CN113203856A - 检测冠状病毒抗体的试剂盒、冠状病毒抗体的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及检测冠状病毒抗体的试剂盒、冠状病毒抗体的检测方法。本发明提供的试剂盒可用于检测冠状病毒抗体，其通过待测样本中的冠状病毒抗体分别与捕获组分中的冠状病毒疫苗原液、检测组分中的冠状病毒疫苗原液相结合，再以发光强度对检测结果进行判定，从而实现对待测样本中冠状病毒抗体的检测。检测过程无需在BSL‑3实验室进行即可快速获得检测结果，具有操作简便、特异性高、检测通量高的优点。

Description

检测冠状病毒抗体的试剂盒、冠状病毒抗体的检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种检测冠状病毒抗体的试剂盒，冠状病毒疫苗原液在制备检测冠状病毒抗体检测试剂中的用途，以及一种冠状病毒抗体的检测方法。
背景技术
冠状病毒(Coronavirus)是自然界广泛存在的一大类病毒，是直径约80～120nm的RNA病毒。目前已发现有七种可感染人类的冠状病毒，分别是人冠状病毒229E(HCoV-229E)、HCoV-OC43、SARS病毒(SARS-CoV)、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、MERS病毒(MERS-CoV)以及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发的急性呼吸道传染病，在全球各国大规模爆发并急速扩散，目前已成为全球性重大的公共卫生事件，并成为人类历史上致死人数最多的流行病之一。
新型冠状病毒包含四种主要的结构蛋白：刺突(Spike，S)蛋白、膜(Membrane，M)蛋白、包膜(Envelope，E)蛋白和核衣壳(Nucleocapsid，N)蛋白。S蛋白是位于病毒囊膜表面的同源三聚体蛋白，由N端的S1亚基和C端的S2亚基组成。SARS-CoV-2通过位于S1亚基中的受体结合结构域(Receptor Binding Domain，RBD)识别和结合宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting Enzyme 2，ACE2)，触发细胞膜融合级联反应，从而进入细胞造成感染。
面对肆虐的新冠疫情，新冠疫苗被认为是新冠病毒的首选防护手段。已批准使用的疫苗III期临床试验中，尽管接种疫苗的受试者有一定的感染率，但相对于安慰剂组，已经证明了疫苗对疾病的保护力。疫苗临床及相关研究数据显示，中和抗体在防止(或减轻)新冠感染中起着重要的作用，因此对于中和抗体的检测也至关重要。中和抗体检测的实验室“金标准”是感染抑制试验，主要包括蚀斑减少中和试验(plaque reductionneutralization test，PRNT)和微量中和试验(Micro-neutralization assay，MNA)。对于新冠中和抗体的检测，两种方法均将定量SARS-CoV-2病毒与不同稀释度的待测样本混合后，接种到单层Vero细胞上。通过细胞的病毒变程度，建立抑制曲线，评估样本中中和抗体的滴度。两种方法中均涉及SARS-CoV-2活病毒，对试验环境的生物安全等级要求高。
发明内容
本发明目的在于提供一种检测冠状病毒抗体的试剂盒，以及一种冠状病毒抗体的检测方法，旨在解决现有冠状病毒抗体检测技术中存在的对生物安全级别要求高、操作复杂、检测通量低的技术问题。
为了实现上述发明目的，本发明一方面，提供了一种检测冠状病毒抗体的试剂盒，其包括捕获组分和检测组分，其中，所述捕获组分包括冠状病毒疫苗原液和固相载体，所述检测组分包括标记有信号标记物的冠状病毒疫苗原液。
本发明提供的试剂盒中，捕获组分和检测组分中都含有冠状病毒疫苗原液，因此都可以与待测样本中的冠状病毒抗体相结合，从而实现对待测样本中冠状病毒抗体的检测。该试剂盒具有成分简单、操作简便、特异性高、检测通量高的优点，可满足大规模检测的需求。
本发明另一方面，提供了冠状病毒疫苗原液在制备检测冠状病毒抗体检测试剂中的用途。
本发明利用冠状病毒抗体可以与冠状病毒疫苗原液结合的特性，通过待测样本中的冠状病毒抗体分别与捕获组分中的冠状病毒疫苗原液、检测组分中的冠状病毒疫苗原液相结合，从而实现对待测样本中冠状病毒抗体的检测。该试剂盒可以实现对冠状病毒抗体的定量检测，且检测过程无需在BSL-3实验室进行即可快速获得检测结果，具有操作简便、特异性高、检测通量高的优点。
本发明最后一方面，提供了一种冠状病毒抗体的检测方法，其包括如下步骤：
提供待测样本、冠状病毒疫苗原液、固相载体和发光底物，其中，所述冠状病毒疫苗原液包括第一冠状病毒疫苗原液和第二冠状病毒疫苗原液，所述第一冠状病毒疫苗原液标记有信号标记物；
将所述待测样本、所述第一冠状病毒疫苗原液、所述第二冠状病毒疫苗原液和所述固相载体进行混合处理，得到结合物；
将所述结合物与所述发光底物进行混合反应，测量所述混合反应产生的光子数，所述光子数与所述待测样本中冠状病毒抗体的含量成正比。
本发明提供的冠状病毒抗体检测方法利用夹心法检测原理，通过将一部分冠状病毒疫苗原液固定在固相载体上，另一部分冠状病毒疫苗原液标记有信号标记物，从而使待测样本中的冠状病毒抗体可以分别与固相载体表面的冠状病毒疫苗原液抗原位点、以及信号标记物标记的冠状病毒疫苗原液的抗原位点进行结合得到结合物，再以发光强度对检测结果进行判定。该检测方法可以快速检测待测样本中的冠状病毒抗体，具有操作简便、特异性高、检测通量高的优点，可满足大规模检测的需求。
附图说明
图1表示实施例提供的试剂盒在检测时的定标曲线。
具体实施方式
本发明实施例提供了一种检测冠状病毒抗体的试剂盒，其包括捕获组分和检测组分，其中，捕获组分包括冠状病毒疫苗原液和固相载体，检测组分包括标记有信号标记物的冠状病毒疫苗原液。
本发明实施例提供的试剂盒中，捕获组分和检测组分中都含有冠状病毒疫苗原液，因此都可以与待测样本中的冠状病毒抗体相结合，从而实现对待测样本中冠状病毒抗体的检测。该试剂盒具有成分简单、操作简便、特异性高、检测通量高的优点，可满足大规模检测的需求。
本发明实施例提供的试剂盒中，冠状病毒疫苗原液是制备冠状病毒疫苗的中间产物，包括但不限于冠状病毒灭活疫苗原液、冠状病毒亚单位疫苗原液、冠状病毒载体(如腺病毒载体、水疱性口炎病毒载体)疫苗原液、冠状病毒减毒活疫苗原液等，优选冠状病毒灭活疫苗原液。其中，冠状病毒是系统分类上属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的病毒，包括但不限于SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV等。本发明实施例提供的冠状病毒疫苗原液可按照本领域常规的制备冠状病毒疫苗的方法制备获得，例如，在制备新型冠状病毒灭活疫苗原液时，可通过将SARS-CoV-2接种于Vero细胞，经培养、收获、灭活、纯化步骤，获得新型冠状病毒灭活疫苗原液。
本发明实施例中，冠状病毒抗体包括冠状病毒中和抗体。冠状病毒抗体与冠状病毒中和抗体具有好的相关性，因此，本发明实施例提供的试剂盒在检测冠状病毒抗体的同时，可实现对冠状病毒中和抗体的定性检测。
在一些实施例中，冠状病毒疫苗原液为新型冠状病毒疫苗原液，相应地，包含该新型冠状病毒疫苗原液的试剂盒可用于检测的冠状病毒抗体为新型冠状病毒抗体。
进一步地，新型冠状病毒抗体包括新型冠状病毒中和抗体。
本发明实施例提供的试剂盒中，捕获组分中的固相载体用于负载冠状病毒疫苗原液，具体选择包括但不限于培养板、化学发光板、磁性颗粒、荧光微球、试纸、芯片中的至少一种。
本发明实施例提供的试剂盒中，检测组分中的信号标记物用于标记冠状病毒疫苗原液，在检测过程中，通过加入发光底物以检测发光强度，从而实现对待测样本中相关组分的定性和定量。该信号标记物包括但不限于化学发光标记物、电化学发光标记物、量子点、荧光微球中的至少一种，其中，化学发光标记物包括但不限于碱性磷酸酶、鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、辣根过氧化物酶等；电化学发光标记物包括但不限于三联吡啶钌；量子点包括但不限于金量子点、CdSe量子点、ZnCdSe量子点等。
在一些实施例中，试剂盒还包括稀释基质，用于对捕获组分、检测组分中的至少一种进行稀释。稀释基质包括但不限于磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris(三羟甲基氨基甲烷)等。
在一些实施例中，试剂盒还包括样本处理液、样本稀释液中的至少一种，用于对样本中的干扰物质进行处理或对样本进行稀释。
本发明实施例提供的试剂盒可用于检测样本中的冠状病毒抗体。
本发明实施例还提供了冠状病毒疫苗原液在制备检测冠状病毒抗体检测试剂中的用途。
本发明实施例利用冠状病毒抗体可以与冠状病毒疫苗原液结合的特性，通过待测样本中的冠状病毒抗体分别与捕获组分中的冠状病毒疫苗原液、检测组分中的冠状病毒疫苗原液相结合，从而实现对待测样本中冠状病毒抗体的检测。同时，由于冠状病毒抗体与冠状病毒中和抗体具有高度相关性，因此还可实现对冠状病毒中和抗体的定性。本发明实施例提供的冠状病毒疫苗原液制备的冠状病毒抗体检测试剂，其检测过程无需在BSL-3实验室进行即可快速获得检测结果，具有操作简便、特异性高、检测通量高的优点。
本发明实施例中的“样本”或“待测样本”，是指血液样本(如：血清或血浆)，其来源为哺乳动物受试者，该受试者包括患有、疑似患有或携带冠状病毒的感染群体、康复群体、无症状感染群体、已接种疫苗群体等。
本发明实施例中，将冠状病毒疫苗原液用于制备检测冠状病毒抗体检测试剂时，冠状病毒疫苗原液包括但不限于冠状病毒灭活疫苗原液、冠状病毒亚单位疫苗原液、冠状病毒载体(如腺病毒载体、水疱性口炎病毒载体)疫苗原液、冠状病毒减毒活疫苗原液等，优选冠状病毒灭活疫苗原液。
本发明实施例中，将冠状病毒疫苗原液用于制备检测冠状病毒抗体检测试剂时，冠状病毒抗体包括冠状病毒中和抗体。
在一些实施例中，冠状病毒疫苗原液为新型冠状病毒疫苗原液，相应地，用于制备检测冠状病毒抗体检测试剂时，该冠状病毒抗体为新型冠状病毒抗体。
相应地，本发明实施例还提供了一种冠状病毒抗体的检测方法，其包括如下步骤：
S1、提供待测样本、冠状病毒疫苗原液、固相载体和发光底物，其中，冠状病毒疫苗原液包括第一冠状病毒疫苗原液和第二冠状病毒疫苗原液，第一冠状病毒疫苗原液标记有信号标记物；
S2、将待测样本、第一冠状病毒疫苗原液、第二冠状病毒疫苗原液和固相载体进行混合处理，得到结合物；
S3、将结合物与发光底物进行混合反应，测量混合反应产生的光子数，光子数与待测样本中冠状病毒抗体的含量成正比。
本发明实施例提供的冠状病毒抗体检测方法利用夹心法检测原理，通过将一部分冠状病毒疫苗原液固定在固相载体上，另一部分冠状病毒疫苗原液标记有信号标记物，从而使待测样本中的冠状病毒抗体可以分别与固相载体表面的冠状病毒疫苗原液抗原位点、以及信号标记物标记的冠状病毒疫苗原液的抗原位点进行结合得到结合物，再以发光强度对检测结果进行判定。该检测方法可以快速检测待测样本中的冠状病毒抗体，具有操作简便、特异性高、检测通量高的优点，可满足大规模检测的需求。同时，由于冠状病毒抗体与冠状病毒中和抗体具有高度相关性，因此还可实现对冠状病毒中和抗体的定性。
具体地，S1中，待测样本、冠状病毒疫苗原液、信号标记物、固相载体的定义、具体选择等如前文所述，此处不再赘述。发光底物，在本发明实施例中用于与信号标记物发生作用或反应从而产生光子，经检测设备检测发光强度，实现待测样本中的冠状病毒抗体的定量。在一些实施例中，发光底物包括3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷(AMPPD)、三丙胺、四甲基联苯胺中的至少一种。
本发明实施例中，冠状病毒疫苗原液包括第一冠状病毒疫苗原液和第二冠状病毒疫苗原液，第一冠状病毒疫苗原液与第二冠状病毒疫苗原液可以相同也可以不同。其中，第一冠状病毒疫苗原液标记有信号标记物，在检测过程中作为检测组分；第二冠状病毒疫苗原液在检测过程中负载于固相载体上作为捕获组分。
S2中，将待测样本、第一冠状病毒疫苗原液、第二冠状病毒疫苗原液和固相载体进行混合处理的方法可以选择本领域的常规方法。经混合处理，待测样本中的冠状病毒抗体分别与标记有信号标记物的第一冠状病毒疫苗原液、负载于固相载体上的第二冠状病毒疫苗原液结合，形成结合物。本发明实施例对于第二冠状病毒疫苗原液负载于固相载体上的方法没有特别限制，既可以在混合处理之前，事先将第二冠状病毒疫苗原液负载于固相载体上，也可以在混合处理的过程中，使第二冠状病毒疫苗原液负载于固相载体上。负载方法包括但不限于吸附、化学键偶联、生物素-亲和素结合、与抗体识别结合等方式。
本发明实施例在混合处理后所得的结合物，是指直接或间接负载于固相载体上而成的复合物，其余未负载于固相载体上的复合物已由清洗等常规手段被去除。
S3中，通过将结合物与发光底物进行混合反应，结合物中的信号标记物在发光底物的作用下产生发光效应，对产生的光子数进行检测，根据光子数检测结果可知待测样本中是否含有冠状病毒抗体，以及相应冠状病毒抗体的含量。以下以信号标记物为碱性磷酸酶、发光底物为AMPPD为例进行详细说明：AMPPD与碱性磷酸酶混合时，AMPPD被碱性磷酸酶所分解并脱去一个磷酸基，生成不稳定的中间产物。该中间产物通过分子内电子转移产生间氧苯甲酸甲酯阴离子，处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子从激发态返回基态时，产生化学发光并用于检测。
可以理解的是，由于待测样本中的冠状病毒抗体通过夹心法与第一冠状病毒疫苗原液和第二冠状病毒疫苗原液分别结合，且第一冠状病毒疫苗原液上标记有信号标记物，因此检测结果中，产生光子数的量与待测样本中冠状病毒抗体的含量成正比，根据标准曲线即可得出待测样本中冠状病毒抗体的含量。
在一些实施例中，用于检测混合反应所产生光子数的方法包括酶联免疫吸附剂测定法、化学发光测定法、电化学发光测定法、免疫层析法、上转换发光检测法、下转换发光检测法中的至少一种。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例检测冠状病毒抗体的试剂盒、冠状病毒抗体的检测方法的进步性能显著的体现，以下通过多个实施例来举例说明上述技术方案。
实施例
本实施例提供了新型冠状病毒疫苗原液用于新型冠状病毒抗体的检测方法及相应的试剂盒。该试剂盒中，捕获组分的主要成分为包被有新型冠状病毒疫苗原液的磁性颗粒(简称磁珠)，检测组分的主要成分为标记有碱性磷酸酶的新型冠状病毒疫苗原液。
1.1试剂的制备
1.1.1捕获组分制备工艺
将新型冠状病毒灭活疫苗原液(中国生物技术股份有限公司)包被于磁珠(ThermoFisher)表面。下面详细描述相应的包被方法：
首先将新型冠状病毒灭活疫苗原液进行前处理，通过透析去除其缓冲基质中的保护组分。按照每毫克磁珠加入0.5μg至40μg的新型冠状病毒灭活疫苗原液的比例进行包被。在反应过程中磁珠表面的羧基在EDC/NHS催化下与新型冠状病毒灭活疫苗原液的氨基进行偶联。典型的制备过程为：取20mg表面修饰有羧基的磁珠，超声分散于10mM MES缓冲液中，加入80mg EDC和120mg NHS，超声混合均匀后，置于37℃摇床15min。之后在处理后的磁珠中，按照比例加入新型冠状病毒灭活疫苗原液，混匀，并置于37℃摇床反应10h至18h。清洗封闭后，制备得到包被有新型冠状病毒灭活疫苗原液的磁珠包被物。将磁珠包被物稀释于50mM MES缓冲液(0.5M NaCl、0.5％BSA、0.05％吐温20，pH＝6.0)，磁珠包被物浓度为0.2～1.0mg/mL。
1.1.2检测组分制备工艺
将新型冠状病毒灭活疫苗原液(中国生物技术股份有限公司)与碱性磷酸酶(Roche Life Science)进行偶联，制备得酶标记物。将酶标记物稀释于50mM MES缓冲液(0.5M NaCl、0.5％BSA、0.05％吐温20，pH＝6.0)，酶标记物浓度为0.5～3μg/mL。
1.2样本检测
1.2.1将样本、标记有碱性磷酸酶的新型冠状病毒灭活疫苗原液和包被有新型冠状病毒灭活疫苗原液的磁珠添加到反应管中。经过孵育，样本中的SARS-CoV-2抗体分别与磁珠表面新型冠状病毒灭活疫苗原液抗原位点以及碱性磷酸酶标记的新型冠状病毒灭活疫苗原液抗原位点结合，形成复合物。反应完成后，磁场吸住磁珠，洗去未结合的物质，得到结合物。
1.2.2将化学发光底物液(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷，AMPPD)添加到反应管内，AMPPD被碱性磷酸酶所分解，脱去一个磷酸基，生成不稳定的中间产物，该中间产物通过分子内电子转移产生间氧苯甲酸甲酯阴离子，处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子从激发态返回基态时，产生化学发光。再通过光电倍增管对反应中所产生的光子数进行测量，所产生光子的量与样本内SARS-CoV-2抗体的含量成正比。定标曲线如图1所示。
1.3阳性判断值的确定
收集83例采集自新冠肺炎确诊病例(核酸检测为阳性)的咽拭子样本作为阳性样本，以及116例采集自新冠肺炎排除病例的咽拭子样本(核酸检测为阴性)作为阴性样本。样本测试前离心处理(相对离心力1000g，离心时间5min)，并转移上清液进至洁净的样本管中，按“1.2样本检测”进行测试，得到各样本中抗体的浓度值。采用受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)的方法对样本测试的结果进行统计分析，得到该试剂盒的阳性判断值(Cut-off值)为10AU/mL。
1.4试剂反应条件的确定
1.4.1反应样本量的确定如表1所示。
表1反应样本量的确定
样本量 5μL 10μL 20μL 30μL 50μL
样本1 5300 4917 4151 4248 4782
样本2 89139 181788 191590 204200 224116
样本3 1278711 2553847 2434958 2483055 2794046
样本4 3688940 6450418 7038310 7782916 8624799
信噪比1(RLU<sub>样本2</sub>/RLU<sub>样本1</sub>) 16.82 36.97 46.16 48.06 46.87
信噪比2(RLU<sub>样本3</sub>/RLU<sub>样本1</sub>) 241.26 519.43 586.61 584.46 584.28
信噪比3(RLU<sub>样本4</sub>/RLU<sub>样本1</sub>) 696.00 1311.97 1695.60 1831.93 1803.59
通过表1可以看出，信噪比随样本量增加而增加。样本量在5μL～20μL时，信噪比随样本量增加显著升高，继续提升样本量(20μL～50μL)，信噪比提升不显著。由于样本量的增加感染风险会增加，因此优选样本量20μL。
1.4.2反应时间的确定如表2所示。
表2反应时间的确定
反应时间 10min 15min 20min 25min 30min
样本1 4947 4492 4289 4692 5070
样本2 89936 119486 185202 204303 219835
样本3 637992 799228 2508110 2721373 2976820
样本4 5207266 6633302 7342960 8031866 8806738
信噪比1(RLU<sub>样本2</sub>/RLU<sub>样本1</sub>) 18.18 26.60 43.18 43.55 43.36
信噪比2(RLU<sub>样本3</sub>/RLU<sub>样本1</sub>) 128.97 177.94 584.78 580.04 587.19
信噪比3(RLU<sub>样本4</sub>/RLU<sub>样本1</sub>) 1052.65 1476.82 1712.05 1711.94 1737.17
通过表2可以看出，信噪比和信号值随反应时间增加而增加。反应时间在10min～20min时，信噪比和信号值随反应时间的增加显著升高，继续提升孵育时间(20min～30min)，信噪比提升不显著，因此反应时间选择20min。
1.4.3组分浓度的确定如表3和表4所示。
表3组分浓度的确定
Figure BDA0003050125220000131
通过表3可以看出，信噪比和信号值随磁珠浓度增加而增加。磁珠浓度在0.2-0.7mg/mL时，信噪比和信号值随磁珠浓度的增加显著升高，继续提升磁珠浓度(0.7-1.0mg/mL)，信噪比提升不显著，因此磁珠浓度选择0.7mg/mL。
表4组分浓度的确定
Figure BDA0003050125220000141
通过表4可以看出，信噪比和信号值随酶标记物浓度增加而增加。酶标记物浓度在0.5-2μg/mL时，信噪比和信号值随酶标记物浓度的增加显著升高，继续提升酶标记物浓度(2.0-3.0μg/mL)，信噪比提升不显著，因此酶标记物浓度选择2.0μg/mL。
1.5与病毒中和试验一致性
1.5.1病毒中和试验
病毒中和试验采用固定病毒稀释血清法。试验需先滴定病毒毒价，试验时将其稀释成每一单位剂量含100个TCID50，再将待检血清倍比稀释加等量100个TCID50/mL的病毒液，混匀后37℃孵育2h，每一稀释度接种细胞培养板，每孔0.1mL。5％CO2 37℃培养箱培养4天后，记录出现CPE孔数。按Karber法计算中和价，即50％细胞被保护时抗血清的最大稀释度。
1.5.2重组RBD夹心法试剂盒
以“1.4”所得各试剂含量制备得到的试剂盒并应用其优选反应条件作为实验组，重组RBD夹心法试剂盒作为对照组。其中，重组RBD夹心法试剂盒的捕获组分主要成分为包被有SARS-CoV-2S1-RBD的重组抗原磁性微珠，S1-RBD为深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，检测组分的主要成分为标记有碱性磷酸酶的重组SARS-CoV-2S1-RBD重组抗原，S1-RBD为ACRO biosystems，SPD-C52H3)。病毒中和试验对比结果如表5和表6所示。
表5实验组的病毒中和试验结果
Figure BDA0003050125220000151
表6对照组的病毒中和试验结果
Figure BDA0003050125220000161
通过表5和表6可以看出，与对照组比较，实验组在阴性符合率不变的条件下，阳性符合率提高，即灵敏度提高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种检测冠状病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括捕获组分和检测组分，其中，所述捕获组分包括冠状病毒疫苗原液和固相载体，所述检测组分包括标记有信号标记物的冠状病毒疫苗原液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述冠状病毒疫苗原液包括冠状病毒灭活疫苗原液、冠状病毒亚单位疫苗原液、冠状病毒载体疫苗原液、冠状病毒减毒活疫苗原液中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述冠状病毒疫苗原液为新型冠状病毒疫苗原液；和/或
所述冠状病毒抗体包括冠状病毒中和抗体。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体包括培养板、化学发光板、磁性颗粒、荧光微球、试纸、芯片中的至少一种；和/或
所述信号标记物包括化学发光标记物、电化学发光标记物、量子点、荧光微球中的至少一种。
5.冠状病毒疫苗原液在制备检测冠状病毒抗体检测试剂中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述冠状病毒疫苗原液包括冠状病毒灭活疫苗原液、冠状病毒亚单位疫苗原液、冠状病毒载体疫苗原液、冠状病毒减毒活疫苗原液中的至少一种。
7.根据权利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述冠状病毒疫苗原液为新型冠状病毒疫苗原液；和/或
所述冠状病毒抗体包括冠状病毒中和抗体。
8.一种冠状病毒抗体的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供待测样本、冠状病毒疫苗原液、固相载体和发光底物，其中，所述冠状病毒疫苗原液包括第一冠状病毒疫苗原液和第二冠状病毒疫苗原液，所述第一冠状病毒疫苗原液标记有信号标记物；
将所述待测样本、所述第一冠状病毒疫苗原液、所述第二冠状病毒疫苗原液和所述固相载体进行混合处理，得到结合物；
将所述结合物与所述发光底物进行混合反应，测量所述混合反应产生的光子数，所述光子数与所述待测样本中冠状病毒抗体的含量成正比。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述冠状病毒疫苗原液包括冠状病毒灭活疫苗原液、冠状病毒亚单位疫苗原液、冠状病毒载体疫苗原液、冠状病毒减毒活疫苗原液中的至少一种。
10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于，所述测量所述混合反应产生的光子数的方法包括酶联免疫吸附剂测定法、化学发光测定法、电化学发光测定法、免疫层析法、上转换发光检测法、下转换发光检测法中的至少一种。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116359506A (zh) * 2023-03-21 2023-06-30 深圳市巨东生物医学工程有限公司 一种用于检测鼻咽癌的试剂盒
WO2023169506A1 (zh) * 2022-03-09 2023-09-14 中生复诺健生物科技(上海)有限公司 编码新型冠状病毒S蛋白的mRNA疫苗

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106546732A (zh) * 2015-09-17 2017-03-29 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 人类免疫缺陷病毒抗原和抗体联合检测试剂盒及其用途和检测方法
CN111505286A (zh) * 2020-04-28 2020-08-07 郑州伊美诺生物技术有限公司 一种新型冠状病毒特异性抗体双抗原夹心elisa检测试剂盒及其制备方法
CN111505277A (zh) * 2020-03-10 2020-08-07 四川省人民医院 2019新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒
CN111537742A (zh) * 2020-04-16 2020-08-14 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 可用于检测新型冠状病毒的中和抗体的检测试剂盒
CN111569058A (zh) * 2020-06-18 2020-08-25 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种SARS-CoV-2灭活疫苗及其制备方法
CN111690059A (zh) * 2020-06-19 2020-09-22 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种抗SARS-CoV-2的单克隆抗体1D7
CN111781354A (zh) * 2020-09-04 2020-10-16 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 新型冠状病毒中和性抗体滴度检测elisa试剂盒
CN112067803A (zh) * 2020-08-18 2020-12-11 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 磁性纳米颗粒标记的免疫层析法制备的新型冠状病毒检测试剂盒
CN112098644A (zh) * 2020-09-11 2020-12-18 江苏美克医学技术有限公司 一种酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒及其检测方法
CN112485436A (zh) * 2020-11-09 2021-03-12 桂林电子科技大学 检测新冠疫苗注射后体内中和抗体的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法
CN112630428A (zh) * 2020-12-23 2021-04-09 武汉爱博泰克生物科技有限公司 一种检测新冠病毒IgG/IgM总抗体的方法和试剂盒
CN112710844A (zh) * 2020-12-16 2021-04-27 北京开景基因技术有限公司 用于检测新型冠状病毒中和抗体的半定量试剂盒及方法

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106546732A (zh) * 2015-09-17 2017-03-29 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 人类免疫缺陷病毒抗原和抗体联合检测试剂盒及其用途和检测方法
CN111505277A (zh) * 2020-03-10 2020-08-07 四川省人民医院 2019新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒
CN111537742A (zh) * 2020-04-16 2020-08-14 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 可用于检测新型冠状病毒的中和抗体的检测试剂盒
CN111505286A (zh) * 2020-04-28 2020-08-07 郑州伊美诺生物技术有限公司 一种新型冠状病毒特异性抗体双抗原夹心elisa检测试剂盒及其制备方法
CN111569058A (zh) * 2020-06-18 2020-08-25 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种SARS-CoV-2灭活疫苗及其制备方法
CN111690059A (zh) * 2020-06-19 2020-09-22 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种抗SARS-CoV-2的单克隆抗体1D7
CN112067803A (zh) * 2020-08-18 2020-12-11 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 磁性纳米颗粒标记的免疫层析法制备的新型冠状病毒检测试剂盒
CN111781354A (zh) * 2020-09-04 2020-10-16 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 新型冠状病毒中和性抗体滴度检测elisa试剂盒
CN112098644A (zh) * 2020-09-11 2020-12-18 江苏美克医学技术有限公司 一种酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒及其检测方法
CN112485436A (zh) * 2020-11-09 2021-03-12 桂林电子科技大学 检测新冠疫苗注射后体内中和抗体的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法
CN112710844A (zh) * 2020-12-16 2021-04-27 北京开景基因技术有限公司 用于检测新型冠状病毒中和抗体的半定量试剂盒及方法
CN112630428A (zh) * 2020-12-23 2021-04-09 武汉爱博泰克生物科技有限公司 一种检测新冠病毒IgG/IgM总抗体的方法和试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张园 等: ""新型冠状病毒核酸、抗原和抗体联合检测的临床价值讨论"", 《现代检验医学杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023169506A1 (zh) * 2022-03-09 2023-09-14 中生复诺健生物科技(上海)有限公司 编码新型冠状病毒S蛋白的mRNA疫苗
CN116359506A (zh) * 2023-03-21 2023-06-30 深圳市巨东生物医学工程有限公司 一种用于检测鼻咽癌的试剂盒

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