CN111569058A - 一种SARS-CoV-2灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种SARS‑CoV‑2灭活疫苗及其制备方法，所述制备方法包括如下步骤：步骤(1)Vero细胞的复苏和规模化培养；步骤(2)接种工作种子批毒种、病毒培养及一次性收获病毒液，即为病毒收获液；步骤(3)第一次病毒灭活、浓缩及第二次病毒灭活后得灭活病毒浓缩液；步骤(4)灭活病毒浓缩液纯化后得疫苗原液；步骤(5)原液经检定合格后配制成半成品及分装。

Description

一种SARS-CoV-2灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体的，涉及一种SARS-CoV-2灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
2019年12月末发生严重急性呼吸道综合症疫情，病原学检测结果证实为一种新型冠状病毒，随后细胞分离获得新型冠状病毒株。国际病毒分类委员会将该新型冠状病毒命名为重症急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus2，SARS-CoV-2)，WHO将该病毒导致的疾病命名为新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease2019，COVID-19)。COVID-19疫情已造成全球范围的大流行，COVID-19给各国人民生命财产安全和社会发展带来了巨大的危害。
流行病学研究表明，COVID-19冠状病毒感染后，常见呼吸道症状为发热、干咳、乏力,肌痛、气促和呼吸困难、淋巴细胞减少症，重症和危重病例可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。
病毒主要传播途径为呼吸道飞沫传播、密切接触传播，特殊环境下的气溶胶传播，也可能存在粪口传播途径和母婴传播。医学干预治疗手段为支持治疗和对症治疗，目前尚无针对性抗冠状病毒感染特效药和疫苗上市。
加强预防性COVID-19疫苗研发，对疫情的应急防控和远期控制具有重要意义。预防新冠病毒可能的广泛传播而造成的持续或重新流行，迫切需要快速研发疫苗及目标人群接种,特别是高风险的医护人员，其他参与病原诊断、治疗、药物临床研究、防疫一线的工作人员，及重症、病死率高的高危人群，也需要疫苗接种保护高危人群。
许多研究机构开展了疫苗的研发工作，这些疫苗包括基于反向遗传学操作的减毒活疫苗、亚单位疫苗(主要表面抗原S蛋白)、DNA疫苗(S基因)、病毒载体疫苗(腺病毒，痘病毒等载体)以及灭活苗。灭活疫苗是通过物理或者化学处理等方法使病毒失去感染性而制备成的疫苗。灭活疫苗不具有致病性，但基本保持了病毒的免疫原结构，因此是安全有效的经典疫苗手段。
目前利用细胞工厂大规模培养Vero细胞用于病毒性疫苗已有多款上市产品，包括：口服脊灰减毒活疫苗、肠道病毒71型灭活疫苗和冻干甲型肝炎减毒活疫苗等。目前，还没有用于预防新型冠状病毒感染的疫苗上市，利用细胞工厂培养Vero细胞，再接种特定的新型冠状病毒毒株进行病毒培养和收获制备新型冠状病疫苗，还未见报道。
发明内容
本发明首先涉及一种SARS-CoV-2病毒的灭活疫苗的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤(1)Vero细胞的复苏和规模化培养；
步骤(2)接种工作种子批毒种、病毒培养及一次性收获病毒液，即为病毒收获液；
步骤(3)第一次病毒灭活、浓缩及第二次病毒灭活后得灭活病毒浓缩液；
步骤(4)灭活病毒浓缩液纯化后得疫苗原液；
具体的：
步骤(1)所述Vero细胞复苏和规模化培养为：
取工作细胞库的1支或多支同批Vero细胞，经复苏扩增、胰蛋白酶替代物消化、37℃±1℃培养制备的一定数量并用于接种病毒的细胞为一个细胞批。
使用的细胞培养液为含5％～10％新生牛血清的199培养液，置于细胞工厂内，37℃培养至均匀单层Vero细胞；随后培养3～6天，至细胞密度2～5×107个/ml，优选的，培养6天，至细胞密度约为5×107个/ml；
步骤(2)所述的接种工作种子批毒种、病毒培养及收获为：
1)替换Vero细胞培养液为病毒维持液，所述病毒维持液为199培养液和DMEM培养液的混合液，优选的，所述病毒维持液为199培养液和DMEM培养液按照体积比2：1混合的混合液，每100L病毒维持液加入0.1～10ml工作毒种，工作毒种病毒滴度不低于6.00LgCCID50/ml；优选的，每1ml工作毒种加入100L病毒维持液中，工作毒种滴度为8.00LgCCID50/ml；；
2)将病毒维持液加入细胞工厂中，培养条件为37℃±1℃；培养3～6天，观察细胞病变，细胞病变CPE达到80％以上时，一次性收获病毒液，即为病毒收获液；
步骤(3)所述的病毒的第一次病毒灭活、浓缩及第二次病毒灭活具体为：
1)病毒收获液立即加入甲醛灭活：甲醛溶液直接加入盛装病毒收获液的容器中，使终浓度37％甲醛溶液与病毒收获液的积比1:1000～10000，置37℃下灭活3～8天；
或者2)于2～8℃放置后用β-丙内酯灭活：病毒收获液温度达到2～8℃后，β-丙内酯与病毒收获液体积比1:2000～8000，置于2～8℃下灭活2～4天；
第一次病毒灭活完毕后，采用100～300KD膜包超滤浓缩20～80倍得病毒浓缩液；
随后对病毒浓缩液进行第二次病毒灭活操作得灭活病毒浓缩液，灭活步骤同第一次灭活，如二次采用β-丙内酯灭活时，灭活完成后将灭活病毒液置37℃水解至少2小时，以确保β-丙内酯完全水解；
步骤(4)所述的灭活病毒浓缩液纯化步骤为：
将灭活病毒浓缩液采用柱色谱法进行凝胶过滤层析纯化，色谱介质为琼脂糖凝胶Sepharose 4FF或Sepharose 6FF(优选为Sepharose 4FF)，采用PH7.4、浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗脱，每次上样量不超过层析柱体积的10％，280nm紫外监测收集第一峰，即为目的蛋白峰，即获得SARS-CoV-2病毒疫苗原液，原液置于2～8℃保存；
所述的最终接种病毒的细胞工厂为10和/或40层细胞工厂。
进一步的，所述的SARS-CoV-2病毒疫苗原液经检定合格后，在配制容器中按铝终浓度为0.80～1.20mg/ml加入氢氧化铝佐剂，在混匀的状态下加入原液，补加pH 7.2～7.4磷酸盐缓冲液至新型冠状病毒特异性抗原含量为200～800WU/ml(WU代表新型冠状病毒灭活抗原单位)所需体积，混匀，即为半成品。分装在预灌封注射器或者西林瓶中，0.5ml/支。
本发明还涉及由所述方法制备获得的SARS-CoV-2病毒灭活疫苗。
本发明的有益效果在于：
1、采取两步病毒灭活，规模化制备新型冠状病毒灭活疫苗过程中，由于病毒收获液体积较大，封闭化管道操作过程中，可能存在部分病毒收获液粘附于管壁或瓶壁，从而导致存在灭活死角，基于此，选择超滤浓缩后的病毒浓缩液进行第二次病毒灭活，进一步降低生物安全风险；两次灭活确保疫苗的生物安全。
2、本发明选择100～300kD超滤膜包对灭活的病毒收获液进行灭活病毒抗原浓缩富集处理，同时去除部分小分子杂蛋白；超滤浓缩后，采取了Sepharose 4FF或Sepharose6FF为凝胶过滤层析介质，去除与病毒颗粒分子量相差较大的大部分牛血清、宿主细胞DNA以及宿主细胞蛋白，大大减少了疫苗原液中杂质含量，在保证疫苗效力的同时最大限度提高了疫苗的纯度，降低了疫苗内杂质的含量，从而降低了人体由于接种而引起不良反应的几率。
3、本发明制备的新型冠状病毒灭活疫苗在体外相对效力测定、体内效力、异常毒性、热稳定性试验、内毒素含量、牛血清白蛋白残留量、Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白质残留量等方面均达到工艺设计要求，这得益于优化的工艺，要点是细胞经细胞工厂培养，换无血清病毒维持液接种病毒，操作简单，并且大幅度的降低了成本，有利于细胞病变的控制并能够大幅度提高病毒收获液的病毒滴度，从而有效提高疫苗的效力；收获的病毒液经两次病毒灭活，确保最终原液不含有活的病毒；病毒液经超滤、凝胶过滤，最大限度降低了疫苗原液中杂质含量、保证了单位蛋白中有效抗原含量高，从而保证了疫苗的效力。
附图说明
图1、接种工作毒株3天后的Vero细胞照片，图中明显可见细胞染毒病变。
图2、疫苗制备工艺流程图。
图3、4FF填料凝胶过滤层析图谱。
图4、6FF填料凝胶过滤层析图谱。
图5、疫苗供试品的抗体效价GMT值。
具体实施方式
SARS-CoV-2病毒毒株
研究用的毒株为2019-nCoV WIV04株，将工作种子批毒种感染Vero细胞，检测结果表明，毒种滴度达到8.00LgCCID50/ml，将制备的工作种子批保藏在-60℃以下的超低温冰箱保存。
实施例1、制备SARS-CoV-2病毒灭活疫苗实例1
(1)毒种采用新型冠状病毒株2019nCoVWIV04-1，生产用细胞为Vero细胞；
(2)将复苏后的Vero细胞采用胰酶替代物TrypLE Select消化分散均匀，加入含10％新生牛血清的199培养液混合均匀后加入到细胞工厂中，置于37℃培养至均匀单层；
(3)Vero细胞在10层细胞工厂培养6天后，细胞密度3×107个/ml，弃掉细胞培养液加入1.6L病毒维持液；
(4)将含有工作毒种的病毒维持液，工作毒种滴度8.00LgCCID50/ml，每个细胞工厂加入含0.01ml工作毒种的1.6L病毒维持液，病毒于细胞工厂中培养，培养条件为37℃±1℃；
(5)病毒培养3～4天后，观察细胞病变，细胞病变(CPE)达到80％以上时，一次性收获病毒液，即为病毒收获液,病毒收获液装在收集桶内，取样做无菌检查、支原体检查和病毒滴度检查，病毒收获液在2～8℃暂存；病毒滴度检测结果为6.88LgCCID50/ml，无细菌及支原体感染；
(6)病毒收获液温度降至2～8℃后，按1:2000体积比加入β-丙内酯，置2～8℃灭活3天。病毒灭活到期后，每个灭活容器应立即取样，分别进行病毒灭活验证试验和抗原含量检测；
(7)将灭活后的病毒液采用300KD膜包超滤浓缩60倍得病毒浓缩液；
(8)病毒浓缩液置2～8℃2天后，按体积比1:2000比例加入β-丙内酯，置2～8℃灭活3天进行第二次病毒灭活。37℃水解2小时，以确保β-丙内酯完全水解；
(9)将第二次病毒灭活后的病毒液采用柱色谱法进行第一次纯化，色谱介质为琼脂糖凝胶Sepharose 4FF(图3)，采用PH7.4、浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗脱，每次上样量不超过层析柱体积的10％，以280nm波长紫外检测器监测流出液的吸光度变化，收集第一峰，即为目的蛋白峰，即获得新型冠状病毒疫苗原液，抽样做原液检定，原液置于2～8℃保存；
(10)新型冠状病毒疫苗原液经检定合格后，在配制容器中按铝终浓度为1.0mg/ml加入氢氧化铝佐剂，在混匀的状态下加入原液，补加pH 7.2～7.4磷酸盐缓冲液至新型冠状病毒特异性抗原含量为800WU/ml(WU代表新型冠状病毒灭活抗原单位)所需体积，混匀，即为半成品。分装在预灌封注射器或者西林瓶中，0.5ml/支。
实施例2、制备SARS-CoV-2病毒灭活疫苗实例2
(1)毒种采用新型冠状病毒株2019nCoVWIV04-1，生产用细胞为Vero细胞；
(2)将复苏后的Vero细胞采用胰酶替代物TrypLE Select消化分散均匀，加入含10％新生牛血清的199培养液混合均匀后加入到细胞工厂中，置于37℃培养至均匀单层Vero细胞；
(3)Vero细胞在10层细胞工厂培养6天后，细胞密度3×107个/ml，弃掉细胞培养液加入1.6L病毒维持液；
(4)将含有工作毒种的病毒维持液加入细胞工厂，工作毒种滴度8.00LgCCID50/ml，每个细胞工厂加入含0.01ml工作毒种的1.6L病毒维持液，病毒于细胞工厂中培养，培养条件为37℃±1℃；
(5)病毒培养3～4天后，观察细胞病变，细胞病变CPE达到80％以上时，一次性收获病毒液，即为病毒收获液,病毒收获液装在收集桶内，取样做无菌检查、支原体检查和病毒滴度检查，病毒收获液在2～8℃暂存；病毒滴度检测结果为7.00LgCCID50/ml，无细菌及支原体感染；
(6)病毒收获液温度达到2～8℃后，按1:2000体积比加入β-丙内酯，置2～8℃灭活3天。病毒灭活到期后，每个灭活容器应立即取样，分别进行病毒灭活验证试验和抗原含量检测；
(7)将灭活后的病毒液采用300KD膜包超滤浓缩60倍得病毒浓缩液；
(8)病毒浓缩液置2～8℃2天后，按体积比1:2000比例加入β-丙内酯，置2～8℃灭活3天。37℃水解2小时，以确保β-丙内酯完全水解；
(9)将第二次病毒灭活后的病毒液采用柱色谱法进行第一次纯化，色谱介质为琼脂糖凝胶Sepharose 6FF(图4)，采用PH7.4、浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗脱，每次上样量不超过层析柱体积的10％，以280nm波长紫外检测器监测流出液的吸光度变化，收集第一峰，即为目的蛋白峰，即获得新型冠状病毒疫苗原液，抽样做原液检定，原液置于2～8℃保存；
(10)新型冠状病毒疫苗原液经检定合格后，在配制容器中按铝终浓度为1.0mg/ml加入氢氧化铝佐剂，在混匀的状态下加入原液，补加pH 7.2～7.4磷酸盐缓冲液至新型冠状病毒特异性抗原含量为800WU/ml(WU代表新型冠状病毒灭活抗原单位)所需体积，混匀，即为半成品。分装在预灌封注射器或者西林瓶中，0.5ml/支。
实施例3、制备SARS-CoV-2病毒灭活疫苗实例3
(1)毒种采用新型冠状病毒株2019nCoVWIV04-1，生产用细胞为Vero细胞；
(2)将复苏后的Vero细胞采用胰酶替代物TrypLE Select消化分散均匀，加入含10％新生牛血清的199培养液混合均匀后加入到细胞工厂中，置于37℃培养至均匀单层Vero细胞；
(3)Vero细胞在10层细胞工厂培养6天后，细胞密度3×107个/ml，弃掉细胞培养液加入1.6L病毒维持液；
(4)将含有工作毒种的病毒维持液加入细胞工厂，工作毒种滴度8.00LgCCID50/ml，每个细胞工厂加入含0.01ml工作毒种的1.6L病毒维持液，病毒于细胞工厂中培养，培养条件为37℃±1℃；
(5)病毒培养3～4天后，观察细胞病变，细胞病变CPE达到80％以上时，一次性收获病毒液，即为病毒收获液,病毒收获液装在收集桶内，取样做无菌检查、支原体检查和病毒滴度检查，经检测，病毒滴度为7.15LgCCID50/ml，无细菌及支原体感染，病毒收获液立即加入甲醛灭活；
(6)将甲醛溶液直接加入盛装病毒收获液的容器中，使终浓度37％甲醛溶液与病毒收获液的积比1:5000，置37℃条件静置灭活7天。病毒灭活到期后，每个灭活容器应立即取样，分别进行病毒灭活验证试验和抗原含量检测；
(7)将灭活后的病毒液采用300KD膜包超滤浓缩60倍得病毒浓缩液；
(8)病毒浓缩液置37℃1天后，按体积比1:5000比例加入37％甲醛溶液，置37℃灭活5天；
(9)将第二次病毒灭活后的病毒液采用柱色谱法进行第一次纯化，色谱介质为琼脂糖凝胶Sepharose4FF，采用PH7.4、浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗脱，每次上样量不超过层析柱体积的10％，以280nm波长紫外检测器监测流出液的吸光度变化，收集第一峰，即为目的蛋白峰，即获得新型冠状病毒疫苗原液，抽样做原液检定，原液置于2～8℃保存；
(10)新型冠状病毒疫苗原液经检定合格后，在配制容器中按铝终浓度为1.0mg/ml加入氢氧化铝佐剂，在混匀的状态下加入原液，补加pH 7.2～7.4磷酸盐缓冲液至新型冠状病毒特异性抗原含量为800WU/ml(WU代表新型冠状病毒灭活抗原单位)所需体积，混匀，即为半成品。分装在预灌封注射器或者西林瓶中，0.5ml/支。
实施例4、疫苗效果检定
将按照上述实施例1、2和3制备的SARS-CoV-2病毒灭活疫苗进行检定结果比较，结果如下表所示：
Figure BDA0002545645860000051
表中，异常毒性实验步骤及结果为：
实验动物：SPF级K.M小鼠，规格18～22g/只。普通级豚鼠，规格250～350g/只。
供试品：实施例1-3制得的疫苗样品，给药前样品需室温平衡。
1、小鼠试验
注射：取小鼠每组5只(共三组分别对应实施例1-3的疫苗样品)，注射前每只小鼠称体重，应为18～22g。每只小鼠注射0.5ml成品疫苗，观察7天。
结果判定：观察期内，小鼠全部健存，且无异常反应；到期时全部小鼠体重均增加，判定供试品符合规定。
2、豚鼠试验
注射：取豚鼠每组2只(共三组分别对应实施例1-3的疫苗样品)，注射前每只豚鼠称体重，应为250～350g。每只豚鼠注射0.5ml成品疫苗，观察7天。
结果判定：观察期内，豚鼠全部健存，且无异常反应，到期时全部豚鼠体重均增加，判定供试品符合规定。
表中，体内效力的检测方法步骤为
1、小鼠免疫及血清分离
(1)小鼠免疫：
将疫苗供试品(实施例1-3制备得到疫苗产品)分别接种4-8周龄雌性Balb/C小鼠，每组10只，腹腔注射接种0.5ml。每次实验设10只阴性对照小鼠。
(2)血清分离
接种后14天，采集血样，37℃放置2小时后，5000rpm/分离心10分钟，将待检血清样品56℃水浴灭活30分钟，当天检测或保存于-20℃待检。
疫苗供试品和阴性对照每组有效采血小鼠数量不少于8只。
2、免疫后血清效价测定
(1)抗原包被:CBS为包被稀释液，将纯化抗原(实施例1-3制备的疫苗原液)稀释至终浓度1μg/ml，包被于酶标板，100μl/孔，4℃静置过夜。
(2)酶标板封闭：洗板3遍，拍干，以0.01M PBST-1％BSA为封闭液，每孔加入封闭液200μl，37℃孵育1-2小时。
(3)血清样品稀释：
采用血清样品稀释液(PBST-1％BSA)将血清样品稀释至400倍，再进行2倍系列稀释，共稀释8个梯度(400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200倍)。
对照血清稀释：取健康小鼠血清等量混合后，用血清样品稀释液稀释至400倍。
(4)加入酶标板：弃酶标板中封闭液，拍干，将稀释后的样品按照100μl/孔加入封闭好的酶标板中第1～8行，每个稀释度为单孔，第11列加入稀释后的对照小鼠血清，第12列加入稀释液，均为100μl/孔。
(5)置于恒温水浴箱，37℃水浴1小时。
(6)使用洗板机，洗涤液重复洗板5次。
(7)加入稀释至工作浓度的羊抗小鼠HRP酶标抗体，100μL/孔，置于恒温水浴箱，37℃水浴1小时。
(8)使用洗板机，洗涤液重复洗板5次。
(9)显色及终止：按照先后顺序分别加入A和B两种显色液各50μL/孔，混匀后，置于37℃水浴避光显色15分钟。随后加入终止液，50μL/孔，450/630nm测OD值(450nm波长，以630nm为参比波长)。
3、小鼠血清效价计算:
以对照小鼠血清平均OD值的2.1倍为Cut-off值，当对照小鼠血清平均OD值小于0.05时，则按0.05计算。以待检样品小鼠血清OD值≥Cut-off值的最高稀释倍数即为抗体效价。
4、结果判定
计算每组中小鼠效价的GMT值，其中单只小鼠效价低于200时，按照100计算，当≥51200时，按照51200计算GMT值(图5)。
由表中数据可以得出，本发明制备的新型冠状病毒灭活疫苗内毒素含量低、无抗生素且安全有效，在体内效力和体外相对效力测定、内毒素含量、牛血清白蛋白残留量、Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白质残留量均达到设计的工艺要求，这得益于优化的工艺，同时制备操作简单，大幅度的降低了成本。
本发明制备的新型冠状病毒灭活疫苗无抗生素，且不含有大分子过敏原性成分，极大的提高了疫苗的安全性。
最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做限定本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种SARS-CoV-2病毒的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤(1)Vero细胞的复苏和规模化培养；
步骤(2)接种工作种子批毒种、病毒培养及收获得病毒收获液；
步骤(3)第一次病毒灭活、浓缩及第二次病毒灭活后得灭活病毒浓缩液；
步骤(4)灭活病毒浓缩液纯化后得疫苗原液；
其中，
步骤(3)所述的病毒的第一次病毒灭活、浓缩及第二次病毒灭活具体为：
1)病毒收获液立即加入甲醛灭活：甲醛溶液直接加入盛装病毒收获液的容器中，使终浓度37％甲醛溶液与病毒收获液的积比1:1000～10000，置37℃下灭活3～8天；
或者2)于2～8℃放置后用β-丙内酯灭活：病毒收获液温度达到2～8℃后，β-丙内酯与病毒收获液体积比1:2000～8000，置于2～8℃下灭活2～4天；
第一次病毒灭活完毕后，采用100～300KD膜包超滤浓缩20～80倍得病毒浓缩液；
随后对病毒浓缩液进行第二次病毒灭活操作得灭活病毒浓缩液，灭活步骤同第一次灭活，如二次采用β-丙内酯灭活时，灭活完成后将灭活病毒液置37℃水解至少2小时，以确保β-丙内酯完全水解；
步骤(4)所述的灭活病毒浓缩液纯化步骤为：
将灭活病毒浓缩液采用柱色谱法进行凝胶过滤层析纯化，色谱介质为琼脂糖凝胶Sepharose 4FF或Sepharose 6FF(优选为Sepharose 4FF)，采用PH7.4、浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗脱，每次上样量不超过层析柱体积的10％，280nm紫外监测收集第一峰，即为目的蛋白峰，即获得SARS-CoV-2病毒疫苗原液，原液置于2～8℃保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(1)所述Vero细胞复苏和规模化培养为：
使用的细胞培养液为含5％～10％新生牛血清的199培养液，置于细胞工厂内，37℃培养至均匀单层Vero细胞；随后培养3～6天，至细胞密度2～5×107个/ml，优选的，培养6天，至细胞密度约为5×107个/ml。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，
步骤(2)所述的接种工作种子批毒种、病毒培养及收获为：
1)替换Vero细胞培养液为病毒维持液，所述病毒维持液为199培养液和DMEM培养液的混合液，优选的，所述病毒维持液为199培养液和DMEM培养液按照体积比2：1混合的混合液，每100L病毒维持液加入0.1～10ml工作毒种，优选的，每1ml工作毒种加入100L病毒维持液中，工作毒种滴度为8.0LgCCID50/ml；
2)将病毒维持液加入细胞工厂中，培养条件为37℃±1℃；培养3～6天，观察细胞病变，细胞病变CPE达到80％以上时，一次性收获病毒液，即为病毒收获液。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
SARS-CoV-2病毒疫苗原液经检定合格后，在配制容器中按铝终浓度为0.80～1.20mg/ml加入氢氧化铝佐剂，在混匀的状态下加入原液，补加pH 7.2～7.4磷酸盐缓冲液至新型冠状病毒特异性抗原含量为200～800WU/ml(WU代表新型冠状病毒灭活抗原单位)所需体积，混匀，即为半成品；
最后分装在预灌封注射器或者西林瓶中，0.5ml/支。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的最终接种病毒的细胞工厂为10层和/或40层细胞工厂。
6.由权利要求1-5任一所述方法制备获得的SARS-CoV-2病毒灭活疫苗。
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