). Det andre område kommer etter et Arg/Lys-rikt område som antas å representere et proteolytisk behandlingssete (Wain-Hobson, supra).

Som angitt ovenfor viser antistoffer for LAV-glykoprotein ( env-genproduktet) seg tidlig i løpet av virusinfeksjonen og holder seg også i de senere stadier av sykdommen (Kitchen et al., Nature 312: 367 (1984). Antistoffer for glykoproteinet er derfor en særlig god indikator på tidligere utsettelse for LAV, hvilket gjør glykoproteinet, eller deler derav, særlig nyttige i blodtestingsmetoder.

Et særlig foretrukket parti av env-området av LAV-genomet

er ENV-3. Som vist på fig. 3 spenner ENV-3 over nukleotidsekvensen fra bp 7178 til bp 7698. Det henvises nå til fig.

7 hvor de følgende underområder finnes innenfor området (angitt ved en linje som strekker seg over bokstavene på fig. 7): (1) et hydrofobisk peptid kodet for ved bp 7315 t.o.m. 7350; (2) et dodekapeptid inneholdende mulige proteolytiske be-handlingsseter for kløyving av det omsluttende forløperprotein til gp 65 og gp 43; (3) et høyt konservert område rundt to cysteinrester; (4) en konservert sekvens ved 3'-enden (karbok-sy); og (5) en konservert rekkefølge ved 5'-enden (amino).

Data som fås ved bruk av syntetiske peptider som svarer til

de forskjellige underområder av ENV-3, indikerer at de viktigste områder er de som omfatter eller er i nærheten av cystein-restene og de som omfatter eller er i nærheten av det proteolytiske prosessområde. Syntesen og utvelgelsen av visse av disse peptider er beskrevet i søkernes samtidige US patent-søknad nr. 728 052, innlevert 29. april 1985 av Cosand.

ENV-3 er også nesten fullstendig blottet for potensielle glykosyleringsseter, og derfor kan antigenisiteten av det rekombinante protein med rimelig grunn ventes å etterligne den for det naturlige protein. Hele sekvensen av env-genet og dets proteinprodukt er vist på fig. 8 hvor de potensielle glykosyleringsseter er vist overstreket. Under henvisning til fig. ■ 8 kan det ses at en lang strekning av ENV-3 er fritt for slike seter, og at sammenlignet med resten av genet er ENV-3 som helhet påfallende underglykosylert.

I det følgende eksempel ble en LAV genomisk klon betegnet

som XJ19 subklonet inn i den bakterielle plasmidvektor pUC 18. Den resulterende subklon betegnet som pBT-1 (gitt ATCC aksesjonsnr. 53069), ble ytterligere subklonet for å gi pRS-3, som inneholdt hovedsakelig env-, F- og LTR-områdesekvenser. env-

og en del av F-sekvensene ble ytterligere subklonet inn i M13mp18, og områdene av env-sekvensen ble overført inn i den

trD_E-induserbare ekspresjonsvektor. env-DNA ble innføyet

i ramme på nedsiden av trp E-genet, hvilket førte til ekspresjonen av et trp E- env fusjonsprotein når E. coli ble transformert med dette konstruerte materiale. De resulterende proteiner ble delvis renset og karakterisert ved deres reaktivitet i ELISA med sera fra kjente seropositive og kjente seronegative individer. Fem nyttige konstruksjoner, betegnet som pENV-1

t.o.m. pENV-5, ble identifisert.

Eksempel

A. Konstruksjon av trp- env-ekspresjonsvektorer

Hvilke som helst av flere forskjellige bakterielle ekspresjons-systemer kan anvendes for å uttrykke fremmedproteiner. trp E-systemet ble valgt for ekspresjon av LAV- env-sekvenser fordi det inneholder en sterk induserbar promotor, men dets ekspresjon kan også undertrykkes slik at fremmed (og potensielt giftig) protein ikke akkumuleres i bakteriene i lange perioder av gangen.

Da der ikke finnes noen hurtig og bekvem måte å sortere eller selektere for bakterier transformert med vektor som inneholder en fremmed innføyelse (i motsetning til bakterier som er transformert med vektor alene), er det bekvemt å subklone det ønskede område av et stort stykke DNA (såsom Xfag-DNA) inn i en vektor som inneholder et seleksjonssystem for innføyelser før det overføres til trp E-ekspresjonsvektoren. Dette letter sorteringen av transformerte bakterier i forhold til de som inneholder det ønskede innføyde materiale.

Oppfinnernes metode gikk derfor ut på først å subklone i to trinn det meste av env-området av LAV-genomet inn i en over-føringsvektor, M13mp18 (fig. 1). Deretter ble forskjellige fragmenter av denne subklon ligatisert inn i den ene eller den andre av tre trp-ekspresjonsvektorer (pJH 11, pJH 12,

pJH 14) som skilte seg fra hverandre bare ved sin leseramme av restriksjonssetene i polylinkerområdet (se fig. 2). Noen av de resulterende subkloner (f.eks. pENV-5, pENV-4) ble anvendt som sådan, men andre krevde ytterligere modifikasjoner (pENV-1, pENV-2, pENV-3) for å gi det ønskede produkt.

1. Subkloning av LAV- genom

a. Fremstilling av fag-DNA

Hele LAV-genomet ble oppnådd fra Pasteur Institut i form av Xfag-partikler inneholdende en genomisk DNA-innføyelse på

9,2 kb i Hind III-setet av fag XL47.1. Denne klon er betegnet som XJ19 og er beskrevet i Wain-Hobson et al., Cell 40: 9

(1985). XJ19-fagpartikler ble transfisert inn i Q359-stammen av E. coli K-12 (genotypen av Q35 9 er hsdRk", hsdMk , supF, 08O, P2) i henhold til fremgangsmåten ifølge Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, på s. 64. En enkelt plaque ble tatt ut og fag-forstørret ved platelysat-metoden (Maniatis, supra, på s. 65). Etter en inkubasjon på 9 h ved 37°C ble platene (100 mm i diameter) inneholdende konfluente plaquer overdekket med 5 ml 100 nM NaCl/20 mM MgSO4/50 mM Tris, pH 7,5. Etter inkubasjon i 12 h ved 4°C ble væsken samlet opp og ekstrahert to ganger med et like stort volum kloroform.

Til 10 ml av den resulterende vandige fase inneholdende fag-partikler ble der tilsatt 2 ml 0,25 M EDTA/2,5% SDS/0,5 M Tris, pH 9, og suspensjonen ble inkubert ved 70°C i 15 min for å bryte opp fagen. 2,5 ml 8 M kaliumacetat ble tilsatt, og opp-løsningen ble inkubert på is i 15 min, deretter sentrifugert i 10 min ved 12.0000 x g ved 4°C til pelletprotein. Den ovenpåflytende væske ble overført til et 50 ml's polypropen-sentri-fugerør og ekstrahert med et like stort volum fenol (pH 8, ekvilibrert med 1 M Tris, pH 8) ved 20°C. Den vandige fase ble deretter ekstrahert med et like stort volum kloroform:iso-amylalkohol (24:1), ved 20°C. Til den vandige fase ble der deretter tilsatt 2,5 volumer 95% etanol for å felle ut DNA. Etter sentrifugering ble DNA-pelleten tørket og resuspendert

i 10 mM Tris HC1, pH 7,4/1 mM EDTA.

b. Subkloning av env-området

Ca. 12 ug XJ19 DNA fremstilt i eksempel A.1.a ovenfor ble fordøyet fullstendig med restriksjonsenzymet Sst I (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD) som bare kutter i LTR-områdene

av dette isolat av LAV. Fordøyelsesblandingen ble underkastet elektroforese ved 1 V/cm gjennom 0,9% agarose i 0,089 M Tris-borat/0,089 M borsyre/1 mM EDTA. Posisjonen av fragmentet på 9,1 kb ble bestemt i forhold til molekylvektstandarder etter farging med etidiumbromid. Dette bånd ble elektroeluert inn i NA45-papir (Schleicher og Schuell, Keene, NH). DNA ble

utvunnet fra papiret i henhold til instruksjonene gitt av fabrikanten.

Sst-I-fragmentet på 9,1 kb ble ligert inn i den Sst I-digisterte vektor pUC 18 med et forhold på 10 innføyde molekyler pr. 1 vektormolekyl. E. coli-stammen HB101 ble transformert

med ligasjonsblandingen ved CaC^-fremgangsmåten ifølge Maniatis et al. ( supra) og platet oppå agarplater av LB pluss ampicillin (200 ug/ml).

Enkeltkolonier ble plukket ut og fortynnet inn i 3 ml LB pluss ampicillin-medium og dyrket over natten ved 37°C med konstant risting. Plasmid-DNA ble fremstilt ved den alkaliske lysemetode (Maniatis et al., supra, på s. 368). En koloni ble utvalgt

som inneholdt Sst-I-innføyelsen på 9,1 kb i en orientering slik at Eco RI-setet i polylinkeren var nærmest 5'-enden av LAV-genomet som bestemt ved restriksjonsanalyse av plasmid-DNA. Denne subklon ble betegnet pBT-1 (ATCC aksesjonsnr. 53069)

(fig. 1).

Plasmid pBT-1 ble deretter fordøyet med Eco RI, og vektoren som fortsatt inneholdt 3 1 -enden av LAV-genomet ble religert. Dette tjente til å fjerne 5' Eco RI-fragmentene fra plasmidet. HB101-celler ble transformert med ligasjonsblandingen, og

en koloni inneholdende innføyelsen pRS-3 ble identifisert ved restriksjonsanalyse av det rensede plasmid-DNA.

Sekvensen mellom Kpn I-setene ved bp 5889 og bp 8572 [numme-rering i henhold til Wain-Hobson et al., Cell 40: 9 (1985)]

som inneholdt det meste av env-området, ble deretter overført fra pRS-3- til M13mp18-vektoren. Dette ble gjort for ytterligere å fjerne overskytende sekvenser (ikke- env) og også

for å plassere env-sekvensene i en vektor som benytter 8-galaktosidase snarere enn amplicillin som den selekterbare/sorter-bare markør. Dette var fordelaktig fordi trp E-ekspresjonsvektoren bruker ampicillinresistens som sin selekterbare markør, og overføring av en innføyelse fra én vektor (pUC 18) som kode

for ampicillin-resistensfaktoren til en annen ( trp-ekspresjonsvektorer pJH 11,12,14) ville gjøre utvelgelse av den ønskede innføyelse pluss vektoren vanskeligere. M13-fagen ble sortert ut ved bruk av det kromogene substrat 5-bromo-4-kloro-3-indolyl-8-galaktosid (Sigma Chemical Co.) for å merke av for inakti-vering av 8-galaktosidase på grunn av innføyelse av env-sekvensen. De fager som inneholdt innføyelser, ble sortert ut for orienteringen av innføyelsen i forhold til restriksjonssetene i polylinkerområdet. DNA ble isolert fra rekombinanter (mpSW16, mpSW19) 'for hver orientering (fig. 1). 2. Innføyelse av env-sekvensen i trp-vektorer Ekspresjonsvektorene inneholdt E. coli trp-operon-promotoren, operatoren, og trp E-genet innføyet i pBR322 (fig. 2). trp E-genet ble avkortet ved sitt Bgl II-sete nærmest sin 5'-ende ved innføyelse av en polylinkersekvens (Konopka et al., J. Virol 51: 223 (1984)). De forskjellige trp-vektorer (pJH 11, pJH 12 og pJH 14) avvek i henhold til leserammen av restriksjonssetene inne i polylinkerområdet. Innføyelse av en åpen leseramme inn i den riktige vektor resulterer i produksjonen av et fusjonsprotein med trp E-sekvenser ved aminoterminal-enden (Spindler et al., J. Virol 49: 132 (1984)).

Oppfinnerne valgte ut fem overlappende områder av LAV- env

for ekspresjon (fig. 3). Valget ble bestemt ved begrensningen på innføyelsesstørrelse i disse vektorer (Konopka et al.,

J. Virol 51: 223 (1984)) og av plasseringen av hydrofobe sekvenser, hvilket kan være skadelig for ekspresjonen.

pENV-5 (ATCC aksesjonsnr. 53074) ble konstruert ved ligatisering av env-området fra mpSW19s Bam HI-sete i polylinkerområdet av env Hind III-setet (bp nr. 7698) inn i Bam HI- og Hind III- (New England Biolabs) begrenset pJH 12 (fig. 4). Ligati-sjoner ble overført inn i CaCl2-sjokkert E. coli HB101 og bakteriene platet i nærvær av ampicillin (Sigma) ved 100 ug/ml og tryptofan (Sigma) ved 20 yg/ml. Tryptofanet ble tilsatt for å undertrykke ekspresjonen av det fremmede protein hvis

akkumulering kan være skadelig for bakteriene. Ampicillin-resistente kolonier ble sortert ut ved minilysater for nærværet av rekombinante plasmider inneholdende env-fagmentet.

pENV-1 (ATCC aksesjonsnr. 53070) ble oppnådd fra pENV-5 ved utslettelse av sekvensene mellom de to Bgl II-seter (bp 6598

og bp 7178) (fig. 4). Denne utslettelse reduserte størrelsen av den åpne leseramme ved innføring av et stoppkodon like etter Bgl II-setet.

pENV-2 (ATCC aksesjonsnr. 53071) ble konstruert ved innføyelse av fragmentet mellom to Bgl II-seter (bp 6598 og bp 7178)

inn i Bam HI-begrenset pJH 14 (fig. 5) (Bgl II og Bam HI-over-heng er forenlige). E. coli HB 101 ble transformert med liga-sjonsreaksjoner og de ampicillin-resistente kolonier sortert ut ved restriksjonsanalyse for nærværet og orienteringen av env-innføyelsen inn i pJH 14.

pENV-3 (ATCC aksesjonsnr. 53072) krevet ligasjon av env-området mellom mpSW19s Bam HI-sete (i polylinkeren) og Hind III-setet (bp 7698) inn i Bam HI- og Hind III-begrenset pJH 11 (fig. 5). E. coli HB101 ble transformert med ligasjonsreaksjonen, og

de ampicillinresistente kolonier ble sortert ut ved minilysater. DNA fra en passende koloni ble isolert, fordøyet med Bam

HI og Bgl II (New England Biolabs) og religert. Dette

DNA ble brukt til å transformere E. coli HB101. De resulterende ampicillinresistente bakterier ble sortert ut ved restriksjonsanalyse for rekombinante plasmider som hadde slettet ut fragmentet fra Bam HI til Bgl II (fig. 5). Utslettelse av fragmentet bragte env-sekvensene mellom Bgl II-setet (bp 7178) og Hind III-setet (bp 7698) inn i den riktige leseramme.

pENV-4 (ATCC aksesjonsnr. 53073) ble konstruert ved ligering av Hind III-fragmentet fra mpSW16 inn i pJH 12 som var blitt behandlet med Hind III og alkalisk fosfatase fra kalvetarm (Boehringer Mannheim) (fig. 6). Rekombinante plasmider ble identifisert ved transformasjon av E. coli HB101 med

ligasjonsblandingen og deretter sortering ved restriksjonsanalyse av minilysater.

B. Proteinekspresjon

1. Transformasjon av E. coli med trp- env-konstruksjoner

Hver av dé rekombinante trp- env-ekspres jonsplasmider ble over-ført fra E. coli HB101 til E. coli C600 fordi den sistnevnte

er en poensielt bedre vert for proteinproduksjon. Overføringen omfattet transformasjon av CaC^-sjokkert C600 med superkveilet DNA fra minilysater av HB101. Bakterier ble strøket ut på plater i nærvær av ampicillin og tryptofan som beskrevet (Konopka et al., J. Virol 51: 223 (1984)). Medikamentresistente kolonier ble sortert ut ved minilysater for å bekrefte nærværet av det riktige plasmid.

2. Ekspresjon av trp- env-proteiner

Vekst og induksjon av E. coli C600 transformert ved trp-ekspresjonsvektorer var som beskrevet (Spindler et al., J. Virol 49: 1 32 ( 1 984 ) ; Konopka et al. , J. Virol 5J_: 223 ( 1 984) ) .

I korthet ble minimalt medium inneholdende tryptofan (20 ug/ml) og ampicillin (100 vg/ ml) podet med transformerte bakterier fra glycerolbeholdninger. Kulturer ble dyrket med gjennomlufting ved 37°C over natten. Etter denne behandling ble kulturene podet ved 1:100 inn i nytt minimalt medium inneholdende ampicillin (100 ug/ml), men ikke noe tryptofan. Disse kulturer ble dyrket med gjennomlufting i 2-3 h (inntil tidlig log-fase)

ved 37°C. Induseringsmiddelet, 3-6-indolakryisyre (Sigma),

ble tilsatt inntil en sluttkonsentrasjon på 20 ug/ml fra nylig fremstilte beholdninger på 20 mg/ml i 95% etanol.

Induserte kulturer ble dyrket ved 37°C med gjennomlufting

i 4-5 h og deretter pelletert og valgfritt frosset. Protein-utbytter fra pENV-1, pENV-2 og pENV-3 var typisk 10-30 mg/l, mens utbyttene fra pENV-4 og pENV-5 var typisk mindre enn 1 mg/l.

C. Isolering og rensing av trp- env-proteiner

Fusjonsproteiner ble delvis renset fra cellepelleter som beskrevet (Konopka et al., J. Virol 51: 223 (1984)). Kort beskrevet ble bakterier resuspendert i 100 ml 50 mM Tris, pH 7,5/0,5 mM EDTA/150 mM NaCl (TNE) pr. 1 indusert kultur. Lysozym (Sigma) ble satt til en endelig konsentrasjon på- 1 mg/ml.

Etter 15 min ved 0°C ble NP40 satt til blandingen til en endelig konsentrasjon på.0,2% i 10 min ved 0°C. 1-2 mg DNase (Sigma) ble deretter tilsatt med 150 ml DNase-buffer (150 mM NaCl/12 mM MgC^). Reaksjonsblandinger ble inkubert i 1 h ved 0°C med hyppig omrøring. Uoppløselige proteiner ble deretter pelletert ved sentrifugering i 15 min ved 8000 x g ved 0°C. Pellets ble vasket to ganger i TNE og deretter analysert for nærværet av uoppløselige proteiner ved denaturerende polyakrylamid-gelelektroforese. Proteiner ble gjort synlige ved farging med Coomassie Brilliant Blue R.

Pelleten som inneholdt det uoppløselige materiale fra 1 1 bakterier ble oppløseliggjort i 6 ml 6 M guanidinklorid/0,1 M Tris HC1, pH 7,8. Til denne oppløsning ble der tilsatt ca. 60 mg fast ditiotreitol (DTT), og reduksjonen ble tillatt å fortsette i 30 min ved 37°C.

Det oppløseliggjorte reduserte protein ble underkastet gel-gjennomtrengningskromatografi på en 9,4 mm x 25 cm GF-250 Zorbax-kolonne (Du Pont, Wilmington, DE). En 100 yl's porsjon av proteinoppløsningen ble injisert på kolonnen og eluert med 6 M guanidinklorid med en strømningshastighet på 0,5 ml/min. Den optiske tetthet ved 280 nm ble målt, og fraksjoner ble samlet opp ved 30 sekunders mellomrom. Fraksjon nr. 32, dvs. den fraksjon som elueres mellom 7,75 og 8,00 ml, ble brukt i de etterfølgende analyser. Det skal bemerkes at innlemmelse av DTT vil resultere i dannelsen av uoppløselige metallsulfider når guanidinklorid av lavere kvalitet anvendes.

trp- env-fusjonsproteinene er også blitt renset som følger: Fusjonsproteiner ble delvis renset fra cellepellets som en uoppløselig pellet (beskrevet ovenfor). Pelleten inneholdende det uoppløselige materiale fra 4 1 bakterier ble oppløseliggjort i 4 ml 6 M guanidinklorid/O,1 M Tris HC1, pH 7,8. Til denne oppløsning ble der tilsatt ca. 100 mg fast ditiotreitol (DTT), og reduksjonen ble tillatt å fortsette i 1 h ved 37°C.

Det oppløseliggjorte, reduserte protein ble underkastet gel-gjennomtrengningskromatografi på en 2,6 x 87 cm kolonne av Fractogel TSK HW-50 (S) (MCB Manufacturing Chemists, Gibbstown, NJ). De 4 ml av redusert protein ble pumpet på kolonnen og

-4 -3

eluert med 2x10 M DDT/2 x 10 etendiamintetraeddiksyre (EDTA)/6 M guanidinklorid (American Research Products Co.,

South Euclid, OH). Kolonnen ble drevet ved 0,5 ml/min, den optiske tetthet ved 280 nm ble målt, og fraksjoner ble samlet opp ved 10 min's mellomrom. Fraksjoner 34 og 35, de to fraksjoner fra senteret av den UV-absorberende topp, ble brukt i de etter-følgende analyser.

D. Immunologisk reaktivitet av trp- env-proteiner

1. Analyse ved Western blott

Porsjoner fra de uoppløselige proteinpreparater uttrykt ved pENV-1, pENV-2, pENV-3, pENV-4 og pENV-5 ble oppløseliggjort i 2% natriumdodecylsulfat/100 mM Tris, pH 6,8/20% glycerol/

1,5 M 8-merkaptoetanol og underkastet elektroforese på denaturerende polyakrylamidgeler. Proteiner ble elektrooverført på nitrocellulose (BA85, Sch-leicher og Schuell, Keene, NH)

og filtrene blokket med 5% serumalbumin fra storfe (Sigma). Filtrer ble deretter undersøkt med prober med E. coli-adsorbert menneskeserum samlet opp fra AIDS-pasienter. Filtrene ble utviklet ved HRP-konjugert geite-aHuIg. Det oppsamlede materiale (pool) var reaktivt med alle fem trp- env-fusjonsproteiner,

men ikke med trp E-proteinet alene.

2. Analyse ved ELISA

Uoppløselige proteinpreparater av pENV-1, pENV-2, pENV-3,

pENV-5 og trp E ble oppløseliggjort i 3 m guanidinklorid.

Uoppløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering ved 15.000 x g i 5 min. Oppløseliggjorte proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved fremgangsmåten ifølge Bradford ( Analytical Biochemistry

72: 248 (1976)). Proteinene ble fortynnet i 0,05 M karbonat/ bikarbonat-buffer (pH 9,6) til en endelig konsentrasjon på

1-2 ug/ml. Porsjoner på 50 yl ble tilført pr. mikrotiterbrønn og inkubert ved 4°C over natten. Plater ble deretter blokket med BLOTTO (5% [w/v] ikke-fettholdig tørrmelk/0 ,01 % timero-sol/0,01% antiskum A i 0,01 M natriumfosfat, pH 7,2/0,15 M natriumklorid) i 1 h ved 37°C. Sammenslåtte seropositive sera, sera fra homoseksuelle menn eller LAS-pasienter og sera fra friske heteroseksuelle individer ble fortynnet 1:100 med en 1:1-blanding av BLOTTO og PBS (0,01 M natriumfosfat, pH 7,3/ 0,15 M NaCl), og 50 ul fortynnet serum ble tilsatt pr. brønn i 1 h ved 37°C. Seraene ble fjernet og platene ble vasket tre ganger i vaskebuffer (0,15 M NaCl/0,05% [w/v] Tween 20)

før tilsetting av 100 pl av geit-antihumant IgG/pepperrot-peroksidase-konjugatet (fortynnet 1:10.000 i 50 mM natriumcitrat/ 0,05% Tween 20/1% varmeinaktivert normalt geiteserum fra Antibodies, Inc., Davis, CA) i 1 h ved 37°C. Konjugatet ble fjernet og platene vasket tre ganger med 0,15 M NaCl/0,05%

(w/v) Tween 20. ELISA-prøven ble utviklet ved tilsetting av

100 yl pr. brønn substratoppløsning (10 mg o-fenylendiamin i 50 ml 0,05 M natriumcitrat, pH 7,0) i 30 min ved værelse-temperatur. Reaksjonene ble stanset med 100 yl pr. brønn 3N H2S04 og den optiske tetthet ved 490 nm bestemt ved en automati-sert ELISA-leser. Proteiner fremstilt ved pENV-1, pENV-2, pENV-3 og pENV-5 ble alle funnet å være reaktive med kjente seropositive sera.

<y>tterligere sortering av det pENV-1-, pENV-3- og pENV-5-kodede protein ble utført ved bruk av materiale fra de guanidinklorid-oppløseliggjorte pellets beskrevet ovenfor (det pENV-1-kodede protein ble ytterligere renset ved gelgjennomtrengningskro-matografi som beskrevet ovenfor) mot et utvalg av 31 menneskeserum-prøver. Utvalget omfattet 8 sera fra friske heteroseksuelle individer (definert som negative i et helt virus ELISA), to serumoppsamlinger fra AIDS-pasienter og 21 sera

fra individer diagnostisert som LAS (lymfadenopatisyndrom). Sera fra LAS-individer ble bekreftet som seropositive i en hel-virus ELISA. 12 ble ytterligere bekreftet ved Western blott-analyse. Resultatene er vist i tabell 1. Disse resultater viser at sera fra AIDS- eller LAS-pasienter var mer reaktive med pENV-1-, pENV-3- og pENV-5-kodet protein enn sera fra nor-male individer var. Denne beskrivelse viser at trp- env-fusjonsproteinene kan anvendes til å søke etter tilstedeværelsen av sera som er reaktive med det AIDS-frembringende virus LAV.

3. Fluorescens objektivglass- test for påvisning av serum-antistoff for LAV

Oppløselig proteinprodukt fremstilt som beskrevet ovenfor konjugeres til lateksperler, og preparatet av protein/perler etanolfikseres på preparatglass for mikroskop. En porsjon av pasientserum inkuberes med protein/perlene på et preparatglass. Glassene vaskes, og FITC-merket antihumant-immunoglobulin i Evans blå motfargestoff (counterstain) tilsettes. Glassene vaskes, og monteringsmedium og dekkglass påføres hvert av glassene.

Alternativt blir protein/perle-preparatet plassert i reagens-rør for inkubering med pasientserum. Rørene sentrifugeres og vaskes, og FITC-merket antihumant-immunoglobulin i Evans blå motfargestoff tilsettes. Rørene sentrifugeres, og den ovenpå-flytene væske suges av. En porsjon av perlene plasseres på et mikroskop-prøveglass og etanolfikseres, og dekkglass plasseres.

Alle preparatglassene undersøkes ved fluorescensmikroskopi. Dersom prøveserumet er antistoff-positivt, kommer perlene til syne som fluorescerende grønne kuler, dersom prøveserumet er antistoff-negativt, viser perlene seg som røde kuler.

Fotnoter til tabell 1:

1Viruslysat ble fremstilt ved bunnfelling av den ovenpåflytende væske av infiserte cellekulturer med 10% polyetenglykol (PEG 6000) og deretter bånddannelse (banding) to ganger til like-vekt i en sukrosegradient på 20-60%. Virusbåndet ved tetthet 1,16 ble fjernet og viruspartikler ytterligere konsentrert ved ultrasentrifugering, deretter lysert i RIPA-buffer (beskrevet i fotnote 2) inneholdende 0,5% natriumdodecylsulfat, deretter strøket på brønner av mikrotiter-testplater.

<2>Radio-merkede LAV-antigener ble brutt opp i RIPA-buffer (Gilead et al., Nature 264:263 (1976)) og ble deretter omsatt med menneskeserum. De resulterende immune komplekser ble separert ved binding til en Staphlococcus aureus-adsorbent (Kessler,

J. Immunology 115: 1617 (1975)), fulgt av en rekke vaskinger. Immunbunnfelte antigener ble analysert ved SDS polyakrylamidgel-elektroforese (Laemmli, Nature 227:680, (1970)), fulgt av fluorgrafi. Nærværet av enten et p25- eller gp43-bånd ble ansett som nødvendig og tilstrekkelig til å bekrefte at en prøve var seropositiv.

<3>LAS = lymfadenopatisyndrom.

4

i.u. = ikke utført.

Claims (8)

1. Isolert DNA-sekvens, karakterisert ved at det omfatter et segment av env-regionen til LAV-genomet, hvor nevnte sekvens koder for et protein som er immunologisk reaktivt med antistoffer til LAV og hvor nevnte sekvens er valgt fra innskuddet env-1 i plasmidet pENV-1, ATCC nr. 53070, innskuddet env-2 i plasmidet pENV-2, ATCC nr..53 071, innskuddet env-3 i plasmidet pENV-3, ATCC nr. 53072, innskuddet env-4 i plasmidet pENV-4, ATCC nr.

53 073, innskuddet env-5 i plasmidet pENV-5, ATCC nr. 53 074, som angitt i figur 3 og 8, eller redundante/degenererte variasjoner av de nevnte DNA-sekvenser.

2. Isolert DNA-sekvens som angitt i krav 1, karakterisert ved at den omfatter sekvensen vist på fig. 8 fra bp 7178 til bp 7698, som koder for et protein som er immunologisk reaktivt med antistoffer for LAV.

3. Rekombinant plasmid som kan gjennomgå replikasjon i bakterielle vertsceller, karakterisert ved at det innbefatter prokaryote transkripsjonene og translasjonene signaler for ekspresjon, fulgt i lesefase av en DNA sekvens som angitt i et av de foregående krav 1-2, hvilken sekvens koder for et protein som er immunologisk reaktivt med antistoffer for LAV.

4. Rekombinant plasmid som angitt i krav 3, karakterisert ved at signalene fås fra tr<p->operonet.

5. Bakteriell celle, karakterisert ved at den er transformert med et rekombinant plasmid som angitt i et av de foregående krav 3-4.

6. Transformert celle som angitt i krav 5, karakterisert ved at den bakterielle celle er E.coli.

7. Fremgangsmåte til fremstilling av proteiner som angitt i figur 8 som er immunologisk reaktive med antistoffer for LAV, karakterisert ved at den omfatter å innføre i en bakteriell vertscelle et rekombinant plasmid ifølge krav 3-4 som kan gjennomgå replikasjon i bakterielle vertsceller, hvilket plasmid innbefatter prokaryote transkripsjonene og translasjonene signaler for ekspresjon, fulgt i lesefase av en DNA-sekvens i henhold til et av de foregående krav 1-2, hvilken sekvens koder for et protein som er immunologisk reaktivt med antistoffer for LAV, å dyrke den nevnte bakterielle vert i et passende medium, og å isolere proteinproduktet med den nevnte sekvens fra den nevnte bakterielle vert, eventuelt å rense proteinproduktet ved gelgj ennomtrengningskromatograf i.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at signalene fås fra tr<p->operonet.