CN113219171A - 检测冠状病毒中和抗体的试剂盒、冠状病毒中和抗体的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及检测冠状病毒抗体的试剂盒、冠状病毒中和抗体的检测方法。本发明提供的试剂盒可用于检测冠状病毒中和抗体，其利用竞争法检测原理，通过将信号标记物标记冠状病毒疫苗原液或活性物质，使冠状病毒疫苗原液与待测样本中的冠状病毒中和抗体竞争结合活性物质，再以发光强度对检测结果进行判定，检测过程无需在BSL‑3实验室进行即可快速获得检测结果，具有操作简便、特异性高、检测通量高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种检测冠状病毒中和抗体的试剂盒，冠状病毒疫苗原液在制备检测冠状病毒中和抗体检测试剂中的用途，以及一种冠状病毒中和抗体的检测方法。
背景技术
冠状病毒(Coronavirus)是自然界广泛存在的一大类病毒，是直径约80～120nm的RNA病毒。目前已发现有七种可感染人类的冠状病毒，分别是人冠状病毒229E(HCoV-229E)、HCoV-OC43、SARS病毒(SARS-CoV)、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、MERS病毒(MERS-CoV)以及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是由新型冠状病毒引发的急性呼吸道传染病，在全球各国大规模爆发并急速扩散，目前已成为全球性重大的公共卫生事件，并成为人类历史上致死人数最多的流行病之一。
新型冠状病毒包含四种主要的结构蛋白：刺突(Spike，S)蛋白、膜(Membrane，M)蛋白、包膜(Envelope，E)蛋白和核衣壳(Nucleocapsid，N)蛋白。S蛋白是位于病毒囊膜表面的同源三聚体蛋白，由N端的S1亚基和C端的S2亚基组成。SARS-CoV-2通过位于S1亚基中的受体结合结构域(Receptor Binding Domain，RBD)识别和结合宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting Enzyme 2，ACE2)，触发细胞膜融合级联反应，从而进入细胞造成感染。
国内外研究人员针对SARS-CoV-2中和抗体进行了大量研究分析。Ju等对从8例SARS-CoV-2感染者的B细胞中分离鉴定出具有病毒中和活性的靶向S-RBD区域的抗体，晶体结构分析显示其通过空间位阻作用抑制病毒与ACE2的结合，从而阻断病毒的进入。Shi等从一名恢复期COVID-19患者中分离出具有强大体外病毒中和活性的单抗，能够抑制恒河猴的SARS-CoV-2感染；结构研究显示其可以识别与S-RBD与ACE2结合位点重叠的表位，通过空间位阻和直接的界面-残基竞争作用干扰病毒/受体的相互作用。Rogers等发现新冠康复者血浆中抗体种类众多，病毒中和活性较高的抗体主要靶向S-RBD上的不同表位，针对其他非RBD表位的单克隆抗体则中和活性相对较低。Brouwer等对筛选到的19株具有假病毒中和活性的抗体进行分析，其中大部分(74％)靶向S-RBD，并结合RBD上不同表位。Piccoli等研究表明，S-RBD区域为免疫显性表位，SARS-CoV-2免疫血清中大约90％已知的中和抗体靶向S-RBD区域。越来越多的研究证据均显示，SARS-CoV-2中和抗体主要识别表位为S-RBD区域，通过抑制病毒RBD与宿主细胞受体ACE2的结合发挥保护作用。此外，针对中和抗体的体外病毒中和数据和在实验动物模型体内的活病毒挑战数据，均显示中和抗体对SARS-CoV-2具有保护作用的潜力。
已批准使用的疫苗III期临床试验中，尽管接种疫苗的受试者有一定的感染率，但相对于安慰剂组，已经证明了疫苗对疾病的保护力。疫苗临床及相关研究数据显示，中和抗体在防止(或减轻)新冠感染中起着重要的作用，因此对于中和抗体的检测也至关重要。中和抗体检测的实验室“金标准”是感染抑制试验，主要包括蚀斑减少中和试验(plaquereduction neutralization test，PRNT)和微量中和试验(Micro-neutralization assay，MNA)。对于新冠中和抗体的检测，两种方法均将定量SARS-CoV-2病毒与不同稀释度的待测样本混合后，接种到单层Vero细胞上。通过细胞的病毒变程度，建立抑制曲线，评估样本中中和抗体的滴度。两种方法中均涉及SARS-CoV-2活病毒，对试验环境的生物安全等级要求高。
发明内容
本发明目的在于提供一种试剂盒，以及一种冠状病毒中和抗体的检测方法，旨在解决现有中和抗体检测技术中存在的对生物安全级别要求高、操作复杂、检测通量低的技术问题。
为了实现上述发明目的，本发明一方面，提供了一种检测冠状病毒中和抗体的试剂盒，其包括冠状病毒疫苗原液和活性物质，所述活性物质包括血管紧张素转化酶2(ACE2)蛋白或其片段、酪氨酸蛋白激酶受体(AXL)蛋白或其片段、结合抗体中的至少一种，所述结合抗体能与所述冠状病毒疫苗原液结合，所述结合抗体包括冠状病毒中和抗体和其它抗体。
本发明提供的试剂盒，利用ACE2可以被SARS-CoV-2的RBD识别和结合从而进入细胞造成感染、AXL可以促进SARS-CoV-2病毒附着进入细胞并增强感染、结合抗体能与冠状病毒疫苗原液结合的特点，通过以冠状病毒疫苗原液和包括ACE2蛋白或其片段、AXL蛋白或其片段、结合抗体中的至少一种的活性物质作为试剂盒组分，从而可以实现SARS-CoV-2病毒相关的检测，具有操作简便、特异性高、检测通量高的优点，可满足大规模检测的需求。
本发明另一方面，提供了冠状病毒疫苗原液在制备检测冠状病毒中和抗体检测试剂中的用途。
本发明再一方面，提供了冠状病毒疫苗原液和活性物质在制备检测冠状病毒中和抗体检测试剂中的用途，所述活性物质包括血管紧张素转化酶2蛋白或其片段、酪氨酸蛋白激酶受体蛋白或其片段、结合抗体中的至少一种，所述结合抗体能与所述冠状病毒疫苗原液结合，所述结合抗体包括冠状病毒中和抗体和其它抗体。
本发明利用SARS-CoV-2与试剂盒中的ACE2、AXL和/或结合抗体具有高亲和力的特性，通过冠状病毒疫苗原液与样本中的冠状病毒中和抗体竞争结合ACE2、AXL和/或结合抗体，从而实现对样本中冠状病毒中和抗体的检测。该试剂盒可以实现对冠状病毒中和抗体的定量检测，且检测过程无需在BSL-3实验室进行即可快速获得检测结果，具有操作简便、特异性高、检测通量高的优点。
本发明最后一方面，提供了一种冠状病毒中和抗体的检测方法，其包括如下步骤：
提供待测样本、冠状病毒疫苗原液、活性物质和发光底物，其中，所述冠状病毒疫苗原液或所述活性物质标记有信号标记物，所述活性物质包括血管紧张素转化酶2蛋白或其片段、酪氨酸蛋白激酶受体蛋白或其片段、结合抗体中的至少一种，所述结合抗体能与所述冠状病毒疫苗原液结合，所述结合抗体包括冠状病毒中和抗体和其它抗体；
将所述待测样本、所述冠状病毒疫苗原液和所述活性物质进行混合处理，得到结合物；
将所述结合物与所述发光底物进行混合反应，测量所述混合反应产生的光子数，所述光子数与所述待测样本中冠状病毒中和抗体的含量成反比。
本发明提供的冠状病毒中和抗体检测方法利用竞争法检测原理，通过将信号标记物标记冠状病毒疫苗原液或活性物质，使冠状病毒疫苗原液与待测样本中的冠状病毒中和抗体竞争结合活性物质，再以发光强度对检测结果进行判定。该检测方法可以快速检测待测样本中的冠状病毒中和抗体，具有操作简便、特异性高、检测通量高的优点，可满足大规模检测的需求。
附图说明
图1表示实施例1提供的试剂盒在检测时的定标曲线；
图2表示实施例1提供的试剂盒将捕获组分与检测组分的活性成分互换前后进行检测的一致性；
图3表示实施例2提供的试剂盒在检测时的定标曲线；
图4表示实施例2提供的试剂盒将捕获组分与检测组分的活性成分互换前后进行检测的一致性；
图5表示实施例3提供的试剂盒在检测时的定标曲线；
图6表示实施例3提供的试剂盒将捕获组分与检测组分的活性成分互换前后进行检测的一致性；
图7表示实施例4提供的试剂盒在检测时的定标曲线；
图8表示实施例4提供的试剂盒将捕获组分与检测组分的活性成分互换前后进行检测的一致性；
图9表示实施例5提供的试剂盒在检测时的定标曲线；
图10表示实施例5提供的试剂盒将捕获组分与检测组分的活性成分互换前后进行检测的一致性。
具体实施方式
本发明实施例提供了一种检测冠状病毒中和抗体的试剂盒，其包括冠状病毒疫苗原液和活性物质，活性物质包括血管紧张素转化酶2(ACE2)蛋白或其片段、酪氨酸蛋白激酶受体(AXL)蛋白或其片段、结合抗体中的至少一种，结合抗体能与冠状病毒疫苗原液结合，结合抗体包括冠状病毒中和抗体和其它抗体。
本发明实施例提供的试剂盒，利用ACE2可以被SARS-CoV-2的RBD识别和结合从而进入细胞造成感染、AXL可以特异性地促进SARS-CoV-2病毒附着进入细胞并增强感染、结合抗体能与冠状病毒疫苗原液结合的特点，通过以冠状病毒疫苗原液和包括ACE2蛋白或其片段、AXL蛋白或其片段、结合抗体中的至少一种的活性物质作为试剂盒组分，从而可以实现SARS-CoV-2病毒相关的检测，具有操作简便、特异性高、检测通量高的优点，可满足大规模检测的需求。
本发明实施例提供的试剂盒中，冠状病毒疫苗原液是制备冠状病毒疫苗的中间产物，包括但不限于冠状病毒灭活疫苗原液、冠状病毒亚单位疫苗原液、冠状病毒载体(如腺病毒载体、水疱性口炎病毒载体)疫苗原液、冠状病毒减毒活疫苗原液等，优选冠状病毒灭活疫苗原液。其中，冠状病毒是系统分类上属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的病毒，包括但不限于SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV等。本发明实施例提供的冠状病毒疫苗原液可按照本领域常规的制备冠状病毒疫苗的方法制备获得，例如，在制备新型冠状病毒灭活疫苗原液时，可通过将SARS-CoV-2接种于Vero细胞，经培养、收获、灭活、纯化步骤，获得新型冠状病毒灭活疫苗原液。
本发明实施例提供的试剂盒中，ACE2蛋白或其片段、AXL蛋白或其片段既可以是通过重组技术产生的重组蛋白，也可以是天然生物来源的蛋白。
本发明实施例提供的试剂盒中，结合抗体是指能与冠状病毒疫苗原液结合的抗体，包括冠状病毒中和抗体和其它抗体。结合抗体中的“冠状病毒中和抗体”是指冠状病毒侵入人体后，人体通过免疫应答产生的保护性抗体制成的、作为试剂盒组分之一存在的物质，其可以阻断冠状病毒与受体蛋白的结合，阻止冠状病毒的进一步侵入。结合抗体中的“其它抗体”是指冠状病毒中和抗体之外的、能与冠状病毒疫苗原液结合的抗体，包括但不限于冠状病毒S蛋白区域的抗体等。
关于冠状病毒中和抗体，研究发现在新冠康复者血浆中和抗体的种类众多，且病毒中和活性较高的中和抗体主要靶向S-RBD上的不同表位，针对其它非RBD表位的单克隆抗体则中和活性相对较低。此外，还有多种非S-RBD区域的中和抗体和多种可能的保护机制，如N末端结构域(NTD)中和抗体即为新型冠状病毒中和抗体的重要部分。NTD区域中和抗体的中和曲线与RBD区域中和曲线不一致，这可能是由于NTD中和抗体的保护机理不同于RBD区域中和抗体，并通过阻止/干扰病毒S-RBD与宿主细胞ACE2受体结合起保护作用。
在一些实施例中，试剂盒包括第一捕获组分和第一检测组分，该第一捕获组分包括活性物质和固相载体，第一检测组分包括标记有信号标记物的冠状病毒疫苗原液。
进一步地，活性物质包括血管紧张素转化酶2蛋白或其片段、酪氨酸蛋白激酶受体蛋白或其片段、冠状病毒中和抗体中的至少一种。
更进一步地，当活性物质中含有血管紧张素转化酶2蛋白或其片段时，所得试剂盒用于检测待测样本中的冠状病毒中和抗体，可进一步提升其检测灵敏度。
作为第一种具体实施方式，在检测时，第一捕获组分中的ACE2蛋白或其片段固定在固相载体上，如待测样本中存在的相关组分可竞争或阻止ACE2与标记有信号标记物的冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，则可以实现对待测样本中相关组分的定性和定量检测。
作为第二种具体实施方式，在检测时，第一捕获组分中的AXL蛋白或其片段固定在固相载体上，如待测样本中存在的相关组分可竞争或阻止AXL与标记有信号标记物的冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，则可以实现对待测样本中相关组分的定性和定量检测。
作为第三种具体实施方式，在检测时，第一捕获组分中的ACE2蛋白或其片段、AXL蛋白或其片段固定在固相载体上，如待测样本中存在的相关组分可竞争或阻止ACE2和/或AXL与标记有信号标记物的冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，则可以实现对待测样本中相关组分的定性和定量检测。其中，ACE2蛋白或其片段、AXL蛋白或其片段既可以共同固定在同一固相载体上，也可以分别固定在不同固相载体上。
作为第四种具体实施方式，在检测时，第一捕获组分中的冠状病毒中和抗体固定在固相载体上，如待测样本中存在的相关组分可竞争或阻止冠状病毒中和抗体与标记有信号标记物的冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，则可以实现对待测样本中相关组分的定性和定量检测。
在一些实施例中，试剂盒包括第一捕获组分和第一检测组分，该第一捕获组分包括冠状病毒疫苗原液和固相载体，第一检测组分包括标记有信号标记物的活性物质。
进一步地，活性物质包括血管紧张素转化酶2蛋白或其片段、酪氨酸蛋白激酶受体蛋白或其片段、冠状病毒中和抗体中的至少一种。
更进一步地，当活性物质中含有血管紧张素转化酶2蛋白或其片段时，所得试剂盒用于在冠状病毒中和抗体检测，可进一步提升其检测灵敏度。
作为第五种具体实施方式，在检测时，第一捕获组分中的冠状病毒疫苗原液固定在固相载体上，如待测样本中存在的相关组分可竞争或阻止ACE2蛋白或其片段与冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，则可以实现对待测样本中相关组分的定性和定量检测。
作为第六种具体实施方式，在检测时，第一捕获组分中的冠状病毒疫苗原液固定在固相载体上，如待测样本中存在的相关组分可竞争或阻止AXL蛋白或其片段与冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，则可以实现对待测样本中相关组分的定性和定量检测。
作为第七种具体实施方式，在检测时，第一捕获组分中的冠状病毒疫苗原液固定在固相载体上，如待测样本中存在的相关组分可竞争或阻止ACE2和/或AXL与冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，则可以实现对待测样本中相关组分的定性和定量检测。
作为第八种具体实施方式，在检测时，第一捕获组分中的冠状病毒疫苗原液固定在固相载体上，如待测样本中存在的相关组分可竞争或阻止冠状病毒中和抗体与冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，则可以实现对待测样本中相关组分的定性和定量检测。
在一些实施例中，试剂盒包括第二捕获组分、第二检测组分和中和组分，且结合抗体包括冠状病毒中和抗体和其它抗体，其中，第二捕获组分包括其它抗体和固相载体，第二检测组分包括标记有信号标记物的冠状病毒中和抗体，中和组分包括冠状病毒疫苗原液。
作为第九种具体实施方式，在检测时，第二捕获组分中的其它抗体固定在固相载体上，并与中和组分、待测样本中的相关组分形成复合物。该复合物中，如待测样本中的相关组分可竞争或阻止标记有信号标记物的冠状病毒中和抗体与冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，则可以实现对待测样本中相关组分的定性和定量检测。
在一些实施例中，试剂盒包括第二捕获组分、第二检测组分和中和组分，第二捕获组分包括冠状病毒中和抗体和固相载体，第二检测组分包括标记有信号标记物的其它抗体，中和组分包括冠状病毒疫苗原液。
作为第十种具体实施方式，在检测时，第二捕获组分中的冠状病毒中和抗体固定在固相载体上，第二检测组分与中和组分、待测样本中的相关组分形成复合物。该复合物中，如待测样本中的相关组分可竞争或阻止冠状病毒中和抗体与冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，则可以实现对待测样本中相关组分的定性和定量检测。
上述实施例和具体实施方式中，固相载体用于负载冠状病毒疫苗原液或活性物质，具体选择包括但不限于培养板、化学发光板、磁性颗粒、荧光微球、试纸、芯片中的至少一种。
上述实施例和具体实施方式中，信号标记物用于标记冠状病毒疫苗原液或活性物质，在检测过程中，通过加入发光底物以检测发光强度，从而实现对待测样本中相关组分的定性和定量。该信号标记物包括但不限于化学发光标记物、电化学发光标记物、量子点、荧光微球中的至少一种，其中，化学发光标记物包括但不限于碱性磷酸酶、鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、辣根过氧化物酶等；电化学发光标记物包括但不限于三联吡啶钌；量子点包括但不限于金量子点、CdSe量子点、ZnCdSe量子点等。
在一些实施例中，试剂盒还包括稀释基质，用于对捕获组分、检测组分、中和组分中的至少一种进行稀释。稀释基质包括但不限于磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris(三羟甲基氨基甲烷)等。
在一些实施例中，试剂盒还包括样本处理液、样本稀释液中的至少一种，用于对样本中的干扰物质进行处理或对样本进行稀释。
本发明实施例提供的试剂盒可用于检测样本中的上述相关物质，尤其适合检测样本中的冠状病毒中和抗体。
在一些实施例中，当试剂盒中的冠状病毒疫苗原液为新型冠状病毒疫苗原液时，所检测样本中的冠状病毒中和抗体即为新型冠状病毒中和抗体。
本发明实施例还提供了冠状病毒疫苗原液和活性物质在制备检测冠状病毒中和抗体检测试剂中的用途。其中，活性物质包括血管紧张素转化酶2蛋白或其片段、酪氨酸蛋白激酶受体蛋白或其片段、结合抗体中的至少一种，结合抗体能与所述冠状病毒疫苗原液结合，结合抗体包括冠状病毒中和抗体和其它抗体。
本发明实施例利用SARS-CoV-2与试剂盒中的ACE2、AXL和/或结合抗体具有高亲和力的特性，通过冠状病毒疫苗原液与样本中的冠状病毒中和抗体竞争结合ACE2、AXL和/或结合抗体，从而实现对样本中冠状病毒中和抗体的检测。该试剂盒可以实现对冠状病毒中和抗体的定量检测，且检测过程无需在P3实验室进行即可快速获得检测结果，具有操作简便、特异性高、检测通量高的优点。
本发明实施例以冠状病毒疫苗原液而非其它抗原作为试剂盒的组分，是基于以下原因：冠状病毒S蛋白是由三聚体构成，RBD位于每个S蛋白单体的尖端。RBD有两种构象，分别为“向下(down)”和“向上(up)”，RBD从“向下(down)”构象翻转到“向上(up)”构象，从而暴露一个称为受体结合基序(receptor-binding motif)的隐藏位点，进而与ACE2结合。研究发现，能阻断/干扰冠状病毒RBD区域与ACE2结合的中和抗体中，有一部分中和抗体的位点与ACE2的结合位点重叠，而另一部分中和抗体的位点与ACE2不重叠，中和抗体与RBD结合后可使RBD处于“向下(down)”构象，或影响S蛋白融合前的稳定性，进而阻断/干扰RBD与ACE2的结合。因此，采用RBD和ACE2作为试剂盒组分检测冠状病毒中和抗体时，仅能检出与ACE2的结合位点重叠的那一部分中和抗体。而本发明实施例采用冠状病毒疫苗原液与ACE2或其蛋白片段作为试剂盒组分，则可检出多种RBD区域的中和抗体，可显著提升冠状病毒中和抗体的检测灵敏度。此外，基于AXL可以ACE2非依赖性地促进冠状病毒附着，进入人肺上皮细胞，通过细胞外Ig样结构域与冠状病毒S蛋白NTD区域中和抗体特异性相互作用这一中和抗体发挥作用的机理，本发明实施例采用冠状病毒疫苗原液与AXL蛋白或其片段作为试剂盒组分，即可检出NTD区域的中和抗体。本发明实施例采用冠状病毒疫苗原液和冠状病毒中和抗体标准品作为试剂盒组分，其中，冠状病毒中和抗体标准品所含有的冠状病毒中和抗体种类越多，该试剂盒所能检出冠状病毒中和抗体的种类也越多，相应的检测灵敏度越高。
进一步地，当试剂盒包括ACE2蛋白或其片段时，可进一步提升样本中冠状病毒中和抗体的检出率，改善漏检问题。
本发明实施例中的“样本”或“待测样本”，是指血液样本(如血清或血浆)，其来源为哺乳动物受试者，该受试者包括患有、疑似患有或携带冠状病毒的感染群体、康复群体、无症状感染群体、已接种疫苗群体等。
在上述用途中，冠状病毒疫苗原液、活性物质的具体选择如前文所述，此处不再赘述。
相应地，本发明实施例还提供了一种冠状病毒中和抗体的检测方法，其包括如下步骤：
S1、提供待测样本、冠状病毒疫苗原液、活性物质和发光底物，其中，冠状病毒疫苗原液或活性物质标记有信号标记物，活性物质包括血管紧张素转化酶2蛋白或其片段、酪氨酸蛋白激酶受体蛋白或其片段、结合抗体中的至少一种，结合抗体能与冠状病毒疫苗原液结合，结合抗体包括冠状病毒中和抗体和其它抗体；
S2、将待测样本、冠状病毒疫苗原液和活性物质进行混合处理，得到结合物；
S3、将结合物与发光底物进行混合反应，测量混合反应产生的光子数，光子数与待测样本中冠状病毒中和抗体的含量成反比。
本发明实施例提供的冠状病毒中和抗体检测方法利用竞争法检测原理，通过将信号标记物标记冠状病毒疫苗原液或活性物质，使冠状病毒疫苗原液与待测样本中的冠状病毒中和抗体竞争结合活性物质，再以发光强度对检测结果进行判定。该检测方法可以快速检测待测样本中的冠状病毒中和抗体，具有操作简便、特异性高、检测通量高的优点，可满足大规模检测的需求。
具体地，S1中，待测样本、冠状病毒疫苗原液、活性物质的定义、具体选择等如前文所述，此处不再赘述。发光底物，在本发明实施例中用于与信号标记物发生作用或反应从而产生光子，经检测设备检测发光强度，实现待测样本中的冠状病毒中和抗体的定量。在一些实施例中，发光底物包括3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷(AMPPD)、三丙胺、四甲基联苯胺中的至少一种。
S2中，将待测样本、冠状病毒疫苗原液和活性物质进行混合处理的方法可以选择本领域的常规方法，所得结合物包括待测样本中的冠状病毒中和抗体(如有)与冠状病毒疫苗原液的结合物、冠状病毒疫苗原液与活性物质的结合物中的至少一种，且冠状病毒疫苗原液或活性物质负载于固相载体上。本发明实施例对于冠状病毒疫苗原液或活性物质负载于固相载体上的方法没有特别限制，既可以在混合处理之前，事先将冠状病毒疫苗原液或活性物质负载于固相载体上，也可以在混合处理的过程中，使冠状病毒疫苗原液或活性物质负载于固相载体上。负载方法包括但不限于吸附、化学键偶联、生物素-亲和素结合、与抗体识别结合等方式。
本发明实施例在混合处理后所得的结合物，是指直接或间接负载于固相载体上而成的复合物，其余未负载于固相载体上的复合物已由清洗等常规手段被去除。
在混合处理过程中，根据信号标记物标记物质以及活性物质具体选择的不同，可以分为以下几种具体实施方式：
作为第一种具体实施方式，冠状病毒疫苗原液标记有信号标记物作为第一检测组分，与ACE2蛋白或其片段、待测样本、固相载体进行混合处理后，ACE2蛋白或其片段固定在固相载体上作为第一捕获组分，待测样本中的冠状病毒中和抗体(如有)竞争或阻止ACE2蛋白或其片段与冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，所得结合物为ACE2蛋白或其片段与冠状病毒疫苗原液的结合物，并被固定在固相载体上，用于后续反应和检测。而待测样本中的冠状病毒中和抗体与冠状病毒疫苗原液的结合物则因未被固定而被洗去。
作为第二种具体实施方式，冠状病毒疫苗原液标记有信号标记物作为第一检测组分，与AXL蛋白或其片段、待测样本、固相载体进行混合处理后，AXL蛋白或其片段固定在固相载体上作为第一捕获组分，待测样本中的冠状病毒中和抗体(如有)竞争或阻止AXL蛋白或其片段与冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，所得结合物为AXL蛋白或其片段与冠状病毒疫苗原液的结合物，并被固定在固相载体上，用于后续反应和检测。而待测样本中的冠状病毒中和抗体与冠状病毒疫苗原液的结合物则因未被固定而被洗去。
作为第三种具体实施方式，冠状病毒疫苗原液标记有信号标记物作为第一检测组分，与ACE2蛋白或其片段、AXL蛋白或其片段、待测样本、固相载体进行混合处理后，ACE2蛋白或其片段、AXL蛋白或其片段固定在固相载体上共同作为第一捕获组分，待测样本中的冠状病毒中和抗体(如有)竞争或阻止ACE2蛋白或其片段/AXL蛋白或其片段与冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，所得结合物为ACE2蛋白或其片段与冠状病毒疫苗原液的结合物，以及AXL蛋白或其片段与冠状病毒疫苗原液的结合物，并被固定在固相载体上，用于后续反应和检测。而待测样本中的冠状病毒中和抗体与冠状病毒疫苗原液的结合物则因未被固定而被洗去。其中，ACE2蛋白或其片段、AXL蛋白或其片段固定在固相载体上的方式，既可以是ACE2蛋白或其片段、AXL蛋白或其片段共同固定在同一固相载体上，也可以是ACE2蛋白或其片段、AXL蛋白或其片段分别固定在不同固相载体上。
作为第四种具体实施方式，冠状病毒疫苗原液标记有信号标记物作为第一检测组分，与冠状病毒中和抗体(结合抗体中的一类)、待测样本、固相载体进行混合处理后，冠状病毒中和抗体(结合抗体中的一类)固定在固相载体上作为第一捕获组分，待测样本中的冠状病毒中和抗体(如有)竞争或阻止冠状病毒中和抗体(结合抗体中的一类)与冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，所得结合物为冠状病毒中和抗体(结合抗体中的一类)与冠状病毒疫苗原液的结合物，并被固定在固相载体上，用于后续反应和检测。而待测样本中的冠状病毒中和抗体与冠状病毒疫苗原液的结合物则因未被固定而被洗去。
作为第五种具体实施方式，ACE2蛋白或其片段标记有信号标记物作为第一检测组分，与冠状病毒疫苗原液、待测样本、固相载体进行混合处理后，冠状病毒疫苗原液固定在固相载体上作为第一捕获组分，待测样本中的冠状病毒中和抗体(如有)竞争或阻止ACE2蛋白或其片段与冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，所得结合物为ACE2蛋白或其片段与冠状病毒疫苗原液的结合物，以及待测样本中的冠状病毒中和抗体与冠状病毒疫苗原液的结合物，并被固定在固相载体上，用于后续反应和检测。
作为第六种具体实施方式，AXL蛋白或其片段标记有信号标记物作为第一检测组分，与冠状病毒疫苗原液、待测样本、固相载体进行混合处理后，冠状病毒疫苗原液固定在固相载体上作为第一捕获组分，待测样本中的冠状病毒中和抗体(如有)竞争或阻止AXL蛋白或其片段与冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，所得结合物为AXL蛋白或其片段与冠状病毒疫苗原液的结合物，以及待测样本中的冠状病毒中和抗体与冠状病毒疫苗原液的结合物，并被固定在固相载体上，用于后续反应和检测。
作为第七种具体实施方式，以标记有信号标记物的ACE2蛋白或其片段、标记有信号标记物的AXL蛋白或其片段作为第一检测组分，与冠状病毒疫苗原液、待测样本、固相载体进行混合处理后，冠状病毒疫苗原液固定在固相载体上作为第一捕获组分，待测样本中的冠状病毒中和抗体(如有)竞争或阻止ACE2蛋白或其片段/AXL蛋白或其片段与冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，所得结合物为ACE2蛋白或其片段/AXL蛋白或其片段与冠状病毒疫苗原液的结合物，以及待测样本中的冠状病毒中和抗体与冠状病毒疫苗原液的结合物，并被固定在固相载体上，用于后续反应和检测。
作为第八种具体实施方式，冠状病毒中和抗体(结合抗体中的一类)标记有信号标记物作为第一检测组分，与冠状病毒疫苗原液、待测样本、固相载体进行混合处理后，冠状病毒疫苗原液固定在固相载体上作为第一捕获组分，待测样本中的冠状病毒中和抗体(如有)竞争或阻止冠状病毒中和抗体(结合抗体中的一类)与冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，所得结合物为冠状病毒中和抗体(结合抗体中的一类)与冠状病毒疫苗原液的结合物，以及待测样本中的冠状病毒中和抗体与冠状病毒疫苗原液的结合物，并被固定在固相载体上，用于后续反应和检测。
进一步地，第一种具体实施方式至第八种具体实施方式中，优选先将待测样本与第一检测组分充分混合之后，再加入第一捕获组分并充分混合，以进一步提升待测样本中的冠状病毒中和抗体与冠状病毒疫苗原液的结合效率，以及活性物质与冠状病毒疫苗原液的结合效率，对提升检测效率和灵敏度具有促进作用。
作为第九种具体实施方式，冠状病毒中和抗体(结合抗体中的一类)标记有信号标记物作为第二检测组分，冠状病毒疫苗原液作为中和组分，第二检测组分与中和组分、待测样本、固相载体进行混合处理的步骤包括：
S21、将待测样本、第二捕获组分(其它抗体固定在固相载体上)和中和组分进行混合处理，形成“其它抗体-冠状病毒疫苗原液-待测样本中的冠状病毒中和抗体(如有)”复合物，且该复合物固定在固相载体上；
S22、将S21所得复合物与第二检测组分进行混合处理，待测样本中的冠状病毒中和抗体(如有)竞争或阻止冠状病毒中和抗体(结合抗体中的一类)与冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，所得结合物为其它抗体-冠状病毒疫苗原液-待测样本中的冠状病毒中和抗体(如有)”复合物，以及其它抗体-冠状病毒疫苗原液-冠状病毒中和抗体(结合抗体中的一类)”复合物，并被固定在固相载体上，用于后续反应和检测。
作为第十种具体实施方式，其它抗体标记有信号标记物作为第二检测组分，冠状病毒中和抗体(结合抗体中的一类)作为中和组分，第二检测组分与中和组分、待测样本、固相载体进行混合处理的步骤包括：
S23、将待测样本、第二检测组分和中和组分进行混合处理，形成“其它抗体-冠状病毒疫苗原液-待测样本中的冠状病毒中和抗体(如有)”复合物；
S24、将S23所得复合物与第二捕获组分(冠状病毒中和抗体(结合抗体中的一类)固定在固相载体上)进行混合处理，待测样本中的冠状病毒中和抗体(如有)竞争或阻止冠状病毒中和抗体(结合抗体中的一类)与冠状病毒疫苗原液的结合位点结合，所得结合物为“其它抗体-冠状病毒疫苗原液-冠状病毒中和抗体(结合抗体中的一类)”复合物，并被固定在固相载体上，用于后续反应和检测。而未与冠状病毒中和抗体(结合抗体中的一类)结合的物质则因未被固定而被洗去。
进一步地，上述第九种具体实施方式和第十种具体实施方式，优选先将待测样本与第二捕获组分和中和组分充分混合之后，再加入第二检测组分并充分混合，以进一步提升待测样本中的冠状病毒中和抗体与冠状病毒疫苗原液的结合效率，冠状病毒中和抗体(结合抗体中的一类)与与冠状病毒疫苗原液的结合效率，以及其它抗体与冠状病毒疫苗原液的结合效率，对提升检测效率和灵敏度具有促进作用。
S3中，通过将结合物与发光底物进行混合反应，结合物中的信号标记物在发光底物的作用下产生发光效应，对产生的光子数进行检测，根据光子数检测结果可知待测样本中是否含有冠状病毒中和抗体，以及相应冠状病毒中和抗体的含量。以下以信号标记物为碱性磷酸酶、发光底物为AMPPD为例进行详细说明：AMPPD与碱性磷酸酶混合时，AMPPD被碱性磷酸酶所分解并脱去一个磷酸基，生成不稳定的中间产物。该中间产物通过分子内电子转移产生间氧苯甲酸甲酯阴离子，处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子从激发态返回基态时，产生化学发光并用于检测。
可以理解的是，由于待测样本中的冠状病毒中和抗体与活性物质竞争性结合冠状病毒疫苗原液，因此检测结果中，产生光子数的量与待测样本中冠状病毒中和抗体的含量成反比，根据标准曲线即可得出待测样本中冠状病毒中和抗体的含量。
在一些实施例中，用于检测混合反应所产生光子数的方法包括酶联免疫吸附剂测定法、化学发光测定法、电化学发光测定法、免疫层析法、上转换发光检测法、下转换发光检测法中的至少一种。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例试剂盒及其应用、冠状病毒中和抗体的检测方法的进步性能显著的体现，以下通过多个实施例来举例说明上述技术方案。
实施例
实施例1
本实施例提供了新型冠状病毒疫苗原液与ACE2用于新型冠状病毒中和抗体的检测方法及相应的试剂盒。该试剂盒中，捕获组分的主要成分为包被有ACE2蛋白的磁性颗粒(简称磁珠)，检测组分的主要成分为标记有碱性磷酸酶的新型冠状病毒疫苗原液。
1.1试剂的制备
1.1.1捕获组分制备工艺
将人血管紧张素转化酶II(ACE2)(北京义翘神州科技股份有限公司，10108-H02H)包被于磁珠(Thermo Fisher)表面。下面详细描述相应的包被方法：
首先将ACE2进行前处理，通过透析去除其缓冲基质中的保护组分。按照每毫克磁珠加入0.5μg至40μg的ACE2的比例进行包被。在反应过程中磁珠表面的羧基在EDC/NHS催化下与ACE2的氨基进行偶联。典型的制备过程为：取20mg表面修饰有羧基的磁珠，超声分散于10mM MES缓冲液中，加入80mg EDC和120mg NHS，超声混合均匀后，置于37℃摇床15min。之后在处理后的磁珠中，按照比例加入ACE2，混匀，并置于37℃摇床反应10h至18h。清洗封闭后，制备得到包被有ACE2的磁珠包被物。将磁珠包被物稀释于50mM MES缓冲液(0.5M NaCl、0.5％BSA、0.05％吐温20，pH＝6.0)，磁珠包被物浓度为0.2～1.0mg/mL。
1.1.2检测组分制备工艺
将新型冠状病毒灭活疫苗原液(中国生物技术股份有限公司)与碱性磷酸酶(Roche Life Science)进行偶联，制备得酶标记物。将酶标记物稀释于50mM MES缓冲液(0.5M NaCl、0.5％BSA、0.05％吐温20，pH＝6.0)，酶标记物浓度为0.1～0.7μg/mL。
1.2样本检测
1.2.1将样本和标记有碱性磷酸酶的新型冠状病毒灭活疫苗原液加入到反应管中，混合均匀。
1.2.2将包被有ACE2蛋白磁珠加到反应管中孵育，样本中的SARS-CoV-2中和抗体竞争或阻止ACE2蛋白或蛋白片段与疫苗原液的结合位点结合。反应完成后，磁场吸住磁珠，洗去未结合的物质。
1.2.3将化学发光底物液(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷，AMPPD)添加到反应管内，AMPPD被碱性磷酸酶所分解，脱去一个磷酸基，生成不稳定的中间产物，该中间产物通过分子内电子转移产生间氧苯甲酸甲酯阴离子，处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子从激发态返回基态时，产生化学发光。再通过光电倍增管对反应中所产生的光子数进行测量，所产生光子的量与样本内SARS-CoV-2中和抗体的含量成反比。定标曲线如图1所示。
1.3阳性判断值的确定
收集83例采集自新冠肺炎确诊病例(核酸检测为阳性)的咽拭子样本作为阳性样本，以及116例采集自新冠肺炎排除病例的咽拭子样本(核酸检测为阴性)作为阴性样本。样本测试前离心处理(相对离心力1000g，离心时间5min)，并转移上清液进至洁净的样本管中，按“1.2样本检测”进行测试，得到各样本中中和抗体的浓度值。采用受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)的方法对样本测试的结果进行统计分析，得到该试剂盒的阳性判断值(Cut-off值)为10AU/mL。
1.4试剂反应条件的确定
1.4.1反应样本量的确定如表1所示。
表1 反应样本量的确定
| 样本量 | 5μL | 10μL | 20μL | 30μL | 50μL |
| 样本1 | 7401430 | 7666712.2 | 7613454 | 7821662 | 7679192 |
| 样本2 | 6793577 | 7014050.2 | 6248892 | 6571311 | 6109407 |
| 样本3 | 4802657 | 4804782.8 | 3879832 | 3945940 | 3870113 |
| 样本4 | 1506113 | 1356849.3 | 1198056 | 1222979 | 1172851 |
| 信噪比1(RLU<sub>样本1</sub>/RLU<sub>样本2</sub>) | 1.09 | 1.09 | 1.22 | 1.19 | 1.26 |
| 信噪比2(RLU<sub>样本1</sub>/RLU<sub>样本3</sub>) | 1.54 | 1.60 | 1.96 | 1.98 | 1.98 |
| 信噪比3(RLU<sub>样本1</sub>/RLU<sub>样本3</sub>) | 4.91 | 5.65 | 6.35 | 6.40 | 6.55 |
通过表1可以看出，信噪比随样本量增加而增加。样本量在5μL～20μL时，信噪比随样本量增加显著升高，继续提升样本量(20μL～50μL)，信噪比提升不显著。由于样本量的增加感染风险会增加，因此优选样本量20μL。
1.4.2反应时间的确定如表2和表3所示。
表2 反应时间的确定
通过表2可以看出，信噪比随第一步孵育时间增加而增加。第一步孵育时间在10min～20min时，信噪比随样本量增加显著升高，继续提升孵育时间(20min～30min)，信噪比提升不显著，因此第一步孵育时间选择20min。
表3 反应时间的确定
通过表3可以看出，信噪比随第二步孵育时间增加变化不显著。信号值随第二步孵育时间增加而增加。第二步孵育时间由2min提升至5min，信号值显著升高，继续提升孵育时间，信号值提升不显著，因此第二步孵育时间选择5min。
1.4.3组分浓度的确定如表4和表5所示。
表4 组分浓度的确定
通过表4可以看出，信噪比随磁珠浓度的增加变化不显著。信号值随磁珠浓度的增加而增加。磁珠浓度由0.2mg/mL提升至0.5mg/mL，信号值显著升高，继续提升磁珠浓度，信号值提升不显著，因此磁珠浓度选择0.5mg/mL。
表5 组分浓度的确定
通过表5可以看出，信号值随着酶标浓度的增加而增加。但酶标浓度为0.5μg/mL～0.7μg/mL时，信噪比降低。综合考虑信号值和信噪比，酶标浓度选择0.2μg/mL。
1.5检测结果
1.5.1捕获组分与检测组分的活性成分互换，对检测结果的影响
方法1：捕获组分主要成分为包被有ACE2蛋白的磁性微珠，检测组分主要成分为标记有碱性磷酸酶的新型冠状病毒疫苗原液。
方法2：捕获组分主要成分为包被有新型冠状病毒疫苗原液的磁性微珠，检测组分主要成分为标记有碱性磷酸酶的ACE2蛋白。
采用方法1和方法2的两个检测试剂盒，对50例新冠感染康复者患者样本进行检测，进行方法学比对，结果如图2所示。通过图2可以看出，两种试剂盒的r2＝0.94，检测结果一致性高。
1.5.2病毒中和试验
病毒中和试验采用固定病毒稀释血清法。试验需先滴定病毒毒价，试验时将其稀释成每一单位剂量含100个TCID50，再将待检血清倍比稀释加等量100个TCID50/mL的病毒液，混匀后37℃孵育2h，每一稀释度接种细胞培养板，每孔0.1mL。5％CO2 37℃培养箱培养4天后，记录出现CPE孔数。按Karber法计算中和价，即50％细胞被保护时抗血清的最大稀释度。
1.5.3重组RBD+ACE2试剂盒作为对照(方法3)，其中，捕获组分与方法1相同，即主要成分为包被有ACE2蛋白的磁性微珠，检测组分主要成分为标记有碱性磷酸酶的SARS-CoV-2刺突蛋白S1-RBD(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)。病毒中和试验对比结果如表6和表7所示。
表6 方法1的病毒中和试验结果
表7 方法3的病毒中和试验结果
通过表6和表7可以看出，与方法3比较，方法1在阴性符合率不变的条件下，阳性符合率提高，即灵敏度提高。
实施例2
本实施例提供了新型冠状病毒疫苗原液与AXL用于新型冠状病毒中和抗体的检测方法及相应的试剂盒。该试剂盒中，捕获组分的主要成分为包被有AXL蛋白的磁性颗粒(简称磁珠)，检测组分的主要成分为标记有碱性磷酸酶的新型冠状病毒疫苗原液。
2.1试剂的制备
2.1.1捕获组分制备工艺
该步骤与实施例1中的1.1.1基本相同，不同之处在于以AXL(ACRO biosystems，AXL-H5226)替换ACE2。
2.1.2检测组分制备工艺
该步骤与实施例1中的1.1.2基本相同，不同之处在于所得酶标记物浓度为0.2～1.0μg/mL。
2.2样本检测
该步骤与实施例1中的1.2基本相同，不同之处在于以AXL(ACRO biosystems，AXL-H5226)替换ACE2，所得定标曲线如图3所示。
2.3阳性判断值的确定
该步骤与实施例1中的1.3相同。
2.4试剂反应条件确定
2.4.1反应样本量的确定如表8所示。
表8 反应样本量的确定
| 样本量 | 5μL | 10μL | 20μL | 30μL | 50μL |
| 样本1 | 1058760 | 1102319 | 1089307 | 1125604 | 1155540 |
| 样本2 | 957280 | 877708 | 782751 | 800110 | 812029 |
| 样本3 | 726491 | 629399 | 457635 | 431666 | 446516 |
| 样本4 | 349850 | 243574 | 174997 | 123652 | 125214 |
| 信噪比1(RLU<sub>样本1</sub>/RLU<sub>样本2</sub>) | 1.11 | 1.26 | 1.39 | 1.41 | 1.42 |
| 信噪比2(RLU<sub>样本1</sub>/RLU<sub>样本3</sub>) | 1.46 | 1.75 | 2.38 | 2.61 | 2.59 |
| 信噪比3(RLU<sub>样本1</sub>/RLU<sub>样本3</sub>) | 3.03 | 4.53 | 6.22 | 9.10 | 9.23 |
通过表8的结果可以看出，信噪比随样本量增加而增加。样本量在5μL～30μL时，信噪比随样本量增加显著升高，继续提升样本量(30μL～50μL)，信噪比提升不显著。由于样本量的增加感染风险会增加，因此优选样本量30μL。
2.4.2反应时间的确定如表9和表10所示。
表9 反应时间的确定
通过表9可以看出，信噪比随第一步孵育时间增加而增加。第一步孵育时间在10min～20min时，信噪比随样本量增加显著升高，继续提升孵育时间(20min～30min)，信噪比提升不显著，因此第一步孵育时间选择20min。
表10 反应时间的确定
通过表10可以看出，信噪比随第二步孵育时间增加变化不显著。信号值随第二步孵育时间增加而增加。第二步孵育时间由2min提升至5min，信号值显著升高，继续提升孵育时间，信号值提升不显著，因此第二步孵育时间选择5min。
2.4.3组分浓度的确定如表11和表12所示。
表11 组分浓度的确定
通过表11可以看出，信噪比随磁珠浓度的增加变化不显著。信号值随磁珠浓度的增加而增加。磁珠浓度由0.2mg/mL提升至0.7mg/mL，信号值显著升高，继续提升磁珠浓度，信号值提升不显著，因此磁珠浓度选择0.7mg/mL。
表12 组分浓度的确定
通过表12可以看出，信号值随着酶标浓度的增加而增加。但酶标浓度为0.5μg/mL-0.7μg/mL时，信噪比降低。综合考虑信号值和信噪比，酶标浓度选择0.5μg/mL。
2.5检测结果
2.5.1捕获组分与检测组分的活性成分互换，对检测结果的影响
方法1：捕获组分主要成分为包被有AXL蛋白的磁性微珠，检测组分主要成分为标记有碱性磷酸酶的新型冠状病毒疫苗原液。
方法2：捕获组分主要成分为包被有新型冠状病毒疫苗原液的磁性微珠，检测组分主要成分为标记有碱性磷酸酶的AXL蛋白。
采用方法1和方法2的两个检测试剂盒，对53例新冠感染康复者患者样本进行检测，进行方法学比对，结果如图4所示。通过图4可以看出，两种试剂盒的r2＝0.93，检测结果一致性高。
2.5.2与病毒中和试验一致性
2.5.2.1病毒中和试验
病毒中和试验采用固定病毒稀释血清法。试验需先滴定病毒毒价，试验时将其稀释成每一单位剂量含100个TCID50，再将待检血清倍比稀释加等量100个TCID50/mL的病毒液，混匀后37℃孵育2h，每一稀释度接种细胞培养板，每孔0.1mL。5％CO2 37℃培养箱培养4天后，记录出现CPE孔数。按Karber法计算中和价，即50％细胞被保护时抗血清的最大稀释度。
2.5.2.2与病毒中和试验一致性结果如表13所示。
表13 与病毒中和试验一致性
实施例3
本实施例提供了新型冠状病毒疫苗原液与ACE2和AXL用于新型冠状病毒中和抗体的检测方法及相应的试剂盒。该试剂盒中，捕获组分的主要成分为包被有ACE2蛋白的磁性颗粒(捕获组分-1)和包被有AXL蛋白的磁性颗粒(捕获组分-2)，检测组分的主要成分为标记有碱性磷酸酶的新型冠状病毒疫苗原液。
3.1试剂的制备
3.1.1捕获组分制备工艺
捕获组分-1的制备方法与实施例1中的1.1.1相同，捕获组分-2的制备方法与实施例2中的2.1.1相同。
3.1.2检测组分制备工艺
该步骤与实施例1中的1.1.2基本相同，不同之处在于酶标记物浓度为0.2～0.7μg/mL。
3.2样本检测
3.2.1将样本和标记有碱性磷酸酶的新型冠状病毒灭活疫苗原液加入到反应管中，混合均匀。
3.2.2将捕获组分-1和捕获组分-2加到反应管中孵育，样本中的SARS-CoV-2中和抗体竞争或阻止ACE2/AXL蛋白或蛋白片段与疫苗原液的结合位点结合。反应完成后，磁场吸住磁珠，洗去未结合的物质。
3.2.3将化学发光底物液(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷，AMPPD)添加到反应管内，AMPPD被碱性磷酸酶所分解，脱去一个磷酸基，生成不稳定的中间产物，该中间产物通过分子内电子转移产生间氧苯甲酸甲酯阴离子，处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子从激发态返回基态时，产生化学发光。再通过光电倍增管对反应中所产生的光子数进行测量，所产生光子的量与样本内SARS-CoV-2中和抗体的含量成反比。定标曲线如图5所示。
3.3阳性判断值的确定
该步骤与实施例1中的1.3相同。
3.4试剂反应条件确定
3.4.1反应样本量的确定如表14所示。
表14 反应样本量的确定
| 样本量 | 5μL | 10μL | 20μL | 30μL | 50μL |
| 样本1 | 7208776 | 7531900 | 7431697 | 7538009 | 7599551 |
| 样本2 | 6727148 | 6742941 | 6092483 | 6140631 | 6063218 |
| 样本3 | 4810140 | 4763945 | 3777301 | 3761531 | 3774317 |
| 样本4 | 1586374 | 1477518 | 1220322 | 1242368 | 1240617 |
| 信噪比1(RLU<sub>样本1</sub>/RLU<sub>样本2</sub>) | 1.07 | 1.12 | 1.22 | 1.23 | 1.25 |
| 信噪比2(RLU<sub>样本1</sub>/RLU<sub>样本3</sub>) | 1.50 | 1.58 | 1.97 | 2.00 | 2.01 |
| 信噪比3(RLU<sub>样本1</sub>/RLU<sub>样本3</sub>) | 4.54 | 5.10 | 6.09 | 6.07 | 6.13 |
通过表14的结果可以看出，信噪比随样本量增加而增加。样本量在5μL～30μL时，信噪比随样本量增加显著升高，继续提升样本量(30μL～50μL)，信噪比提升不显著。由于样本量的增加感染风险会增加，因此优选样本量30μL。
3.4.2反应时间的确定如表15和表16所示。
表15 反应时间的确定
通过表15可以看出，信噪比随第一步孵育时间增加而增加。第一步孵育时间在10min～20min时，信噪比随样本量增加显著升高，继续提升孵育时间(20min～30min)，信噪比提升不显著，因此第一步孵育时间选择20min。
表16 反应时间的确定
通过表16可以看出，信噪比随第二步孵育时间增加变化不显著。信号值随第二步孵育时间增加而增加。第二步孵育时间由2min提升至5min，信号值显著升高，继续提升孵育时间，信号值提升不显著，因此第二步孵育时间选择5min。
3.4.3组分浓度的确定如表17和表18所示。
表17 组分浓度的确定
通过表17可以看出，捕获组分-1的磁珠包被物浓度用量固定为0.4mg/mL，变化捕获组分-2的磁珠包被物浓度用量。捕获组分-2的磁珠包被物浓度由0mg/mL升高到0.3mg/mL，信噪比和信号值显著升高。捕获组分-2磁珠包被物浓度由0.3mg/mL提升至0.7mg/mL，信号值和信噪比变化不显著，因此捕获组分-2磁珠包被物浓度选择0.3mg/mL。
表18 组分浓度的确定
通过表18可以看出，信号值随着酶标浓度的增加而增加。但酶标浓度为0.5μg/mL-0.7μg/mL时，信噪比降低。综合考虑信号值和信噪比，酶标浓度选择0.3μg/mL。
3.5检测结果
3.5.1捕获组分与检测组分的活性成分互换，对检测结果的影响
方法1：捕获组分-1主要成分为包被有ACE2蛋白的磁性微珠，捕获组分-2主要成分为宝贝有AXL蛋白的磁性微珠，检测组分主要成分为标记有碱性磷酸酶的新型冠状病毒疫苗原液。
方法2：捕获组分主要成分为包被有新型冠状病毒疫苗原液的磁性微珠，检测组分-1主要成分为标记有碱性磷酸酶的ACE2蛋白，检测组分-2主要成分为标记有碱性磷酸酶的AXL蛋白。
采用方法1和方法2两个检测试剂盒，对50例新冠感染康复者患者样本进行检测，进行方法学比对，结果如图6所示。两种试剂盒的r2＝0.92，检测结果一致性高。
3.5.2病毒中和试验一致性
3.5.2.1病毒中和试验
病毒中和试验采用固定病毒稀释血清法。试验需先滴定病毒毒价，试验时将其稀释成每一单位剂量含100个TCID50，再将待检血清倍比稀释加等量100个TCID50/ml的病毒液，混匀后37℃孵育2h，每一稀释度接种细胞培养板，每孔0.1ml。5％CO2 37℃培养箱培养4天后，记录出现CPE孔数。按Karber法计算中和价，即50％细胞被保护时抗血清的最大稀释度。
3.5.2.2与病毒中和试验一致性的结果如表19所示。
表19 病毒中和试验一致性结果
实施例4
本实施例提供了新型冠状病毒疫苗原液与新型冠状病毒中和抗体(结合抗体中的一类)用于新型冠状病毒中和抗体的检测方法及相应的试剂盒。该试剂盒中，捕获组分的主要成分为包被有新型冠状病毒疫苗原液的固相载体。新型冠状病毒疫苗原液固定于固相载体的方式包括：通过吸附的方法、化学键偶联的方式、生物素-亲和素结合方式、通过与抗体识别结合的方法等；检测组分的主要成分为标记有碱性磷酸酶的新型冠状病毒中和抗体标准品。
4.1试剂的制备
4.1.1捕获组分制备工艺
该步骤与实施例1中的1.1.1基本相同，不同之处在于以将新型冠状病毒灭活疫苗原液(中国生物技术股份有限公司)替换ACE2，且所得磁珠包被物的浓度为0.5mg/mL。
4.1.2检测组分制备工艺
将新冠中和抗体-1(北京义翘神州生物技术有限公司，40591-MM57)和新冠中和抗体-2(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，MR2085)分别与碱性磷酸酶(Roche LifeScience)进行偶联，制备得酶标记物-1和酶标记物-2。将酶标记物-1和酶标记物-2按照一定的比例混合并稀释于50mM MES缓冲液(0.5M NaCl、0.5％BSA、0.05％吐温20，pH＝6.0)，制备得酶标记物。
4.2样本检测
4.2.1将样本和包被有新型冠状病毒灭活疫苗原液的磁珠加入到反应管中，混合均匀。
4.2.2将标记有碱性磷酸酶的新冠中和抗体-1和新冠中和抗体-2加到反应管中孵育，样本中的SARS-CoV-2中和抗体竞争或阻止标记有碱性磷酸酶的中和抗体与疫苗原液的结合位点结合。反应完成后，磁场吸住磁珠，洗去未结合的物质。
4.2.3将化学发光底物液添加到反应管内，发光底物(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷，AMPPD)被碱性磷酸酶所分解，脱去一个磷酸基，生成不稳定的中间产物，该中间产物通过分子内电子转移产生间氧苯甲酸甲酯阴离子，处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子从激发态返回基态时，产生化学发光。再通过光电倍增管对反应中所产生的光子数进行测量，所产生光子的量与样本内SARS-CoV-2中和抗体的含量成反比。定标曲线如图7所示。
4.3阳性判断值的确定
该步骤与实施例1中的1.3相同。
4.4试剂反应条件确定
4.4.1反应样本量的确定如表20所示。
表20 反应样本量的确定
| 样本量 | 5μL | 10μL | 20μL | 30μL | 50μL |
| 样本1 | 5049637 | 5309929 | 5397601 | 5593200 | 5802413 |
| 样本2 | 4705378 | 4751119 | 4520986 | 4412696 | 4729983 |
| 样本3 | 3348945 | 3345249 | 3119168 | 2800763 | 2939426 |
| 样本4 | 1122394 | 1018936 | 939582 | 903649 | 920054 |
| 信噪比1(RLU样本1/RLU样本2) | 1.07 | 1.12 | 1.19 | 1.27 | 1.23 |
| 信噪比2(RLU样本1/RLU样本3) | 1.51 | 1.59 | 1.73 | 2.00 | 1.97 |
| 信噪比3(RLU样本1/RLU样本3) | 4.50 | 5.21 | 5.74 | 6.19 | 6.31 |
通过表20可以看出，信噪比随样本量增加而增加。样本量在5μL～30μL时，信噪比随样本量增加显著升高，继续提升样本量(30μL～50μL)，信噪比提升不显著。由于样本量的增加感染风险会增加，因此优选样本量30μL。
4.4.2反应时间的确定如表21和表22所示。
表21 反应时间的确定
通过表21可以看出，信噪比随第一步孵育时间增加而增加。第一步孵育时间在10min～15min时，信噪比随样本量增加显著升高，继续提升孵育时间(15min～30min)，信噪比提升不显著，因此第一步孵育时间选择15min。
表22 反应时间的确定
通过表22可以看出，信噪比随第二步孵育时间增加变化不显著。信号值随第二步孵育时间增加而增加。第二步孵育时间由2min提升至5min，信号值显著升高，继续提升孵育时间，信号值提升不显著，因此第二步孵育时间选择5min。
4.4.3组分浓度的确定如表23和表24所示。
表23 组分浓度的确定
通过表23可以看出，检测组分-2的酶标记物浓度用量固定为0.2μg/mL，改变检测组分-1的用量。检测组分-1的浓度由0μg/mL升高到0.3μg/mL，信噪比和信号值显著升高。检测组分-1浓度由0.3μg/mL提升至0.7μg/mL，信噪比下降，因此检测组分-1浓度选择0.3μg/mL。
表24 组分浓度的确定
通过表24可以看出，信号值随着酶标浓度的增加而增加。但酶标浓度为0.2μg/mL-0.5μg/mL时，信噪比降低。综合考虑信号值和信噪比，酶标浓度选择0.2μg/mL。
4.5检测结果
4.5.1捕获组分与检测组分的活性成分互换，对检测结果的影响
方法1：捕获组分主要成为包被有新型冠状病毒灭活疫苗原液的磁性微珠，检测组分主要成分为标记有碱性磷酸酶的新型冠状病毒中和抗体(该新型冠状病毒中和抗体为4.1.2中的新冠中和抗体-1和新冠中和抗体-2)。
方法2：捕获组分主要成为包被有新型冠状病毒中和抗体的磁性微珠，检测组分主要成分为标记有碱性磷酸酶的新型冠状病毒灭活疫苗原液。
采用方法1和方法2两个检测试剂盒，对58例新冠感染康复者患者样本进行检测，进行方法学比对，结果如图8所示。两种试剂盒的r2＝0.96，检测结果一致性高。
4.5.2与病毒中和试验一致性
4.5.2.1病毒中和试验
病毒中和试验采用固定病毒稀释血清法。试验需先滴定病毒毒价，试验时将其稀释成每一单位剂量含100个TCID50，再将待检血清倍比稀释加等量100个TCID50/ml的病毒液，混匀后37℃孵育2h，每一稀释度接种细胞培养板，每孔0.1ml。5％CO2 37℃培养箱培养4天后，记录出现CPE孔数。按Karber法计算中和价，即50％细胞被保护时抗血清的最大稀释度。
4.5.2.2与病毒中和试验一致性的结果如表25所示。
表25 与病毒中和试验一致性
实施例5
本实施例提供了新型冠状病毒疫苗原液与结合抗体(包括新型冠状病毒中和抗体和其它抗体，且能与新型冠状病毒疫苗原液结合)用于新型冠状病毒中和抗体的检测方法及相应的试剂盒。该试剂盒中，捕获组分的主要成分为包被有其它抗体的固相载体，检测组分的主要成分为标记有碱性磷酸酶的新型冠状病毒中和抗体，中和组分的主要成分为新型冠状病毒疫苗原液。其它抗体固定于固相载体的方式包括：通过吸附的方法、化学键偶联的方式、生物素-亲和素结合方式、通过与抗体识别结合的方法等。
5.1试剂的制备
5.1.1捕获组分制备工艺
将其它抗体(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)包被于磁性微珠(简称磁珠)(Thermo Fisher)表面。下面详细描述相应的包被方法：
首先将其它抗体进行前处理，通过透析去除其缓冲基质中的保护组分。按照每毫克磁珠加入0.5μg至40μg的抗体的比例进行包被。在反应过程中磁珠表面的羧基在EDC/NHS催化下与抗体的氨基进行偶联。典型的制备过程为：取20mg表面修饰有羧基的磁珠，超声分散于10mM MES缓冲液中，加入80mg EDC和120mg NHS，超声混合均匀后，置于37℃摇床15min。之后在处理后的磁珠中，按照比例加入新冠灭活疫苗原液，混匀，并置于37℃摇床反应10h至18h。清洗封闭后，制备得到包被有抗体的磁珠包被物。将磁珠包被物稀释于50mMMES缓冲液(0.5M NaCl、0.5％BSA、0.05％吐温20，pH＝6.0)，磁珠包被物浓度为0.5mg/mL。
5.1.2检测组分制备工艺
将新冠中和抗体-1(北京义翘神州生物技术有限公司，40591-MM57)和新冠中和抗体-2(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，MR2085)分别与碱性磷酸酶(Roche LifeScience)进行偶联，制备得酶标记物-1和酶标记物-2。将酶标记物-1和酶标记物-2按照一定的比例混合并稀释于50mM MES缓冲液(0.5M NaCl、0.5％BSA、0.05％吐温20，pH＝6.0)，制备得酶标记物。
5.1.3中和组分的制备
将新型冠状病毒灭活疫苗原液(中国生物技术股份有限公司)按照一定的浓度稀释于50mM MES缓冲液(0.5M NaCl、0.5％BSA、0.05％吐温20，pH＝6.0)，制备得中和组分。
5.2样本检测
第一步，将样本、包被有标记有能与新型冠状病毒灭活疫苗原液结合的其它抗体的固相组分和中和组分加入到反应管中，混合并孵育，形成“其它抗体的固相组分-新型冠状病毒灭活疫苗原液-样本新型冠状病毒中和抗体”复合物。
第二步，将主要成分为标记有信号标记物的新型冠状病毒中和抗体加到反应管中孵育，样本中的新型冠状病毒中和抗体阻止或干扰试剂中的中和抗体与新型冠状病毒灭活疫苗原液的结合位点结合。反应完成后，磁场吸住磁珠，洗去未结合的物质。
第三步，将化学发光底物液添加到反应管内，发光底物(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷，AMPPD)被碱性磷酸酶所分解，脱去一个磷酸基，生成不稳定的中间产物，该中间产物通过分子内电子转移产生间氧苯甲酸甲酯阴离子，处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子从激发态返回基态时，产生化学发光。再通过光电倍增管对反应中所产生的光子数进行测量，所产生光子的量与样本内SARS-CoV-2中和抗体的含量成反比。定标曲线如图9所示。
5.3阳性判断值的确定
该步骤与实施例1中的1.3相同。
5.4试剂反应条件确定
5.4.1反应样本量的确定如表26所示。
表26 反应样本量的确定
| 样本量 | 5μL | 10μL | 20μL | 30μL | 50μL |
| 样本1 | 5785642 | 5721257 | 5667116 | 5741414 | 5473184 |
| 样本2 | 5136551 | 4757339 | 4497060 | 4628984 | 4360208 |
| 样本3 | 3673868 | 3016104 | 2779710 | 2869069 | 2599831 |
| 样本4 | 1022332 | 948521 | 848165 | 845356 | 805459 |
| 信噪比1(RLU<sub>样本1</sub>/RLU<sub>样本2</sub>) | 1.13 | 1.20 | 1.26 | 1.24 | 1.26 |
| 信噪比2(RLU<sub>样本1</sub>/RLU<sub>样本3</sub>) | 1.57 | 1.90 | 2.04 | 2.00 | 2.11 |
| 信噪比3(RLU<sub>样本1</sub>/RLU<sub>样本3</sub>) | 5.66 | 6.03 | 6.68 | 6.79 | 6.80 |
通过表26可以看出，信噪比随样本量增加而增加。样本量在5μL～20μL时，信噪比随样本量增加显著升高，继续提升样本量(20μL～50μL)，信噪比提升不显著。由于样本量的增加感染风险会增加，因此优选样本量20μL。
5.4.2反应时间的确定如表27和表28所示。
表27 反应时间的确定
通过表27可以看出，信噪比随第一步孵育时间增加而增加。第一步孵育时间在10min～15min时，信噪比随样本量增加显著升高，继续提升孵育时间(15min～30min)，信噪比提升不显著，因此第一步孵育时间选择15min。
表28 反应时间的确定
通过表28可以看出，信噪比随第二步孵育时间增加变化不显著。信号值随第二步孵育时间增加而增加。第二步孵育时间由2min提升至5min，信号值显著升高，继续提升孵育时间，信号值提升不显著，因此第二步孵育时间选择5min。
5.4.3组分浓度的确定如表29所示。
表29 组分浓度的确定
通过表29可以看出，捕获组分浓度为0.5mg/mL。检测组分中新冠中和抗体-1的浓度为0.3μg/mL，新冠中和抗体-2的浓度为0.2μg/mL。中和组分的浓度由1μg/mL升高到5μg/mL，信号值显著升高，信噪比变化不显著。中和组分浓度由5μg/mL提升至10μg/mL，信噪比显著下降，因此中和组分中疫苗原液的浓度选择为5μg/mL。
5.5检测结果
5.5.1捕获组分与检测组分互换，对检测结果的影响
方法1：捕获组分的主要成分为包被有能与新型冠状病毒灭活疫苗原液结合的其它抗体的磁珠；检测组分的主要成分为标记有碱性磷酸酶的新型冠状病毒中和抗体；中和组分的主要成分为新型冠状病毒灭活疫苗原液。
方法2：捕获组分的主要成分为包被有新型冠状病毒中和抗体的磁性微珠；检测组分的主要成分为标记有碱性磷酸酶的能与新型冠状病毒灭活疫苗原液结合的其它抗体；中和组分的主要成分为新型冠状病毒灭活疫苗原液。
采用方法1和方法2两个检测试剂盒，对50例新冠感染康复者患者样本进行检测，进行方法学比对，结果如图10所示。两种试剂盒的r2＝0.94，检测结果一致性高。
5.5.2与病毒中和试验一致性
5.5.2.1病毒中和试验
病毒中和试验采用固定病毒稀释血清法。试验需先滴定病毒毒价，试验时将其稀释成每一单位剂量含100个TCID50，再将待检血清倍比稀释加等量100个TCID50/ml的病毒液，混匀后37℃孵育2h，每一稀释度接种细胞培养板，每孔0.1ml。5％CO2 37℃培养箱培养4天后，记录出现CPE孔数。按Karber法计算中和价，即50％细胞被保护时抗血清的最大稀释度。
5.5.2.2与病毒中和试验一致性的结果如表30所示。
表30 病毒中和试验一致性结果
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (11)
1.一种检测冠状病毒中和抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括冠状病毒疫苗原液和活性物质，所述活性物质包括血管紧张素转化酶2蛋白或其片段、酪氨酸蛋白激酶受体蛋白或其片段、结合抗体中的至少一种，所述结合抗体能与所述冠状病毒疫苗原液结合，所述结合抗体包括冠状病毒中和抗体和其它抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一捕获组分和第一检测组分，其中，所述第一捕获组分包括所述活性物质和固相载体，所述第一检测组分包括标记有信号标记物的所述冠状病毒疫苗原液；或
所述第一捕获组分包括所述冠状病毒疫苗原液和固相载体，所述第一检测组分包括标记有信号标记物的所述活性物质。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一捕获组分包括所述血管紧张素转化酶2蛋白或其片段、所述酪氨酸蛋白激酶受体蛋白或其片段中的至少一种以及所述固相载体，所述第一检测组分包括标记有信号标记物的所述冠状病毒疫苗原液；或
所述第一捕获组分包括所述冠状病毒疫苗原液和所述固相载体，所述第一检测组分包括所述血管紧张素转化酶2蛋白或其片段、所述酪氨酸蛋白激酶受体蛋白或其片段中的至少一种，且所述血管紧张素转化酶2蛋白或其片段、所述酪氨酸蛋白激酶受体蛋白或其片段中的至少一种标记有信号标记物。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一捕获组分包括所述冠状病毒中和抗体和所述固相载体，所述第一检测组分包括标记有信号标记物的所述冠状病毒疫苗原液；或
所述第一捕获组分包括所述冠状病毒疫苗原液和所述固相载体，所述第一检测组分包括标记有信号标记物的所述冠状病毒中和抗体。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第二捕获组分、第二检测组分和中和组分，其中，所述第二捕获组分包括所述其它抗体和固相载体，所述第二检测组分包括标记有信号标记物的所述冠状病毒中和抗体，所述中和组分包括所述冠状病毒疫苗原液；或
所述第二捕获组分包括所述冠状病毒中和抗体和固相载体，所述第二检测组分包括标记有信号标记物的所述其它抗体，所述中和组分包括所述冠状病毒疫苗原液。
6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述冠状病毒疫苗原液包括冠状病毒灭活疫苗原液、冠状病毒亚单位疫苗原液、冠状病毒载体疫苗原液、冠状病毒减毒活疫苗原液中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述冠状病毒疫苗原液为新型冠状病毒疫苗原液。
8.冠状病毒疫苗原液在制备检测冠状病毒中和抗体检测试剂中的用途。
9.冠状病毒疫苗原液和活性物质在制备检测冠状病毒中和抗体检测试剂中的用途，所述活性物质包括血管紧张素转化酶2蛋白或其片段、酪氨酸蛋白激酶受体蛋白或其片段、结合抗体中的至少一种，所述结合抗体能与所述冠状病毒疫苗原液结合，所述结合抗体包括冠状病毒中和抗体和其它抗体。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述冠状病毒疫苗原液包括冠状病毒灭活疫苗原液、冠状病毒亚单位疫苗原液、冠状病毒载体疫苗原液、冠状病毒减毒活疫苗原液中的至少一种；和/或
所述冠状病毒疫苗原液为新型冠状病毒疫苗原液。
11.一种冠状病毒中和抗体的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供待测样本、冠状病毒疫苗原液、活性物质和发光底物，其中，所述冠状病毒疫苗原液或所述活性物质标记有信号标记物，所述活性物质包括血管紧张素转化酶2蛋白或其片段、酪氨酸蛋白激酶受体蛋白或其片段、结合抗体中的至少一种，所述结合抗体能与所述冠状病毒疫苗原液结合，所述结合抗体包括冠状病毒中和抗体和其它抗体；
将所述待测样本、所述冠状病毒疫苗原液和所述活性物质进行混合处理，得到结合物；
将所述结合物与所述发光底物进行混合反应，测量所述混合反应产生的光子数，所述光子数与所述待测样本中冠状病毒中和抗体的含量成反比。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114062677A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-02-18 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种检测新冠病毒中和抗体的试剂盒及其制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102520169A (zh) * | 2011-11-29 | 2012-06-27 | 唐山怡安生物工程有限公司 | 一种动物狂犬病中和抗体elisa检测试剂盒及其应用 |
| CN111562369A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-08-21 | 威海威高生物科技有限公司 | SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒 |
| CN112098644A (zh) * | 2020-09-11 | 2020-12-18 | 江苏美克医学技术有限公司 | 一种酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒及其检测方法 |
-
2021
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102520169A (zh) * | 2011-11-29 | 2012-06-27 | 唐山怡安生物工程有限公司 | 一种动物狂犬病中和抗体elisa检测试剂盒及其应用 |
| CN111562369A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-08-21 | 威海威高生物科技有限公司 | SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒 |
| CN112098644A (zh) * | 2020-09-11 | 2020-12-18 | 江苏美克医学技术有限公司 | 一种酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒及其检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHRISTOPHER O. BARNES ET AL.: "Structural classification of neutralizing antibodies against the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain suggests vaccine and therapeutic stragtegies", 《BIORXIV》 * |
| SHUAI WANG ET AL.: "AXL is a candidate receptor for SARS-CoV-2 that promotes infection of pulmonary and bronchial epithelial cells", 《CELL RESEARCH》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114062677A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-02-18 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种检测新冠病毒中和抗体的试剂盒及其制备方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210806 |